專利名稱：抗人血小板膜糖蛋白Ibα嵌合抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)嵌合抗體領(lǐng)域，具體的說是抗人血小板膜糖蛋白Iba嵌合抗體。
背景技術(shù)：
血小板GPIb a是一種血小板特異性膜糖蛋白，以GPIb_IX_V復(fù)合物的形式存在， 該復(fù)合物包含四個(gè)亞單位，GPIb a，GPIbP，GPIX和GPV，以2 4 2 I的比例組成。它們都是I型跨膜糖蛋白，包括胞外區(qū)，跨膜區(qū)和胞漿區(qū)。GPIba與GPIbP之間以二硫鍵的形式共價(jià)連接組成GPIb，GPIb與GPIX，GPV以非共價(jià)鍵的形式連接形成GPIb-1X-V復(fù)合物。 GPIba是該復(fù)合物中主要的配體結(jié)合亞單位。當(dāng)血管受損時(shí)，血小板膜表面受體GPIb a在高剪切力條件下與血漿VWFAl結(jié)構(gòu)域結(jié)合，同時(shí)VWF的A3結(jié)構(gòu)域與血管損傷部位暴露的內(nèi)皮下基質(zhì)主要是膠原結(jié)合，從而在VWF的橋聯(lián)作用下實(shí)現(xiàn)血小板的初始黏附。此外，VWF結(jié)合GPIb a后引發(fā)一系列血小板細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞，最終使血小板整合素受體GPIIb/IIIa活化，引起血小板聚集，形成血栓。而動(dòng)脈血栓引起的中風(fēng)、心肌梗死等血栓栓塞性疾病是我國最常見的死亡病因之一，且其發(fā)病率仍在不斷上升。目前臨床應(yīng)用的阿司匹林和氯噼格雷是第一代抗血小板藥物，GPIIb/IIIa抑制劑為第二代抗血小板藥物。雖然這些藥物對(duì)于改善動(dòng)脈血栓引起的血栓栓塞性疾病有著巨大的貢獻(xiàn)，但是，仍然有相當(dāng)一部分病人用了這類藥物之后不能改善缺血性癥狀。另外，潛在的出血并發(fā)癥也限 制了這些藥物的應(yīng)用。血小板黏附是動(dòng)脈血栓形成的早期必經(jīng)階段，阻斷GPIb α與VWF的結(jié)合，抑制血小板的初始黏附，被認(rèn)為能夠有效抑制血栓形成，并且能夠降低出血傾向。Deckmyn等報(bào)道在狒狒股動(dòng)脈狹窄血栓模型的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用抗血小板GPIb α單克隆抗體6B4-Fab劑量為O. 6mg/kg 時(shí)可以明顯減少單位時(shí)間內(nèi)周期性血流減低發(fā)生的次數(shù)，還明顯抑制血小板在I型膠原上的沉積(700-1000/s)。2mg/kg的6B4_Fab可以完全抑制周期性血流減低的發(fā)生,而無出血時(shí)間的延長(zhǎng)。因此，抗GPIba單克隆抗體具有良好的抗血栓應(yīng)用前景。
但是目前市面上的抗血小板GPIb α單克隆抗體大多還是鼠源性抗體，由于鼠源性抗體應(yīng)用到人體后可能出現(xiàn)人抗鼠抗體反應(yīng)，因此逐漸被人源化抗體所取代，這是單抗發(fā)展的趨勢(shì)。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種人源化的抗血小板GPIb α單克隆抗體及其制備方法。
本發(fā)明提供的抗人血小板膜糖蛋白Iba嵌合抗體，包括嵌合抗體成熟輕鏈和嵌合抗體成熟重鏈，所述嵌合抗體成熟輕鏈的氨基酸序列為序列表中序列2的自氨基末端第 453 666位氨基酸殘基，所述嵌合抗體成熟重鏈的氨基酸序列為序列表中序列2的自氨基末端第I 452位氨基酸殘基。
上述抗人血小板膜糖蛋白Iba嵌合抗體為如下I)或2)所示蛋白質(zhì)
I)由序列表中序列2所示氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
2)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加具有抗人血小板I吳糖蛋白Iba功能的由I)衍生的蛋白質(zhì)。
上述抗人血小板膜糖蛋白Iba嵌合抗體的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
所述抗人血小板膜糖蛋白Iba嵌合抗體的編碼基因?yàn)槿缦翴) 3)中任一所述的基因
I)其核苷酸序列是序列表中的序列I ;
2)在嚴(yán)格條件下可與序列表中的序列I限定的DNA序列雜交且編碼上述任一抗體的DNA分子；
3)與I)的基因具有90%以上同源性且編碼上述任一抗體的DNA分子。
含有上述抗人血小板膜糖蛋白Iba嵌合抗體編碼基因的重組表達(dá)載體、試劑盒、 轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。


附圖是本發(fā)明嵌合抗體及其Fab片段體外抑制瑞斯托霉素誘導(dǎo)的血小板聚集分析圖。其中(A) (f)富血小板血漿與10μ g/ml chSZ2 ； (g)富血小板血漿與10 μ g/ml鼠源 SZ2 ； (h)富血小板血漿與10 μ g/ml人IgG(B) chSZ2Fab呈劑量依賴型抑制瑞斯托霉素誘導(dǎo)的血小板聚集(a至e代表O. 5,1,2, 5,10 μ g/ml chSZ2Fab片段).具體實(shí)施方式
下面結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
實(shí)施例1:抗人血小板膜糖蛋白Iba嵌合抗體的獲得
一、引物設(shè)計(jì)和合成，
實(shí)驗(yàn)中所涉及的引物除了試劑盒提供的以外,均為Invitrogen公司合成。
權(quán)利要求
1.抗人血小板膜糖蛋白Iba嵌合抗體,包括嵌合抗體成熟輕鏈和嵌合抗體成熟重鏈，其特征在于所述嵌合抗體成熟輕鏈的氨基酸序列為序列表中序列2的自氨基末端第453 666位氨基酸殘基，所述嵌合抗體成熟重鏈的氨基酸序列為序列表中序列2的自氨基末端第I 452位氨基酸殘基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述抗人血小板膜糖蛋白Iba嵌合抗體，其特征在于所述嵌合抗體為由序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述抗人血小板膜糖蛋白Iba嵌合抗體的編碼基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的編碼基因，其特征在于所述編碼基因的核苷酸序列是序列表中的序列I。
5.含有權(quán)利要求3所述編碼基因的重組表達(dá)載體或表達(dá)盒。
6.含有權(quán)利要求3所述編碼基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
7.含有權(quán)利要求3所述編碼基因的重組菌。
全文摘要
本發(fā)明公開了抗人血小板膜糖蛋白Ibα嵌合抗體，包括嵌合抗體成熟輕鏈和嵌合抗體成熟重鏈，所述嵌合抗體成熟輕鏈的氨基酸序列為序列表中序列2的自氨基末端第453～666位氨基酸殘基，所述嵌合抗體成熟重鏈的氨基酸序列為序列表中序列2的自氨基末端第1～452位氨基酸殘基。本發(fā)明還公開了所述嵌合抗體的制備方法及其濃度效果分析。
文檔編號(hào)C12N1/21GK102993307SQ20111026669
公開日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2011年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月9日
發(fā)明者費(fèi)敏, 阮長(zhǎng)耿, 楊劍峰 申請(qǐng)人:蘇州蘇大賽爾免疫生物技術(shù)有限公司, 蘇州大學(xué)