專利名稱：一種依非巴特的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于多肽藥物制備方法技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種新的依非巴特的制備方法。
背景技術(shù)：
依非巴特(Eptifibatide)是一個合成的環(huán)七肽含有6個氨基酸和一個去氨基半胱氨酸(巰基丙酸)。這個藥是在一種barbourin結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上發(fā)明出來的。這是一種從東南侏儒型響尾蛇(Sistrurus m. barbouri)的蛇毒中發(fā)現(xiàn)的多肽。依非巴特(Eptifibatide)是一種新型的血小板糖蛋白Ilb/IIIa受體拮抗劑，它通過抑制血小板聚集的最后共同途徑，具有抗血小板作用強、起效快、不良反應(yīng)少等優(yōu)點。依非巴特 (Eptifibatide)和GPIIb/IIIa受體結(jié)合的特異性是由于賴氨酸-甘氨酸-門冬氨酸 (KGD)這一多肽序列，和整合素配體中存在的多肽序列RGD只有一個氨基酸的區(qū)別。此藥對GPIIb/IIIa受體有很高的親合力和很高的特異性，也有快速的離解率。其結(jié)果是清除半衰期較短，依非巴特(Eptifibatide)對血小板的抑制容易逆轉(zhuǎn),在停止滴入藥物2至4小時內(nèi)血小板功能即恢復到基線水平；不像阿昔單抗，依非巴特(Eptifibatide)沒有免疫源性，觀察到的血小板減少的發(fā)生頻率和普通肝素相似。依非巴特(Eptifibatide)是一種特異性GPIIb/IIIa受體阻滯劑，在ACS病人中劑量依賴性地抑制體外血小板的聚集，在健康志愿者和行PCI術(shù)的病人中能抑制纖維原與二磷酸腺苷(ADP)活化的血小板的結(jié)合。本品對血小板糖蛋白Ilb/IIIa受體的阻滯是可逆的，一旦出現(xiàn)不良反應(yīng)可立即停藥，不良反應(yīng)輕。依非巴特具有以下的結(jié)構(gòu)Mpr-Harg-Gly-Asp-Trp-Pro-CyS-NH2有關(guān)依非巴特的制備方法，國內(nèi)外有報道。中國專利CN200910247949報道了依非巴特的Fmoc固相合成法，采用氨基樹脂為開始的載體樹脂，依次接入保護氨基酸，所得肽樹脂采用三氟醋酸(TFA)酸解。在本產(chǎn)品結(jié)構(gòu)中有IHarg和I個Gly,在固相法依次接入Fmoc-Gly過程中， 由于GI y自身的特性和保護Har g結(jié)構(gòu)的特性，在產(chǎn)品制備過程產(chǎn)生易產(chǎn)生以下雜質(zhì) [+IGly]-依非巴特、[-IGly]-依非巴特、和[-IHarg]-依非巴特,從使粗品純度大幅度降低，而這些雜質(zhì)與依非巴特自身的極性相近，增大了純化的難度，產(chǎn)品總收率無法得到有效提高，同時影響產(chǎn)品純度，影響用藥的安全性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供依非巴特的制備方法，該制備方法使用了新的保護氨基酸片段，直接避免了 [+IGly]-依非巴特、[-IGly]-依非巴特、[-IHarg]-依非巴特雜質(zhì)的產(chǎn)生，提高了產(chǎn)品收率和純度，反應(yīng)效率高、有利于實現(xiàn)規(guī)?；墓滔嗪铣晒に?。本發(fā)明依非巴特的制備方法，包括固相多肽合成法制備依非巴特樹脂、依非巴特
Rink AmideAM 樹脂Rink Amide 樹脂
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樹脂酸解得到依非巴特線性肽粗品、經(jīng)氧化后得到依非巴特粗品，再經(jīng)純化和換鹽得到依非巴特成品，其中固相多肽合成法制備依非巴特樹脂的方法為在氨基樹脂上通過固相偶聯(lián)合成法依次接入下列序列中相對應(yīng)的保護氨基酸或片段，得到依非巴特樹脂X-Y-Trp (R1) -Pro-Cys (R2)-氨基樹脂其中，R1 SBoc 或H;R2 STrt 或 Acm;X 為 Mpr (R2) -Harg (R3)，R3 為 Pbf 或 H ;Y 為 Gly-Asp(OtBu)。作為本發(fā)明優(yōu)選的方案，接入X片段時，僅用I次固相偶聯(lián)合成反應(yīng)，偶聯(lián)所使用的Fmoc-保護氨基酸或片段為Mpr (Trt) -Harg (R3) -OH ；作為本發(fā)明優(yōu)選的方案，接入Y片段時，I)僅用I次偶聯(lián)直接接入,Fmoc-保護氨基酸或片段為Fmoc-Gly-Asp(OtBu)-OH ； 或2)分2次偶聯(lián)依次接入，F(xiàn)moc-保護氨基酸或片段為第一次為 Fmoc-Asp (OtBu) -0H、第二次為 Fmoc-Gly-OH。本發(fā)明接入X和Y以外的其它片段時保護氨基酸分別為=Fmoc-Trp(R1)-OH, R1為 Boc 或 H ；Fmoc-Pro-0H ；Fmoc-Cys (R2) -OH, R2 為 Trt 或 Acm。作為本發(fā)明優(yōu)選的方案，接入各個氨基酸或片段時，保護氨基酸的用量為載體樹脂總摩爾數(shù)的I. 2 6倍，優(yōu)選3倍。本發(fā)明所述的氨基樹脂，其氨基取代值為O. 3 I. 5mmol/g樹脂，優(yōu)選的取代值為
O.5 I. OmmoI /g 樹脂。進一步地,氨基樹脂選自Rink Amide樹脂、Rink Amide AM樹脂、Rink MBHA樹脂和Sieber樹脂中的一種，優(yōu)選為RinkAmide MBHA樹脂。
權(quán)利要求
1.一種依非巴特的制備方法，包括固相多肽合成法制備依非巴特樹脂、依非巴特樹脂酸解得到依非巴特線性肽粗品、經(jīng)氧化后得到依非巴特粗品，再經(jīng)純化和換鹽得到依非巴特成品，其中固相多肽合成法制備依非巴特樹脂的方法為在氨基樹脂上通過固相偶聯(lián)合成法依次接入下列序列中相對應(yīng)的保護氨基酸或片段，得到依非巴特樹脂X-Y-Trp (R1) -Pro-Cys (R2)-氨基樹脂其中，R1 為 Boc 或 H ；R2 為 Trt 或 Acm ；X 為 Mpr (R2) -Harg (R3)，R3 為 Pbf 或 H ;Y 為 Gly-Asp (OtBu)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的依非巴特的制備方法，其特征在于接入X片段時，僅用I次固相偶聯(lián)合成反應(yīng)，偶聯(lián)所使用的Fmoc-保護氨基酸或片段為Mpr (Trt) -Harg (R3) -OH, R3為 Pbf 或 H0
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的依非巴特的制備方法，其特征在于接入Y片段時，1)分I次偶聯(lián)直接接入，F(xiàn)moc-保護氨基酸或片段為Fmoc-Gly-Asp(OtBu)-OH;或2)分2次偶聯(lián)依次接入，F(xiàn)moc-保護氨基酸或片段為第一次為Fmoc-Asp(OtBu)-0H、 第二次為 Fmoc-Gly-OH。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的依非巴特的制備方法，其特征在于接入X和 Y以外的其它的保護氨基酸分別為=Fmoc-Trp (R1) -OH, R1為Boc或H ；Fmoc-Pro-0H ； Fmoc-Cys (R2) -OH, R2 為 Trt 或 Acm。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項所述的依非巴特的制備方法，其特征在于接入各個氨基酸片段時，保護氨基酸的用量為載體樹脂總摩爾數(shù)的I. 2 6倍，優(yōu)選3倍。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的依非巴特的制備方法，其特征在于所述氨基樹脂取代值為O.3 I. 5mmol/g樹脂，優(yōu)選的Fmoc-Leu-取代值為O. 5 I. Ommol/g樹脂。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的依非巴特的制備方法，其特征在于所述氨基樹脂選自 RinkAmide樹脂、Rink Amide AM樹脂、Rink MBHA樹脂和Sieber樹脂中的一種，優(yōu)選為 RinkAmide MBHA 樹脂。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的依非巴特的制備方法，其特征在于所述固相偶聯(lián)合成法是 前一步反應(yīng)得到的保護氨基酸-樹脂脫去保護Fmoc后再與下一個保護氨基酸偶聯(lián)反應(yīng)，偶聯(lián)反應(yīng)時間為60 300分鐘，優(yōu)選的為100 140分鐘。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項所述的依非巴特的制備方法，其特征在于依非巴特樹脂經(jīng)酸解同時脫去樹脂及側(cè)鏈保護基得到依非巴特線性肽粗品Mpr-Harg-Gly-Asp-Trp-Pro-CyS-NH20
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的依非巴特的制備方法，其特征在于依非巴特樹脂酸解時采用的酸解劑為三氟醋酸(TFA)、1，2-乙二硫醇(EDT)和水混合溶劑，混合溶劑的配比為TFA 的比列為80-95% (V/V)，EDT的比例為I 10% (V/V)，余量為水。
11.根據(jù)權(quán)利要求I 8任一項所述的依非巴特的制備方法，其特征在于依非巴特線性肽粗品氧化后得到依非巴特粗品時，依非巴特線性肽先用醋酸溶解，過濾后用氧化劑氧化環(huán)化,依非巴特線性肽結(jié)構(gòu)中的Mpr中的巰基SH和Cys中的SH經(jīng)氧化形成二硫鍵S-S而得到Mpr-Harg-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys-NH2所述氧化劑為碘、hA ^ DMSQ中的至少-種。
全文摘要
本發(fā)明屬于多肽藥物制備方法技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及依非巴特的制備方法。本發(fā)明依非巴特的制備方法，包括固相多肽合成法制備依非巴特樹脂、依非巴特樹脂酸解得到依非巴特線性肽粗品、經(jīng)氧化后得到依非巴特粗品，再經(jīng)純化和換鹽得到依非巴特成品，其中固相多肽合成法制備依非巴特樹脂的方法為在氨基樹脂上通過固相偶聯(lián)合成法依次接入下列序列中相對應(yīng)的保護氨基酸或片段，得到依非巴特樹脂X-Y-Trp(R1)-Pro-Cys(R2)-氨基樹脂其中，R1為Boc或H；R2為Trt或Acm；X為Mpr(R2)-Harg(R3)，R3為Pbf或H；Y為Gly-Asp(OtBu)。本發(fā)明產(chǎn)品純度可達99.5％以上。
文檔編號C07K1/06GK102584944SQ20121002519
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月6日
發(fā)明者文永均, 王曉莉, 祝傳斌, 童光彬, 韓玉 申請人:成都圣諾科技發(fā)展有限公司