一種精制玻璃酸酶的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及從新鮮動物睪丸中提取玻璃酸酶的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]玻璃酸酶又名透明質(zhì)酸酶，在哺乳動物的睪丸里含量很豐富，能水解透明質(zhì)酸，使其粘滯性明顯下降，有利于受精時精子進入卵子。也存在于精子、頌下腺、蜂毒、蛇毒、皮膚、脾臟、水蛭及細胞的溶酶體中。
[0003]玻璃酸酶的穩(wěn)定性較好，42°C加熱60分鐘活力不損失；100°C加熱5分鐘，活力可保留80%。受熱失活后進行冷卻可恢復(fù)部分活力。在pH5以下或pH8以上酶仍較穩(wěn)定。在低濃度水溶液中較易失活，但可加入0.2%或0.5%阿拉伯膠或0.2%明膠保護。Fe2+、Cu2+對酶有可逆抑制作用，Pb2+、Hg2+、Ni2+等對酶活性沒有明顯影響。硫酸軟骨素B (皮膚素)、硫酸類肝素、硫酸角質(zhì)素、肝素及高濃度玻璃酸酶對酶均有抑制作用，但可被0.15mol/L氯化鈉或硫酸魚精蛋白所逆轉(zhuǎn)。
[0004]藥用玻璃酸酶為白色或微黃色粉末，無氣味，易溶于水，不溶于丙酮、乙醚、乙醇等有機溶劑。生化制藥主要用牛、羊睪丸為原料進行提取制備。
[0005]低溫乙醇法是1940年由美國哈佛大學醫(yī)學院的Edwin J.Cohn教授發(fā)明的，因此又稱為“孔氏法”。孔氏法最初用來分離牛血清白蛋白，隨后應(yīng)用于人血漿分離。1944年，白蛋白制品首次進行臨床輸注，用于搶救7名在日軍偷襲珍珠港中嚴重燒傷的美國水兵，并由此開始了血漿蛋白制品的工業(yè)化生產(chǎn)。乙醇作為一種蛋白沉淀劑，具有許多優(yōu)點:介電常數(shù)低、與水易混溶、在正常環(huán)境和工作條件下無易爆性、低分子量、化學上的相對惰性、低毒、價廉、易得和抑菌作用。至今，大規(guī)模血漿蛋白分離仍基本采用低溫乙醇分離法。
[0006]國外50年代初已投入生產(chǎn)，并收載于英國和日本藥典中，商品名Rondas。我國1965年正式投入生產(chǎn)，從羊睪丸中提取，收入1977版中國藥典。王彥，周淑敏等曾在2002年15卷(1)期的《黑龍江醫(yī)藥》上發(fā)表了一篇名為《透明質(zhì)酸酶提取工藝的研究》的論文，較詳細的介紹了工業(yè)生產(chǎn)中從羊睪丸中提取玻璃酸酶的傳統(tǒng)工藝以及在此基礎(chǔ)上由他們改良的新工藝；李丹，郭育濤等曾在2011年8月第40卷第8期的《應(yīng)用化工》上發(fā)表了一篇名為《牛睪丸中透明質(zhì)酸酶提取工藝研究》的論文，介紹了用鹽酸和乙酸的混合液溶解、硫酸銨鹽析方法，從牛睪丸中提取玻璃酸酶的實驗研究。國內(nèi)傳統(tǒng)工藝是用酸液溶解和硫酸銨鹽析來提取玻璃酸酶粗品，粗品經(jīng)透析、凍干得玻璃酸酶精品的，本發(fā)明提供了一種精制玻璃酸酶的制備方法，它包括以下步驟:糜漿、預(yù)處理、碾磨、熱交換、二級離心、微濾、超濾、真空冷凍干燥、粉碎調(diào)制、成品。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明提供了一種精制玻璃酸酶的制備方法，它包括以下步驟:糜漿、預(yù)處理、碾磨、熱交換、二級離心、微濾、超濾、真空冷凍干燥、粉碎調(diào)制、成品。
[0008]所述的預(yù)處理步驟是:對采收的新鮮糜漿添加0.5%-1.0%的抗氧化劑，0.5%-1.0%的重金屬螯合劑后，充分攪拌20-30分鐘。
[0009]所述的碾磨步驟是:將預(yù)處理的糜漿倒入膠體磨中，充分磨碎，得到玻璃酸酶料液。
[0010]所述的熱交換步驟是:玻璃酸酶料液通過板式換熱器迅速降低溫度至8-12°C，并且在此后的提取分離過程通過冷水循環(huán)系統(tǒng)維持料液在這個溫度范圍。
[0011]所述的二級離心步驟是:玻璃酸酶料液通過碟式離心機、管式離心機的不斷連續(xù)分離，得到澄清的玻璃酸酶料液。
[0012]所述的微濾步驟是:玻璃酸酶澄清料液通過截留分子量為0.1-0.2 μ的微濾組件去除微生物和大分子量雜質(zhì)。
[0013]所述的超濾步驟是:除菌除雜的玻璃酸酶料液通過截留分子量為8000-16000的超濾膜組件去除小分子量雜質(zhì)和水，濃縮料液，體積比為4.0-5.0:1。
[0014]所述的真空冷凍干燥步驟是:將玻璃酸酶濃縮液放入真空冷凍干燥機或超低溫冰箱(冷庫)中速凍至溫度為_30°C;開始抽真空，繼續(xù)維持制冷2小時；將制冷變?yōu)榧訜?，緩慢加熱使料液溫度上升?0°C時即得玻璃酸酶干燥固體。
[0015]所述的粉碎調(diào)制步驟是:玻璃酸酶干燥固體經(jīng)過粉碎、添加輔料、混勻后就可以包裝成不同規(guī)格的成品。
[0016]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果是:
國內(nèi)現(xiàn)有技術(shù)是用酸液溶解、硫酸銨鹽析的方法來制取玻璃酸酶粗品，粗品經(jīng)透析、凍干得玻璃酸酶精品；而本發(fā)明提供了一種精制玻璃酸酶的制備方法，它包括以下步驟:糜漿、預(yù)處理、碾磨、熱交換、二級離心、微濾、超濾、真空冷凍干燥、粉碎調(diào)制、成品。本提取方法的特點是:通過預(yù)處理、熱交換并保持提取過程在低溫條件下進行，能有效減少長期高溫等條件對酶活力降低的影響；通過碾磨將糜漿充分溶解在料液中，利于提高酶提取回收率；本方法提取的玻璃酸酶純度高、效價高、熱穩(wěn)定性好，外觀、理化、微生物限度等指標均達到或超過國內(nèi)外相關(guān)藥品標準；該方法工藝簡單、生產(chǎn)成本低，產(chǎn)量高，可工業(yè)化生產(chǎn)。
【具體實施方式】
[0017]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。
[0018]實施例1
本實施例的精制玻璃酸酶制造方法，它包括以下步驟:糜漿一預(yù)處理一碾磨一熱交換—二級離心一微濾一超濾一真空冷凍干燥一調(diào)制、粉碎、成品。具體操作為:采收新鮮糜楽，添加0.5%的抗氧化劑、0.5%的重金屬螯合劑，充分攪拌20分鐘；將預(yù)處理的糜漿倒入膠體磨中，充分磨碎，得到玻璃酸酶料液；玻璃酸酶料液通過板式換熱器降低溫度至8°C，并且在此后的提取分離過程通過冷水循環(huán)系統(tǒng)維持料液在這個溫度范圍；玻璃酸酶料液通過碟式離心機、管式離心機的不斷連續(xù)分離，得到澄清的玻璃酸酶澄清料液；玻璃酸酶澄清料液通過截留分子量為0.1 μ的微濾組件去除微生物和大分子量雜質(zhì)；除菌除雜的玻璃酸酶料液通過截留分子量為8000的超濾膜組件去除小分子量雜質(zhì)和水，濃縮料液，體積比為4.0:1 ;將玻璃酸酶濃縮液放入真空冷凍干燥機或超低溫冰箱(