Dc誘導(dǎo)活化劑、dc體外培養(yǎng)方法和dc、及cik的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于細胞免疫技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種DC誘導(dǎo)活化劑、DC體外培養(yǎng)方法和DC、及 CIK。
【背景技術(shù)】
[0002]過繼免疫治療是將自身或異體的抗腫瘤效應(yīng)細胞的前體細胞，在體外采用IL-2、抗CD3單抗，特異性多肽等激活劑進行誘導(dǎo)、激活和擴增后，再轉(zhuǎn)輸給腫瘤患者，從而提高患者抗腫瘤免疫力，以達到治療的目的。目前在臨床中使用最多的過繼細胞免疫治療主要是 DC(dendritic cell，樹突狀細胞)治療、CIK (Cytokine-1nduced Killer，細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞)治療和DC-CIK聯(lián)合免疫治療。其中，DC主要從骨髓組織、血液中分離出，具有很強的捕獲抗原、呈遞抗原的能力和分泌能力，能夠誘導(dǎo)持久有力的特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)。CIK是人外周血中單個核細胞在體外經(jīng)多種細胞因子刺激后獲得的一群異質(zhì)細胞。它具有增殖能力強、殺瘤活性高和殺瘤譜廣、臨床應(yīng)用不良反應(yīng)小的特點，是腫瘤過繼免疫治療中更為有效的殺瘤效應(yīng)細胞。而相對前兩者，將DC和CIK進行共培養(yǎng)之后形成的DC-CIK聯(lián)合免疫具有更優(yōu)的使用效果，因為在共培養(yǎng)的過程中，兩者之間相互既促進DC的成熟，更能促進C1K的增殖并且加強CIK的腫瘤殺傷效力。
[0003]然而現(xiàn)有技術(shù)通常的DC體外增殖和誘導(dǎo)過程中，由于DC本身分離自單個核細胞(PBMC)體外培養(yǎng)中的半貼壁細胞，這些貼壁細胞直接貼附在加工處理的塑料培養(yǎng)容器中，而這一體外的培養(yǎng)環(huán)境不能具備體內(nèi)的原始生存環(huán)境，因此DC的生長、成熟以及表達的性狀、免疫活性等方面都不能達到原始體內(nèi)環(huán)境的水平，大大影響了 DC所要具備的抗原提呈效果。
[0004]而進一步在DC-CIK聯(lián)合免疫中，由于CIK功能的強弱與DC提呈的專一性和數(shù)量有關(guān)，將培養(yǎng)的DC與CIK進行共培養(yǎng)時，DC體外增殖能力低、相反CIK增殖能力強大，會造成DC和CIK的接觸機會低，從而影響DC的抗原提呈作用，最終降低CIK的治療效力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明實施的目的在于克服現(xiàn)有培養(yǎng)出DC抗原提呈性能以及與CIK共培養(yǎng)時生長能力不足影響CIK殺傷力的缺陷，提供一種能夠在DC進行體外培養(yǎng)的過程中大大提升其抗原提呈能效、細胞活性，但同時又能保持其分化程度的DC誘導(dǎo)活化劑，以及采用該DC誘導(dǎo)活化劑進行DC體外培養(yǎng)的方法和方法得到的DC、CIKo
[0006]為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明實施例的技術(shù)方案如下:
[0007]—種DC誘導(dǎo)活化劑，包括小細胞肺癌特異性EGFR和鋁佐劑。
[0008]本發(fā)明的上述DC誘導(dǎo)劑利用EGFR本身具有很多腫瘤細胞表面結(jié)構(gòu)簇，在DC進行培養(yǎng)的過程中作為模擬抗原對DC進行刺激和誘導(dǎo)，使其細胞活性能維持在較高的狀態(tài)；同時搭配鋁佐劑形成EGFR緩釋，以及保護EGFR降解、衰減，還與DC質(zhì)膜相互作用，最終能強化DC對抗原的處理和提呈能力。
[0009]本發(fā)明在上述DC誘導(dǎo)活化劑的基礎(chǔ)上還提出一種采用上述DC誘導(dǎo)活化劑進行DC體外培養(yǎng)的方法，包括如下步驟:
[0010]獲取DC，對所述DC進行體外培養(yǎng)；
[0011 ] 在所述體外培養(yǎng)的過程中，用上述DC誘導(dǎo)活化劑對所述DC進行誘導(dǎo)處理。
[0012]本發(fā)明的上述DC體外培養(yǎng)的方法，為了克服免疫細胞治療存在的單核貼壁細胞貼壁環(huán)境不佳、DC提呈效果不強、活性抗原不易儲存的現(xiàn)象，添加小細胞肺癌特異性抗原EGFR和鋁鹽佐劑進行誘導(dǎo)和活化，相比現(xiàn)有方式培養(yǎng)的DC具有更高的對抗原的處理和提呈能力和更強大的腫瘤特異性殺傷細胞。
[0013]本發(fā)明還提出一種采用上述DC體外培養(yǎng)的方法培養(yǎng)得到的DC，以及將該DC應(yīng)用于DC-CIK聯(lián)合免疫，進行DC-CIK共培養(yǎng)制備的CIK。
[0014]本發(fā)明制備得到的DC和CIK相比現(xiàn)有的通常培養(yǎng)的方式制備的DC和CIK，DC活性和增值能力高，在共培養(yǎng)的過程中能具有與CIK更多的接觸幾率；并且在培養(yǎng)的過程中，DC經(jīng)過EGFR的誘導(dǎo)，能提呈更多的抗原信息，使得最終制備得到的CIK具有更高的活性和腫瘤特異性殺傷能力。
【具體實施方式】
[0015]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0016]本發(fā)明實例提出一種用于DC體外培養(yǎng)過程中提升DC對抗原的處理和提呈能力的DC誘導(dǎo)活化劑，該DC誘導(dǎo)活化劑能夠在DC進行體外培養(yǎng)的過程中大大提升其抗原提呈能效、細胞活性，但同時又能保持其分化程度。本發(fā)明的DC誘導(dǎo)活化劑包括小細胞肺癌(Small Cell Lung Cancer，SCLC)特異性EGFR (epidermal growth factor receptor，表皮生長因子受體)和鋁佐劑的混合物。
[0017]其中，EGFR本身是上皮生長因子細胞增殖和信號傳導(dǎo)的受體，是一種糖蛋白，屬于酪氨酸激酶型受體，EGFR在實體腫瘤中會存在高表達或異常表達，而EGFR的過表達或者異常表達是和腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移、侵潤、預(yù)后差有關(guān)。因此在本發(fā)明中采用小細胞肺癌特異性EGFR，利用其本身具有很多腫瘤細胞表面結(jié)構(gòu)簇，在DC進行培養(yǎng)的過程中作為模擬抗原對DC進行刺激和誘導(dǎo)，使其細胞活性能維持在較高的狀態(tài)。同時，EGFR相比通常使用的人工合成和直接通過患者腫瘤切除組織的特意性抗原，除了結(jié)構(gòu)簇豐富、效果好之外；更主要的是在體外液體培養(yǎng)環(huán)境或者存儲過程中，人工合成和直接通過患者腫瘤切除組織抗原特性會逐漸的減弱，需要較嚴格的存儲或者使用環(huán)境以保證其特效，而EGFR自身是糖蛋白，在胞內(nèi)成熟之后，其形態(tài)結(jié)構(gòu)不容易再發(fā)生較大的變化，抗原穩(wěn)定性和存儲便易度都更好。
[0018]針對DC培養(yǎng)中的液相培養(yǎng)的環(huán)境和過程結(jié)合上述EGFR，DC誘導(dǎo)活化劑進一步還包括有鋁佐劑，其是一種優(yōu)良的呈半膠狀的蛋白吸附劑，能從溶液中強烈吸附蛋白質(zhì)抗原，形成非變性的物理沉淀；當(dāng)其接種到類似機體環(huán)境內(nèi)后可形成一個“抗原庫”，緩慢釋放出抗原，充分延長了 EGFR的作用時間；并且更進一步還能對EGFR進行保護，避免EGFR在環(huán)境變化中發(fā)生自身結(jié)構(gòu)或者性能變化、降解等等而導(dǎo)致抗原特性衰減的情形。同時，除了上述保護作用之外，鋁佐劑自身也可以通過與DC質(zhì)膜相互作用，提升DC的細胞活性，具有免疫佐劑功能；因此本發(fā)明的DC誘導(dǎo)活化劑最終能強化DC對抗原的處理和提呈能力，獲得更強大的腫瘤特異性殺傷細胞。
[0019]在上述實施方式中，鋁佐劑根據(jù)使用情況可以選擇氫氧化鋁、氫氧化鋁凝膠、磷酸鋁、硫酸鋁、銨明礬及鉀明礬中的至少一種。在實施中，基于其用于結(jié)合蛋白共同發(fā)揮效果的目的，一般根據(jù)用于蛋白質(zhì)作為的溶劑和保護的PBS緩沖系，鋁佐劑優(yōu)選采用磷酸鋁進行，可以盡量地避免額外引入其他的元素或者離子、基團等對培養(yǎng)過程中的培養(yǎng)液元素比例和成分造成破壞。進一步在使用中，根據(jù)鋁佐劑吸附能力，DC誘導(dǎo)活化劑中小細胞肺癌特異性EGFR和鋁佐劑的質(zhì)量比控制在2:1?8:1。
[0020]在本發(fā)明提出的上述DC誘導(dǎo)活化劑的基礎(chǔ)上，本發(fā)明進一步還提出一種DC體外培養(yǎng)的方法，包括如下步驟:
[0021]S10，從單個核細胞中獲取DC ;
[0022]S20，將獲取的DC進行體外培養(yǎng)；
[0023]S30，在體外培養(yǎng)的過程中用上述DC誘導(dǎo)活化劑對DC進行活化誘導(dǎo)。
[0024]其中，步驟S10中制備獲取DC，在本發(fā)明實施中優(yōu)選建議采用從新鮮血液中獲取，相比經(jīng)過冷庫儲存或者培養(yǎng)傳代之后的DC，從新鮮血液中制備的DC離體時間不長，其細胞活性和狀態(tài)的減弱或者形態(tài)改變程度都較少，更加利于保持其免疫性能。具體制備的過程可以按照通常DC制備試劑盒說明書進行制備獲取，而在本發(fā)明中為了更適于本發(fā)明的誘導(dǎo)的效果和細胞活性，可以參考如下過程進行:
[0025]S11，獲取新鮮血液(為了防止血液凝固，可以先用抗凝劑進行抗凝處理)；
[0026]S12，將血液300g離心分離后棄去血漿，取細胞沉淀物備用；
[0027]S13，用淋巴細胞分離液分離提取細胞沉淀物中的單個核細胞(PBMC)；
[0028]S14，將步驟S13獲取的單個核細胞用基礎(chǔ)培養(yǎng)