于300g離心lOmin后，上層的血漿單獨(dú)取出用于制備低血小板血漿(用于制備后續(xù)的免疫細(xì)胞培養(yǎng)液)；
[0060]離心之后的下層含血細(xì)胞的沉淀物，用注射用生理鹽水重懸至每管30ml懸濁混合液；
[0061]S13，再取4支含15ml淋巴細(xì)胞分離液的50ml離心管，緩慢的將步驟S12的懸濁混合液用移液器轉(zhuǎn)移到淋巴細(xì)胞分離液的上層；400g離心20分鐘后將中間白膜層吸入到新的50ml離心管中，所得的白膜層即為單個核細(xì)胞；
[0062]同時，重復(fù)3?4次用注射用生理鹽水補(bǔ)液到45ml后，300g離心5分鐘，對單個核細(xì)胞進(jìn)行清洗，清洗完之后離心搜集單個核細(xì)胞的細(xì)胞體；
[0063]S14，將步驟S13獲得的單個核細(xì)胞用20ml基礎(chǔ)培養(yǎng)液重懸，并將懸液加至含30個膠原支架的T75培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)2?3h，之后將不貼壁細(xì)胞倒入另外一個T175培養(yǎng)瓶中，并用基礎(chǔ)培養(yǎng)液補(bǔ)足T175培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)液到50ml，并加入0.5ml PPP和50ul IFN- γ (終濃度為1000IU/ml)培養(yǎng)；這里需要說明的是T175培養(yǎng)瓶中進(jìn)行選擇性培養(yǎng)之后得到從不貼壁的單個核細(xì)胞中的CIK ;
[0064]S15，將不貼壁細(xì)胞去除后，向T75培養(yǎng)瓶中加入20ml免疫細(xì)胞培養(yǎng)液A進(jìn)行選擇培養(yǎng)，即可獲得貼壁的單個核細(xì)胞中的DC ;
[0065]其中，免疫細(xì)胞培養(yǎng)液A:含1 % PPP、終濃度為50ng/ml的GM-CSF、終濃度為500IU/ml的IL-4的基礎(chǔ)培養(yǎng)液。
[0066](3)分別培養(yǎng)DC和CIK
[0067]S21，將步驟S14中培養(yǎng)CIK的T175培養(yǎng)瓶培養(yǎng)2d，向T175培養(yǎng)瓶中加入20mL免疫細(xì)胞培養(yǎng)液B ;其中，免疫細(xì)胞培養(yǎng)液B:含終濃度為100IU/ml的IL-1 α、終濃度為50ng/ml的抗⑶3單抗、終濃度為300IU/ml的IL-2的基礎(chǔ)培養(yǎng)液。
[0068]S22，將步驟S15中培養(yǎng)DC的T75培養(yǎng)瓶培養(yǎng)時間至4d，用免疫細(xì)胞培養(yǎng)液A進(jìn)行半量換液；
[0069]在同時在T175培養(yǎng)瓶的CIK培養(yǎng)至4d時，向T175培養(yǎng)瓶中補(bǔ)加擴(kuò)增培養(yǎng)液B到100ml ；
[0070]S31，制備誘導(dǎo)活化劑:將 lmL 的 50ug/mL EGFR(美國 Life Technologies 公司)和lmL的招鹽佐劑(終濃度為0.125%，為質(zhì)量體積比，丹麥Brenntag B1sector公司)混合，于4°C進(jìn)行預(yù)吸附；
[0071]S32，誘導(dǎo):當(dāng)T75培養(yǎng)瓶的DC培養(yǎng)至第6d時，向T75培養(yǎng)瓶中加入預(yù)先進(jìn)行吸附的DC誘導(dǎo)活化劑，進(jìn)行誘導(dǎo)；
[0072]同時，將T175培養(yǎng)瓶中的CIK轉(zhuǎn)入培養(yǎng)袋中培養(yǎng)，補(bǔ)加擴(kuò)增培養(yǎng)液到300ml ;此步驟中采用的擴(kuò)增培養(yǎng)液為含1% PPP、終濃度為300IU/ml的IL-2的基礎(chǔ)培養(yǎng)液；
[0073]S40，在步驟S32進(jìn)行約誘導(dǎo)Id之后，向T75培養(yǎng)瓶中，加入20ul TNF_a(腫瘤壞死因子，終濃度為20ng/ml)，最終促進(jìn)DC成熟和穩(wěn)定。
[0074](4) DC-CIK 共培養(yǎng):
[0075]S50，在步驟S40加入TNF_ α —天以后，用細(xì)胞刮刀刮下T75培養(yǎng)瓶中的DC，加入到CIK培養(yǎng)中進(jìn)行共培養(yǎng)，并補(bǔ)加擴(kuò)增培養(yǎng)液到600ml ;再過2d之后搜集細(xì)胞。
[0076](4)為了驗(yàn)證本發(fā)明方法的進(jìn)步性，需要對其所獲得的細(xì)胞的能效進(jìn)行鑒定，已驗(yàn)證類型是否準(zhǔn)確真實(shí)，以及能效是否確實(shí)有提升，而由于DC細(xì)胞的培養(yǎng)方法的有益效果是DC吞噬提呈抗原的能力增強(qiáng)，該效果沒有直接的檢測指標(biāo)，只能間接通過共培養(yǎng)后CIK的增殖能力和表型分析的結(jié)果來反映該效果，具體:
[0077]1、用臺盼藍(lán)染色法計數(shù)CIK，計算其增殖倍數(shù)。
[0078]2、取誘導(dǎo)14天的CIK細(xì)胞，經(jīng)PBS洗滌2遍后，各取1Χ 106/100 μ1置于falcon管中，分別加入20 μ 1鼠抗人熒光素標(biāo)記的⑶3、⑶16、⑶56、⑶3/⑶56及同型對照IgGl/IgGl，4°C避光孵育30min，PBS洗滌2遍后流式細(xì)胞儀上機(jī)分析。
[0079]其中，上述每項的檢測重復(fù)3個對照，最終取結(jié)果平均值；CIK增殖倍數(shù)的平均結(jié)果為4?5x10s，相比通常的CIK的2?3xl07的增殖能力有顯著的提升，且表型檢測的最終確定類型確實(shí)為CIK。
[0080]3、在上述共培養(yǎng)獲得的CIK體外性能測試之后，進(jìn)一步進(jìn)行最終的腫瘤殺傷能力測驗(yàn):
[0081]將本發(fā)明的細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組、與靶細(xì)胞組和效應(yīng)細(xì)胞組共同組成三個對照組，取96孔培養(yǎng)板，每孔內(nèi)實(shí)驗(yàn)組加入效應(yīng)細(xì)胞(CIK)和靶細(xì)胞(K562細(xì)胞)各100 μ L，效靶比為25:1，效應(yīng)細(xì)胞為1.25Χ 105個，靶細(xì)胞為5000個；靶細(xì)胞組加入靶細(xì)胞和培養(yǎng)液各100 μ L ;效應(yīng)細(xì)胞組加入效應(yīng)細(xì)胞和培養(yǎng)液各100 μ L，各組設(shè)置3個平行復(fù)孔。置37°C培養(yǎng)箱孵育4h，加入MTT 20 μ L，再孵育4h，離心后棄上清，每孔加入二甲基亞砜(DMS0) 150 μ L，充分溶解后于酶聯(lián)免疫檢測儀(波長為570nm)檢測每孔吸光度值A(chǔ)，用以下公式計算殺傷率=[1-(A實(shí)驗(yàn)孔-A效應(yīng)孔)/A靶細(xì)胞孔]X 100% ;
[0082]本發(fā)明實(shí)驗(yàn)組最終計算后的殺傷率為78.6% (重復(fù)3次的平均數(shù))，相比通常DC-CIK細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)3周后，按照效靶比為15:1?20:1時檢測的殺傷率55?65%提升了 10%多，因此可以說明本發(fā)明制備的DC和CIK更好的細(xì)胞活性和腫瘤殺傷效力。
[0083]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包括在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1.一種DC誘導(dǎo)活化劑，其特征在于，包括小細(xì)胞肺癌特異性EGFR和鋁佐劑。2.如權(quán)利要求1所述的DC誘導(dǎo)活化劑，其特征在于，所述小細(xì)胞肺癌特異性EGFR和鋁佐劑的質(zhì)量比為2:1?8:1。3.如權(quán)利要求1或2所述的DC誘導(dǎo)活化劑，其特征在于，所述鋁佐劑為氫氧化鋁、氫氧化鋁凝膠、磷酸鋁、硫酸鋁、銨明礬及鉀明礬中的至少一種。4.一種DC體外培養(yǎng)方法，其特征在于，包括如下步驟: 獲取DC，對所述DC進(jìn)行體外培養(yǎng)； 在所述體外培養(yǎng)的過程中，用DC誘導(dǎo)活化劑對所述DC進(jìn)行誘導(dǎo)處理；其中，所述DC誘導(dǎo)活化劑為權(quán)利要求1?3任一項所述的DC誘導(dǎo)活化劑。5.如權(quán)利要求4所述的DC體外培養(yǎng)方法，其特征在于，對所述DC進(jìn)行誘導(dǎo)處理之后還包括，用TNF- α對所述DC進(jìn)行刺激處理。6.如權(quán)利要求4或5所述的DC體外培養(yǎng)方法，其特征在于，對所述DC進(jìn)行體外培養(yǎng)的過程中，采用的培養(yǎng)液為含有60?100IU/ml硫酸慶大霉素、0.5?1.5% PPP、40?60ng/ml 的 GM-CSF、450 ?550IU/ml 的 IL-4 的 DMEM。7.—種根據(jù)權(quán)利要求4?6任一項所述的DC體外培養(yǎng)方法制備的DC。8.—種CIK，其特征在于，該CIK為采用權(quán)利要求7所述的DC進(jìn)行DC-CIK共培養(yǎng)制備獲得。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種DC誘導(dǎo)活化劑，包括小細(xì)胞肺癌特異性EGFR和鋁佐劑。本發(fā)明的上述DC誘導(dǎo)劑利用EGFR本身具有很多腫瘤細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)簇，在DC進(jìn)行培養(yǎng)的過程中作為模擬抗原對DC進(jìn)行刺激和誘導(dǎo)，使其細(xì)胞活性能維持在較高的狀態(tài)；同時搭配鋁佐劑形成EGFR緩釋，以及保護(hù)EGFR降解、衰減，還與DC質(zhì)膜相互作用，最終能強(qiáng)化DC對抗原的處理和提呈能力。本發(fā)明還提出采用上述DC誘導(dǎo)活化劑進(jìn)行DC體外培養(yǎng)的方法、由該方法獲得的DC，以及將該DC應(yīng)用于DC-CIK聯(lián)合免疫，進(jìn)行DC-CIK共培養(yǎng)制備的CIK。相比現(xiàn)有的通常培養(yǎng)的方式制備的DC和CIK，DC活性和增值能力高，DC經(jīng)過EGFR的誘導(dǎo)，能提呈更多的抗原信息，使得最終制備得到的CIK具有更高的活性和腫瘤特異性殺傷能力。
【IPC分類】C12N5/0784, C12N5/0783
【公開號】CN105385658
【申請?zhí)枴緾N201510894798
【發(fā)明人】曾憲卓, 魯菲
【申請人】深圳愛生再生醫(yī)學(xué)科技有限公司
【公開日】2016年3月9日
【申請日】2015年12月8日