H9亞型禽流感重組鴨腸炎病毒rDEVΔUL2-H9株的構(gòu)建及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及H9亞型禽流感重組鴨腸炎病毒rDEV Δ UL2-H9株的構(gòu)建及其應(yīng)用，屬 于病毒學(xué)和獸用生物制品領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 鴨腸炎病毒（Duck enteritis virus, DEV)，又名鴨痕病毒（Duck Plague virus)， 可感染鴨、鵝及其它雁形目禽類，引起血管損傷、組織出血、消化道粘膜損傷、淋巴器官受 損和實(shí)質(zhì)性器官退行性病變的一種急性、接觸性、敗血性傳染病--鴨病毒性腸炎（Duck viral enteritis, DVE)，或稱鴨痕（Duck plague, DP) (Sandhu and Metwally, 2008)。自 1923年被首次發(fā)現(xiàn)以來(lái)（Baudet，1923)，本病相繼發(fā)生于法國(guó)、印度、比利時(shí)、英國(guó)、泰國(guó)和 加拿大等國(guó)家（殷震和劉景華，1997)，流行范圍、感染禽類的種類有逐步擴(kuò)大的趨勢(shì)，至少 48種雁形目中的禽類對(duì)DEV易感（Kaleta et al.，2007)。鴨瘟是一種廣泛嗜全身性感染 的傳染病，發(fā)病率和死亡率都很高，給水禽養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大損失。免疫接種是預(yù)防和控制該 病暴發(fā)的重要措施，目前我國(guó)用于鴨瘟預(yù)防的疫苗主要是上世紀(jì)60年代研究成功的雞胚 弱化活疫苗。DEV具有良好的免疫原性，免疫力產(chǎn)生快速，免疫后3天便可抵抗鴨瘟強(qiáng)毒攻 擊；免疫期長(zhǎng)，可達(dá)一年。
[0003] DEV屬于痕疼病毒科、甲型痕疼病毒亞科、馬立克病毒屬、鴨痕疼病毒1型 (http://www. ictvonline. org)。李玉峰應(yīng)用Shot-gun方法首次完成了 DEV--我國(guó)鴨 瘟商品化疫苗（DEV VAC)的全基因組測(cè)序。DEV VAC基因組全長(zhǎng)為158, 089bp，G+C含量 為44. 91%，由長(zhǎng)獨(dú)特區(qū)（Unique Long, UL)和短獨(dú)特區(qū)（Unique Short, US)組成，US區(qū)兩 端為一對(duì)反向重復(fù)序列，分別稱為內(nèi)部重復(fù)序列（Internal R印eat, IR)和末端重復(fù)序列 (Terminal R印eat, TR)?；蚪M結(jié)構(gòu)為UL-IR-US-TR，呈典型的D型皰疹病毒基因組結(jié)構(gòu) (Li et al.，2009)。我們完成了我國(guó)鴨腸炎病毒強(qiáng)毒參考株全基因組序列測(cè)定，該毒株基 因組全長(zhǎng)為162，131bp，共78個(gè)0RF，編碼76個(gè)蛋白（Yang et al.,2014)。與DEV CSC相 比，雞胚連續(xù)傳代致弱株DEV K p63基因組短4040bp，在UL區(qū)的5'端連續(xù)缺失3, 513bp導(dǎo) 致UL56移框突變，以及3'端連續(xù)缺失528bp導(dǎo)致UL2缺失176個(gè)氨基酸。DEV CSC UL2編 碼了一個(gè) HSV-1 同源物--尿啼啶 DNA 糖基化酶（uracil DNA glycosylase，UNG)。UNG 是 一個(gè)普遍存在的極保守的DNA修復(fù)酶。與DEVCSC相比，DEV K p63UL2在65位氨基酸后缺失 176aa，導(dǎo)致缺少前3個(gè)結(jié)構(gòu)基序而不能形成HSV-1UL2相似的3D結(jié)構(gòu)（Savva et al.，1995) 和活性中心（Arnold et al.，2006 ;Bordoli et al.，2009 ;Guex and Peitsch, 1997 ;Guex et al.，2009;Schwede et al.,2003)。研究表明，UL2對(duì)HSV-I在細(xì)胞培養(yǎng)中的正常復(fù)制 是非必需的，但對(duì)病毒在神經(jīng)元中的復(fù)制具有重要作用。通過(guò)同源重組的方法，構(gòu)建了缺失 UL2的HSV-I突變體，小鼠顱內(nèi)直接接種后，其神經(jīng)毒力比親本毒低10倍，而外周途徑接種 后神經(jīng)毒力低100, 〇〇〇倍（Pyles and Thompson, 1994)。DEV UL2基因是否具有HSV-I相 似的功能，有待進(jìn)一步研究。
[0004] 自1994年在我國(guó)廣東某雞場(chǎng)分離到H9N2亞型禽流感病毒以來(lái)，該亞型病毒在我 國(guó)的雞、鴨、鵝等禽類中廣泛流行，一直呈上升趨勢(shì)，對(duì)鴨致病性逐漸增強(qiáng)，可引起蛋鴨產(chǎn)蛋 量下降，沙殼蛋增多，使雛鴨出現(xiàn)呼吸道癥狀和亞臨床癥狀，此外，還可引起免疫抑制，造成 鴨群繼發(fā)大腸桿菌等疾病，對(duì)養(yǎng)鴨也造成重大經(jīng)濟(jì)損失。
[0005] 隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，重組病毒活載體疫苗成為當(dāng)前新型疫苗研究的熱點(diǎn)。 利用基因工程技術(shù)，將外源DNA插入到病毒基因重組，利用病毒表達(dá)外源DNA蛋白，制備成 一種活載體疫苗。這種疫苗可以同時(shí)啟動(dòng)機(jī)體細(xì)胞和體液免疫，可以通過(guò)一次免疫預(yù)防多 種疾病，降低了生產(chǎn)成本，簡(jiǎn)化了免疫程序，還能克服不同病毒弱毒疫苗之間的干擾現(xiàn)象。
[0006] 本發(fā)明通過(guò)同源重組技術(shù)，構(gòu)建了一株缺失UL2基因196-723位核苷酸、帶有GFP 標(biāo)記的重組鴨腸炎病毒rDEV Δ UL2-GFP株，然后應(yīng)用綠色熒光蛋白負(fù)篩選技術(shù)，獲得了表 達(dá)H9亞型禽流感病毒血凝素（HA)基因的重組鴨腸炎病毒rDEV Δ UL2-H9株。該重組病毒 免疫鴨后，能抵抗DEV強(qiáng)毒株的攻擊，還能誘導(dǎo)較高的H9HI抗體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種表達(dá)H9亞型禽流感病毒血凝素（HA)基因的重組鴨腸 炎病毒，即本發(fā)明先構(gòu)建了一株缺失UL2基因、攜帶綠色熒光蛋白基因（GFP)標(biāo)記的重組鴨 腸炎病毒rDEV △ UL2-GFP株，然后應(yīng)用綠色熒光蛋白負(fù)篩選技術(shù)，獲得了表達(dá)H9亞型禽流 感病毒HA基因的重組鴨腸炎病毒rDEV Δ UL2-H9株。將重組鴨腸炎病毒rDEV Δ UL2-H9株 制備成活疫苗，可預(yù)防鴨瘟和H9亞型禽流感。
[0008] 本發(fā)明的技術(shù)方案
[0009] 1. 一株重組鴨腸炎病毒，其特征在于該毒株為鴨腸炎病毒（Duck enteritis virus，DEV)rDEVAUL2-H9株，該病毒株已于2015年11月11日送交北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西 路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保 藏，保藏編號(hào)為=CGMCC No. 11497
[0010] 2.如權(quán)利要求1所述一株重組鴨腸炎病毒，其特征在于該鴨腸炎病毒 rDEV Δ UL2-H9株的UL2基因內(nèi)插入了 H9亞型禽流感病毒血凝素（HA)基因。
[0011] 3.如權(quán)利要求1所述一株重組鴨腸炎病毒的應(yīng)用，其特征在于該毒株作為疫苗生 產(chǎn)毒株用于制備H9亞型禽流感-鴨腸炎病毒二聯(lián)活疫苗，預(yù)防H9亞型禽流感和鴨瘟。
[0012] 4.如權(quán)利要求3所述一株重組鴨腸炎病毒的應(yīng)用，其特征在于是將該株病毒接種 長(zhǎng)滿單層的無(wú)特定病原雞的雞胚成纖維細(xì)胞，收獲病毒培養(yǎng)物，加適宜穩(wěn)定劑，經(jīng)冷凍真空 干燥制成所述H9亞型禽流感-鴨腸炎病毒二聯(lián)活疫苗。
[0013] 5.如權(quán)利要求1所述一株重組鴨腸炎病毒的應(yīng)用，其特征在于該株病毒缺失了 UL2基因196-723位核苷酸，可在此區(qū)域插入H5亞型禽流感病毒或/和鴨肝炎病毒或/和 鴨黃病毒保護(hù)基因并獲得穩(wěn)定、高效表達(dá)，制備成鴨腸炎病毒為載體的聯(lián)合活疫苗。
【具體實(shí)施方式】
[0014] 1.重組病毒構(gòu)建
[0015] 本發(fā)明所述的重組病毒為表達(dá)H9亞型禽流感病毒HA基因的鴨腸炎病毒 rDEV Δ UL2-H9株，該病毒構(gòu)建方法如下：
[0016] ⑴載體
[0017] PMD-18T載體，用于克隆測(cè)序及轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建，購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公 司。含有CMV啟動(dòng)子、polyA的GFP報(bào)告基因載體pT-GFP-gpt (見(jiàn)圖1)，由本發(fā)明人所在實(shí) 驗(yàn)室構(gòu)建、保存。
[0018] ⑵引物設(shè)計(jì)
[0019] 根據(jù)GenBank上發(fā)表的DEV序列設(shè)計(jì)合成以下引物：
[0020] 表1本發(fā)明構(gòu)建所涉及的相關(guān)引物信息
[0023] (3)含GFP標(biāo)記的鴨腸炎病毒rDEV Δ UL2-GFP的構(gòu)建
[0024] 1)轉(zhuǎn)移載體 pT-UL2-GFP-gpt 的構(gòu)建
[0025] 以鴨腸炎病毒基因組DNA(AV1221)為PCR擴(kuò)增模板，以引物UL2-uF、UL2-UR擴(kuò)增 UL2基因的左端1185bp片段。以引物UL2-d、UL2-dR擴(kuò)增UL2基因的右端1302bp片段。擴(kuò) 增目的片段分別連接PMD-18T載體，構(gòu)建相應(yīng)的重組質(zhì)粒pT-UL2u和pT-UL2d。用Sail和 HindIII雙酶切上述重組質(zhì)粒，分別回收3800bp和1302bp片段，獲得重組質(zhì)粒pT-UL2ud。 將重組質(zhì)粒pT-UL2ud用Sail酶切，電泳回收后去磷酸化；pT-GFP-gpt用Sail酶切，電泳 回收2. Ikb片段，將GFP-gpt表達(dá)盒插入到pT-UL2ud中，獲得轉(zhuǎn)移載體pT-UL2-GFP-gpt。
[0026] 2)同源重組
[0027] 按照Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑盒（Invitrogen公司）說(shuō)明書(shū)，將轉(zhuǎn)移載體 pT-UL2-GFP-gpt與DEV進(jìn)行轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細(xì)胞（CEF)。具體步驟如下：
[0028] 六孔板中的CEF培養(yǎng)至長(zhǎng)成70%~90%細(xì)胞單層時(shí)，接種適量的DEV，吸附1~ 4小時(shí)；將1 μ g轉(zhuǎn)移載體稀釋于不含血清和抗生素的opti-DMEM中，使混合液的終體積 均為50 yL，室溫孵育5min;取2 yL Lipofectamine 2000與48 yL不含血清和抗生素的 opti-DMEM輕輕混勻，室溫孵育5min ;將50 μ L Lipofectamine 2000稀釋液分別滴加到 50yL質(zhì)粒稀釋液中，邊加邊混勻；室溫孵育20min。在此期間，將六孔板中的細(xì)胞用無(wú)血 清OPTI-MEM輕輕洗兩遍后，每孔加入0. 5mL無(wú)血清0ΡΤΙ-ΜΕΜ，將100 μ L Lipofectamine 2000/DNA復(fù)合物逐滴加入到6孔板中，輕輕搖動(dòng)使其均勻混合，置37°C培養(yǎng)4h，棄去上清， 加入10%胎牛血清的[99培養(yǎng)基，置37°(：培養(yǎng)2411后，用1%胎牛血清的[99培養(yǎng)基換 液，置37°C培養(yǎng)3~5d，每天觀察，直至出現(xiàn)重組病毒熒光斑。
[0029] 3)重組病毒的蝕斑純化
[0030] 將初步獲得的重組病毒接種已長(zhǎng)成良好細(xì)胞單層的6孔板CEF細(xì)胞，吸附1小時(shí) 后，棄去吸附液，鋪上1 %的低熔點(diǎn)瓊脂糖，繼續(xù)培養(yǎng)。接種48小時(shí)后在熒光顯微鏡下觀察 綠色熒光，挑選單個(gè)熒光蝕斑于0. 5ml M199營(yíng)養(yǎng)液中，凍融1次后接種6孔板CEF細(xì)胞，如 此進(jìn)行蝕斑純化3~4次，將獲得的重組病毒命名為rDEV Δ UL2-GFP。
[0031] 4)重組病毒rDEV Δ UL2-GFP的鑒定
[0032] 采用ORF C17F、0RF C17R引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，PCR產(chǎn)物測(cè)序證實(shí)，重組病毒缺 失了 UL2基因，并成功插入了 GFP標(biāo)記基因（見(jiàn)圖2)。
[0033] 5)重組病毒rDEV Δ UL2-GFP的應(yīng)用
[0034] 該株病毒缺失了 UL2基因196-723位核苷酸，可在此區(qū)域插入H5亞型禽流感病 毒、鴨肝炎病毒等的保護(hù)基因并獲得穩(wěn)定、高效表達(dá)，制備成鴨腸炎病毒為載體的聯(lián)合活疫 苗。
[0035] (4) H9亞型禽流感病毒HA基因的重組鴨腸炎病毒（rDEV Δ UL2-H9)的構(gòu)建
[0036] 重組病毒rDEV Δ UL2-GFP缺失了 UL2基因196-723位核苷酸，可在此區(qū)域插入H5 亞型禽流感病毒HA基因（序列9)獲得重組病毒。
[0037] 1)轉(zhuǎn)移載體PT-UL2-H9的構(gòu)建
[0038] 根據(jù)GenBank公布的鴨源H9亞型禽流感病毒HA基因序列（序列10)，人工合成HA 基因，以H9NheI-F和H9BHI-R引物RT-PCR擴(kuò)增HA基因。將目的片段連接pMD-18T載體，構(gòu) 建重組質(zhì)粒PT-H9NBH。分別用NheI和BamHI雙酶切重組質(zhì)粒pT-UL2-GFP-gpt和pT-H9NBH， 分別回收6. Okb片段和I. 6kb片段，并將兩片段連接，獲得重組轉(zhuǎn)移載體pT-UL2-H9。
[0039] 2)同源重組
[0040] 按照Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)，將轉(zhuǎn)移載體pT-UL2-H9與 rDEV AUL2-GFP病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細(xì)胞（CEF)。具體步驟如下：
[0041] 六孔板中的CEF培養(yǎng)至長(zhǎng)成70 %~90 %細(xì)胞單層時(shí)，接