專利名稱：IgG1型抗人β₂糖蛋白I單克隆抗體及其制備和應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于抗體制備技術(shù)范疇，用于相關(guān)自身免疫性疾病的研究領(lǐng)域，具體涉及抗人糖蛋白I ( β 2GPI)單克隆抗體的制備、鑒定及應用。背景說明抗磷脂綜合征(APS)是以病人體內(nèi)出現(xiàn)高滴度抗磷脂抗體(APL)為主要特征的一種非器官特異性自身免疫性疾病，可單獨發(fā)病，也可與其他自身免疫病伴發(fā)，尤其是SLE。它的主要臨床特點是反復動、靜脈血栓形成，多器官缺血及習慣性流產(chǎn)。APL是一組直接針對負電荷磷脂和蛋白輔助因子的非均一性的循環(huán)性自身抗體，主要包括狼瘡抗凝物(LA)、抗心磷脂抗體(aCL)、抗磷脂酰絲氨酸抗體和抗磷脂酰乙醇胺抗體。研究發(fā)現(xiàn)，APL主要識別磷脂結(jié)合蛋白，而不是磷脂本身，其中，最重要的磷脂結(jié)合蛋白是β2糖蛋白I ( ^2GPI),其 與相應抗體(抗P2GPI)形成復合物，在APS病理過程中發(fā)揮重要作用。2005年悉尼舉行的國際血栓止血學會(ISTH)會議首次增補抗β 2GPI抗體陽性作為APS實驗室診斷指標之
O抗i32GPI/i32GPI復合物可通過激活血管內(nèi)皮細胞，使其分泌并釋放細胞粘附分子、炎性因子、TF等，并可刺激血液單核細胞表達TF。TF為貫穿于細胞膜的單鏈糖蛋白，是凝血因子YD /Vila的受體，TF/VIIa以復合物的形式激活凝血因子IX、X，從而引發(fā)血液凝固。因此,抗P2GPI/P2GPI復合物誘導細胞表達TF是APS血栓形成的重要機理，但具體的作用機制還亟待探討。本實驗室主要從事P2GPI及其抗體刺激單核細胞的胞內(nèi)信號傳導機制的研究，進而闡明抗P2GPI/P2GPI在APS血栓形成機制中的關(guān)鍵作用。在研究中需要使用大量P2GPI及抗P2GPI,但是目前國內(nèi)市場上還沒有抗P2GPI銷售，國外此抗體銷售價格過高，且購買周期長，制約研究工作的順利開展。因此，制備抗P2GPI單克隆抗體將大大節(jié)約研究的時間成本和經(jīng)濟成本，為這一領(lǐng)域的研究工作順利進行奠定良好基礎(chǔ)，具有重要的應用意義。國內(nèi)外不同文獻報道的正常人血漿中^2GPI的水平稍有差別有200±35m g/L、15(T300m g/L、5(Tl50mgL等，文獻報道結(jié)果不一有很大的原因在于所用檢測方法不同，有的是用ELISA檢測，還有的用放射免疫法、免疫電泳等。要想得到統(tǒng)一的結(jié)果那么首先得統(tǒng)一檢測方法。目前國內(nèi)還沒有檢測P2GPI的試劑盒，因此本發(fā)明中抗P2GPI單克隆抗體的制備為P2GPI試劑盒的制備奠定了一定基礎(chǔ)，以便為國內(nèi)提供了一個統(tǒng)一檢測P2GPI的方法。新近有文獻報道，APS患者體內(nèi)總的P2GPI的水平明顯高于健康及其他自身免疫性疾病對照者，且與健康對照組相比，APS患者體內(nèi)P2GPI含量升高，其血栓形成的風險也相應增加，說明P2GPI的水平與血栓形成的風險有很大的相關(guān)性。據(jù)還有些文獻報道，P2GPI與許多疾病存在一定的關(guān)系，不同疾病P2GPI可表現(xiàn)出不同變化，如在肝硬化患者和彌漫性血管內(nèi)凝血患者體內(nèi)^2GPI降低，有家族聚集傾向的腦卒中患者i32GPI血清水平的增高，但具體機制不詳。綜上，本發(fā)明所述試劑盒不僅可用于APS患者血栓形成風險的預測而且可以用于中國人群P2GPI水平的普查以及方便研究其與其它疾病之間的關(guān)系。本實驗室從人血漿中純化出P2GPI并制備了抗P2GPI多克隆抗體(黃宏亮，周紅，俞穎，等.兔抗人β2糖蛋白I多克隆抗體的制備與鑒定[J].臨床檢驗雜志.2009，27(3) :192-194.)，且近年來一直在進行APS致病機制的探討工作。鑒于單克隆抗體(MAbs)具有特異性強，靈敏度高和易標準化等優(yōu)點，本發(fā)明制備了鼠抗人β 2GPI單克隆抗體并分析其特性，為深入的機制研究奠定了基礎(chǔ)。鑒于本實驗室已有的抗P2GPI的單抗和多抗，本發(fā)明提供了一種人血漿β 2GPI雙抗體夾心ELISA檢測方法及試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容
^2GPI是分子量約45 50KD的糖蛋白，其結(jié)構(gòu)由5個補體調(diào)控蛋白樣結(jié)構(gòu)區(qū)(I V)組成，肝臟是主要合成部位?？筆2GPI/i32GPI復合物在APS病理機制中的作用受到極大關(guān)注。鑒于MAbs具有特異性強，靈敏度高和易標準化等優(yōu)點，本發(fā)明的目的在于提供抗^2GPI單克隆抗體，及其在制備檢測i32GPI的雙抗夾心ELISA測定試劑盒中的應用。本發(fā)明所述的IgGl型抗人P2GPI單克隆抗體，是由雜交瘤細胞系A(chǔ)B2-F6分泌，所述雜交瘤細胞系A(chǔ)B2-F6的保藏號為CCTCCNO :C201132。
上述IgGl型抗人β 2GPI單克隆抗體的制備方法是以純化的人血漿β 2GPI免疫BALB/c小鼠，采用PEG融合技術(shù)，間接ELISA法和有限稀釋法，制備和篩選雜交瘤細胞。雜交瘤細胞繼續(xù)擴大培養(yǎng)后注射入BALB/c小鼠制備腹水，經(jīng)硫酸銨沉淀及Protein G純化MAbs0秋水仙素阻抑法鑒定雜交瘤細胞株染色體數(shù)目，ELISA測定滴度，Ig亞類試劑盒鑒定Ig亞類，Western blot鑒定特異性。本發(fā)明用純化的人血衆(zhòng)β 2gpi免疫后的小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞融合后產(chǎn)生的雜交瘤AB2-F6，分泌的單克隆抗體為IgGl/Kappa型，其可與本室制備的P2GPI反應，并與標準抗P2GPI單克隆抗體具有可比性，本發(fā)明具有較強的特異性。本發(fā)明還公開了所述IgGl型抗人β2糖蛋白I的單克隆抗體在制備人血漿@2糖蛋白I的雙抗體夾心ELISA測定試劑盒中的應用。一種人血漿β 2糖蛋白I的雙抗體夾心ELISA測定試劑盒，由抗β 2GPI多克隆抗體包被的ELISA板、10%胎牛血清封閉液、抗β 2GPI單克隆抗體、HRP-羊抗鼠IgG、顯色液和終止液組成。其中顯色液包括A液=H2O2 ；B液四甲基聯(lián)苯胺(TMB)。上述檢測β 2GPI的雙抗夾心ELISA測定試劑盒的制備方法是通過對棋盤滴定確定β 2GPI單/多克隆抗體和HRP-羊抗鼠IgG最佳工作濃度、最佳封閉液及封閉時間的確定、最佳抗體溫育時間和最佳待檢P2GPI濃度的確定，最終建立了 P2GPI的檢測方法和試劑盒。本發(fā)明所述檢測β 2GPI的雙抗夾心ELISA測定方法。其步驟包括(I)用包被液CBS將本實驗室制備的兔抗人β 2GPI的多克隆抗體稀釋到工作濃度(O. OSyg/μ I)加入ELISA板孔內(nèi)，每孔100 μ I,置于4°C冰箱過夜；(2)棄去孔內(nèi)液體，用洗滌液PBST沖洗酶標板5次，每次5min,用吸水紙拍干；(3)在各ELISA板孔的孔中加入封閉液10%的胎牛血清250 μ 1，37°C作用2h，按步驟(2)的方法洗滌；(4)用PBS稀釋液將稀釋后的標準品和待測血漿標本加入包被有多克隆抗體的ELISA板孔中，每孔50 μ 1，37°C作用lh，按步驟(2)的方法洗滌；(5)用PBS稀釋液將抗人P2GPI的單克隆抗體稀釋到工作濃度(O. 06 μ g/孔)，每孔加入50 μ I, 37°C作用lh,重復步驟(2)的方法洗滌；(6)用洗滌液將HRP-羊抗鼠IgG按工作濃度稀釋(按體積比1:10000)，每孔加入50μ 1，37°C作用lh，重復步驟(2)的方法洗滌；(7)在酶標板孔的每孔中加入A、B顯色液各50 μ 1，37°C避光顯色15min;(8)在酶標板孔的每孔中加入50 μ I終止液終止反應；(9)在酶標儀上于主波長450nm，參考波長630nm處進行雙波長比色，測定步驟(8)中的吸光度值(0D值)；(10)繪制標準曲線，計算待檢樣品中P2GPI的含量。其中步驟(I)所述的ELISA板購自Costar公司的96孔單孔可拆式酶標板； 步驟(I)所述的包被液CBS (O. 05M)配制如下碳酸鈉I. 59g，碳酸氫鈉2. 93g，用蒸餾水定容至1000ml，用HCL/NaOH調(diào)pH至9. 6 ;步驟(2)所述洗滌緩沖液PBST (O. 15M)的配制如下氯化鈉8. 0g，氯化鉀O. 2g，磷酸氫二鈉O. 2g，磷酸二氫鉀2. 9g，吐溫200. 5ml，用蒸餾水定容至1000ml，調(diào)pH至7. 4 ;步驟(3)所述封閉液配制如下洗滌液100ml，胎牛血清10ml，胎牛血清購自GIBCO公司；步驟(4)、(5)所述的抗原、抗體稀釋液PBS (O. 01M)的配制如下磷酸二氫鈉O. 39g，磷酸氫二鈉I. 27g，氯化鈉O. 85g，蒸餾水定容至1000ml，調(diào)pH至7. 2 ;步驟(6)中所述HRP-羊抗鼠IgG購自博士德生物工程有限公司；步驟(7)所述顯色液A、B，以及步驟(8)中所述終止液均來自江蘇大學附屬醫(yī)院檢驗科。


圖I為純化抗β 2GPI單克隆抗體的12%SDS_PAGE分析；圖2為雜交瘤細胞染色體分析；圖3為MAbs的亞類鑒定(試紙條法)；其中1、3、5為測試帶，2、4、6為標準帶，檢測結(jié)果 IgGl/Kappa。圖4為抗β 2GPI單克隆抗體特異性分析(Western blot)。圖5為人血漿β 2糖蛋白I的雙抗體夾心ELISA測定試劑盒的標準曲線。本發(fā)明所述的雜交瘤細胞系A(chǔ)B2-F6，于2011年6月14日送交中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC NO C201132 ;保藏單位地址中國武漢大學。
具體實施例方式下述所使用的P2GPI和抗P2GPI多克隆抗體由發(fā)明人制備，制備方法分別見參考文獻(黃宏亮，周紅，王婷，等.β 2糖蛋白I純化及其穩(wěn)定性分析[J].江蘇大學學報.2008，18(4) :344-347.)和(黃宏亮，周紅，俞穎，等.兔抗人β2糖蛋白I多克隆抗體的制備與鑒定[J].臨床檢驗雜志.2009, 27 (3) : 192-194.)，制備的β 2GPI已鑒定其與標準P2GPI特性相同，制備的抗i32GPI多克隆抗體已經(jīng)免疫雙向擴散試驗(IDD)、EL ISA和western-bloting等方法鑒定,具有特異性。實施例1、抗β 2GPI單克隆抗體的制備
(I)小鼠免疫將P2GPI用生理鹽水稀釋后與等量福氏完全佐劑(Sigma公司)充分乳化后制成免疫原，頸背部皮下多點注射6周齡BALB/c雌性小鼠(50 μ g/只，購自揚州醫(yī)學比較中心)。以后每隔2周用福氏不完全佐劑(Sigma公司)同等劑量P2GPI乳化后進行加強免疫2 3次(50μ g/只，腹腔注射)。末次加強免疫后7天，小鼠斷尾取血，測免疫效價，選擇免疫效價高的小鼠于末次加強免疫20天，用生理鹽水稀釋同等劑量β 2GPI進行尾靜脈加強(12. 5 μ g/只)，沖擊免疫后3 5天內(nèi)眼球采血留樣用ELISA法測定免疫小鼠血清效價；取脾細胞用于融合。(2)細胞融合和雜交瘤細胞的克隆化SP2/0骨髓瘤細胞(購自上海生物細胞學研究所)于融合前幾天擴大培養(yǎng)，挑選對數(shù)生長期的細胞用于融合。小鼠摘眼球取血，留血清作陽性對照，小鼠處死后取脾細胞，將脾細胞與SP2/0細胞以4 :1混合于融合管，離心，去上清，沉淀于37°C水浴中滴加lmL50%PEG1450(Sigma公司)，60s內(nèi)均勻加完，立即于90s內(nèi)滴加30mL無血清RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco公司)終止反應，37°C水浴中靜置lOmin，離心去上 清，融合細胞用HAT培養(yǎng)基(Gibco公司)稀釋后鋪入加有飼養(yǎng)細胞的96孔板(Greiner公司)，置于371，5%0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3天后開始觀察克隆生長情況，第4天用HAT培養(yǎng)基半量換液，7天左右用HT培養(yǎng)基(Gibco公司)完全換出孔中HAT培養(yǎng)基。采用間接ELISA法進行篩選，陽性孔轉(zhuǎn)入24孔培養(yǎng)板擴大培養(yǎng)凍存，同時用有限稀釋法進行3 4次亞克隆，至陽性率達100%擴大培養(yǎng)，建株保存，該雜交瘤細胞系命名為AB2-F6。(3)間接ELISA法檢測抗β 2GPI單克隆抗體時抗原和二抗?jié)舛鹊拇_定β 2GPI用O. 05mol/L pH9. 6的碳酸鹽溶液稀釋后包被酶標板，封閉液為含10%小牛血清(Gibco公司)的O. 02mol/LpH7. 4PBS。以正常鼠血清I :1000作為陰性對照，以β 2GPI免疫鼠的多抗血清I :2000作為陽性對照，用方陣滴定法確定包被抗原和酶標記抗體(羊抗鼠IgG-HRP)的最佳組合。結(jié)果判定樣品吸光度(A)值大于陰性對照A值的2.1倍判為陽性。最佳條件為I μ g/ml β 2GPI包被酶標板，羊抗鼠IgG-HRP工作濃度I 10000。(4)抗β 2GPI單克隆抗體的制備及純化取10 12周齡BALB/c小鼠腹腔注射液體石蠟(O. 5mL/只)，7 10天后腹腔注射雜交瘤細胞AB2-F6 (O. 5 I X IO6/只)，7 14天左右抽取腹水，分裝后貯存于_70°C冰箱。采用硫酸銨沉淀及Protein G純化腹水，以SDS-PAGE鑒定純度。按經(jīng)驗公式蛋白濃度(HigmL)=L 45XA280-O. 74XA26tl計算純化前后的蛋白濃度和收獲率。SDS-PAGE按常規(guī)方法操作，12%分離膠，5%濃縮膠，抗體濃度lmgmL，與等量的還原型加樣緩沖液混合，IOO0C 5min，25 μ L/孔上樣，恒定電流50mA電泳，O. 25%考馬斯亮藍染色，進行蛋白掃描。分析結(jié)果見圖1，泳道為還原條件下電泳結(jié)果，分別為免疫球蛋白重鏈(約50KD)和輕鏈(約25KD)，腹水單抗的純度在90%以上。實施例2、抗β 2GPI單克隆抗體的鑒定(I)單克隆抗體的鑒定用秋水仙素阻抑法獲得較多的分裂中期的雜交瘤細胞(AB2-F6)，再經(jīng)低滲，固定處理后，用10%Giemsa染液染色，鏡下觀察染色體。如圖2顯示，雜交瘤細胞染色體數(shù)目多于SP2/0細胞的51條，在99-108條之間。用間接ELISA法測定細胞培養(yǎng)上清和腹水效價，間接ELISA法結(jié)果顯示雜交瘤細胞培養(yǎng)上清和純化后的腹水單抗對^2GPI的滴度分別為I : 29和I : 215。用單克隆抗體亞類鑒定試劑盒鑒定Ig亞類(按說明書操作)，結(jié)果顯示細胞分泌IgGl/Kappa型抗體(圖3)。用Western blot鑒定抗P2GPI單克隆抗體的特異性用加樣緩沖液將β 2GPI配制成lmg/mL，12%SDS_PAGE電泳分離蛋白，再以350mA恒流轉(zhuǎn)印至PVDF膜；膜置于含有5%脫脂牛奶的TBS/T室溫封閉Ih ;將膜分別與I :1000稀釋的本發(fā)明的P2GPI單抗及標準P2GPI單抗(MAB1066，美國Chemicon公司)反應，次日用TBS/T洗滌3次，15min/次，采用HRP標記的羊抗鼠IgG抗體(I 2000), 37°C孵育lh，TBS/T洗滌3次，15min/次，ECL顯色系統(tǒng)定影顯色，觀察雜交條帶。結(jié)果見圖4 圖A為本發(fā)明的抗P2GPI單克隆抗體反應結(jié)果，結(jié)果顯示本發(fā)明的抗P2GPI單克隆抗體與PVDF膜上約45KD的β 2GPI抗原發(fā)生反應，與67KD處的BSA無明顯反應，說明單抗只識別β 2GPI，特異性好，圖B為購買的標準抗β 2GPI單克隆抗體反應(陽性對照)。(2)雜交瘤細胞株的鑒定復蘇液氮罐中凍存6個月的細胞株AB2-F6，經(jīng)擴大培養(yǎng)后將細胞通過腹腔注射BALB/c小鼠，收集腹水測其對β 2GPI的ELISA滴度，觀察雜交瘤細胞分泌抗P2GPI單克隆抗體的穩(wěn)定性；染色體檢查按常規(guī)方法進行。結(jié)果顯示AB2-F6穩(wěn)定分泌抗P2GPI單克隆抗體，且雜交瘤細胞染色體數(shù)目在99-108條之間。實施例3、人血漿β 2GPI雙抗體夾心ELISA試劑盒的建立(I)選取合適的封閉劑 將實驗分為三組，其中每組又分為不包被只封閉組和包被加封閉組，選取三個常用封閉液用PBST分別配制成5%的脫脂奶粉，2%牛血清白蛋白，10%胎牛血清(FBS)分別封閉以上三組，結(jié)果顯示，前兩個封閉液封閉效果不佳，有較強的非特異性顯色，而10%FBS封閉效果較好，幾乎沒有非特異性顯色。(2)抗人β 2GPI單/多克隆抗體及HRP-羊抗鼠IgG最佳工作濃度的確定利用棋盤滴定確定各組分的最佳工作濃度。由于本方法屬于間接雙抗夾心法，需要確定三個組分的最佳工作濃度，故可分兩次棋盤滴定①第一次滴定，固定包被抗體及酶標二抗的濃度以相對保守量O. 05 μ g/ μ I的抗i32GPI多克隆抗體100 μ I包被ELISA板，4°C包被過夜；次日，用PBST洗滌5次，Imin/次，吸水紙拍干；每孔加入250μ 110%FBS，37°C封閉2h ;同上洗滌后，ELISA板橫向變化抗原^2GPI 的濃度，分別以 1μ g/μ 1、0· 2μ g/μ 1、0· 04 μ g/μ 1,0. 008 μ g/μ I 和 O. 0016 μ g/μ 15個梯度再加一個空白即只加PBS按每孔50 μ I加入微孔中，37°C溫育Ih ;洗滌后，縱向變化單克隆抗體濃度，分另丨J 以 O. 04 μ g/μ 1、0· 02 μ g/ μ 1、0· 01 μ g/ μ 1、0· 005 μ g/μ I、O. 0025 μ g/μ I、0· 0012 μ g/μ I、0· 0006 μ g/μ 17 個梯度再加一個 O 濃度按每孔 50 μ I 力口入微孔，37°C溫育Ih ;洗滌后，每孔加入用PBST稀釋8000倍的HRP-羊抗鼠IgG50 μ 1，37°C溫育O. 5h ;充分洗滌后，每孔加入A、B底物液各5(^1，371反應151^11后，每孔加入5(^1終止液終止反應，酶標儀讀取主波長為450nm,參考波長為630nm處的吸光度值。以信噪比(含分析物所測得的OD值與不含分析物所測得的OD值的比值)最大者所對應的抗原抗體濃度為最佳工作濃度。結(jié)果見表I表I第一次棋盤滴定結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種IgGl型抗人β2糖蛋白I的單克隆抗體，其特征在于所述單克隆抗體由雜交瘤細胞系A(chǔ)B2-F6分泌，所述雜交瘤細胞系A(chǔ)B2-F6的保藏號為CCTCC NO :C201132。
2.一種制備IgGl型抗人β2糖蛋白I單克隆抗體的方法，其特征在于包括以下步驟將雜交瘤細胞AB2-F6擴大培養(yǎng)后注射入BALB/c小鼠制備腹水，腹水經(jīng)硫酸銨沉淀及Protein G純化后得到抗β2糖蛋白I單克隆抗體。
3.權(quán)利要求I所述IgGl型抗人β2糖蛋白I的單克隆抗體在制備人血衆(zhòng)β 2糖蛋白I的雙抗體夾心ELISA測定試劑盒中的應用。
4.一種人血漿β2糖蛋白I的雙抗體夾心ELISA測定試劑盒，其特征在于由抗i32GPI多克隆抗體包被的ELISA板、10%胎牛血清封閉液、權(quán)利要求I所述的抗β 2GPI單克隆抗體、HRP-羊抗鼠IgG、顯色液和終止液組成。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種IgG1型抗人β2糖蛋白I(β2GPI)單克隆抗體的發(fā)明。所述IgG1型抗人β2糖蛋白I的單克隆抗體，是由雜交瘤細胞系A(chǔ)B2-F6分泌。所述的單克隆抗體可與本室制備的β2GPI反應，并與標準抗β2GPI單克隆抗體具有可比性，本發(fā)明具有較強的特異性。所述單克隆抗體用于制備人血漿β2糖蛋白I的雙抗體夾心ELISA測定試劑盒。
文檔編號C12N5/20GK102816238SQ20121025600
公開日2012年12月12日 申請日期2012年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月28日
發(fā)明者周紅, 許國瑩, 胥亞, 嚴金川, 穆原, 王婷, 夏龍飛, 解鴻翔, 劉敬敬, 張曉蕾 申請人:江蘇大學