一種用于糖蛋白富集的納米金摻雜整體材料及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于糖蛋白富集的納米金摻雜整體材料的制備。所述的納米金摻雜整體材料是以甲基丙烯酸縮水甘油酯（GMA）和聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）作為單體，采用原位聚合的方式，得到親水性聚合物整體材料基質(zhì)。然后利用基質(zhì)表面的環(huán)氧基團，采用化學(xué)衍生法，使基質(zhì)表面富含巰基，從而，修飾納米金顆粒；最后在基質(zhì)中納米金表面共修飾巰基苯硼酸和巰基乙胺，基于苯硼酸親和色譜法富集糖蛋白。本發(fā)明的材料借助了單體聚乙二醇二丙烯酸酯的親水性，降低了基質(zhì)材料對蛋白質(zhì)的非特異性吸附，提高了富集選擇性；并且結(jié)合了納米粒子的高比表面積，提高了富集容量，從而實現(xiàn)了糖蛋白的高效、高選擇性富集。
【專利說明】一種用于糖蛋白富集的納米金摻雜整體材料及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及功能化整體材料用于糖蛋白的富集，具體地說是一種納米金摻雜整體材料的制備及其用于糖蛋白的高效高選擇性富集。
【背景技術(shù)】
[0002]蛋白質(zhì)糖基化是一種重要的翻譯后修飾，據(jù)報道目前至少有50%的蛋白質(zhì)發(fā)生了糖基化修飾，其對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能有著重要的影響。然而，由于糖蛋白豐度低、糖肽占總肽段比例小，采用質(zhì)譜分析檢測時往往被高豐度的非糖肽掩蓋，若不對糖蛋白進行富集，欲從復(fù)雜的生物樣品體系中分析糖蛋白幾乎是不可能的。文獻報道中對糖蛋白常用的分離富集方法主要有凝集素親和法、硼酸法、酰肼法和親水作用法等。其中硼酸法是利用苯硼酸能與順式二羥基化合物在堿性條件下結(jié)合形成穩(wěn)定的絡(luò)合物，當(dāng)介質(zhì)的PH切換為酸性時，絡(luò)合物解吸釋放出順式二羥基化合物。苯硼酸作為糖蛋白富集的配基具有三個顯著的優(yōu)點:1)共價結(jié)合，親和力強；2)可逆反應(yīng)，結(jié)合/解吸過程容易控制；3)在酸性條件下解吸，解吸條件的質(zhì)譜兼容，且不會破壞糖鏈結(jié)構(gòu)，因此，近年來在糖蛋白富集中有很大的應(yīng)用。
[0003]整體柱由于具有反壓小，通透性好，易于實現(xiàn)在線等優(yōu)勢，其應(yīng)用非常廣泛。至今已有成功報道將苯硼酸配基利用共聚或后修飾方法固載于整體材料上，實現(xiàn)了對糖蛋白的有效富集(L Ren, Y Liu, M Dong, Z.Liu.J.Chromatogr.A.2009，1216，8421-8425 ；Z Linj J Pangj H Yang, Z Caij L Zhang, G.Chen, Chem.Commun.2011, 47, 9675-9677 ；Y Liuj L Renj Z Liu.Chem.Commun.2011, 47, 5067-5069;Y Liuj Y Lu，Z Liuj Chem.Sc1.，2012，3，1467-1471)。目前用于硼酸親和柱的整體材料主要分兩類:聚合物基質(zhì)和硅膠材料基質(zhì)。其中基于硅膠基質(zhì)的整體材料比表面積比較大，但由于硅羥基的作用，其對蛋白質(zhì)存在較強的的非特異性吸附，會影響富集的選擇性，且硅膠基質(zhì)的材料可耐受的PH范圍很窄；而采用聚合物基質(zhì)存在最主要的問題是其比表面積比較小，從而降低富集容量。因此，我們將納米顆粒摻雜入親水性整體材料用于富集糖蛋白，可顯著提高富集容量及選擇性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]納米金具有比表面積大，生物相容性好，穩(wěn)定性好，易于修飾的優(yōu)勢，將其摻入整體材料中可顯著增大比表面積，并且利用其易于修飾的特點可以制備含多種功能基團的整體柱。本發(fā)明的目的是提供一種親水性好的整體基質(zhì)載體，表面固載納米金，進一步修飾巰基苯硼酸，從而制備出比表面積大、非特異性吸附小的硼親和整體柱，用于糖蛋白質(zhì)的高容量、高選擇性富集。
[0005]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
[0006]采用甲基丙烯酸縮水甘油酯和聚乙二醇二丙烯酸酯作為單體，在石英毛細管內(nèi)進行原位熱聚合，得到親水性聚合物整體基質(zhì)，經(jīng)環(huán)氧開環(huán)反應(yīng)在聚合物基質(zhì)表面引入巰基，然后在其表面固載納米金顆粒，進一步在納米金顆粒表面共修飾巰基苯硼酸和巰基乙胺。
[0007]所述苯硼酸修飾的納米金摻雜整體材料的制備，具體步驟如下:
[0008]( I)含環(huán)氧基團的親水性整體材料基質(zhì)的制備:以甲基丙烯酸縮水甘油酯(質(zhì)量分數(shù)為20-30% (w/w))和聚乙二醇二丙烯酸酯(質(zhì)量分數(shù)為10-20% (w/w))作為單體，加入致孔劑正丙醇和環(huán)己醇混合物(質(zhì)量分數(shù)為50-70%(w/w))，以及引發(fā)劑偶氮二異丁腈(質(zhì)量分數(shù)占單體總質(zhì)量的0.05-0.1% (w/w))。震蕩超聲混勻，通氮氣去除溶解氧，灌柱，加熱聚合10-24小時后分別用純甲醇和純水沖出未反應(yīng)發(fā)的試劑；
[0009](2)基質(zhì)表面修飾納米金:向所制備的含環(huán)氧基團的毛細管整體柱中連續(xù)通入半胱胺溶液，于40-70°C下反應(yīng)6小時，采用IM Tris-HCl (pH=8)緩沖溶液封尾2_4小時后用純水沖洗柱子至中性，在室溫下連續(xù)通入三羧甲基磷酸溶液還原二硫鍵，用純水沖洗柱子；最后向富含巰基的整體材料中通入納米金溶液；
[0010](3)苯硼酸修飾的納米金摻雜整體材料的制備:向上述制備的納米金摻雜整體材料中連續(xù)通入含4-巰基苯硼酸與巰基乙胺混合物室溫下反應(yīng)1-3天。
[0011]制備的苯硼酸修飾的納米金摻雜整體材料用于選擇性地富集糖蛋白。
[0012]本發(fā)明具有如下優(yōu)點:
[0013]1.本發(fā)明采用含聚乙二醇鏈的親水性單體聚乙二醇二丙烯酸酯作交聯(lián)劑，制備的基質(zhì)材料親水性好，非特異性吸附小。
[0014]2.本發(fā)明采用納米金摻雜整體材料，大大提高了材料比表面積，修飾上更多的功能基團苯硼酸，使其對糖蛋白的富集選擇性高，容量高，且易于實現(xiàn)在線富集。
[0015]3.本發(fā)明中共修飾巰基苯硼酸和巰基乙胺，通過B-N間的配位可有效提高材料對糖蛋白的富集能力。
[0016]4.制備的材料剛性，機械強度好，可耐受0_40MPa的壓力范圍，適用pH范圍寬(1-14)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1為苯硼酸修飾的納米金摻雜整體材料的制備流程圖
[0018]圖2為制備的含環(huán)氧基團的整體材料的掃描電鏡圖，圖A為放大600倍，圖B為5000 倍
[0019]圖3納米金摻雜整體材料的EDS元素分析光譜圖
[0020]圖4苯硼酸修飾的納米金摻雜整體柱對糖蛋白(辣根過氧化物酶，HRP)與非糖蛋白(牛血清白蛋白，BSA)混合溶液(質(zhì)量比1:1000)的富集效果圖。a)原液；b)上樣流出液；c)富集產(chǎn)物。
【具體實施方式】
[0021]下面通過實施例對本發(fā)明提供的方法進行詳述，但不以任何形式限制本發(fā)明。
[0022]實施例1
[0023]1.苯硼酸修飾的納米金摻雜整體材料的制備
[0024]如圖1所示，按如下流程制備:
[0025]I)含環(huán)氧基團整體材料基質(zhì)的制備:按如下配制預(yù)聚溶液:240mg甲基丙烯酸縮水甘油酯，160mg聚乙二醇二丙烯酸酯,50mg正丙醇,550mg環(huán)己醇,和4mg偶氮二異丁腈。將預(yù)聚溶液超聲IOmin后，通氮氣去除溶液中的溶解氧；導(dǎo)入經(jīng)過雙鍵修飾的毛細管內(nèi)，用硅橡膠封住毛細管兩端，并在50°C下，引發(fā)聚合，聚合時間12小時后分別用純甲醇和純水沖出未反應(yīng)單體和致孔劑；
[0026]2)基質(zhì)表面修飾納米金:向所制備的含環(huán)氧基團的毛細管整體柱中連續(xù)通入IM半胱胺溶液(采用IM NaOH溶液溶解)，于50°C下反應(yīng)6小時，采用IM Tris-HCl (pH=8)緩沖溶液封尾2小后用純水沖洗柱子至中性，在室溫下連續(xù)通入0.25M三羧甲基磷酸溶液(用氨水調(diào)pH至中性)還原二硫鍵，用純水沖洗柱子；最后向富含巰基的整體材料中通入納米金顆粒濃度為IO14個/mL的納米金溶液(納米金粒徑12nm)，至流出液變紅為止；
[0027]3)苯硼酸修飾的納米金摻雜整體材料的制備:向上述制備的納米金摻雜整體材料中連續(xù)通入含4-巰基苯硼酸(IOmM)與巰基乙胺(IOmM)混合物的體積分數(shù)為50%乙醇水溶液，室溫下反應(yīng)2天。
[0028]2.所制備的含環(huán)氧基團的整體材料的掃描電鏡圖如圖2所示
[0029]3.所制備的納米金摻雜整體材料金含量是采用EDS元素分析法測定的，所得金質(zhì)量百分比為37.25% (如圖3所示)。
[0030]實施例2
[0031]為考察苯硼酸修飾的納米金摻雜整體柱對糖蛋白的富集容量，材料用色譜前沿分析法測定。具體測定步驟為，采用IOOmM磷酸鹽緩沖溶液作上樣緩沖，采用在柱子(實施例1)上沒有保留的IM碳酸氫銨溶液測死時間，然后將0.2M HRP連續(xù)通入親和柱中，測得其出峰時間，從而計算出此柱對糖蛋白HRP的吸附容量為2.08mg/g。
[0032]實施例3
[0033]為了考察苯硼酸修飾的納米金摻雜整體柱對糖蛋白富集的選擇性以及非特異吸附，進一步進行干擾實驗。
[0034]1.蛋白混合溶液配制
[0035]將糖蛋白(辣根過氧化物酶，HRP)與非糖蛋白(牛血清白蛋白，BSA)按質(zhì)量比1:1000混合，并溶解于50mM碳酸氫銨緩沖溶液中(pH 10.0),從而制得濃度為10.01mg/mL的蛋白混合溶液。
[0036]2.選擇性富集糖蛋白
[0037]取實施例1制備的苯硼酸修飾的納米金摻雜整體柱(內(nèi)徑150 μ m，長10cm)，采用50mM碳酸氫銨緩沖溶液(pH 10.0)平衡20min。以0.5 μ L.mirT1的流速向柱中通入上述配制的蛋白混合溶液20min,用50mM碳酸氫銨緩沖溶液(pH 10.0)沖洗柱子20min,最后向柱子通入體積分數(shù)為0.1%的水溶液進行洗脫，流速為I μ L.mirT1，洗脫時間為20min。分別取原液，上樣流出液及洗脫液直接進行MALD1-TOF MS鑒定。
[0038]3.MALD1-TOF MS 分析
[0039]將IyL富集產(chǎn)物與IyL SA基質(zhì)(20mg/mL芥子酸溶于含0.1%三氟乙酸的60%乙腈溶液)依次點于MALDI靶板上，待樣品點干燥后進行質(zhì)譜鑒定。MALD1-TOF MS實驗是在Ultraflex III TOF/TOF (Bruker Daltonics, Bremen, Germany)上進行，檢測時米用線性正離子模式。
[0040]如圖4a所示，原液中HRP由于濃度極低，使得質(zhì)譜響應(yīng)信號被BSA抑制而無法檢測；經(jīng)苯硼酸修飾的納米金摻雜整體富集之后，HRP信號強度顯著提高(圖4c)，且大大消除了干擾蛋白的影響。表明本材料對糖蛋白具有極高的選擇性，且僅20ng糖蛋白仍能夠得到富集，靈敏度極高。
【權(quán)利要求】
1.一種用于糖蛋白富集的納米金摻雜整體材料，其特征在于: 采用甲基丙烯酸縮水甘油酯和聚乙二醇二丙烯酸酯作為單體，在石英毛細管內(nèi)進行原位熱聚合，得到含有環(huán)氧基團的親水性聚合物整體基質(zhì)，經(jīng)環(huán)氧開環(huán)反應(yīng)在聚合物基質(zhì)表面引入巰基，然后通過巰基在其表面修飾納米金顆粒，進一步在納米金顆粒表面修飾巰基苯硼酸或共修飾巰基苯硼酸和巰基乙胺。
2.按照權(quán)利要求1所述的納米金摻雜整體材料，其特征在于:含有環(huán)氧基團的親水性聚合物整體材料基質(zhì)采用甲基丙烯酸縮水甘油酯和聚乙二醇二丙烯酸酯為單體，采用正丙醇和環(huán)己醇作為致孔劑，采用偶氮二異丁腈為引發(fā)劑，在石英毛細管中原位熱聚合而成； 單體甲基丙烯酸縮水甘油酯和聚乙二醇二丙烯酸酯的分別占單體和致孔劑總質(zhì)量的20-30% (w/w)和10-20% (w/w);致孔劑的用量占單體和致孔劑總質(zhì)量的50-70% (w/w)； 正丙醇和環(huán)己醇的質(zhì)量比例為1:10-50;引發(fā)劑的用量占單體總質(zhì)量的0.05-0.l%(w/w)； 聚合溫度為40-80°C，聚合時間為10-24小時。
3.按照權(quán)利要求1所述的納米金摻雜整體材料，其特征在于: 向含有環(huán)氧基團的親水性聚合物整體材料基質(zhì)中連續(xù)通入半胱胺溶液進行反應(yīng)；半胱胺采用1-2M NaOH溶液溶解，半胱胺濃度為0.5-2M，反應(yīng)溫度為40_70°C，反應(yīng)時間為l-12h ； 用0.5-2M Tris-HCl (pH=7_10)緩沖溶液封尾2_4h后用純水沖洗柱子至中性；然后連續(xù)通入三羧甲基磷酸溶液還原二硫鍵；三羧甲基磷酸(TCEP)溶液用氨水調(diào)pH至中性，濃度為0.1-1M，還原二硫鍵的溫度為15-50°C，時間為l-12h ； 再用純水沖洗柱子后通入納米金溶液，至流出液變紅為止；納米金溶液中納米金尺寸為 2_50nm。
4.按照權(quán)利要求1所述的納米金摻雜整體材料，其特征在于: 向制備的納米金摻雜整體材料中連續(xù)通入含4-巰基苯硼酸與巰基乙胺混合物的乙醇水溶液，室溫下反應(yīng)1-3天； 乙醇水溶液中4-巰基苯硼酸的摩爾濃度為0.01-2M，4-巰基苯硼酸與巰基乙胺摩爾比在20:1與1:0之間，乙醇水溶液中乙醇水溶液的體積分數(shù)為20-80%。
5.一種權(quán)利要求1所述納米金摻雜整體材料在糖蛋白富集過程中的應(yīng)用。
【文檔編號】C07K1/22GK103877949SQ201210559453
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2012年12月19日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月19日
【發(fā)明者】張麗華, 吳慈, 梁玉, 楊開廣, 張玉奎 申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所