專利名稱：：抗dll4抗體及其使用方法抗DLL4抗體及其^f吏用方法發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明一般地涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明關(guān)注抗DLL4抗體及其用途。
背景技術(shù)：
：維管聯(lián)結(jié)(vascularsupply)的發(fā)育是許多生理性和病理性過(guò)程的基本要求?；钴S生長(zhǎng)中的組織諸如胚胎和腫瘤要求充足的血液供應(yīng)。它們通過(guò)生成促血管發(fā)生因子來(lái)滿足這一需要，所述促血管發(fā)生因子經(jīng)由稱為血管發(fā)生(angiogenesis)的過(guò)程促進(jìn)新血管形成。血管的管形成是復(fù)雜^f旦有序的生物學(xué)事件，牽涉所有或許多以下步驟a)自已有的內(nèi)皮細(xì)胞(EC)增殖出EC或自祖細(xì)胞分化出EC;b)EC遷移并接合以形成索樣結(jié)構(gòu)；c)血管索然后發(fā)生管發(fā)生(tubulogenesis)以形成具有中央內(nèi)腔的血管；d)已有的索或血管伸出芽以形成次生血管；e)初級(jí)血管叢發(fā)生進(jìn)一步重塑(remodeling)和整形(reshaping);及內(nèi)皮周細(xì)胞(peri-endothelialcell)被募集來(lái)包圍內(nèi)皮管，為血管提供維持和調(diào)控功能，此類(lèi)細(xì)胞包括用于小毛細(xì)血管的周細(xì)胞、用于更大血管的平滑肌細(xì)胞、和心臟中的心肌細(xì)胞。Hanahan，5We"ce277:48-50(1997);Hogan和Kolodziej,Ato.iev.GW".3:513-23(2002);Lubarsky和Krasnow,CW/112:19-28(2003)。現(xiàn)在完全確立了血管發(fā)生牽涉多種病癥的發(fā)病機(jī)理。這些包括實(shí)體瘤和轉(zhuǎn)移、動(dòng)脈粥樣硬化、晶狀體后纖維組織增生、血管瘤、慢性炎癥、眼內(nèi)新血管疾病諸如增殖性視網(wǎng)膜病例如糖尿病性視網(wǎng)膜病、年齡相關(guān)黃斑變性(AMD)、新生血管性青光眼、移植角膜組織和其它組織的免疫排斥、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、和銀屑病。Folkman等，/所o/.CTzew.267:10931-34(1992);Klagsbrun等，Wev.i^jw'o/.53:217-39(1991);及GarnerA.,"Vasculardiseases",于PathobiologyofOcularDisease.ADynamicApproach,GarnerA和KlintworthGK編，第2版，MarcelDekker，NY，1994,pp1625-1710。在胂瘤生長(zhǎng)的情況中，血管發(fā)生對(duì)于自增生至瘤形成的轉(zhuǎn)換，及為腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移提供營(yíng)養(yǎng)似乎是至關(guān)重要的。Folkman等，Atowre339:58(1989)。新血管形成(neovascularization)讓肺瘤細(xì)胞獲得了與正常纟田月包相比的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)和增殖自治。腫瘤通常開(kāi)始于單個(gè)異常細(xì)胞，由于與可利用毛細(xì)管床的距離，該細(xì)胞只能增殖至幾立方毫米的尺寸，而且它能在較長(zhǎng)的一段時(shí)間里保持"休目民，，狀態(tài)而不進(jìn)一步生長(zhǎng)和傳播。有些腫瘤細(xì)胞然后轉(zhuǎn)向血管發(fā)生表型以激活內(nèi)皮細(xì)胞，所述內(nèi)皮細(xì)胞增殖并成熟成新的毛細(xì)血管。這些新形成的血管不僅讓原發(fā)性腫瘤繼續(xù)生長(zhǎng)，而且讓轉(zhuǎn)移性肺瘤細(xì)胞傳播并再建群(recolonization)。因而，在胂瘤切片中的微血管密度與乳腺癌及數(shù)種其它胂瘤的患者存活之間觀察到了相關(guān)性。Weidner等，W./Met/.324:1-6(1991);Horak等,340:1120-24(1992);Macchiarini等,￡a"c"340:145-46(1992)。尚未完全了解控制血管發(fā)生轉(zhuǎn)換的精確機(jī)制，但是認(rèn)為腫瘤塊的新血管形成源自眾多血管發(fā)生刺激物與抑制物的凈平衡(Folkman，Ato.7kfed1(1):27-31(1995))。血管發(fā)育過(guò)程受到嚴(yán)密調(diào)節(jié)。迄今為止，多種分子，多為由周?chē)?xì)胞生成的分泌性因子，已顯示出調(diào)節(jié)EC分化、增殖、遷移和接合成索樣結(jié)構(gòu)。例如，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)已鑒定為牽涉刺激血管發(fā)生和誘導(dǎo)血管通透性的關(guān)鍵因子。Ferrara等，五"^ckiev.18:4-25(1997)。甚至單個(gè)VEGF等位基因的遺失導(dǎo)致胚胎致死的發(fā)現(xiàn)指向此因子在血管系統(tǒng)的發(fā)育和分化中所發(fā)揮的不可代替的作用。此外，VEGF已顯示為與腫瘤和眼內(nèi)病癥有關(guān)的新血管形成的關(guān)鍵介導(dǎo)物。Ferrara等，五mfocK見(jiàn)上文。VEGFmRNA在多數(shù)所檢查的人腫瘤中過(guò)表達(dá)。Berkman等，/C//"./weW.91:153-59(1993);Brown等，i/薩"尸"Ao/.26:86-91(1995);Brown等,C騰erto.53:4727-35(1993);Mattern等，5"Y./Owcer73:931-34(1996);Dvorak等，爿w./.PaAo/.146:1029-39(1995)。同樣，眼部液體中VEGF的濃度水平與糖尿病性和其它缺血相關(guān)視網(wǎng)膜病患者中的活躍的血管增殖的存在高度相關(guān)。Aiello等，W/331:1480-87(1994)。此外，研究證明了VEGF在AMD患者脈絡(luò)膜新血管膜中的定位。Lopez等，/"veW.(9//^a/mo/.1>^.5W,37:855-68(1996)?？筕EGF中和性抗體在棵鼠中遏制多種人腫瘤細(xì)胞系的生長(zhǎng)(Kim等，Ato,e362:841-44(1993);Warren等，/C7z."./"ve"95:1789-97(1995);Borgstr6m等，Ca"cer56:4032-39(19%);Melnyk等，Ca"cerW仏756:921-24(1996)),而且在缺血性視網(wǎng)膜病癥模型中還抑制眼內(nèi)血管發(fā)生(Adamis等，y^c/2.(9p/zAa/mo/.114:66-71(1996))。因此，抗VEGF單克隆抗體或其它VEGF作用抑制劑是有希望用于治療腫瘤和多種眼內(nèi)新血管病癥的候選物。此類(lèi)抗體記載于例如1998年1月14日公布的EP817,648和1998年10月15日公布的W098/45331和W098/45332。一種抗VEGF抗體，貝伐單抗(bevacizumab),已獲FDA批準(zhǔn)與化療方案聯(lián)合用于治療特定癌癥，而且抗VEGF抗體片段，ranibizumab,已獲FDA批準(zhǔn)用于治療年齡相關(guān)(濕性)黃斑變性。這兩種藥物正在進(jìn)行中的臨床試驗(yàn)中接受調(diào)查。顯然仍然需要具有對(duì)于開(kāi)發(fā)成治療劑而言最佳的臨床屬性的藥劑。本文所述發(fā)明滿足了這種需求并提供了其它好處。完整收錄本文中所引用的所有參考文獻(xiàn)(包括專利申請(qǐng)和出版物)作為參考。發(fā)明概述本發(fā)明部分基于多種DLL4結(jié)合劑(諸如免疫偶聯(lián)物、抗體、及其片段)的鑒定。DLL4表現(xiàn)為重要且有利的治療性靶物，而且本發(fā)明提供了基于結(jié)合DLL4的組合物和方法。本發(fā)明的DLL4結(jié)合劑(如本文中所述)提供了重要的治療劑和診斷劑，用于靶向與DLL4-Notch受體途徑的表達(dá)和/或活性有關(guān)的病理學(xué)疾患。因而，本發(fā)明提供了涉及DLL4結(jié)合的方法、組合物、試劑盒和制品。本發(fā)明提供了結(jié)合(諸如特異性結(jié)合)DLL4的抗體。一方面，本發(fā)明提供了分離的抗DLL4抗體，其中該抗體的全長(zhǎng)IgG形式以約lnM或更好、或約500pM或更好的結(jié)合親和力特異性結(jié)合人DLL4。如本領(lǐng)域完全確立的，配體對(duì)其受體的結(jié)合親和力可以使用多種測(cè)定法中任一種來(lái)測(cè)定，而且在多種定量值方面表述。因而，在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合親和力以Kd值表示，而且反映內(nèi)在結(jié)合親和力(例如，具有最小化的親合(力)效果)。一般且優(yōu)選地，結(jié)合親和力在體外測(cè)量，無(wú)論在無(wú)細(xì)胞環(huán)境中還是在細(xì)胞相關(guān)環(huán)境中?？梢允褂迷S多本領(lǐng)域已知的多種測(cè)定法(包括本文所述那些)中任一種來(lái)獲得結(jié)合親和力測(cè)量，包括例如Biacore⑧、放射性免疫測(cè)定法(RIA)和ELISA。在有些實(shí)施方案中，該分離的抗DLL4抗體以相似的親和力結(jié)合人和d、鼠DLL4，即對(duì)人DLL4的結(jié)合親和力與對(duì)小鼠DLL4的結(jié)合親和力相差不超過(guò)100倍。在有些實(shí)施方案中，對(duì)人DLL4的結(jié)合親和力與對(duì)小鼠DLL4的結(jié)合親和力相差不超過(guò)10倍。在有些實(shí)施方案中，該抗體以約lnM或更好、或約500pM或更好的結(jié)合親和力特異性結(jié)合小鼠DLL4。一方面，本發(fā)明提供了分離的抗DLL4抗體，其中該抗體的全長(zhǎng)IgG形式以約2x105或更好、或約lx1()S或更好的k。n特異性結(jié)合人DLL4。如本領(lǐng)域完全確立的，配體對(duì)其受體的結(jié)合k。n可以使用多種測(cè)定法中任一種來(lái)測(cè)定，而且在多種定量值方面表述。一方面，本發(fā)明提供了結(jié)合DLL4的配體結(jié)合區(qū)的分離的抗體。在有些實(shí)施方案中，該分離的抗體結(jié)合包含DLL4胞外結(jié)構(gòu)域、由其組成或主要由其組成的多肽。在有些實(shí)施方案中，該分離的抗體結(jié)合包含人DLL4的氨基酸252-282、1-252、1-286、1-324和/或219-286、由其組成或主要由其組成的多肽。一方面，本發(fā)明提供了與Notch受體竟?fàn)幗Y(jié)合DLL4的分離的抗DLL4抗體。一方面，本發(fā)明提供了抑制、降低和/或阻斷DLL4生物學(xué)活性的分離的抗DLL4抗體。一方面，本發(fā)明的抗DLL4抗體包含(a)至少一種、兩種、三種、四種、五種或六種高變區(qū)(HVR)序列，其選自下組(i)HVR-L1,其包含序列Al-All，其中A1-A11是RASQDVSTAVA(SEQIDNO:10)(ii)HVR-L2，其包含序列B1-B7，其中B1-B7是SASFLYS(SEQIDNO:11)(iii)HVR-L3,其包含序列C1-C9，其中C1-C9是QQSYNGPST(SEQIDNO:15)(iv)HVR-H1，其包含序列D1-D10，其中D1-D10是GFTFTDNWIS(SEQIDNO:1)(v)HVR-H2,其包含序列El-E18，其中E1-E18是GVINPNSGATEYADSVKG(SEQIDNO:5)和(vi)HVR-H3，其包含序列F1-F15，其中F1-F15是VYYCARDNFGGYFDY(SEQIDNO:9);和9(b)至少一種變體HVR，其中該變體HVR序列包含SEQIDNO:1-18中所述序列的至少一個(gè)殘基的修飾。一方面，本發(fā)明的抗DLL4抗體包含(a)至少一種、兩種、三種、四種或五種高變區(qū)(HVR)序列，其選自下組(i)HVR-L1,其包含序列A1-A11,其中A1-A11是RASQDVSTAVA(SEQIDNO:10)(ii)HVR-L2，其包含序列B1-B7，其中B1-B7是SASFLYS(SEQIDNO:11)(m)HVR-L3，其包含序列C1-C9，其中C1-C9是QQSVNGPAT(SEQIDNO:14)(iv)HVR-H1,其包含序列DI-DIO,其中D1-DIO是GFSFRDNWIS(SEQIDNO:2)(v)HVR-H2，其包含序列E1-E18,其中E1-E18是GVINPNSGSTDYADSVKG(SEQIDNO:3);(vi)HVR-H3，其包含序列F1-F15,其中F1-F15是VYYCARDNFGGYFDY(SEQIDNO:9);和(b)至少一種變體HVR，其中該變體HVR序列包含SEQIDNO:1-18中所述序列的至少一個(gè)殘基的修飾。一方面，本發(fā)明的抗DLL4抗體包含(a)至少一種、兩種、三種、四種或五種高變區(qū)(HVR)序列，其選自下組(i)HVR-Ll，其包含序列Al-All,其中Al-All是RASQDVSTAVA(SEQIDNO:10)(ii)HVR-L2，其包含序列B1-B7，其中B1-B7是SASFLYS(SEQIDNO:11)(iii)HVR-L3,其包含序列C1-C9，其中C1-C9是QQSYTGTVT(SEQIDNO:18)(iv)HVR-HI,其包含序列D1-D10，其中D1-D10是GFTFTDNWIS(SEQIDNO:1)(v)HVR-H2，其包含序列E1-E18,其中E1-E18是GYISPNSGFTYYADSVKG(SEQIDNO:8)和(vi)HVR-H3,其包含序列F1-F15，其中F1-F15是10VYYCARDNFGGYFDY(SEQIDNO:9);和(b)至少一種變體HVR,其中該變體HVR序列包含SEQIDNO:l-18中所述序列的至少一個(gè)殘基的修飾。一方面，本發(fā)明-提供了如下抗體，其包含一種、兩種、三種、四種、五種或六種HVR,其中每種HVR包含選自SEQIDNO:l-18的序列、由其組成或基本上由其組成，且其中SEQIDNO:10對(duì)應(yīng)HVR-L1，SEQIDNO:ll對(duì)應(yīng)HVR-L2，SEQIDNO:12、13、14、15、16、17或18對(duì)應(yīng)HVR-L3，SEQIDNO:1或2對(duì)應(yīng)HVR-H1，SEQIDNO:3、4、5、6、7或8對(duì)應(yīng)HVR-H2，及SEQIDNO:9對(duì)應(yīng)HVR-H3。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3、HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3,其中每個(gè)依次包含SEQIDNO:10、11、12、1、3、9。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含HVR-LI、HVR-L2、HVR-L3、HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3，其中每個(gè)依次包含SEQTDNO:10、11、13、1、4、9。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3、HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3，其中每個(gè)依次包含SEQII)NO:10、11、14、2、3、9。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3、HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3,其中每個(gè)依次包含SEQIDNO:10、11、15、1、5、9。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3、HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3，其中每個(gè)依次包含SEQII)NO:10、11、16、1、6、9。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3、HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3，其中每個(gè)依次包含SEQIDNO:10、11、17、1、7、9。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3、HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3，其中每個(gè)依次包含SEQIDNO:10、11、18、1、8、9。本發(fā)明抗體中的變體HVR可具有該HVR內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)(諸如兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或更多)殘基的修飾。在一個(gè)實(shí)施方案中，HVR-L3變體包含下列位置任何組合中的l-6(1、2、3、4、5或6)處替代91(S或W)、92(Y或F)、93(T、N或S)、94(T或G)、95(P、Q、A或T)和/或96(P、S、A或V)。在一個(gè)實(shí)施方案中，HVR-H2變體包含下列位置任何組合中的l-4(1、2、3或4)處替代50(V、L或Y)、52(N或S)、52a(P或S)或53(N、Q、T或I)。每個(gè)位置后圓括號(hào)內(nèi)的字母指出例示的替代(即置換)氨基酸；對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，其它氨基酸在本文所述背境中作為替代氨基酸的適合性可以使用本領(lǐng)域已知的和/或本文描述的技術(shù)來(lái)常規(guī)地評(píng)估。一方面，本發(fā)明提供了一種抗體，其包含HVR-H1區(qū)，該HVR-H1區(qū)包含SEQIDNO:l或2的序列。一方面，本發(fā)明提供了一種抗體，其包含HVR-H2區(qū)，該HVR-H2區(qū)包含SEQIDNO:3、4、5、6、7或8的序列。一方面，本發(fā)明提供了一種抗體，其包含HVR-H3區(qū)，該HVR-H3區(qū)包含SEQIDNO:9的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種抗體，其包含HVR-L1區(qū)，該HVR-L1區(qū)包含SEQIDN0:IO的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明4是供了一種抗體，其包含HVR-L2區(qū)，該HVR-L2區(qū)包含SEQIDNO:11的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種抗體，其包含HVR-L3區(qū)，該HVR-L3區(qū)包含SEQIDNO:12、13、14、15、16、17或18的序列。一方面，本發(fā)明提供了包含至少一種、至少兩種或所有三種如下序列的抗體(i)包含SEQIDNO:l之序列的HVR-H1序列；(ii)包含SEQIDNO:5之序列的HVR-H2序列；(iii)包含SEQIDNO:9之序列的HVR-H3序列。一方面，本發(fā)明提供了包含至少一種、至少兩種或所有三種下列序列的抗體(i)包含SEQIDNO:10之序列的HVR-L1序列；(ii)包含SEQIDNO:ll之序列的HVR-L2序列；(iii)包含SEQIDNO:15之序列的HVR-L3序列。一方面，本發(fā)明提供了包含至少一種、至少兩種或所有三種下列序列的抗體(i)包含SEQIDNO:l之序列的HVR-H1序列；(ii)包含SEQIDNO:8之序列的HVR-H2序列；(iii)包含SEQIDNO:9之序列的HVR-H3序列。一方面，本發(fā)明提供了包含至少一種、至少兩種或所有三種下列序列的抗體(i)包含SEQIDNO:10之序列的HVR-L1序列；(ii)包含SEQIDNO:ll之序列的HVR-L2序列；12(iii)包含SEQIDNO:18之序列的HVR-L3序列。相對(duì)于如圖la和lb所示的各個(gè)HVR(即Hl、H2或H3)給SEQIDNO:1-18的氨基g吏序列編號(hào)，編號(hào)方式與下文所述Kabat編號(hào)系統(tǒng)一致。一方面，本發(fā)明提供了包含如圖1a和1b所示重鏈HVR序列的抗體。一方面，本發(fā)明提供了包含如圖1a和1b所示輕鏈HVR序列的抗體。本發(fā)明抗體的有些實(shí)施方案包含人源化4D5抗體(huMAb4D5-8)(HERCEPTIN,Genentech,Inc.,SouthSanFrancisco,CA,USA)(還在美國(guó)專利No.6,407,213及Lee等，JtWo/.所o/.(2004),340(5):1073-93中提到)的輕鏈可變域，如下文SEQIDNO:52所示。1AsplieGinMetThrGinSerProSerSerLeuSerAlaSerValGlyAspArgValThrlieThrCysArgAlaSerGinAspVal顏ThrAlaValAlaTrpTyrGinGinLysProGlyLysAlaProLysLeuLeulieTyrSerAlaSerPheLeuTyrSerGlyValProSerArgPheSerGlySerSerGlyThrAspPheThrLeuThrlieSerSerLeuGinProGluAspPheAlaThrTyrTyrCysGinGin///yTyrThrThrProProThrPheGlyGinGlyThrLysValGlulieLys107(SEQIDNO:52)(給HVR殘基加下劃線)在一個(gè)實(shí)施方案中，于第30位、第66位和第91位(分別如上文以粗斜體所示的Asn、Arg和His)中的一處或多處修飾huMAb4D5-8輕鏈可變域序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)修飾的huMAb4D5-8序列包含第30位Ser、第66位Gly和/或第91位Ser。因而，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域包含下文SEQIDNO:53所示序列1AsplieGinMetThrGinSerProSerSerLeuSerAlaSerValGlyAspArgValThrlieThrCysArgAlaSerGinAs。Val5^ThrAlaValAlaTrpTyrGinGinLysProGlyLysAlaProLysLeuLeulieTyrSerAlaSerPheLeuTyrSerGlyValProSerArgPheSerGlySerG(vSerGlyThrAspPheThrLeuThrlieSerSerLeuGinProGluAspPheAlaThrTyrTyrCysGinGinTyrThrThrProProThrPheGlyGinGlyThrLysValGluHeLys107(SEQIDNO:53)(給HVR殘基加下劃線)上文以粗斜體指出相對(duì)于huMAb4D5-8的替代殘基。本發(fā)明抗體可包含任何合適的可變域框架序列，倘若基本上保留了對(duì)DI丄4的結(jié)合活性。例如，在有些實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體包含人亞組III重13鏈框架共有序列。在這些抗體的一個(gè)實(shí)施方案中，框架共有序列包含第71位、第73位和/或第78位替代。在這些抗體的有些實(shí)施方案中，第71位是A，第73位是T和/或第78位是A。在一個(gè)實(shí)施方案中，這些抗體包含huMAb4D5-8(HERCEPTIN,Genentech,Inc.,SouthSanFrancisco,CA,USA)(還在美國(guó)專利No.6,407,213和5,821,337及Lee等，JM/.腺(2004)，340(5):1073-93中提到)的重鏈可變域框架序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，這些抗體還包含人Kl輕鏈框架共有序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，這些抗體包含如美國(guó)專利No.6,407,213&5,821,337所述的huMAb4D5-8的輕鏈HVR序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，這些抗體包含huMAb4D5-8(HERCEPTIN,Genentech,Inc.,SouthSanFrancisco,CA:USA)(還在美國(guó)專利No.6，407，213和5，821,337及Lee等，J編.編.(2004),340(5):1073-93中提到)的輕鏈可變域序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體包含重鏈可變域，其中框架序列包含SEQIDNO:19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36和/或37的序列，且HVRH1、H2和H3序列分別是SEQIDNO:1、5和/或9。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體包含輕鏈可變域，其中框架序列包含SEQIDNO:38、39、40和/或41的序列，且HVRL1、L2和L3序列分別是SEQIDNO:10、11和/或15。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體包含重鏈可變域，其中框架序列包含SEQIDNO:19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36和/或37的序列，且HVRH1、H2和H3序列分別是SEQIDNO:2、3和/或9。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體包含輕鏈可變域，其中框架序列包含SEQIDNO:38、39、40和/或41的序列，且HVRL1、L2和L3序列分別是SEQIDNO:10、11和/或14。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體包含重鏈可變域，其中框架序列包含SEQIDNO:19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36和/或37的序列，且HVRH1、H2和H3序列分別是SEQIDNO:1、8和/或9。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體包含輕鏈可變域，其中框架序列包含SEQIDNO:38、39、40和/或41的序列，且HVRL1、L2和L3序列分別是SEQIDNO:10、11和/或18。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體包含重鏈可變域，其中框架序列包含SEQIDNO:46、47、48和/或49的序列，且HVRH1、H2和H3序列分別是SEQ14IDN0:1、5和/或9。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體包含輕鏈可變域，其中框架序列包含SEQIDNO:42、43、44和/或45的序列，且HVRL1、L2和L3序列分別是SEQIDNO:10、11和/或15。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體包含重鏈可變域，其中框架序列包含SEQIDNO:46、47、48和/或49的序列，且HVRH1、H2和H3序列分別是SEQIDNO:2、3和/或9。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體包含輕鏈可變域，其中框架序列包含SEQIDNO:42、43、44和/或45的序列，且HVRL1、L2和L3序列分別是SEQIDNO:10、11和/或14。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體包含重鏈可變域，其中框架序列包含SEQIDNO:46、47、48和/或49的序列，且HVRH1、H2和H3序列分別是SEQIDNO:l、8和/或9。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體包含輕鏈可變域，其中框架序列包含SEQIDNO:42、43、44和/或45的序列,且HVRL1、L2和L3序列分別是SEQIDNO:10、11和/或18。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體是親和力成熟的，以獲得想要的靶物結(jié)合親和力。在一個(gè)例子中，本發(fā)明親和力成熟的抗體包含氨基酸位置H28、ID0、H31、H32、H33、L91、L92、L93、L94、L95和/或L96中的一處或多處替代。在一個(gè)例子中，本發(fā)明親和力成熟的抗體包含一處或多處下述替代(a)重鏈中，V50L、V50Y、N52S、P52aS、N53Q、N53T、N53I、S56A、S56F、T57S、D58E、D58I、D58A、D58Y或(b)輕鏈中，S91W、Y92F、T93N、T93S、T94G、P95Q、P95A、P95T、P96S、P96A、P96V。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體包含重鏈可變域，該重鏈可變域包含SEQIDNO:54的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域包含SEQIDNO:55的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體包含重鏈可變域和輕鏈可變域，該重鏈可變域包含SEQIDNO:54的序列，而該輕鏈可變域包含SEQIDNO:55的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體包含重鏈可變域，該重鏈可變域包含SEQIDNO:56的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域包含SEQIDNO:57的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體包含重鏈可變域和輕鏈可變域，該重鏈可變域包含SEQIDNO:56的序列，而該輕鏈可變域包含SEQIDNO:57的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體包含重鏈可變域，該重鏈可變域包含15SEQIDNO:58的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域包含SEQIDNO:59的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體包含重鏈可變域和輕鏈可變域，該重鏈可變域包含SEQIDNO:58的序列，而該輕《連可變域包含SEQIDNO:59的序列。一方面，本發(fā)明提供了與任何上述抗體竟?fàn)幗Y(jié)合DLL4的抗體。一方面，本發(fā)明提供了與任何上述抗體結(jié)合DLL4上相同表位的抗體。如本領(lǐng)域所知及下文更詳細(xì)描述的，根據(jù)本領(lǐng)域已知的背景和各種定義(如下文所述)，描繪抗體高變區(qū)的氨基酸位置/邊界可以變化?？勺冇騼?nèi)的有些位置可視為雜交高變位置(hybridhypervariableposition),因?yàn)檫@些位置依照一套標(biāo)準(zhǔn)可認(rèn)為在高變區(qū)內(nèi)，而依照不同的一套標(biāo)準(zhǔn)則認(rèn)為在高變區(qū)外。這些位置中一處或多處還可在延伸的高變區(qū)(如下文進(jìn)一步定義的)中找到。在有些實(shí)施方案中，抗體是單克隆抗體。在有些實(shí)施方案中，抗體是多克隆抗體。在有些實(shí)施方案中，抗體選自下組嵌合抗體、親和力成熟的抗體、人源化抗體和人抗體。在有些實(shí)施方案中，抗體是抗體片段。在有些實(shí)施方案中，抗體是Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2或scFv。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體是嵌合抗體，例如包含嫁接至異源非人序列、人序列或人源化序列(例如框架和/或恒定域序列)的來(lái)自非人供體的抗原結(jié)合序列的抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，非人供體是小鼠。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗原結(jié)合序列是合成的，例如通過(guò)誘變(例如噬菌體展示篩選等)獲得的。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的嵌合抗體具有鼠V區(qū)和人C區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，鼠輕鏈V區(qū)融合至人K輕鏈。在一個(gè)實(shí)施方案中，鼠重鏈V區(qū)融合至人IgGlC區(qū)。本發(fā)明的人源化抗體包括具有FR中氨基酸替代的那些和所嫁接的CDR中有變化的親和力成熟變體。CDR或FR中的替代氨基酸不限于供體或受體抗體中存在的那些。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體還包含F(xiàn)c區(qū)中氨基酸殘基的改變，其導(dǎo)致效應(yīng)器功能改善，包括CDC和/或ADCC功能和B細(xì)胞殺傷增強(qiáng)。本發(fā)明的其它抗體包括具有改善穩(wěn)定性的特定改變的那些。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體包含F(xiàn)c區(qū)中氨基酸殘基的改變，其導(dǎo)致效應(yīng)器功能下降，例如CDC和/或ADCC功能下降和/或B細(xì)胞殺傷下降。在有些實(shí)施方案中，本16的結(jié)合下降(諸如沒(méi)有結(jié)合)。在有些實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體的特征是對(duì)人FcyRI、Fc7RIIA和/或Fc7RIIIA的結(jié)合下降(諸如沒(méi)有結(jié)合)。在有些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體是IgG類(lèi)(例如IgGl或IgG4).的，且包含E233、L234、G236、D265、D270、N297、E318、K320、K322、A327、A330、P331和/或P329(依照EU索引的編號(hào)方式)中至少一處突變。在有些實(shí)施方案中，抗體包含突變L234A/L235A或D265A/N297A。一方面，本發(fā)明提供了包含任何本文所提供的抗原結(jié)合序列的抗DLL4多肽，其中該抗DLL4多肽特異性結(jié)合DLL4。本發(fā)明的抗體結(jié)合(諸如特異性結(jié)合)DLL4,而且在有些實(shí)施方案中，可調(diào)控DLL4相關(guān)效應(yīng)的一個(gè)或多個(gè)方面，包括但不限于下述效應(yīng)的任何一個(gè)或多個(gè)降低或阻斷Notch受體活化、降低或阻斷Notch受體下游分子信號(hào)傳導(dǎo)、破壞或阻斷Notch受體結(jié)合DLL4、和/或促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、和/或抑制內(nèi)皮細(xì)胞分化、和/或抑制動(dòng)脈分化、和/或抑制腫瘤血管灌注、和/或治療和/或預(yù)防肺瘤、細(xì)胞增殖性病癥或癌癥；和/或治療或預(yù)防與DLL4表達(dá)和/或活性有關(guān)的病癥和/或治療或預(yù)防與Notch受體表達(dá)和/或活性有關(guān)的病癥。在有些實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體特異性結(jié)合DLL4。在有些實(shí)施方案中，抗體特異性結(jié)合DLL4胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)。在有些實(shí)施方案中，抗體特異性結(jié)合由DLL4月包外結(jié)構(gòu)域組成或基本上由DLL4胞外結(jié)構(gòu)域組成的多肽。在有些實(shí)施方案中，抗體以約lnM或更好、或約500pM或更好的Ko特異性結(jié)合DLL4。在有些實(shí)施方案中，該抗體以約2x105或更好、或約lx10^'或更好的k。n特異性結(jié)合人DLL4。在有些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體在體內(nèi)和/或在體外降低、抑制和/或阻斷DLL4活性。在有些實(shí)施方案中，抗體與DLL4配體竟?fàn)幗Y(jié)合DI丄4(降低和/或阻斷Notch受體結(jié)合DLL4)。一方面，本發(fā)明提供了包含一種或多種本發(fā)明抗體和載體的組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，該載體是藥學(xué)可接受的。一方面，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明抗DLL4抗體的核酸。一方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明核酸的載體。一方面，本發(fā)明提供了包含一種或多種本發(fā)明核酸和載體的組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，該載體是藥學(xué)可接受的。一方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明核酸或載體的宿主細(xì)胞。載體可能是任何類(lèi)型的，例如重組載體，諸如表達(dá)載體?？梢允褂枚喾N宿主細(xì)胞中任一種。在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞，例如大腸桿菌。在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞，諸如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。一方面，本發(fā)明提供了制備本發(fā)明抗體的方法。例如，本發(fā)明提供了制備抗DLL4抗體(其包括全長(zhǎng)及其片段，如本文所定義的)或免疫偶聯(lián)物的本發(fā)明重組載體，并回收所述抗體。一方面，本發(fā)明提供了一種制品，其包含容器和裝載該容器內(nèi)的組合物，其中該組合物包含一種或多種本發(fā)明的抗DLL4抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，該組合物還包含抗血管發(fā)生劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗血管發(fā)生劑是抗VEGF抗體，例如貝伐單抗(bevacizumab)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該組合物包含本發(fā)明的核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含抗體的組合物還包含載體，其在有些實(shí)施方案中是藥學(xué)可接受的。在一個(gè)實(shí)施方案中，該容器內(nèi)裝有第二種組合物，其中該第二種組合物包含抗血管發(fā)生劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗血管發(fā)生劑是抗VEGF抗體，例如貝伐單抗。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的制品還包含給受試者施用組合物(例如抗體)的說(shuō)明書(shū)(諸如關(guān)于任何本文所述方法的說(shuō)明書(shū))。一方面，本發(fā)明提供了一種試劑盒，其包含裝有包含一種或多種本發(fā)明抗DLL4抗體的組合物的第一容器；和裝有緩沖液的第二容器。在一個(gè)實(shí)施方案中，該緩沖液是藥學(xué)可接受的。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含抗體的組合物還包含載體，其在有些實(shí)施方案中是藥學(xué)可接受的。在一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒還包含給受試者施用組合物(例如抗體)的說(shuō)明書(shū)。防性處理病癥諸如癌癥、肺瘤和/或細(xì)胞增殖性病癥的藥物中的用途。在有些實(shí)施方案中，該病癥是與血管發(fā)生有關(guān)的病理學(xué)疾患。一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的核酸在制備用于治療性和/或預(yù)防性處理病癥諸如癌癥、肺瘤和/或細(xì)胞增殖性病癥的藥物中的用途。在有些實(shí)施方案中，該病癥是與血管發(fā)生有關(guān)的病理學(xué)疾患。一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的表達(dá)載體在制備用于治療性和/或預(yù)防性處理病癥諸如癌癥、肺瘤和/或細(xì)胞增殖性病癥的藥物中的用途。在有些實(shí)施方案中，該病癥是與血管發(fā)生有關(guān)的病理學(xué)疾患。一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的宿主細(xì)胞在制備用于治療性和/或預(yù)防性處理病癥諸如癌癥、腫瘤和/或細(xì)胞增殖性病癥的藥物中的用途。在有些實(shí)施方案中，該病癥是與血管發(fā)生有關(guān)的病理學(xué)疾患。一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的制品在制備用于治療性和/或預(yù)防性處理病癥諸如癌癥、肺瘤和/或細(xì)胞增殖性病癥的藥物中的用途。在有些實(shí)施方案中，該病癥是與血管發(fā)生有關(guān)的病理學(xué)疾患。一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的試劑盒在制備用于治療性和/或預(yù)防性處理病癥諸如癌癥、腫瘤和/或細(xì)胞增殖性病癥的藥物中的用途。在有些實(shí)施方案中，該病癥是與血管發(fā)生有關(guān)的病理學(xué)疾患。本發(fā)明提供了可用于調(diào)控與DLL4表達(dá)和/或活性(諸如升高或降低的表達(dá)和/或活性或不想要的表達(dá)和/或活性)有關(guān)的疾病狀態(tài)的方法和組合物。一方面，本發(fā)明提供了用于治療或預(yù)防與DLL4表達(dá)和/或活性升高有關(guān)的腫瘤、癌癥和/或細(xì)胞增殖性病癥的方法，該方法包括給需要此類(lèi)治療的受試者施用有效量的抗DLL4抗體。一方面，本發(fā)明提供了用于降低、抑制、阻斷或預(yù)防癌癥或腫瘤生長(zhǎng)的方法，該方法包括給需要此類(lèi)治療的受試者施用有效量的抗DLL4抗體。一方面，本發(fā)明提供了用于治療腫瘤、癌癥和/或細(xì)胞增殖性病癥的方法，包括給需要此類(lèi)治療的受試者施用有效量的抗DLL4抗體。一方面，本發(fā)明提供了用于抑制血管發(fā)生的方法，包括給需要此類(lèi)治療的受試者施用有效量的抗DLL4抗體。一方面，本發(fā)明提供了用于治療與血管發(fā)生有關(guān)的病理學(xué)疾患的方法，包括給需要此治療的受試者施用有效量的抗DLL4抗體。在有些實(shí)施方案中，所述與血管發(fā)生有關(guān)的病理學(xué)疾患是腫瘤、癌癥和/或細(xì)胞增殖性病癥。在有些實(shí)施方案中，所述與血管發(fā)生有關(guān)的病理學(xué)疾患是眼內(nèi)新血管疾病。文中有描述，且包括選自下組的癌癥小細(xì)胞肺癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、黑素瘤、乳腺癌、胃癌、結(jié)腸直腸癌(CRC)和肝細(xì)胞癌，包括這些癌癥的轉(zhuǎn)移形式。本發(fā)明的方法還可包括別的治療步驟。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，方法還包括如下步驟，其中將靶細(xì)胞和/或組織(例如癌細(xì)胞)暴露于放射性治療或化療劑或抗血管發(fā)生劑。另一方面，本發(fā)明提供了用于檢測(cè)DLL4的方法，該方法包括在樣品中19檢測(cè)DLL4-抗DLL4抗體復(fù)合物。術(shù)語(yǔ)"檢測(cè)"在用于本文時(shí)包括參照或不參照對(duì)照的定性和/或定量檢測(cè)(測(cè)量水平)。另一方面，本發(fā)明提供了用于i貪斷與DLL4表達(dá)和/或活性有關(guān)的病癥的方法，該方法包括在來(lái)自患有或懷疑患有該病癥的患者的生物學(xué)樣品中檢測(cè)DLL4-抗DLL4抗體復(fù)合物。在有些實(shí)施方案中，該DLL4表達(dá)是升高的表達(dá)或不正常的表達(dá)。在有些實(shí)施方案中，該病癥是腫瘤、癌癥和/或細(xì)胞增殖性病癥。另一方面，本發(fā)明提供了任何本文所述抗DLL4抗體，其中該抗DLL4抗體包含可檢測(cè)的標(biāo)記物。另一方面，本發(fā)明提供了任何本文所述抗DLL4抗體和DLL4的復(fù)合物。在有些實(shí)施方案中，該復(fù)合物是在體內(nèi)或在體外的。在有些實(shí)施方案中，該復(fù)合物包含癌細(xì)胞。在有些實(shí)施方案中，該抗DLL4抗體是可檢測(cè)標(biāo)記的。附圖簡(jiǎn)述圖1a,b:抗DLL4抗體的重鏈和輕鏈HVR環(huán)序列。該圖顯示重鏈HVR序列，Hl、H2和H3，及輕鏈HVR序列，Ll、L2和L3。序列編號(hào)方式如下克隆152.26(HVR-H1是SEQIDNO:1;HVR-H2是SEQIDNO:3;HVR-H3是SEQIDNO:9;HVR-Ll是SEQIDNO:10;HVR-L2是SEQIDNO:11;HVR-L3是SEQIDNO:12);克隆152.26.6(HVR-Hl是SEQIDNO:1;HVR-H2是SEQIDNO:4;HVR-H3是SEQIDNO:9;HVR-Ll是SEQIDNO:10;HVR-L2是SEQIDNO:11;HVR-L3是SEQIDNO:13);克隆152.26.14(HVR-Hl是SEQIDNO:2;HVR-H2是SEQIDNO:3;HVR-H3是SEQIDNO:9;HVR-Ll是SEQIDNO:10;HVR-L2是SEQIDNO:11;HVR-L3是SEQIDNO:14);克隆152,26.20(HVR-Hl是SEQIDNO:1;HVR-H2是SEQIDNO:5;HVR-H3是SEQIDNO:9;HVR-Ll是SEQIDNO:10;HVR-L2是SEQIDNO:11;HVR-L3是SEQIDNO:15);克隆152.26.34(HVR-Hl是SEQIDNO:1;HVR-H2是SEQIDNO:6;HVR-H3是SEQIDNO:9;HVR-Ll是SEQIDNO:10;HVR-L2是SEQIDNO:11;HVR-L3是SEQIDNO:16);克隆152.26.40(HVR-Hl是SEQIDNO:1;HVR-H2是SEQIDNO:7;HVR-H3是SEQIDNO:9;HVR-Ll是SEQIDNO:10;HVR-L2是SEQIDNO:11;HVR-L3是SEQIDNO:17);及克隆152.26.82(HVR-Hl是SEQIDNO:1;HVR-H2是SEQIDNO:208;HVR-H3是SEQIDNO:9;HVR-L1是SEQIDNO:10;HVR-L2是SEQIDNO:11;HVR-L3是SEQIDNO:18)。氨基酸位置是如下文所述依照Kabat編號(hào)系統(tǒng)給編號(hào)的。圖2和3描繪了例示性的受體人共有框架序列，用于以如下序列標(biāo)識(shí)符實(shí)施本發(fā)明。重鏈可變域(VH)共有框架(圖2a,b)人VH亞組I共有框架減去KabatCDR(SEQIDNO:19)人VH亞組I共有框架減去延伸的高變區(qū)(SEQIDNO:20-22)人VH亞組II共有框架減去KabatCDR(SEQIDNO:23)人VH亞組II共有框架減去延伸的高變區(qū)(SEQIDNO:24-26)人VH亞組II共有框架減去延伸的人VH亞組III共有框架減去KabatCDR(SEQIDNO:27)人VH亞組III共有框架減去延伸的高變區(qū)(SEQIDNO:28-30)人VH受體框架減去KabatCDR(SEQIDNO:31)人VH受體框架減去延伸的高變區(qū)(SEQIDNO:32-33)人VH受體2框架減去KabatCDR(SEQIDNO:34)人VH受體2框架減去延伸的高變區(qū)(SEQIDNO:35-37)輕鏈可變域(VL)共有框架(圖3)人VLK亞組I共有框架(SEQIDNO:38)人VLK亞組II共有框架(SEQIDNO:39)人VLK亞組III共有框架(SEQIDNO:40)人VLK亞組IV共有框架(SEQIDNO:41)圖4描繪了huMAb4D5-8輕鏈和重鏈的框架區(qū)序列。以上標(biāo)/粗體表示的數(shù)字指出依照Kabat的氨基酸位置。圖5描繪了huMAb4D5-8輕鏈和重鏈的修飾的/變異的框架區(qū)序列。以上標(biāo)/粗體表示的數(shù)字指出依照Kabat的氨基酸位置。圖6描繪了抗體克隆26.20、26.14和26.82的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)。圖7:DLL4介導(dǎo)的Notch信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)EC增殖。a-c,f,3-D血纖蛋白凝膠中的HUVEC萌芽測(cè)定法(sproutingassay)?？笵LL4抗體(YW26.82)或DBZ促進(jìn)HUVEC萌芽(a)。Ki67染色顯示抗DLL4抗體或DBZ《1起HUVEC的過(guò)度增殖(b)。在存在SF條件化培養(yǎng)基時(shí)，抗DLL4抗體或DBZ增加了HUVEC的萌芽(c)。d，h，抗DLL4抗體的系統(tǒng)遞送引起EC在新生視網(wǎng)膜中的大量積累。視網(wǎng)膜血管結(jié)構(gòu)(異凝集素染色)的低放大率(頂部)和高放大率(底部)的共焦圖像(d)。Ki67染色顯示在用抗DLL4抗體處理的新生視網(wǎng)膜中EC增殖增加(h)。e,通過(guò)固定化DLL4引起的Notch活化抑制HUVEC增殖。f,在存在或沒(méi)有DBZ時(shí)，抗VEGF抗體抑制HUVEC萌芽。g，Notch對(duì)VEGFR2的調(diào)節(jié)。響應(yīng)以下條件的VEGFR2表達(dá)的定量PCR分析HUVEC的3-D血纖蛋白凝膠培養(yǎng)物(7d)中由抗DLL4抗體或DBZ引起的Notch阻斷(左邊)，或HUVEC的2-D培養(yǎng)物(36hr)中由固定化DLL4引起的Notch活化(右邊)。分別使用5(ig/ml和0.08(iM的抗DLL4抗體和DBZ(a-c,e-g)。圖8:DLL4介導(dǎo)的Notch信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)EC分化。a,在存在抗DLL4抗體或DBZ時(shí)，失去了由在血纖蛋白凝膠中生長(zhǎng)的HUVEC形成的腔管(lumen)樣結(jié)構(gòu)(白箭頭)。代替地，芽?jī)?nèi)高度充滿了細(xì)胞(黑箭頭)。b，Notch對(duì)TGF(32的調(diào)節(jié)。響應(yīng)以下條件的TGF(32表達(dá)的定量PCR分析HUVEC的3-D血纖蛋白凝膠培養(yǎng)物(7d)中由抗DLL4抗體或DBZ引起的Notch阻斷(左邊)，或HUVEC的2-D培養(yǎng)物(36hr)中由固定化DLL4引起的Notch活化(右邊)。c，抗DLL4抗體阻斷動(dòng)脈發(fā)育。用a平滑肌肌動(dòng)蛋白(ASMA)和異凝集素染色的新生小鼠視網(wǎng)膜的共焦圖像。如圖ld所述處理新生小鼠。d，用ASMA和異凝集素染色的成年小鼠視網(wǎng)膜的共焦圖像。用PBS或抗DLL4抗體(10mg/kg，每周兩次)處理8周齡的小鼠2周。圖9:DLL4和/或VEGF的選擇性阻斷破壞了肺瘤血管發(fā)生并抑制了腫瘤生長(zhǎng)。a-f，如下腫瘤模型的結(jié)果HM7(a)、Colo205(b)、Calu6(c)、MDA-MB-435(d)、MV-522(e)和WEHI3(f)。顯示了平均腫瘤體積及SE。g-h,胂瘤血管組織學(xué)研究。來(lái)自對(duì)照、抗DLL4抗體和抗VEGF處理的小鼠的EL4腫瘤切片中的抗CD31免疫組織化學(xué)(g)。EL4腫瘤切片中的;疑集素灌注和抗CD31染色(h)。i-p,如下腫瘤模型的結(jié)果SK-OV-3X1(i)、LL2(j)、EL4(k)、H1299(l)、SKMES-1(m)、MX-1(n)、SW620(。)和LS174T(p)。圖10:DLL4/Notch在小鼠腸的穩(wěn)態(tài)中不是必需的。來(lái)自對(duì)照(a，d,g，j)、抗DLL4抗體(10mg/kg，每周兩次，6周)(b，e,h，k)和DBZ(30,ol/kg，每天一次，5天)(c,f,i，l)處理小鼠的小腸的免疫組織化學(xué)研究。如H&E(a,b,c)和Alcian藍(lán)(d,e,f)染色所示，DBZ引起杯形細(xì)胞對(duì)TA群體的替代。這種變化在抗DLL4抗體處理中完全不出現(xiàn)。Ki67(g,h，i)和HES-l(j,k，l)染色還證實(shí)抗DLL4抗體未能復(fù)制DBZ的效果。圖ll:抗DLL4抗體的表征。a,抗DLL4抗體單克隆抗體(Mab)YW26.82的表位作圖。作為C末端人胎盤(pán)堿性磷酸酶(AP)融合蛋白表達(dá)的一組DLL4突變體的圖示。在用純化的抗DLL4抗體(YW26.82，0.5(Lig/ml)包被的96孔微量滴定板上測(cè)試了含有融合蛋白的293T細(xì)胞條件化培養(yǎng)基。使用一步PNPP(Pierce)作為底物和OD405nm吸光度測(cè)量來(lái)檢測(cè)所結(jié)合的DLL4.AP。b-d,YW26.82對(duì)DLL4的選擇性結(jié)合。如所示的(l嗎/ml)用純化的重組蛋白包被96孔NuncMaxiSorpTM平板。通過(guò)ELISA測(cè)定法測(cè)量YW26.82在指定濃度的結(jié)合。使用TMB作為底物和OD450nm吸光度測(cè)量用抗人抗體HRP偶聯(lián)物來(lái)檢測(cè)所結(jié)合的抗體。使用抗HER2和重組ErbB2-ECD作為測(cè)定對(duì)照(b)。經(jīng)載體、全長(zhǎng)DLL4、Jagl或DLLl瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞的FACS分析。僅在經(jīng)DLL4轉(zhuǎn)染的細(xì)胞上檢測(cè)到顯著的YW26.82結(jié)合(頂部小圖)。分別通過(guò)重組大鼠Notch1-Fc(rrNotchl-Fc,中間小圖)和重組大鼠Notch2-Fc(rrNotch2-Fc，底部小圖)來(lái)確認(rèn)Jagl和DLLl的表達(dá)。使用2jig/ml的YW26.82、rrNotchl-Fc或rrNotch2-Fc(R&DSystem),接著是山羊抗人IgG-PE(1:500，JacksonImmunoResearch)(c)?？笵LL4抗體阻斷DLL4-AP而非DLL1-AP對(duì)所包被的rNotchl的結(jié)合，且計(jì)算IC50為約12nM(左邊小圖)?？笵LL4抗體阻斷DLL4-His而非Jagl-His對(duì)所包被的rNotchl的結(jié)合，且計(jì)算IC50為約8nM(右邊小圖)(d)。e,YW26.82對(duì)內(nèi)源性表達(dá)的DLL4的特異性結(jié)合。經(jīng)對(duì)照或DLL4特異性siRNA轉(zhuǎn)染的HUVEC的FACS分析。使用2嗎/ml的YW26.82,接著是山羊抗人IgG-PE(1:500，JacksonImmunoResearch)(e)。圖12:Notch活化對(duì)DLL4的上調(diào)。在沒(méi)有或存在DBZ(0.08laM)時(shí)，通過(guò)固定化的C末端加His標(biāo)簽的人DLL4(氨基酸1-404)來(lái)刺激HUVEC。刺激后36小時(shí)，通過(guò)使用抗DLL4抗體的FACS分析來(lái)檢查內(nèi)源DLL4表達(dá)。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了抗DLL4抗體，其可用于例如治療或預(yù)防與DLL4的表達(dá)和/或活性(諸如升高的表達(dá)和/或活性或者不想要的表達(dá)和/或活性)有關(guān)的疾病狀態(tài)。在有些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體用于治療腫瘤、癌、和/或細(xì)胞增殖性病癥。在有些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體用于治療與血管發(fā)生有關(guān)的病理疾患。23另一方面，本發(fā)明的抗DLL4抗體可作為試劑用于檢測(cè)和/或分離DLL4,諸如檢測(cè)各種組織和細(xì)胞類(lèi)型中的DLL4。本發(fā)明進(jìn)一步提供了制備抗DLL4抗體和編碼抗DLL4抗體的多核苷酸的方法。通用技術(shù)本文中描述或提到的技術(shù)和規(guī)程一般得到了本領(lǐng)域技術(shù)人員的充分理解，而且通常利用常規(guī)方法得以采用，諸如例如下列文獻(xiàn)中記載的廣泛應(yīng)用的方法Sambrook等，MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL第3版(2001)ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y;CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY(F.M.Ausubel等編，(2003));叢書(shū)METHODSINENZYMOLOGY(AcademicPress,Inc.):PCR2:APRACTICALAPPROACH(M.J.MacPherson，B.D.Hames和G.R.Taylor編(1995));Harlow和Lane編(1988)ANTIBOD正S，ALABORATORYMANUAL;及ANIMALCELLCULTURE(R.LFreshney編(1987))。定義"分離的，，抗體指已經(jīng)筌定且自其天然環(huán)境的一種成分分開(kāi)和/或回收的抗體。其天然環(huán)境的污染性成分指會(huì)干擾該抗體的診斷或治療用途的物質(zhì)，可包括酶、激素、和其它蛋白質(zhì)性質(zhì)或非蛋白質(zhì)性質(zhì)的溶質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將抗體純化至(l)才艮據(jù)Lowry法的測(cè)定，抗體重量超過(guò)95%，最優(yōu)選內(nèi)部氨基酸序列的程度，或(3)根據(jù)還原性或非還原性條件下的SDS-PAGE及使用CoomassieTM藍(lán)或優(yōu)選的銀染色，達(dá)到同質(zhì)。既然抗體天然環(huán)境的至少一種成分不會(huì)存在，那么分離的抗體包括重組細(xì)胞內(nèi)的原位抗體。類(lèi)似的，分離的抗體包括重組細(xì)胞周?chē)呐囵B(yǎng)基中的抗體。然而，分離的抗體通常將通過(guò)至少一個(gè)純化步驟來(lái)制備。"分離的"核酸分子指已經(jīng)鑒定且與抗體核酸的天然來(lái)源中通常與之關(guān)聯(lián)的至少一種污染性核酸分子分開(kāi)的核酸分子。分離的核酸分子不同于在自然界中發(fā)現(xiàn)它時(shí)的形式或背景。分離的核酸分子因此與存在于天然細(xì)胞中時(shí)的核酸分子有區(qū)別。然而，分離的核酸分子包括通常表達(dá)該抗體的細(xì)胞中所24包含的核酸分子，例如當(dāng)所述核酸分子在所述細(xì)胞中的染色體定位不同于它在天然細(xì)胞中的染色體定位時(shí)。術(shù)語(yǔ)"依照Kabat的可變域殘基編號(hào)方式'，或"依照Kabat的氨基酸位置編號(hào)方式，，及其變體指Kabat等,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD.(1991)中的抗體編輯用于重鏈可變域或輕鏈可變域的編號(hào)系統(tǒng)。使用此編號(hào)系統(tǒng)，實(shí)際的線性氨基酸序列可包含較少或另外的氨基酸，對(duì)應(yīng)于可變域FR或CDR的縮短或插入。例如，重鏈可變域可包含H2殘基52后的單一氨基酸插入(依照Kabat為殘基52a)及重鏈FR殘基82后的插入殘基(例如依照Kabat為殘基82a、82b和82c等)。給定抗體的Kabat殘基編號(hào)方式可通過(guò)將抗體序列與"標(biāo)準(zhǔn)"Kabat編號(hào)序列比對(duì)同源區(qū)來(lái)確定。短語(yǔ)"基本上相似"或"基本上相同"在用于本文時(shí)表示兩個(gè)數(shù)值(通常一個(gè)涉及本發(fā)明的抗體而另一個(gè)涉及參照/比較抗體)之間足夠高的相似程度，以致本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)為在用所述數(shù)值(例如Kd值)所測(cè)量的生物學(xué)特性背景內(nèi)兩個(gè)數(shù)值之間的差異具有很小的或沒(méi)有生物學(xué)和/或統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。作為參照/比較抗體該數(shù)值的函數(shù)，所述兩個(gè)數(shù)值之間的差異優(yōu)選小于約50%、優(yōu)選小于約40%、優(yōu)選小于約30%、優(yōu)選小于約20%、或優(yōu)選小于約10%。"結(jié)合親和力"通常指分子(例如抗體)的單一結(jié)合位點(diǎn)與其結(jié)合配偶體(例如抗原)之間全部非共價(jià)相互作用總和的強(qiáng)度。除非另有說(shuō)明，在用于本文時(shí)，"結(jié)合親和力"指反映結(jié)合對(duì)的成員(例如抗體與抗原)之間l:l相互作用的內(nèi)在結(jié)合親和力。分子X(jué)對(duì)其配偶體Y的親和力通?？捎媒怆x常數(shù)(Kd)來(lái)表述。親和力可通過(guò)本領(lǐng)域知道的常用方法來(lái)測(cè)量，包括本文中所描述的那些。低親和力抗體通常緩慢的結(jié)合抗原且趨于容易解離，而高親和力抗體通常更快速的結(jié)合抗原且趨于保持更長(zhǎng)時(shí)間的結(jié)合。本領(lǐng)域知道測(cè)量結(jié)合親和力的多種方法，其中任一種都可用于本發(fā)明的目的。下文描述了具體的示例性實(shí)施方案。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照本發(fā)明的"Kd"或"Kd值"是通過(guò)如下測(cè)定法所述使用Fab型式的感興趣抗體及其抗原進(jìn)行的放射性標(biāo)記抗原結(jié)合測(cè)定法(RIA)來(lái)測(cè)量的通過(guò)在存在未標(biāo)記抗原的滴定系列的條件下，用最小濃度的1251標(biāo)記抗原平衡Fab，然后用抗Fab抗體包被的平板捕捉結(jié)合的抗原來(lái)測(cè)量Fab對(duì)抗原的溶液結(jié)合親和力(Chen等，JAfo/所o/293:865-881(1999))。為了確定測(cè)定條件，用50mM碳酸鈉(pH9.6)中的5jig/ml捕捉用抗Fab抗體(CappelLabs)包被微量滴定板(Dynex)過(guò)夜，隨后用PBS中的20/。(w/v)牛血清清蛋白在室溫(約23。C)封閉2-5小時(shí)。在非吸附平板(Nunc#269620)中，將100pM或26pM〖'"I]-抗原與連續(xù)稀釋的感興趣Fab混合(例如與Presta等，Ca"cw尺".57:4593-4599(1997)中抗VEGF抗體，F(xiàn)ab-12的評(píng)估一致)。然后將感興趣Fab保溫過(guò)夜；不過(guò)，保溫可持續(xù)更長(zhǎng)時(shí)間(例如65個(gè)小時(shí))以保證達(dá)到平衡。此后，將混合物轉(zhuǎn)移至捕捉板以進(jìn)行室溫保溫(例如l小時(shí))。然后除去溶液，并用含0.1%Tween-⑧20的PBS洗板8次。平板干燥后，加入150(il/孔閃爍液(MicroScintTM-20;Packard),然后在TopCount伽馬計(jì)數(shù)器(Packard)上對(duì)平板計(jì)數(shù)10分鐘。選擇各Fab給出小于或等于最大結(jié)合之20%的濃度用于竟?fàn)幮越Y(jié)合測(cè)定法。依照另一實(shí)施方案，Kd或Kd值是通過(guò)表面等離振子共振測(cè)定法使用BIAcoreTM-2000或BIAcoreTM-3000(BIAcore，Inc.，Piscataway,NJ)在25。C使用固定化抗原CM5芯片在約10個(gè)響應(yīng)單位(RU)測(cè)量的。簡(jiǎn)而言之，依照供應(yīng)商的說(shuō)明書(shū)用鹽酸N-乙基-N，-(3-二曱基氨基丙基)-碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活化羧曱基化右旋糖苷生物傳感器芯片(CM5,BIAcoreInc.)。用10mM乙酸鈉pH4.8將抗原稀釋至5昭/ml(約0.2(iM),然后以5|^1/分鐘的流速注入至獲得約10個(gè)響應(yīng)單位(RU)的偶聯(lián)蛋白質(zhì)。注入抗原后，注入1M乙醇胺以封閉未反應(yīng)基團(tuán)。為了進(jìn)行動(dòng)力學(xué)測(cè)量，在25。C以約25(il/分鐘的流速注入在含0.05%Tween-20的PBS(PBST)中兩倍連續(xù)稀釋的Fab(0.78nM至500nM)。使用簡(jiǎn)單一對(duì)一朗格繆爾(Langmuir)結(jié)合模型(BIAcoreEvaluationSoftware3.2版)通過(guò)同時(shí)擬合結(jié)合和解離傳感圖計(jì)算結(jié)合速率(k。n)和解離速率(k。ff)。平衡解離常數(shù)(Kd)以比率k。ff/k。n計(jì)算。參見(jiàn)例如Chen,Y.等，JMo/SZo/293:865-881(1999)。如果才艮據(jù)上文表面等離振子共振測(cè)定法，結(jié)合速率超過(guò)106M"S"，那么結(jié)合速率可使用熒光淬滅技術(shù)來(lái)測(cè)定，即根據(jù)分光計(jì)諸如配備了斷流裝置的分光光度計(jì)(astop-flowequippedspectrophometer)(AvivInstruments)或8000系歹'JSLM-Aminco分光光度計(jì)(ThermoSpectronic)中用攪拌比色杯的測(cè)量，在存在濃度漸增的抗原的條件下，測(cè)量PBS,pH7.2中的20nM抗抗原抗體(Fab形式)在25。C的焚光發(fā)射強(qiáng)度(激發(fā)二295nm;發(fā)射二340nm,16nm帶通)的升高或降低。l衣月g本發(fā)明的"結(jié)合速率，，(on-rate，rateofassociation,associationrate)或26"k。n，，也可通過(guò)上文所述相同的表面等離振子共振技術(shù)使用BIAcore-2000或BIAcoreTM-3000(BIAcore,Inc"Piscataway，NJ)在25。C使用固定化抗原CM5芯片在約10個(gè)響應(yīng)單位(RU)來(lái)測(cè)定。簡(jiǎn)而言之，依照供應(yīng)商的說(shuō)明書(shū)用鹽酸N-乙基-N，-(3-二曱基氨基丙基)-碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活化羧曱基化右旋糖普生物傳感器芯片(CM5，BIAcoreInc.)。用10mM乙酸鈉pH4.8將抗原稀釋至5iig/ml(約0.2(iM)，然后以5iil/分鐘的流速注入至獲得約10個(gè)響應(yīng)單位(RU)的偶聯(lián)蛋白質(zhì)。注入抗原后，注入1M乙醇胺以封閉未反應(yīng)基團(tuán)。為了進(jìn)行動(dòng)力學(xué)測(cè)量，在25。C以約25)!1/分鐘的流速注入在含0.05%Tween-⑧20的PBS(PBST)中兩倍連續(xù)稀釋的Fab(0.78nM至500nM)。使用簡(jiǎn)單一對(duì)一朗格繆爾(Langmuir)結(jié)合模型(BIAcoreEvaluationSoftware3.2版)通過(guò)同時(shí)擬合結(jié)合和解離傳感圖計(jì)算結(jié)合速率(k。。)和解離速率(k。ff)。平衡解離常數(shù)(Kd)以比率k。ff/k。n計(jì)算。參見(jiàn)例如Chen,Y.等,JM/腸/293:865-881(1999)。然而，如果根據(jù)上文表面等離振子共振測(cè)定法，結(jié)合速率超過(guò)106M-1S"，那么結(jié)合速率優(yōu)選使用焚光淬滅技術(shù)來(lái)測(cè)定，即根據(jù)分光計(jì)諸如配備了斷流裝置的分光光度計(jì)(AvivInstruments)或8000系列SLM-Aminco分光光度計(jì)(ThermoSpectronic)中用攪拌比色杯的測(cè)量，在存在濃度漸增的抗原的條件下，測(cè)量PBS,pH7.2中的20nM抗抗原抗體(Fab形式)在25。C的焚光發(fā)射強(qiáng)度(激發(fā)二295nm;發(fā)射二340nm,16nm帶通)的升高或降低。術(shù)語(yǔ)"載體"在用于本文時(shí)意指能夠運(yùn)輸與其連接的其它核酸的核酸分子。一類(lèi)載體是"質(zhì)粒"，指其中可連接另外的DNA區(qū)段的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。另一類(lèi)載體是噬菌體載體。另一類(lèi)載體是病毒載體，其中可將另外的DNA區(qū)段連接到病毒基因組中。某些載體能夠在其所導(dǎo)入的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制(例如具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌載體和附加型哺乳動(dòng)物載體)。其它載體(例如非附加型哺乳動(dòng)物載體)可在導(dǎo)入宿主細(xì)胞后整合到宿主細(xì)胞的基因組中，由此隨著宿主基因組一起復(fù)制。此外，某些載體能夠指導(dǎo)與其可操作連接的基因表達(dá)。此類(lèi)載體在本文中稱為"重組表達(dá)載體"(或簡(jiǎn)稱為"重組載體，，)。通常，在重組DNA技術(shù)中有用的表達(dá)載體常常是質(zhì)粒形式。在本說(shuō)明書(shū)中，"質(zhì)粒"和"載體"有時(shí)可互換使用，因?yàn)橘|(zhì)粒是載體的最常用形式。"多核苦酸"或"核酸"在本文中可互換使用，指任何長(zhǎng)度的核苷酸聚合物，包括DNA和RNA。核苷酸可以是脫氧核糖核香酸、核糖核苷酸、經(jīng)過(guò)修飾的核苷酸或堿基、和/或其類(lèi)似物，或者是可通過(guò)DNA或RNA聚合酶或者通過(guò)合成反應(yīng)摻入聚合物的任何底物。多核苷酸可包含經(jīng)過(guò)^'務(wù)飾的核苷酸，諸如曱基化核香酸及其類(lèi)似物。如果有的話，對(duì)核苦酸結(jié)構(gòu)的修飾可以在裝配聚合物之前或之后進(jìn)行。核苷酸序列可以由非核苷酸組分中斷。多核苷酸可以在合成后進(jìn)一步修飾，諸如通過(guò)與標(biāo)記物偶聯(lián)。其它類(lèi)型的修飾包括例如"帽"，將一個(gè)或多個(gè)天然存在的核苷酸用類(lèi)似物替代，核苷酸間修飾諸如例如具有不帶電荷連接(例如膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺酯(phosphoamidate)、氨基曱酸酯等)和具有帶電荷連接(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的修飾，含有懸垂模塊(pendantmoiety)諸如例如蛋白質(zhì)(例如核酸酶、毒素、抗體、信號(hào)肽、聚L-賴氨酸等)的〗務(wù)飾、具有嵌入劑(例如吖啶、補(bǔ)骨脂素等)的修飾、含有螯合劑(例如金屬、放射性金屬、硼、氧化性金屬等)的修飾、含有烷化劑的修飾、具有經(jīng)修飾連接(例如a端基異構(gòu)核酸(anomericnucleicacid)等)的修飾、以及未修飾形式的多核苷酸。另外，通常存在于糖類(lèi)中的任何羥基可以用例如膦酸(phosphonate)基團(tuán)、磷酸(phosphate)基團(tuán)替換，用標(biāo)準(zhǔn)保護(hù)基團(tuán)保護(hù)，或活化以制備與別的核苷酸的別的連接，或者可偶聯(lián)至固體或半固體支持物。5'和3'末端OH可磷酸化或者用胺或1-20個(gè)碳原子的有機(jī)加帽基團(tuán)模塊取代。其它羥基也可衍生成標(biāo)準(zhǔn)保護(hù)基團(tuán)。多核苷酸還可含有本領(lǐng)域普遍知道的核糖或脫氧核糖糖類(lèi)的類(lèi)似物形式，包括例如2'-氧—曱基、2'-氧-烯丙基、2'-氟-或2'-疊氮-核糖，碳環(huán)糖類(lèi)似物，a-端基異構(gòu)糖，差向異構(gòu)糖諸如阿拉伯糖、木糖或來(lái)蘇糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖，無(wú)環(huán)類(lèi)似物及脫堿基核苷類(lèi)似物諸如曱基核糖核苷?？捎脗溥x連接基團(tuán)替換一個(gè)或多個(gè)磷酸二酯連接。這些備選連接基團(tuán)包括但不限于以下實(shí)施方案，其中磷酸酯用P(O)S("硫代酸酯，，(thioate))、P(S)S("二硫代酸酯"(d他ioate))、(0)NR2("酰胺酯"(amidate))、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH2("曱縮醛"(formacetal))替代，其中R或R'各自獨(dú)立為H或者取代的或未取代的烴基(l-20個(gè)C)，任選含有醚(-O-)連接、芳基、烯基、環(huán)烴基、環(huán)烯基或芳烴基(araldyl)。并非多核苷酸中的所有連接都必需是相同的。前述描述適用于本文中提及的所有多核香酸，包括RNA和DNA。"寡核苦酸，，在用于本文時(shí)一般指短的多核苷酸，一般是單鏈，一般是合成的，長(zhǎng)度一般但不是必需小于約200個(gè)核苷酸。術(shù)語(yǔ)"寡核苷酸"與"多核苷酸"并不互相排斥。上文關(guān)于多核苷酸的描述平等且完全適用于寡核苷酸。關(guān)于肽或多肽序列的"百分比(。/。)氨基酸序列同一性"定義為對(duì)比序列并在必要時(shí)引入缺口以獲取最大百分比序列同一性后，且不將任何保守替代視為序列同一性的一部分時(shí)，候選序列中與特定肽或多肽序列中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分率。為測(cè)定百分比氨基酸序列同一性目的的比對(duì)可以本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的多種方式進(jìn)行，例如使用公眾可得到的計(jì)算機(jī)軟件，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MegAlign(DNASTAR)軟件。本領(lǐng)域技術(shù)人員可決定用于測(cè)量比對(duì)的適宜參數(shù)，包括對(duì)所比較序列全長(zhǎng)獲得最大比對(duì)所需的任何算法。然而，為了本發(fā)明的目的，％氨基酸序列同一性值是使用序列比較計(jì)算機(jī)程序ALIGN-2獲得的。ALIGN-2序列比較計(jì)算機(jī)程序由Genentech公司編寫(xiě)，源代碼已經(jīng)連同用戶文檔一起提交給美國(guó)版權(quán)局(USCopyrightO伍ce,WashingtonD.C.,20559)，并以美國(guó)版權(quán)注冊(cè)號(hào)TXU510087注冊(cè)。乂》眾可通過(guò)Genentech公司(SouthSanFrancisco,California)4尋到ALIGN-2程序。ALIGN2程序應(yīng)當(dāng)編譯成在UNIX操作系統(tǒng)，優(yōu)選數(shù)碼UNIX在采用ALIGN-2來(lái)比較氨基酸序列的情況中，給定氨基酸序列A相對(duì)于(to)、與(with)、或針對(duì)(against)給定氨基酸序列B的。/。氨基酸序列同一性(或者可表述為具有或包含相對(duì)于、與、或針對(duì)給定氨基S吏序列B的某一。/。氨基酸序列同一性的給定氨基酸序列A)如下計(jì)算分凄OC/Y乘100的氨基酸殘基數(shù)，且其中Y是B中的氨基酸殘基總數(shù)?？梢灶I(lǐng)會(huì)，若氨基酸序列A的長(zhǎng)度與氨基酸序列B的長(zhǎng)度不相等，則A相對(duì)于B的。/。氨基酸序列同一性將不等于B相對(duì)于A的。/。氨基酸序列同一性。除非另有具體說(shuō)明，本文中所使用的所有％氨基酸序列同一性值都是依照上一段所述，使用ALIGN-2計(jì)算機(jī)程序獲得的。術(shù)語(yǔ)"DLL4"(可互換地稱為"德耳塔樣4"或"S樣4")，在用于本文時(shí)，除非另有明確說(shuō)明或者上下文另有說(shuō)明，指任何天然的或變異的(無(wú)論是天然的或合成的)DLL4多肽。術(shù)語(yǔ)"天然序列"明確涵蓋天然存在的截短或分泌形式(例如胞外結(jié)構(gòu)域序列)、天然存在的變異形式(例如可變剪接形式)和天然存在的等位變體。術(shù)語(yǔ)"野生型DLL4"—般指包含天然存在DLL4蛋白的氨基酸序列的多肽。術(shù)語(yǔ)"野生型DLL4序列"一般指在天然存在DLL4中發(fā)現(xiàn)的氨基酸序列。29術(shù)語(yǔ)"Notch受體"(可互換的稱為"Notch"),在用于本文時(shí)，除非另有明確說(shuō)明或者上下文另有說(shuō)明，指任何天然的或變異的(無(wú)論是天然的或合成的)Notch受體多肽。人具有四種Notch受體(Notchl、Notch2、Notch3、和Notch4)。在用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)Notch受體包括所有四種人Notch受體或任一種。術(shù)語(yǔ)"天然序列"明確涵蓋天然存在的截短或分泌形式(例如胞外結(jié)構(gòu)域序列)、天然存在的變異形式(例如可變剪接形式)和天然存在的等位變體。術(shù)語(yǔ)"野生型Notch受體"一般指包含天然存在Notch受體蛋白的氨基酸序列的多肽。術(shù)語(yǔ)"野生型Notch受體序列"一^:指在天然存在Notch受體中找到的氨基酸序列。術(shù)語(yǔ)"抗體"和"免疫球蛋白"以最廣義互換使用，包括單克隆抗體(例如全長(zhǎng)或完整單克隆抗體)、多克隆抗體、多價(jià)抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性)，而且還可以包括某些抗體片段(如本文中更為詳細(xì)描述的)。抗體可以是人的、人源化的和/或親和力成熟的。術(shù)語(yǔ)"可變的，，指可變域中的某些部分在抗體序列間差異廣泛且用于每種特定抗體對(duì)其特定抗原的結(jié)合和特異性的實(shí)情。然而，變異性并非均勻分布于抗體的整個(gè)可變域。它集中于輕鏈和重鏈可變域中稱作互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)或高變區(qū)(HVR)的三個(gè)區(qū)段?？勺冇蛑懈痈叨缺Ｊ氐牟糠址Q作框架區(qū)(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變域各自包含四個(gè)FR,它們大多采取(3-折疊片構(gòu)象，通過(guò)形成環(huán)狀連接且在有些情況中形成(3-折疊片結(jié)構(gòu)一部分的三個(gè)CDR連接。每條鏈中的CDR通過(guò)FR非常接近的保持在一起，并與另一條鏈的CDR—起促成抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)的形成(參見(jiàn)Kabat等，&，wc"/VofeZ"s/mwwwo/og7.ca/7nerest，第5X反,NationalInstituteofHealth,Bethesda，MD.(1991))。恒定域不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但展現(xiàn)出多種效應(yīng)器功能，諸如抗體依賴性細(xì)胞的(細(xì)胞)毒性中抗體的參與。用木瓜蛋白酶消化抗體產(chǎn)生兩個(gè)相同的抗原結(jié)合片段，稱為"Fab"片段，各自具有一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，及一個(gè)剩余的"Fc"片段，其名稱反映了它易于結(jié)晶的能力。胃蛋白酶處理產(chǎn)生一個(gè)F(ab')2片段，它具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)且仍能夠交聯(lián)抗原。"Fv"是包含完整抗原識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段。在雙鏈Fv種類(lèi)中，此區(qū)由緊密、非共價(jià)結(jié)合的一個(gè)重鏈可變域和一個(gè)輕鏈可變域的二聚體組成。在單鏈Fv種類(lèi)中，一個(gè)重鏈可變域和一個(gè)輕鏈可變域可以通過(guò)柔性肽接頭共價(jià)相連，使得輕鏈和重鏈能在與雙鏈FV種類(lèi)類(lèi)似的"二聚體"結(jié)構(gòu)中相結(jié)合。正是在這種構(gòu)造中，各可變域的三個(gè)CDR相互作用而在VH-VL二聚體表面上確定了抗原結(jié)合位點(diǎn)。六個(gè)CDR共同賦予抗體以抗原結(jié)合特異性。然而，即使是單個(gè)可變域(或只包含對(duì)抗原特異的三個(gè)CDR的半個(gè)Fv)也具有識(shí)別和結(jié)合抗原的能力，只是親和力低于完整結(jié)合位點(diǎn)。Fab片段還包含輕鏈的恒定域和重鏈的第一恒定域(CH1)。Fab'片段與Fab片段的不同之處在于重鏈CH1結(jié)構(gòu)域的羧基末端增加了少數(shù)殘基，包括來(lái)自抗體鉸鏈區(qū)的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸。Fab'-SH是本文中對(duì)其中恒定域半胱氨酸殘基攜帶游離硫醇基的Fab'的稱謂。F(ab')2抗體片段最初是作為在Fab'片段之間有鉸鏈半胱氨酸的成對(duì)Fab'片段生成的。還知道抗體片段的其它化學(xué)偶聯(lián)。根據(jù)其恒定域的氨基酸序列，來(lái)自任何脊推動(dòng)物物種的抗體(免疫球蛋白)的"輕鏈"可歸入兩種截然不同的型中的一種，稱作卡巾自(K)和拉姆達(dá)(人)。根據(jù)其重鏈恒定域的氨基酸序列，免疫球蛋白可歸入不同的類(lèi)。免疫球蛋白有五大類(lèi)IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,其中有些可進(jìn)一步分為亞類(lèi)(同種型)，例如IgG"IgG2、IgG3、IgG4、IgAt和IgA2。將與不同類(lèi)的免疫球蛋白對(duì)應(yīng)的重鏈恒定域分別稱作a、5、s、Y和h不同類(lèi)的免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)造是眾所周知的。"抗體片段"只包含完整抗體的一部分，其中所述部分優(yōu)選保留該部分存在于完整抗體中時(shí)通常與之有關(guān)的至少一項(xiàng)、優(yōu)選大多數(shù)或所有功能?？贵w片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；及由抗體片段形成的多特異性抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體片段包含完整抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)，如此保留結(jié)合抗原的能力。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體片段，例如包含F(xiàn)c區(qū)的抗體片段，保留與Fc區(qū)存在于完整抗體中時(shí)通常與之有關(guān)的至少一項(xiàng)生物學(xué)功能，諸如FcRn結(jié)合、抗體半衰期調(diào)控、ADCC功能和補(bǔ)體結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體片段是體內(nèi)半衰期與完整抗體基本上相似的單價(jià)抗體。例如，這樣的抗體片段可包含一個(gè)抗原結(jié)合臂且其與能夠賦予該片段以體內(nèi)穩(wěn)定性的Fc序列相連。術(shù)語(yǔ)"高變區(qū)"、"HVR，，或"HV"在用于本文時(shí)指抗體可變域中序列上高度可變和/或形成結(jié)構(gòu)上定義的環(huán)的區(qū)域。通常，抗體包含六個(gè)高變區(qū)三個(gè)在VH中(Hl、H2、H3)，三個(gè)在VL中(Ll、L2、L3)。本文中使用且涵蓋許31多高變區(qū)的敘述。Kabat互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)是以序列變異性為基礎(chǔ)的，而且是最常用的(Kabat等，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5片反,PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda，MD,(1991》。Chothia改為指結(jié)構(gòu)環(huán)的位置(Chothia和Lesk,J.Mo/.196:901-917(1987))。AbM高變區(qū)代表KabatCDR與Chothia結(jié)構(gòu)環(huán)之間的折衷，而且得到OxfordMolecular的AbM抗體建模軟件的使用。"接觸(contact)，，高變區(qū)是以對(duì)可獲得的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)的分析為基礎(chǔ)的。下文記錄了這些高變區(qū)中每一個(gè)的殘基。環(huán)UHIHIKabatL24-L34L50-L56L89-L97H31-H35BAbML24-L34L50-L56L89-L97H26-H35B(Kabat編號(hào)方式)H31-H35H26-H35(Chothia編號(hào)方式)H50-H65H50-H58H95-H102H95-H102ChothiaL26-L32L50-L52L91-L96H26-H32H26-H32接觸L30-L36L46-L55L89-L96H30-H35BH30-H35H2H50-H65H50-H58H53-H55H47-H58H3H95-H102H95-H102H96-H101H93-H101高變區(qū)可包括如下"延伸的高變區(qū)，，VL中的24-36或24-34(Ll)、46-56或50陽(yáng)56(L2)和89-97(L3)及VH中的26-35(Hl)、50-65或49-65(H2)和93-102、94-102或95-102(H3)。對(duì)于這些定義中的每一個(gè)，可變區(qū)殘基是依照Kabat等，見(jiàn)上文編號(hào)的。"框架"或"FR"殘基指可變域中除本文中所定義的高變區(qū)殘基外的那些殘基。術(shù)語(yǔ)"單克隆抗體，，在用于本文時(shí)指從一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的抗體，即構(gòu)成群體的各個(gè)抗體相同和/或結(jié)合相同表位，除了生產(chǎn)單克隆抗體的過(guò)程中可能產(chǎn)生的可能變體外，此類(lèi)變體一般以極小量存在。此類(lèi)單克隆抗體典型地包括包含結(jié)合靶物的多肽序列的抗體，其中靶物結(jié)合多肽序列是通過(guò)包括從眾多多肽序列中選擇單一靶物結(jié)合多肽序列在內(nèi)的過(guò)程得到的。例如，選擇過(guò)程可以是從眾多克隆諸如雜交瘤克隆、噬菌體克隆或重組DNA32克隆的集合中選擇獨(dú)特克隆。應(yīng)當(dāng)理解，所選擇的靶物結(jié)合序列可進(jìn)一步改變，例如為了提高對(duì)靶物的親和力、將靶物結(jié)合序列人源化、提高其在細(xì)胞培養(yǎng)物中的產(chǎn)量、降低其在體內(nèi)的免疫原性、創(chuàng)建多特異性抗體等，而且包含改變后的靶物結(jié)合序列的抗體也是本發(fā)明的單克隆抗體。與典型地包含針對(duì)不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制備物不同，單克隆抗體制備物的每種單克隆抗體針對(duì)抗原上的單一決定簇。在它們的特異性外，單克隆抗體制備物的優(yōu)勢(shì)在于它們通常未受到其它免疫球蛋白的污染。修飾語(yǔ)"單克隆"表明抗體從基本上同質(zhì)的抗體群獲得的特征，不應(yīng)解釋為要求通過(guò)任何特定方法來(lái)生產(chǎn)抗體。例如，將依照本發(fā)明使用的單克隆抗體可通過(guò)多種技術(shù)來(lái)生成，包括例如雜交瘤法(例如Kohler等，Atow"256:495(I975);I-Iarlow等,Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,第2版，1988;Hammerling等，于MonoclonalAntibodiesandT-CellHybridomas，563-681，Elsevier,N.Y.,1981)、重組DNA法(參見(jiàn)例如美國(guó)專利No.4,816,567)、噬菌體展示技術(shù)(參見(jiàn)例如Clackson等，7Va&re352:624-628(1991);Marks等.，Afo/.所o/.222:581-597(1991);Sidhu等，/Mo/.S/o/.338(2):299-310(2004);Lee等，/M/.編.340(5):1073-1093(2004);Fellouse,尸rac.A^.Jcat/.101(34):12467-12472(2004);Lee等，J/m附朋o/.Me^xfe284(1-2):119-132(2004))、及用于在具有部分或整個(gè)人免疫球蛋白基見(jiàn)例如WO1998/24893;WO1996/34096;WO1996/33735;WO1991/10741;Jakobovits等，Prac.Ato/.Jcad90:2551(1993);Jakobovits等，362:255-258(1993);Bmggemann等,腸""Z麗畫(huà).7:33(1993);美國(guó)專利No.5,545,806;5,569,825;5,591,669(都屬于GenPharm);5,545,807;WO1997/17852;美國(guó)專利No.5,545,807;5,545,806;5,569,825;5,625,126;5,633,425;5,661,016;Marks等，所o/rec/z"o/ogy10:779-783(1992);Lonberg等，胸騰368:856-859(1994);Morrison,胸匿368:812-813(1994);Fishwild等，祝otec/zwo/c^14:845-851(1996);Neuberger,Atowre所她c/zm/ogy14:826(1996);LonbergandHuszar，她rw./mm薩/.13:65-93(1995))。非人(例如鼠)抗體的"人源化"形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗體。在極大程度上，人源化抗體指人免疫球蛋白(受體抗體)中的高變區(qū)殘基用具有期望特異性、親和力和能力的非人物種(供體33抗體)諸如小鼠、大鼠、家兔或非人靈長(zhǎng)類(lèi)的高變區(qū)殘基替換的免疫球蛋白。在有些情況中，將人免疫球蛋白的框架區(qū)(FR)殘基用相應(yīng)的非人殘基替換。此外，人源化抗體可包含在受體抗體或供體抗體中沒(méi)有找到的殘基。進(jìn)行這些修飾是為了進(jìn)一步改進(jìn)抗體的性能。一般而言，人源化抗體將包含至少一個(gè)、通常兩個(gè)基本上整個(gè)如下可變域，其中所有或基本上所有高變環(huán)對(duì)應(yīng)于非人免疫球蛋白的高變環(huán)，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗體任選還將包含至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)。更多細(xì)節(jié)參見(jiàn)Jones等，Atowe321:522-525(1986);Riechmann等，A^。旨e332:323-329(1988);Presta,C跳腸/.2:593-596(1992)。還可參見(jiàn)以下綜述及其引用的參考文獻(xiàn)Vaswani和Hamilton,^//ergy,^W/z附ac&/附mwwo/.1:105-115(1998);Harris,S/oc/zem,Soc.7hmyac//<my23:1035-1038(1995);Hurle禾口Gross,CwrO/.5:428-433(1994)。"嵌合"抗體(免疫球蛋白)中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類(lèi)別或亞類(lèi)的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而鏈的剩余部分與衍生自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類(lèi)別或亞類(lèi)的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，以及此類(lèi)抗體的片段，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性(美國(guó)專利No.4,816,567;Morrison等，戶rac.Ato/.爿cadt/5L481:6851-6855(1984))。本文中所使用的人源化抗體是嵌合抗體的一個(gè)子集。"單鏈Fv，，或"scFv"抗體片段包含抗體的VH和Vt結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于一條多肽鏈上。一般而言，SCFV多肽在VH與VL結(jié)構(gòu)域之間還包含多肽接頭，使得scFv能夠形成結(jié)合抗原所需的結(jié)構(gòu)。關(guān)于scFv的綜述參見(jiàn)Pluckthun,在Rosenburg和Moore編的《77ze/Vzarwaco/ogvo/Afowoc/owa/J"幼o(hù)&es》第113巻中，Springer-Verlag，NewYork,pp.269-315(1994)。"抗原"指抗體可選擇性結(jié)合的預(yù)定抗原。靶抗原可以是多肽、碳水化合物、核酸、脂質(zhì)、半抗原或其它天然存在的或合成的化合物。優(yōu)選地，靶抗原是多肽。術(shù)語(yǔ)"雙抗體(diabody)"指具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的小型抗體片段，該片段在同一條多肽鏈(VH-VL)中包含相連的重鏈可變域(VH)和輕鏈可變域(VO。通過(guò)使用過(guò)短的接頭使得同一條鏈上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間不能配對(duì)，迫使這些結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對(duì)，從而產(chǎn)生兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。雙抗體更完整的記載于例如EP404,097;WO93/11161;及Hollinger等，/Voc.A^/.Jc"J.OS^,卯:6444-6448(1993)。"人抗體"指擁有與由人生成的抗體的氨基酸序列對(duì)應(yīng)的氨基酸序列和/定義明確排除包含非人抗原結(jié)合殘基的人源化抗體。"親和力成熟的"抗體指在抗體的一個(gè)或多個(gè)CDR中具有一處或多處改變、導(dǎo)致該抗體對(duì)抗原的親和力與沒(méi)有這些改變的親本抗體相比有所改進(jìn)的抗體。優(yōu)選的親和力成熟的抗體將具有納摩爾或甚至皮摩爾量級(jí)的對(duì)靶抗原的親和力。親和力成熟的抗體可通過(guò)本領(lǐng)域已知規(guī)程來(lái)生成。Marks等，傷o/rec/wo/ogy10:779-783(1992)記載了通過(guò)VH和VL結(jié)構(gòu)域改組進(jìn)行的親和力成熟。以下文獻(xiàn)記載了CDR和/或框架殘基的隨機(jī)誘變Barbas等.，尸rac.Ato./km/.6W.園91:3809-3813(1994);Schier等，G匿169:147-155(1995);Yelton等，J./畫(huà)wwo/.155:1994-2004(1995);Jackson等，//畫(huà)國(guó)/.154(7):3310-9(1995);及Hawkins等，Mo/.所o/.226:889-896(1992)?？贵w"效應(yīng)器功能"指那些可歸于抗體Fc區(qū)(天然序列Fc區(qū)或氨基酸序列變體Fc區(qū))且隨抗體同種型而變化的生物學(xué)活性?？贵w效應(yīng)器功能的例子包括Clq結(jié)合和補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性；Fc受體結(jié)合；抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC);吞噬作用；細(xì)胞表面受體(例如B細(xì)胞受體)下調(diào)；和B細(xì)胞活化。"抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性，，或"ADCC，，指其中結(jié)合到某些細(xì)胞毒性細(xì)胞(例如天然殺傷(NK)細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)上存在的Fc受體(FcR)上的分泌型Ig使得這些細(xì)胞毒性效應(yīng)細(xì)胞能夠特異性結(jié)合攜帶抗原的耙細(xì)胞，隨后用細(xì)胞毒素殺死靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性形式。該抗體"武裝"(arm)細(xì)胞毒性細(xì)胞，而且是此類(lèi)殺傷作用絕對(duì)要求的。介導(dǎo)ADCC的主要細(xì)胞，NK細(xì)胞，只表達(dá)FcyRIII，而單核細(xì)胞表達(dá)FcyRI、FcYRII和FcyRI11。Ravetch和Kinet,J朋m.Wev./mm節(jié)o/,9:457-92(1991)第464頁(yè)表3總結(jié)了造血細(xì)胞上的FcR表達(dá)。為了評(píng)估感興趣分子的ADCC活性，可進(jìn)行體外ADCC測(cè)定法，諸如美國(guó)專利No.5,500,362或5，821，337或Presta美國(guó)專利No.6,737,056中所記載的?？捎糜诖祟?lèi)測(cè)定法的效應(yīng)細(xì)胞包括外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)和天然殺傷(NK)細(xì)胞?；蛘?另外，可在體內(nèi)評(píng)估感興趣分子的ADCC活性，例如在動(dòng)物模型中，諸如Clynes等，尸rac.扁.園95:652-656(1998)中所披露的。"人效應(yīng)細(xì)胞"指表達(dá)一種或多種FcR并行使效應(yīng)器功能的白細(xì)胞。優(yōu)選的是，該細(xì)胞至少表達(dá)FcyRin并行使ADCC效應(yīng)器功能。介導(dǎo)ADCC的人白細(xì)胞的例子包括外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)、天然殺傷(NK)細(xì)胞、單核細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞，優(yōu)選PBMC和NK細(xì)胞。效應(yīng)細(xì)胞可以從其天然來(lái)源例如血液分離。"Fc受體"或"FcR"描述結(jié)合抗體Fc區(qū)的受體。優(yōu)選的FcR是天然序列人FcR。此外，優(yōu)選的FcR是結(jié)合IgG抗體的FcR(y受體)，包括FcyRI、FcyRII和FcyRin亞類(lèi)的受體，包括這些受體的等位變體和可變剪接形式。FcyRII受體包括FcyRIIA("活化受體")和Fc7RIIB("抑制受體")，它們具有相似的氨基酸序列，區(qū)別主要在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中。活化受體FcYRIIA在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中包含免疫受體基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受體FcyRIIB在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中包含免疫受體基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)(參見(jiàn)綜述Dagron,Wev./附附w朋/.15:203-234(1997))。FcR的綜述參見(jiàn)Ravetch和Kinet，Aev./ww腦o/.9:457-492(1991);Capel等，Immunomethods4:25-34(1994);deHaas等，J丄a6.C//".Med126:330-41(1995)。術(shù)語(yǔ)"FcR，，在本文中涵蓋其它FcR,包括那些未來(lái)將會(huì)鑒定的。該術(shù)語(yǔ)還包括新生兒受體，F(xiàn)cRn,它負(fù)責(zé)將母體IgG轉(zhuǎn)移給胎兒(Guyer等，/附mw"o/.117:587(1976)及Kim等，//mm麗o/.24:249(1994))并調(diào)節(jié)免疫球蛋白的穩(wěn)態(tài)。WO00/42072(Presta)記載了對(duì)FcR的結(jié)合提高或降低的抗體變體。在此明確收入該專利出版物的內(nèi)容作為參考。還可參見(jiàn)Shields等，J所o/.C/ze肌9(2):6591-6604(2001)。測(cè)量對(duì)FcRn的結(jié)合的方法是已知的(參見(jiàn)例如Ghetie1997,Hinton2004)?？蓽y(cè)定人FcRn高親和力結(jié)合多肽與人FcRn的體內(nèi)結(jié)合和血清半衰期，例如在表達(dá)人FcRn的轉(zhuǎn)基因小鼠或經(jīng)轉(zhuǎn)染的人細(xì)胞系中，或者在施用了Fc變體多肽的靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物中。"補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性，，或"CDC"指存在補(bǔ)體時(shí)對(duì)靶細(xì)胞的溶解。經(jīng)典補(bǔ)體途徑的激活是由補(bǔ)體系統(tǒng)第一組分(Clq)結(jié)合其關(guān)聯(lián)抗原所結(jié)合的抗體(適宜亞類(lèi)的)起始的。為了評(píng)估補(bǔ)體激活，可進(jìn)行CDC測(cè)定法，例如如Gazzano-Santoro"a/.，//mwwwo/.M^/zo<*202:163(1996)中所i己載的。具有更改的Fc區(qū)氨基酸序列及提高或降低的C1q結(jié)合能力的多肽變體記載于美國(guó)專利No.6,194,551Bl和WO99/51642。在此明確收入那些專利出版物的內(nèi)容作為參考。還可參見(jiàn)Idusogie等，J/mm,o/.164:4178-4184(2000)。術(shù)語(yǔ)"含F(xiàn)c區(qū)多肽"指包含F(xiàn)c區(qū)的多肽，諸如批體或免疫粘附素(見(jiàn)下文定義)。Fc區(qū)的C-末端賴氨酸(依照EU編號(hào)系統(tǒng)的殘基447)可以消除，例如在純化多肽的過(guò)程中或者通過(guò)重組改造編碼多肽的核酸。因此，依照本發(fā)明包含具有Fc區(qū)的多肽的組合物可包含具有K447的多肽、消除了所有K447的多肽、或具有與沒(méi)有K447殘基的多肽的混合物。"阻斷性"抗體或"拮抗性"抗體指抑制或降低其所結(jié)合的抗原的生物學(xué)活性。"激動(dòng)性抗體"在用于本文時(shí)指模擬感興趣多肽的至少一項(xiàng)功能性活性的抗體。就本文目的而言，"受體人框架"是包含衍生自人免疫球蛋白框架或人共有框架的VL或VH框架之氨基酸序列的框架。"衍生自"人免疫球蛋白框架或人共有框架的受體人框架可包含與之相同的氨基酸序列，或者可包含預(yù)先存在的氨基酸序列變化。當(dāng)存在預(yù)先存在的氨基酸變化時(shí)，優(yōu)選存在不超過(guò)5個(gè)，優(yōu)選4個(gè)或更少，或者3個(gè)或更少預(yù)先存在的氨基酸變化。當(dāng)VH中存在預(yù)先存在的氨基酸變化時(shí)，優(yōu)選那些變化只位于71H、73H和78H中的三個(gè)、兩個(gè)或一個(gè)位置；例如，位于那些位置的氨基酸殘基可以是71A、73T和/或78A。在一個(gè)實(shí)施方案中，VL受體人框架在序列上與VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列相同。"人共有框架"指代表人免疫球蛋白VL或VH框架序列選集中最常見(jiàn)的氨基酸殘基的框架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列選集來(lái)自可變域序列亞組。通常，序列亞組是如Kabat等的亞組。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)于VL,亞組是如Kabat等的亞組Kl。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)于VH,亞組是如Kabat等的亞組m。"VH亞組III共有框架"包含從Kabat等的可變重鏈亞組m中的氨基酸序列獲得的共有序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，VH亞組ni共有框架氨基酸序列包含下列各序列的至少一部分或整個(gè)EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(SEQIDNO:42)-Hl-WVRQAPGKGLEWV(SEQIDNO:43)-H2-RFTISRDNSKNTLYLQ畫(huà)SLRAEDTAVYYC(SEQIDNO:44)-H3-WGQGTLVTVSS(SEQIDNO:45)。"VL亞組I共有框架"包含從Kabat等的可變輕鏈K亞組I中的氨基酸序列獲得的共有序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，VL亞組I共有框架氨基酸序列包含下列各序列的至少一部分或整個(gè)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQIDNO:46)-Ll-WYQQKPGKAPKLLIY(SEQIDNO:47)-L2-GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQIDNO:48)-L3-FGQGTKVEIK(SEQIDNO:49)。"病癥"或"疾病"指任何會(huì)受益于本發(fā)明的物質(zhì)/分子或方法的治療的疾患。這包括慢性和急性病癥或疾病，包括那些使哺乳動(dòng)物傾向于所討論病癥的病理狀況。本文中待治療的病癥的非限制性例子包括惡性和良性腫瘤；癌瘤、母細(xì)胞瘤和肉瘤。術(shù)語(yǔ)"細(xì)胞增殖性病癥"和"增殖性病癥"指與一定程度的異常細(xì)胞增殖有關(guān)的病癥。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞增殖性病癥指癌癥。"月中瘤"在用于本文時(shí)指所有贅生性細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖，無(wú)論是惡性的還是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性細(xì)月包和組織。術(shù)語(yǔ)"癌癥"、"癌性"、"細(xì)胞增殖性病癥"、"增殖性病癥"和"肺瘤"在本文中提到時(shí)并不互相排斥。術(shù)語(yǔ)"癌癥"和"癌性"指向或描述哺乳動(dòng)物中特征通常為細(xì)胞生長(zhǎng)/增殖不受調(diào)控的生理疾患。癌癥的例子包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、母細(xì)胞瘤、肉瘤和白血病。此類(lèi)癌癥的更具體例子包括鱗狀細(xì)胞癌、小纟田胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、肺的腺癌、肺的鱗癌、腹膜癌、肝細(xì)胞癌、胃腸癌、胰腺癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌(livercancer)、膀胱癌、肝瘤(hepatoma),乳腺癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、前列腺癌、外陰癌、曱狀腺癌、肝癌(hepaticcarcinoma)、胃癌、黑素瘤、及各種類(lèi)型的頭和頸癌。血管發(fā)生失調(diào)可導(dǎo)致可通過(guò)本發(fā)明的組合物和方法來(lái)治療的許多病癥。這些病癥包括非贅生性的和贅生性的疾患。贅生性疾患包括但不限于上文所描述的那些。非贅生性病癥包括但不限于不想要的或異常的肥大、關(guān)節(jié)炎、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、4艮屑病、銀屑病斑塊、結(jié)節(jié)病、動(dòng)脈粥樣硬化、動(dòng)脈粥樣硬化斑塊、糖尿病性和其它增殖性視網(wǎng)膜病包括早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病、晶狀體后纖維組織增生、新血管性青光眼(neovascularglaucoma)、年齡相關(guān)黃斑變性、糖尿病性黃斑水腫、角膜新血管形成、角膜移植片新血管形成、角膜移植片排斥、視網(wǎng)膜/脈絡(luò)膜新血管形成、眼角的新血管形成(發(fā)紅)、眼新血管疾病、血管再狹窄、動(dòng)靜脈畸形(AVM)、腦脊膜瘤、血管瘤、血管纖維瘤、曱狀腺增生(包括格雷夫斯氏(Graves)病)、角膜和其它組織移植、慢性炎癥、肺炎、急性肺損傷/ARDS、敗血癥、原發(fā)性肺動(dòng)脈高壓、惡性肺積液(malignantpulmonaryeffusion)、腦水月中(例如與急性中風(fēng)/閉合性頭部外傷/創(chuàng)傷有關(guān)的)、滑液炎癥(synovialinflammation)、RA中的血管翳形成、骨化性肌炎、肥大性骨形成、骨關(guān)節(jié)炎(OA)、頑固性腹水、多嚢卵巢病、子宮內(nèi)膜異位癥、第三空間流體病(3rdspacingoffluiddiseases)(胰腺炎、間隔綜合征、燒傷、腸病)、子宮纖維瘤(uterinefibroids)、早產(chǎn)、慢性炎癥諸如IBD(克羅恩氏(Crohn)病和潰瘍性結(jié)腸炎)、腎同種異體移植物排斥、炎性腸病、腎病綜合征、不想要的或異常的組織塊生長(zhǎng)(非癌性的)、血友病性關(guān)節(jié)、肥厚性瘢痕、毛發(fā)生長(zhǎng)的抑制、奧-韋二氏(Osler-Weber)綜合征、膿性肉芽腫晶狀體后纖維組織增生、硬皮病、沙眼、血管粘連、滑膜炎、皮炎、先兆子癇、腹水、心包積液(諸如與心包炎有關(guān)的)和胸腔積液。在用于本文時(shí)，"治療"或"處理"指試圖改變所治療個(gè)體或細(xì)胞的自然進(jìn)程的臨床干預(yù)，可以是為了預(yù)防或在臨床病理學(xué)的進(jìn)程中進(jìn)行。治療的期望效果包括預(yù)防疾病的發(fā)生或復(fù)發(fā)、緩解癥狀、削弱疾病的任何直接或間接病理學(xué)后果、防止轉(zhuǎn)移、減緩疾病進(jìn)展的速率、改善或減輕疾病狀態(tài)、及免除或改善預(yù)后。在有些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體用于延遲疾病或病癥的發(fā)生/發(fā)展。"個(gè)體"指脊椎動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選人。哺乳動(dòng)物包括，但不限于，牲畜(諸如牛)、運(yùn)動(dòng)用動(dòng)物、寵物(諸如貓、犬、和馬)、靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物、小鼠和大鼠。為了治療目的，"哺乳動(dòng)物"指歸入哺乳類(lèi)的任何動(dòng)物，包括人，家畜和牲畜，及動(dòng)物園、運(yùn)動(dòng)或?qū)櫸飫?dòng)物，諸如犬、馬、貓、牛等。優(yōu)選的是，哺乳動(dòng)物指人。"有效量，，指在必需的劑量和時(shí)間上有效實(shí)現(xiàn)期望的治療或預(yù)防效果的量。本發(fā)明的物質(zhì)/分子、激動(dòng)劑或拮抗劑的"治療有效量"可根據(jù)諸如個(gè)體的疾病狀態(tài)、年齡、性別和體重及該物質(zhì)/分子、激動(dòng)劑或拮抗劑在個(gè)體中引發(fā)39期望應(yīng)答的能力等因素而變化。治療有效量還指該物質(zhì)/分子、激動(dòng)劑或拮抗劑的治療有益效果勝過(guò)任何有毒或有害后果的量。"預(yù)防有效量"指在必需的劑量和時(shí)間上有效實(shí)現(xiàn)期望的預(yù)防效果的量。通常而非必然，由于預(yù)防劑量是在疾病發(fā)作之前或在疾病的早期用于受試者的，因此預(yù)防有效量低于治療有效量。術(shù)語(yǔ)"細(xì)胞毒劑，，在用于本文時(shí)指抑制或防止細(xì)胞的功能和/或引起細(xì)胞破壞的物質(zhì)。該術(shù)語(yǔ)意圖包括放射性同位素，例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、p32和Lu的放射性同位素；化療劑，例如曱氨蝶口令(methotrexate)、卩可審素(adriamycin)、長(zhǎng)春花生4勿石威類(lèi)(vincaalkaloids)(長(zhǎng)春新》威(vincristine)、長(zhǎng)春石咸(vinblastine)、依托泊芬(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法侖(melphalan)、絲裂霉素(mitomycin)C、苯丁酸氮芥(chlorambucil),柔紅霉素(daunombicin)或其它嵌入劑；酶及其片段，諸如溶核酶；抗生素；和毒素，諸如小分子毒素或者細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物起源的酶活毒素，包括其片段和/或變體；及下文披露的各種抗肺瘤藥或抗癌藥。下文記載了其它細(xì)胞毒劑。殺腫瘤藥引起腫瘤細(xì)胞的破壞。"化療劑"指可用于治療癌癥的化學(xué)化合物。化療劑的例子包括烷化劑類(lèi)(alkylatingagents),諸如塞替派(thiotepa)和CYTOXAN環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide);石黃酸烴基酉旨類(lèi)(alkylsulfonates),i者長(zhǎng)口白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan);f口p底泊舒凡(piposulfan);氮丙口定類(lèi)(aziridines)，i者長(zhǎng)口苯佐^^泉(benzodepa)、卡;皮酉昆(carboquone)、美妥替〉泉(meturedepa)禾口烏；乾替〉泉(uredepa);乙撐亞胺類(lèi)(ethylenimines)和曱基蜜胺類(lèi)(methylamelamines),包括六曱蜜胺(altretamine)、三乙撐蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撐磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙撐石克代辨酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羥曱蜜胺(trimethylolomelamine);番篇一支內(nèi)酯類(lèi)(acetogenin)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone));S-9-四氫大麻酚(tetrahydrocannabinol)(屈大麻f>(dronabinol),MARINOL);卩"立帕酉昆(lapachone);拉巾白醇(lapachol);秋水仙素類(lèi)(colchicines);白樺月旨酸(betulinicacid);喜杉十石威(camptothecin)(包才舌合成類(lèi)似、物4乇泊康(topotecan)(HYCAMTIN)、CPT-11(伊立替康(irinotecan)，CAMPTOSAR)、乙酰喜樹(shù)堿、東復(fù)菪亭(scopoletin)和9-氨基喜樹(shù)堿)；苔蘚抑素(bryostatin);callystatin;CC-1065(包括其阿多來(lái)新(adozelesin)、卡折來(lái)新(carzelesin)和比折來(lái)新(bizelesin)合成類(lèi)似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin);鬼臼酸(podophyllinicacid);替尼泊香(teniposide);隱藻素類(lèi)(cryptophycins)(凈寺另ll是隱藻素1和隱藻素8);多拉司他汀(dolastatin);duocarmycin(包括合成類(lèi)似物，KW-2189和CB1-TM1);艾榴塞洛素(eleutherobin);pancratistatin;sarcodictyin;海纟帛才中素(spongistatin);氛齊類(lèi)(nitrogenmustards)，諸^口苯丁酉菱氛芥(chlorambucil)、茶氮芥(chlornaphazine)、月旦石粦醜胺(cholophosphamide)、辨氛莫司汀(estramustine)、異環(huán)石粦酰胺(ifosfamide)、雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)、鹽酸氧氮芥(mechlorethamineoxidehydrochloride)、美法侖(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥月旦甾醇(phenesterine)、〉發(fā)尼莫司、汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧口定氮芥(uracilmustard);亞硝脲類(lèi)(nitrosoureas),諸"^口卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、一畐莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine);抗生素類(lèi)，諸如烯二炔類(lèi)抗生素(enediyne)(例如加利車(chē)霉素(calicheamicin)，尤其是加利車(chē)霉素yll和加利車(chē)霉素coll(參見(jiàn)例如Agnew，Chem.Intl.Ed.Engl.33:183-186(1994));蒽環(huán)類(lèi)抗生素(dynemicin),包括dynemicinA;埃斯波霉素(esperamicin);以及新制癌素(neocarzinostatin)發(fā)色團(tuán)和相關(guān)色蛋白烯二炔類(lèi)抗生素發(fā)色團(tuán))、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放線菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮絲氨酸(azaserine)、博來(lái)霉素(bleomycin)、放線菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋紅霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放線菌素D(dactinomycin)、柔紅霉素(dau證ubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、ADRIAMYCIN⑧多柔比星(doxorubicin)(包括嗎啉代多柔比星、氰基嗎啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星和脫氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊達(dá)比星(idambicin)、麻西羅霉素(marcellomycin)、絲裂霉素類(lèi)(mitomycins)諸如絲裂霉素C、霉酚酸(mycophenolicacid)、諾拉霉素(nogalamycin)、橄欖霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、potfiromycin、嘌呤霉素(puromycin)、三考失阿霉素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、《連黑菌素(streptonigrin)、鏈佐星(streptozocin)、殺結(jié)核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、凈司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin);抗代謝物類(lèi)，諸如曱氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU);葉酸類(lèi)似物，諸如二曱葉酸(denopterin)、曱氨蝶呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三曱曲沙(trimetrexate);嘌呤類(lèi)似物，41i者如氟達(dá)濱(fludarabine)、6-3克基噤口令(mercaptopurine)、石克。米噤p令(thiamiprine)、硫鳥(niǎo)嘌呤(thioguanine);嘧咬類(lèi)似物，諸如安西他濱(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、雙脫氧尿芬(dideoxyuridine)、去氧氟尿芬(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿芬(floxuridine);雄激素類(lèi)，諸如卡魯睪酮(calusterone)、丙'酸屈他i^酉同(dromostanolonepropionate)、表石危力,醇(epitiostanol)、美力,烷(mepitiostane)、睪內(nèi)酉旨(testolactone);抗腎上腺類(lèi)，諸如氨魯米特(aminoglutethimide)、米4乇坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane);葉酸補(bǔ)充劑，諸如亞葉酸(folinicacid);醋葡醛內(nèi)酯(aceglatone);醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside);氨基乙酰丙酸(aminolevulinicacid);恩尿。密口定(eniluracil);安口丫咬(amsacrine);bestrabucil;比生群(bisantrene);依達(dá)曲沙(edatraxate);地磷酰胺(defofamine);地美可辛(demecolcine);地吖酉昆(diaziquone);elfornithine;依利醋4妄(elliptiniumacetate);i矣;皮霉素(epothilone);依托格魯(etoglucid);硝酸鎵；羥脲(hydroxyurea);香菇多糖(lentinan);氯尼達(dá)明(lonidainine);美登木素生物石成類(lèi)(maytansinoids),i者如美登素(maytansine)和安絲菌素(ansamitocin);米托胍月宗(mitoguazone);米才乇蒽S昆(mitoxantrone);莫旅達(dá)醇(mopidamol);二胺硝吖咬(nitracrine);噴司他丁(pentostatin);蛋氨氮芥(phenamet);外匕柔比星(pirarubicin);洛索蒽酉昆(losoxantrone);2-乙基酰肼(ethylhydrazide);丙卡巴肼(procarbazine);PSK⑧多糖復(fù)合物(JHSNaturalProducts,Eugene,OR);雷佐生(razoxane);根霉素(rhizoxin);西索菲蘭(sizofiran);蟲(chóng)茅J走4者(spirogermanium);纟田交《連孑包菌酉同酉交(tenuazonicacid);三亞胺醌(triaziquone);2，2'，2"-三氯三乙胺；單端孢菌素類(lèi)(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verrucarin)A、桿孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidin));烏拉坦(urethan);長(zhǎng)春地辛(vindesine)(ELDISINE,FILDESIN);達(dá)卡巴。秦(dacarbazine);甘露醇氮芥(mannomustine);二溴甘露酉孚(mitobronitol);二溴衛(wèi)矛西f(mitolactol);旅泊溴烷(pipobroman);gacytosine;阿糖胞普(arabinoside)("Ara-C");塞替派(thiotepa);類(lèi)紫杉醇(taxoids)，例力。TAXOL⑧帕利4也塞(paclitaxel)(Bristol-MyersSquibbOncology,Princeton,N丄)、ABRAXANEtm不含克列莫佛(Cremophor)，清蛋白改造的納米孝貞斗立劑型巾白矛H也塞(AmericanPharmaceuticalPartners,Schaumberg,Illinois)和TAXOTERE⑧多西他塞(doxetaxel)(Rh6ne-PoulencRorer，Antony,France);苯丁酸氮芥(chlorambucil);吉西他濱(gemcitabine)(GEMZAR);6-硫鳥(niǎo)嘌呤(thioguanine);巰基口票p令(mercaptopurine);曱氨蟲(chóng)菜呤(methotrexate);柏類(lèi)似物，諸如順柏(cisplatin)和卡柏(carboplatin);長(zhǎng)春石威(vinblastine)(VELBAN);鉑；依托泊苷(etoposide)(VP-16);異環(huán)磷酰辟(ifosfamide);米托蒽醌(mitoxantrone);長(zhǎng)春新石威(vincristine)(ONCOVIN);奧沙利柏(oxaliplatin);亞葉酸(leucovorin);長(zhǎng)春瑞濱(vinorelbine)(NAVELBINE);能滅瘤(novantrone);依達(dá)曲沙(edatrexate);道諾霉素(daunomycin);氛基蝶吟(aminopterin);伊本膦酸鹽(ibandronate);拓樸異構(gòu)酶抑制劑RFS2000;二氟曱基鳥(niǎo)氨酸(DMFO);類(lèi)視黃酸(retinoids)，諸如視黃酸(retinoicacid);卡培他濱(capecitabine)(XELODA);任何上述物質(zhì)的藥學(xué)可接受鹽、酸或衍生物；以及兩種或多種上述物質(zhì)的組合，諸如CHOP(環(huán)磷酰胺、多柔比星、長(zhǎng)春新堿和潑尼松龍聯(lián)合療法的縮寫(xiě))和FOLFOX(奧沙利鉑(ELOXATIN)if關(guān)合5-FU和亞葉酸的治療方案的縮寫(xiě))。該定義還包括作用為調(diào)節(jié)、降低、阻斷、或抑制可促進(jìn)癌生長(zhǎng)的激素效果的抗激素劑，且常常是系統(tǒng)或全身治療的形式。它們自身可以是激素。例子包括抗雌激素類(lèi)和選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑類(lèi)(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX⑧他莫昔芬)、EVISTA⑧雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮(onapristone)和FARESTON托瑞米芬(toremifene);抗孕酮類(lèi)；雌激素受體下調(diào)劑類(lèi)(ERD);功能為抑制或關(guān)閉卵巢的藥劑，例如促黃體生成激素釋放激素(LHRH)激動(dòng)劑，諸如LUPRON⑧和ELIGARD醋酸亮丙瑞林(leuprolideacetate)、醋酸戈舍瑞林(goserelinacetate)、醋酸布舍瑞林(buserelinacetate)和曲普瑞林(triptorelin);其它抗雄激素類(lèi)，諸如氟他米特(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)和比卡米特(bicalutamide);及抑制在腎上腺中調(diào)節(jié)雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制劑，諸如例如4(5)-咪唑、氨魯米特(aminoglutethimide)、MEGASE⑧醋酸甲地孕酉同(megestrolacetate)、AROMASIN依西美坦(exemestane)、福美坦(formestane)、法倔唑(fadrozole)、RIVISOR⑧伏羅唑(vorozole)、FEMARA來(lái)曲唑(letrozole)和ARIMIDEX⑧阿那曲唑(anastrozole)。另夕卜，化療劑的這種定義包括二膦酸鹽類(lèi)(bisphosphonates),i者如氯膦酸鹽(clodronate)(例如BONEFOS⑧或OSTAC⑧)、DIDROCAL⑧依替膦酸鈉(etidronate),NE-58095、ZOMETA⑧唑來(lái)膦酸/唑來(lái)膦酸鹽(zoledronicacid/zoledronate)、FOSAMAX阿倫膦酸鹽(alendronate)、AREDIA⑧帕米膦酸鹽(pamidronate)、SKELID⑧替魯膦酸鹽(tiludronate)或ACTONEL⑧利塞膦酸鹽(risedronate);以及曲沙他濱(troxadtabine)(1,3-二氧戊環(huán)核苷胞嘧啶類(lèi)似物)；反義寡核苷酸，特別是抑制牽涉異常(abherant)細(xì)胞增殖的信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的基因表達(dá)的反義寡核苷酸，諸如例如PKC-a、Raf、H-Ras和表皮生長(zhǎng)因子受體(EGF-R);疫苗，諸如THERATOPE疫苗和基因療法疫苗，例如ALLOVECTIN疫苗、LEUVECTIN⑧疫苗和VAXID⑧疫苗；LURTOTECAN⑧拓樸異構(gòu)酶l抑制劑；ABARELIXrmRH;lap對(duì)inibditosylate(ErbB-2和EGFR雙重酪氨酸激酶小分子抑制劑，也稱為GW572016);及任何上述物質(zhì)的藥學(xué)可接受鹽、酸或衍生物。"生長(zhǎng)抑制劑"在用于本文時(shí)指在體外或在體內(nèi)抑制細(xì)胞(諸如表達(dá)DLL4的細(xì)胞)生長(zhǎng)的化合物或組合物。因此，生長(zhǎng)抑制劑可以是顯著降低處于S期的細(xì)胞(諸如表達(dá)DLL4的纟田月包)百分比的藥劑。生長(zhǎng)抑制劑的例子包括阻斷細(xì)胞周期行進(jìn)(處于S期以外的位置)的藥劑，諸如誘導(dǎo)G1停滯和M期停滯的藥劑。經(jīng)典的M期阻斷劑包括長(zhǎng)春藥類(lèi)(vincas)(長(zhǎng)春新磁<(vincristine)和長(zhǎng)春堿(vinblastine))、紫杉烷類(lèi)(taxanes)、和拓樸異構(gòu)酶II抑制劑諸如多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epimbicin)、柔紅霉素(daunorubicin)、依托泊苷(etoposide)和博來(lái)霉素(bleomycin)。那些阻滯G1的藥劑也溢出進(jìn)入S期停滯，例如DNA烷化劑類(lèi)諸如他莫昔芬(tamoxifen)、潑尼松(prednisone)、達(dá)卡巴口秦(dacarbazine)、雙氯乙基曱胺(mechlorethamine)、順鉑(cisplatin)、曱氨蝶呤(methotrexate)、5-氟尿嘧咬(5-fluorouracil)和ara-C。更多信息可參見(jiàn)《TheMolecularBasisofCancer》，Mendelsohn和Israel編，第l章，題為"Cellcycleregulation,oncogenes,andantieioplasticdrugs",Murakaini等，WBSaunders,Philadelphia,1995，尤其是第13頁(yè)。紫杉烷類(lèi)(帕利他塞(paclitaxel)和多西他賽(docetaxel))是衍生自紫杉樹(shù)的抗癌藥。衍生自歐洲紫杉的多西他賽(TAXOTERE,Rhone-PoulencRorer)是巾白利他塞(TAXOL,Bristol-MyersSquibb)的半合成類(lèi)似物。帕利他塞和多西他賽促進(jìn)由微管蛋白二聚體裝配成微管并通過(guò)防止解聚使微管穩(wěn)定，導(dǎo)致對(duì)細(xì)胞中有絲分裂的抑制。"多柔比星(Doxorubicin)，，是蒽環(huán)類(lèi)抗生素。多柔比星的完整化學(xué)名是(8S-順式)-10-[(3-氨基-2，3，6-三脫氧-a-L-來(lái)蘇-。比喃己糖基)氧基]-7,8，9,10-四氫-6，8，11-三羥基-8-(羥基乙?；?-1-曱氧基-5，12-萘二酮。(8S-cis)-10-[(3-amino-2,3,6-trideoxy-a-L-lyxo-hexapyranosyl)oxy]-7,8,9，10-tetrahydro-6,8,11-trihydroxy-8-(hydroxyacetyl)-1-methoxy-5，12-naphthacenedione術(shù)語(yǔ)"抗肺瘤組合物"指可用于治療癌癥的組合物，其包含至少一種活性治療劑，例如"抗癌劑"。治療劑(抗癌劑，在本文中也稱為"抗肺瘤劑")的例子包括但不限于例如化療劑、生長(zhǎng)抑制劑、細(xì)胞毒劑、放射療法中所使用的藥劑、抗血管發(fā)生劑、凋亡劑、抗微管蛋白劑、毒素、和其它用于治療癌癥的藥劑例如抗VEGF中和性抗體、VEGF拮抗劑、抗HER-2、抗CD20、表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)拮抗劑(例如酪氨酸激酶抑制劑)、HER1/EGFR抑制劑、erlotinib、COX-2抑制劑(例如塞來(lái)考昔(celecoxib))、干擾素、細(xì)胞因子、能與ErbB2、ErbB3、ErbB4、或VEGF受體中的一種或多種結(jié)合的拮抗劑(例如中和性抗體)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)和/或干細(xì)胞因子(SCF)的受體酪氨酸激酶的抑制劑(例如曱磺酸伊馬替尼(imatinibmesylate)(GleevecNovartis))、TRAIL/Apo2L、及其它生物活性和有機(jī)化學(xué)劑等。術(shù)語(yǔ)"前體藥物"或"藥物前體"在用于本申請(qǐng)時(shí)指與母藥(parentdrug)相比對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性較小并能夠酶促活化或轉(zhuǎn)變?yōu)楦呋钚阅杆幮问降那绑w或f;亍生物形式藥用活性物質(zhì)。參見(jiàn)例如Wilman,"ProdrugsinCancerChemotherapy",BiochemicalSocietyTransactions,14，pp.375-382，615thMeetingBelfast(1986)及Stella等，"Prodrugs:AChemicalApproachtoTargetedDrugDelivery",DirectedDrugDelivery,Borchardt等編,pp.247-267，HumanaPress(1985)。本發(fā)明的前體藥物包括但不限于含磷酸鹽/酯前體藥物、含硫代磷酸鹽/酯前體藥物、含硫酸鹽/酯前體藥物、含肽前體藥物、D-氨基酸修飾前體藥物、糖基化前體藥物、含(3-內(nèi)酰胺前體藥物、含任選取代苯氧基乙酰胺的前體藥物或含任選取代苯乙酰胺的前體藥物、可轉(zhuǎn)變?yōu)楦呋钚远鵁o(wú)細(xì)胞毒性的藥物的5-氟胞嘧咬和其它5-氟尿苦前體藥物?？裳苌鸀楸景l(fā)明使用的前體藥物形式的細(xì)胞毒性藥物的例子包括但不限于上文描述的那些化療劑。"抗血管發(fā)生劑，，或"血管發(fā)生抑制劑"指或是直接或是間接抑制血管發(fā)生(angiogenesis)、血管生成(vasculogenesis)、或不想要的血管通透性的小分子量物質(zhì)、多核苦酸(包括例如抑制性RNA,即RNAi或siRNA)、多肽、分離的蛋白質(zhì)、重組蛋白、抗體、或其偶聯(lián)物或融合蛋白。例如，抗血管發(fā)生劑是上文定義的血管發(fā)生劑的抗體或其它拮抗劑，例如VEGF的抗體、VEGF受體的抗體、可溶性VEGF受體片段、或阻斷VEGF受體信號(hào)傳導(dǎo)的小分子(例如PTK787/ZK2284、SU6668、SUTENT/SU11248(sunitinibmalate)、AMG706或例如國(guó)際專利申請(qǐng)WO2004/113304中所記載的那些)?？寡馨l(fā)生劑還包括天然血管發(fā)生抑制劑，例如血管他丁(angiostatin)、內(nèi)皮他丁(endostatin)等。參見(jiàn)例如Klagsbmn和D,Amore,^朋w.iev.P/2j^'o/.，53:217-39(1991);Streit和Detmar，(9"coge"e，22:3172-3179(2003)(例如列舉惡性黑素瘤中抗血管發(fā)生療法的表3);Ferrara和Alitalo，A^wreMeW"'"e5(12):1359-1364(1999);Tonini等，6>"coge"e,22:6549-6556(2003)(例如列舉抗血管發(fā)生因子的表2);及SatoC7/.(9co/.，8:200-206(2003)(例如列舉臨床試驗(yàn)中所使用的抗血管發(fā)生劑的表l)。本發(fā)明的組合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涵蓋包含抗DLL4抗體的組合物，包括藥用組合物；及包含編碼抗DLL4抗體的序列的多核普酸。在用于本文時(shí)，組合物包含一種或多種結(jié)合DLL4的抗體，和/或一種或多種包含編碼一種或多種結(jié)合DLL4的抗體的序列的多核香酸。這些組合物可進(jìn)一步包含合適的載體，諸如藥學(xué)可接受的賦形劑，包括緩沖劑，它們是本領(lǐng)域眾所周知的。本發(fā)明還涵蓋分離的抗體和多核普酸的實(shí)施方案。本發(fā)明還涵蓋基本上純的抗體和多核香酸的實(shí)施方案。本發(fā)明的抗DLL4抗體優(yōu)選是單克隆的。本發(fā)明的范圍還涵蓋本文中所提供的抗DLL4抗體的Fab、Fab'、Fab'-SH和F(ab')2。這些抗體片段可通過(guò)常規(guī)方法來(lái)制備，諸如酶促消化，或者可以通過(guò)重組技術(shù)來(lái)生成。此類(lèi)抗體片段可以是嵌合的或人源化的。這些片段可用于下文所列的診斷和治療目的。單克隆抗體是由一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的，即構(gòu)成群體的各個(gè)抗體相同，除了可能以極小量存在的可能的天然存在突變。由此，修飾語(yǔ)"單克隆"指明抗體的特征，即不是不同抗體的混合物。本發(fā)明的抗DLL4單克隆抗體可使用最初由Kohler等，7Va&re256:495(1975)記載的雜交瘤方法來(lái)制備，或者可以通過(guò)重組DNA方法(美國(guó)專利No.4,816，567)來(lái)制備。在雜交瘤方法中，免疫小鼠或其它適宜的宿主動(dòng)物，諸如倉(cāng)鼠，以引發(fā)生成或能夠生成如下抗體的淋巴細(xì)胞，所述抗體會(huì)特異性結(jié)合用于免疫的蛋白質(zhì)。DLL4的抗體一般通過(guò)在動(dòng)物中多次皮下(sc)或腹膜內(nèi)(ip)注射DLL4和佐劑來(lái)生成。DLL4可以使用本領(lǐng)域眾所周知的方法來(lái)制備，其中有些方法在本文中有進(jìn)一步的描述。例如，DLL4的重組生產(chǎn)在下文中有描述。在一個(gè)實(shí)施方案中，將動(dòng)物用包含DLL4胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)且其融合至免疫球蛋白重《連Fc部分的DLL4書(shū)f生物免疫。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將動(dòng)物用DLL4-IgG1融合蛋白免疫。通常將動(dòng)物針對(duì)DLL4的免疫原性偶聯(lián)物或衍生物禾口單石粦酰月旨質(zhì)A(MPL)/trehalosedicrynomycolate(TDM)(RibiImmunochem.Research,Inc.,Hamilton,MT)進(jìn)行免疫，將溶液皮內(nèi)注射于多個(gè)部位。2周后，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行加強(qiáng)免疫。7-14天后，對(duì)動(dòng)物采血，并對(duì)血清測(cè)定抗DLL4滴度。對(duì)動(dòng)物進(jìn)行加強(qiáng)免疫，直到滴度達(dá)到平臺(tái)(plateaus)。或者，可以在體外免疫淋巴細(xì)胞。然后，使用合適的融合劑諸如聚乙二醇將淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，以形成雜交瘤纟田胞(Goding,Afo"oc/oa/y4w^7o&esvW"一/as朋(i尸racrice，pp.59-103，AcademicPress,1986)。將如此制備的雜交瘤細(xì)胞在合適的培養(yǎng)基中接種和培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基優(yōu)選含有抑制未融合的親本骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或存活的一種或多種物質(zhì)。例如，若親本骨髓瘤細(xì)胞缺乏酶次黃噤呤鳥(niǎo)噤呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT),則用于雜交瘤的培養(yǎng)基典型的將含有次黃噪呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培養(yǎng)基)，這些物質(zhì)阻止HGPRT缺陷細(xì)胞生長(zhǎng)。優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞是那些高效融合、支持所選抗體生成細(xì)胞穩(wěn)定的高水平生成抗體、并對(duì)諸如HAT培養(yǎng)基的培養(yǎng)基敏感的。在這些細(xì)胞中，優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞系是鼠骨髓瘤系，諸如那些可從索爾克研究所細(xì)胞分配中心(SalkInstituteCellDistributionCenter,SanDiego,California,USA)獲4尋的MOPC-21和MPC-l1小鼠肺瘤及可從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,Rockville,Maryland,USA)獲得的SP-2或X63-Ag8-653細(xì)胞所衍生的。人骨髓瘤和小鼠-人異源骨髓瘤細(xì)胞系也已描述用于生成人單克隆抗體(Kozbor,,/附w麗o/.133:3001(1984);Brodeur等,M/wc/owa/y4油'6o辦尸radw"/cw!Tec/7"—朋d^4，//c加'om1,pp.51-63,MarcelDekker,Inc.,NewYork,1987)。可對(duì)雜交瘤細(xì)胞正在其中生長(zhǎng)的培養(yǎng)液測(cè)定針對(duì)DLL4的單克隆抗體的生成。優(yōu)選的是，通過(guò)免疫沉淀或通過(guò)體外結(jié)合測(cè)定法，諸如放射免疫測(cè)定法(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA),測(cè)定由雜交瘤細(xì)胞生成的單克隆抗體的結(jié)合特異性。單克隆抗體的結(jié)合親和力可通過(guò)例如Mimson等，J朋/.&Vc/zew.107:220(1980)的Scatchard分析來(lái)測(cè)定。在鑒定得到生成具有期望特異性、親和力和/或活性的抗體的雜交瘤細(xì)胞后，該克隆可通過(guò)有限稀釋規(guī)程進(jìn)行亞克隆并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行培養(yǎng)(Goding,Mowc/o腦/v4油力oAesv尸n'"一/esawd尸ra"/ce,pp.59-103,AcademicPress,1986)。適于這一目的的培養(yǎng)基包括例如D-MEM或RPMI-1640培養(yǎng)基。另外，雜交瘤細(xì)胞可在動(dòng)物中作為腹水瘤進(jìn)行體內(nèi)培養(yǎng)。可通過(guò)常規(guī)免疫球蛋白純化規(guī)程，諸如例如蛋白A-Sepharose、羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析，將亞克隆分泌的單克隆抗體與培養(yǎng)液、腹水或血清適當(dāng)分開(kāi)。體克隆來(lái)制備。在原理上，通過(guò)篩選噬菌體文庫(kù)來(lái)選擇合成抗體克隆，所述噬菌體文庫(kù)含有展示融合至噬菌體外殼蛋白的各種抗體可變區(qū)片段(Fv)的噬菌體。通過(guò)針對(duì)所需抗原的親和層析淘選此類(lèi)噬菌體文庫(kù)。表達(dá)能夠結(jié)合所需抗原的Fv片段的克隆被吸附至抗原，從而與文庫(kù)中不結(jié)合的克隆分開(kāi)。然后將結(jié)合的克隆從抗原上洗脫，而且可以通過(guò)額外的抗原吸附/洗脫循環(huán)進(jìn)一步富集。本發(fā)明的任何抗DLL4抗體可以如下獲得，即設(shè)計(jì)合適的抗原篩選規(guī)程來(lái)選擇感興趣的噬菌體克隆，接著使用來(lái)自感興趣的噬菌體克隆的Fv序歹'J和Kabat等，kS^wewcey<尸rafe/m1<TwwMwo/og/ca//"妙ast，第5版,NIHPublication91-3242,BethesdaMD(1991)，vols.l-3中記載的合適的恒定區(qū)(Fc)序列來(lái)構(gòu)建全長(zhǎng)抗DLL4抗體克隆?？贵w的抗原結(jié)合域由兩個(gè)約110個(gè)氨基酸的可變(V)區(qū)形成，分別來(lái)自重鏈(VL)和輕鏈(VH),都呈現(xiàn)三個(gè)高變環(huán)或互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。可變域可以功能性的展示在噬菌體上，或是作為單鏈Fv(scFv)片段(其中VH和VL通過(guò)短的、柔性的肽共價(jià)相連)，或者作為Fab片段(其中它們各自與恒定域融合且非共價(jià)相互作用)，如Winter等，J朋.iev./mw朋o/.，12:433-455(1994)所述。在用于本文時(shí)，編碼scFv的噬菌體克隆和編碼Fab的噬菌體克隆統(tǒng)稱為"Fv噬菌體克隆"或"Fv克隆"。VH和VL基因的全集可以通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)分開(kāi)克隆，并在噬菌體文庫(kù)中隨機(jī)重組，然后可以搜索抗原結(jié)合克隆，如Winter等，iev./mmw"o/.,12:433-455(1994)所述。來(lái)自經(jīng)免疫來(lái)源的文庫(kù)能提供對(duì)免疫原有高親和力的抗體，無(wú)需構(gòu)建雜交瘤。或者，可以克隆未免疫的全集，用于為廣泛的非自身的及自身的抗原提供單一人抗體來(lái)源，無(wú)需任何免疫，如Griffiths等，￡MB(9J,12:725-734(1993)所述。最后，未免疫的文庫(kù)還可以以合成方式來(lái)構(gòu)建，即從干細(xì)胞克隆未重排的V基因片段，使用包含隨機(jī)序列的PCR引物來(lái)編碼高度可變的CDR3區(qū)并在體外實(shí)現(xiàn)重排，如HoogenboomandWinter,/Mo/.所o/.，227:381-388(1992)所述。通過(guò)與次要外殼蛋白pin融合，使用絲狀噬菌體來(lái)展示抗體片段?？贵w片段可以展示為單鏈Fv片段，其中VH與VL結(jié)構(gòu)域通過(guò)柔性多肽間隔物在同一多肽鏈上相連，例如如Marks等，■/Mo/.脂.，222:581-597(1991)所述，或者展示為Fab片段，其中一條鏈與pIII融合，而另一條鏈分泌到細(xì)菌宿主細(xì)胞周質(zhì)中，在此裝配Fab-外殼蛋白結(jié)構(gòu)，其通過(guò)取代一些野生型外殼蛋白而展示在噬菌體表面上，例如如Hoogenboom等，M/c/.Jc/AWay.，19:4133-4137(1991)所述。酸。如果希望文庫(kù)偏向抗DLL4克隆，那么可以給受試者免疫DLL4以產(chǎn)生抗體應(yīng)答，并回收脾細(xì)胞和/或循環(huán)B細(xì)胞或其它外周血淋巴細(xì)胞(PBL)用于文庫(kù)構(gòu)建。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，如下得到了偏向抗DLL4克隆的人抗體基因片段文庫(kù)，即在攜帶功能性人免疫球蛋白基因陣列(且缺乏功能性內(nèi)源抗體生成系統(tǒng))的轉(zhuǎn)基因小鼠中產(chǎn)生抗DLL4抗體應(yīng)答，使得DLL4免疫產(chǎn)生生成針對(duì)DLL4的人抗體的B細(xì)胞。制備人抗體的轉(zhuǎn)基因小鼠的生成在下文中有描述?？梢匀缦芦@得抗DLL4反應(yīng)性細(xì)胞群的進(jìn)一步富集，即使用合適的篩選規(guī)程來(lái)分離表達(dá)DLL4特異性膜結(jié)合抗體的B細(xì)胞，例如通過(guò)用DLL4親和層析進(jìn)行的細(xì)胞分離或者細(xì)胞對(duì)熒光標(biāo)記的DLL4的吸附及后續(xù)的熒光激活細(xì)胞分選(FACS)?；蛘?，來(lái)自未免疫供體的脾細(xì)胞和/或B細(xì)胞或其它PBL的使用提供了可能的抗體全集的更佳展現(xiàn)，而且還容許使用DLL4在其中沒(méi)有抗原性的動(dòng)物(人或非人的)物種構(gòu)建抗體文庫(kù)。為了構(gòu)建摻入體外抗體基因的文庫(kù)，從受試者收獲干細(xì)胞以提供編碼未重排抗體基因區(qū)段的核酸?？梢詮亩喾N動(dòng)物物種(諸如人、小鼠、大鼠、兔類(lèi)、luprine、犬、貓、豬、牛、馬、和禽類(lèi)等)獲得感興趣的免疫細(xì)胞。從感興趣的細(xì)胞回收編碼抗體可變基因區(qū)段(包括VH和VL區(qū)段)的核酸并擴(kuò)增。就重排的VH和VL基因文庫(kù)而言，可以如下獲得所需DNA,即從淋巴細(xì)胞分離基因組DNA或mRNA，接著用與重排的VH和VL基因的5'和3'末端匹配的引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR),如Orlandi等，尸rac.A^/.」cadSc/.(USA),86:3833-3837(1989)所述，由此構(gòu)建多樣性V基因全集供表達(dá)。可以從cDNA和基因組DNA擴(kuò)增V基因，反向引物位于編碼成熟V結(jié)構(gòu)域的外顯子的5'末端，正向引物基于J區(qū)段內(nèi)部，如Orlandi等(1989)和Ward等，Atowe,341:544-546(1989)所述。然而，為了從cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，反向引物還可基于前導(dǎo)外顯子內(nèi)，如Jones等，S,'ofec/7"o/.,9:88-89(1991)所述，正向引物基于恒定區(qū)內(nèi)，如Sastry等，A^/.爿c^/.(^S^),86:5728-5732(1989)所述。為了使互補(bǔ)性最大化，引物中可以摻入簡(jiǎn)并性，如Orlandi等(1989)或Sastry等(1989)所述。優(yōu)選的是，如下將文庫(kù)多樣性最大化，即使用靶向每個(gè)V基因家族的PCR引物來(lái)擴(kuò)增免疫細(xì)胞核酸樣品中存在的所有可獲得的VH和VL重排，例如如Marks等，J.Mo/.5/。/.,222:581-597(1991)或Omm等，M^/e/cz(c油Am.，21:4491-4498(1993)的方法所述。為了將所擴(kuò)增的DNA克隆到表達(dá)載體中，可以在PCR引物的一端引入罕見(jiàn)的限制性位點(diǎn)作為標(biāo)簽，如Orlandi等(1989)所述，或者用帶標(biāo)簽的引物進(jìn)行進(jìn)一步的PCR擴(kuò)增，如Clackson等，A^we,352:624-628(1991)所述。人工合成的重組的V基因全集可以在體外從V基因區(qū)段衍生。大多數(shù)人VH基因區(qū)段已經(jīng)克隆和測(cè)序(Tomlinson等，■/Mo/.說(shuō)W.，2W:7兀-798(1992))，并定位(Matsuda等，AtoweGe"d.，3:88-94(1993));這些克隆的區(qū)段(包括H1和H2環(huán)的所有主要構(gòu)型)可用于生成多樣性VH基因全集，用到編碼序列和長(zhǎng)度多樣性的H3環(huán)的PCR引物，如Hoogenboom和Winter，J.Mo/.所o/.,227:381-388(1992)所述。VH全集還可如下生成，所有序列多樣性集中于單一長(zhǎng)度的長(zhǎng)H3環(huán)，如Barbas等，Prac.A^/.^ca^89:4457-4461(1992)所述。人Vk和VX區(qū)段已經(jīng)克隆和測(cè)序(Williams和Winter,￡w7/mmw"o/.,23:1456-1461(1993)),而且可用于生成合成的輕鏈全集?；谝幌盗蠽H和VL折疊及L3和H3長(zhǎng)度的合成的V基因全集將編碼具有可觀結(jié)構(gòu)多樣性的抗體。擴(kuò)增編碼V基因的DNA后，依照Hoogenboom和Winter,7Mo/,歷o/.,227:381-388(1992)的方法，可以在體外重排種系V基因區(qū)段?？贵w片段全集可以如下構(gòu)建，即以數(shù)種方式將VH與VL基因全集聯(lián)合在一起?？梢栽诓煌d體中創(chuàng)建各個(gè)全集，并在體外重組載體，例如如Hogrefe等，128:119-126(1993)所述，或者在體內(nèi)通過(guò)組合感染來(lái)重組載體，例如Waterhouse等，M/c/.A饑，21:2265-2266(1993)中記載的loxP系統(tǒng)。體內(nèi)重組方法利用Fab片段的雙鏈性質(zhì)來(lái)克服因大腸桿菌轉(zhuǎn)化效率施加的庫(kù)容量限制。分別克隆未免疫的VH和VL全集，一個(gè)克隆入噬菌粒，另一個(gè)克隆入噬菌體載體。然后通過(guò)用噬菌體感染含噬菌粒的細(xì)菌使得每個(gè)細(xì)胞包含不同的組合來(lái)聯(lián)合兩種文庫(kù)，庫(kù)容量只受細(xì)胞存在數(shù)的限制(約102個(gè)克隆)。兩種載體都包含體內(nèi)重組信號(hào)，使得VH與VL基因重組到單一復(fù)制子上，并共包裝成噬菌體病毒粒。這些巨型文庫(kù)提供了大量的具有優(yōu)良親和力(Kd"為約1(T8M)的多樣性抗體。或者，可以將全集依次克隆入同一載體，例如如Barbas等，尸rac.A^/.v4cad5W.t/5W,88:7978-7982(1991)所述，或者通過(guò)PCR裝配到一起，然后克隆，例如如Clackson等，A^we,352:624-628(1991)所述。PCR裝配還可用于將VH和VLDNA與編碼柔性肽間隔物的DNA連接以形成單鏈Fv(scFv)全集。在另一種技術(shù)中，"細(xì)胞內(nèi)PCR裝配，，用于通過(guò)PCR在淋巴細(xì)胞內(nèi)聯(lián)合VH與VL基因，然后克隆所連接基因的全集，如Embleton等，7Vmc/.爿c/Aie&,20:3831-3837(1992)所述。未免疫文庫(kù)(naivelibrary)(天然的或合成的)生成的抗體可具有中等親和力(Kd-1為約106-107M-1),但還可以如下在體外模擬親和力成熟，即構(gòu)建和再次選一奪次生文庫(kù)，如Winter等(1994)，見(jiàn)上文所述。例如，在Hawkins等，J.Mo/.Ao/.,226:889-896(1992)的方法或Gram等，Prac.A^/.t75^,89:3576-3580(1992)的方法中，可使用易錯(cuò)聚合酶在體外隨機(jī)引入突變(Leung等，rec/zm'，e，1:11-15(1989))。另夕卜，可以通過(guò)隨機(jī)突變一個(gè)或多個(gè)CDR來(lái)進(jìn)行親和力成熟，例如在選定的個(gè)別Fv克隆中使用攜帶跨越感興趣CDR的隨機(jī)序列的引物進(jìn)行PCR并篩選更高親和力的克隆。WO96/07754(公布于1996年3月14日)記載了用于在免疫球蛋白輕鏈的互補(bǔ)決定區(qū)中誘導(dǎo)誘變以創(chuàng)建輕鏈基因文庫(kù)的方法。另一種高效方法是將通過(guò)噬菌體展示選出的數(shù)輪鏈改組中篩選更高親和力，如Marks等，歷ofec/z"o/.,10:779-783(1992)所述。此技術(shù)容許生成親和力在10-9M范圍的抗體和抗體片段。DLL4核酸和氨基酸序列是本領(lǐng)域已知的。編碼DLL4的核酸序列可以使用所需DLL4區(qū)域的氨基酸序列來(lái)設(shè)計(jì)。或者，可以使用GenBank編號(hào)NM—019074的cDNA序列(或其片段)。DLL4是一種跨膜蛋白質(zhì)。胞外區(qū)包含8個(gè)EGF樣重復(fù)，以及在所有Notch配體間保守且是受體結(jié)合所必需的DSL結(jié)構(gòu)域。預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)還包含跨膜區(qū)，和缺乏任何催化基序的胞質(zhì)尾。人DLL4蛋白是685個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，包含以下區(qū)域信號(hào)肽(氨基酸1-25);MNNL(氨基酸26-92);DSL(氨基酸155-217);EGF樣(氨基酸221-251);EGF樣(氨基酸252-282);EGF樣(氨基酸284-322);EGF樣(氨基酸324-360);EGF樣(氨基酸366-400);EGF樣(氨基酸402-438);EGF樣(氨基酸440-476);EGF樣(氨基酸480-518);跨膜(氨基酸529-551);胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域(氨基酸552-685)。人DLL4的登錄號(hào)是NM—019074，而小鼠DLL4的登錄號(hào)是薩—019454。編碼DLL4的DNA可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的多種方法來(lái)制備。這些方法包括但不限于通過(guò)Engels等，C/zem./W.￡d￡"g/.，28:716-734(1989)中記載的任何方法，諸如三酯、亞磷酸酯、磷酰胺酯(phosphoramidite)和H-膦酸酯法進(jìn)行的化學(xué)合成。在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼DLL4的DNA的設(shè)計(jì)中使用表達(dá)宿主細(xì)胞所優(yōu)選的密碼子?；蛘?，編碼DLL4的DNA可以從基因組或cDNA文庫(kù)分離。構(gòu)建編碼DLL4的DNA分子后，將該DNA分子與表達(dá)載體，諸如質(zhì)粒中的表達(dá)控制序列可操作連接，其中所述控制序列受到該載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的識(shí)別。一般而言，質(zhì)粒載體包含復(fù)制和控制序列，其衍生自與宿主細(xì)胞相容的物種。載體通常攜帶復(fù)制位點(diǎn)，以及編碼能夠在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中提供表型選擇的蛋白質(zhì)的序列。適于在原核和真核宿主細(xì)胞中表達(dá)的載體是本領(lǐng)域已知的，有些在本文中有進(jìn)一步描述。可以使用真核生物體，諸如酵母或衍生自多細(xì)胞生物體諸如哺乳動(dòng)物的細(xì)胞。任選的是，編碼DLL4的DNA與分泌前導(dǎo)序列可操作連接，導(dǎo)致表達(dá)產(chǎn)物被宿主細(xì)胞分泌到培養(yǎng)基中。分泌前導(dǎo)序列的例子包括stll、ecotin、lamB、皰滲GD、lpp、堿性磷酸酶、轉(zhuǎn)化酶、和a-因子。適用于此處的還有蛋白A的^個(gè)氨基酸的前導(dǎo)序列(Abrahmsen等，EMSOJ:,43卯1(l985))。將宿主細(xì)胞用上文所述本發(fā)明的表達(dá)或克隆載體轉(zhuǎn)染，優(yōu)選轉(zhuǎn)化，并在常規(guī)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基可以為了誘導(dǎo)啟動(dòng)子、選擇轉(zhuǎn)化子、或擴(kuò)增編碼所需序列的基因而適當(dāng)修改。轉(zhuǎn)染指宿主細(xì)胞攝取表達(dá)載體，無(wú)論編碼序列事實(shí)上是否表達(dá)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道許多轉(zhuǎn)染方法，例如CaP04沉淀和電穿孔。若宿主細(xì)胞內(nèi)存在此載體運(yùn)轉(zhuǎn)的任何指示，則一般認(rèn)為轉(zhuǎn)染成功。用于轉(zhuǎn)染的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，有些在本文中有進(jìn)一步描述。轉(zhuǎn)化指將DNA導(dǎo)入生物體，使得DNA可進(jìn)行復(fù)制，或是作為染色體外元件，或是通過(guò)染色體整合。根據(jù)所用宿主細(xì)胞，使用適于所述細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。用于轉(zhuǎn)化的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，有些在本文中有進(jìn)一步描迷。用于生成DLL4的原核宿主細(xì)胞可以如Sambrook等，見(jiàn)上文一般所述進(jìn)行培養(yǎng)。用于生成DLL4的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞可以在多種培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基是本領(lǐng)域眾所周知的，有些在本文中有描述。本發(fā)明公開(kāi)的宿主細(xì)胞涵蓋體外培養(yǎng)的細(xì)胞以及宿主動(dòng)物體內(nèi)的細(xì)胞。純化的DLL4可以附著于合適的基質(zhì)，諸如瓊脂糖珠、丙烯酰胺珠、玻璃珠、纖維素、各種丙烯酸共聚物、羥基曱基丙烯酸酯凝膠、聚丙烯酸和聚曱基丙烯酸共聚物、尼龍、中性和離子載體、諸如此類(lèi)，用于噬菌體展示克隆的親和層析分離。DLL4蛋白對(duì)基質(zhì)的附著可以通過(guò)M"/wA,>￡"2ywo/ogy:巻44(1976)中記載的技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)。將蛋白質(zhì)配體附著于多糖基質(zhì)，例如瓊脂糖、右旋糖香或纖維素的常用技術(shù)牽涉用卣化氰活化載體，隨后將肽配體的脂肪族伯胺或芳香族伯胺偶聯(lián)至活化后的基質(zhì)?；蛘撸珼LL4可用于包被吸附板的孔，在附著至吸附板的宿主細(xì)胞上表達(dá)，或用于細(xì)胞分選，或者偶聯(lián)至生物素以用鏈霉親合素包被的珠捕捉，或者用于本領(lǐng)域已知的用于淘選噬菌體展示庫(kù)的任何其它方法。在適于至少部分噬菌體顆粒結(jié)合吸附劑的條件下，使噬菌體文庫(kù)樣品接觸固定化的DLL4。正常情況下，選擇包括pH、離子強(qiáng)度、溫度等等的條件來(lái)模擬生理學(xué)條件。對(duì)結(jié)合至固相的噬菌體進(jìn)行清洗，然后用酸洗脫，例如如Barbas等，尸rac.Ato/.JcadS"'tASA88:7978-7982(1991)所述，或者用堿洗53脫，例如如Marks等，J.Mo/.所o/.，222:581-597(1991)所述，或者通過(guò)DLL4抗原竟?fàn)幭疵?，例如在與Clackson等，A^we,352:624-628(1991)的抗原竟?fàn)幏?lèi)似的規(guī)程中。噬菌體在單輪選擇中可以富集20-l，000倍。此外，富集的噬菌體可以在細(xì)菌培養(yǎng)物中進(jìn)行培養(yǎng)，并進(jìn)行更多輪選擇。選擇的效率取決于許多因素，包括清洗過(guò)程中解離的動(dòng)力學(xué)，及單個(gè)噬菌體上的多個(gè)抗體片段是否能同時(shí)結(jié)合抗原。具有較快解離動(dòng)力學(xué)(和弱結(jié)合親和力)的抗體可以通過(guò)使用短時(shí)間的清洗、多價(jià)噬菌體展示、及固相中的高抗原包被密度來(lái)保留。高密度不僅通過(guò)多價(jià)相.互作用而穩(wěn)定了噬菌體，而且有利于已解離的噬菌體的再結(jié)合。具有較慢解離動(dòng)力學(xué)(和強(qiáng)結(jié)合親和力)的抗體的選擇可以通過(guò)使用長(zhǎng)時(shí)間的清洗和單價(jià)噬菌體展示(如Bass等，尸rafe/ra,8:309-314(1990)和WO92/09690所述)及低抗原包被密度(如Marks等，歷ofec/mo/.，10:779-783(1992)所述)來(lái)促進(jìn)。有可能在對(duì)DLL4具有不同親和力的噬菌體抗體之間進(jìn)行選擇，甚至是親和力略有差異的。然而，選定抗體的隨機(jī)突變(例如如有些上文所述親和力成熟技術(shù)進(jìn)行)有可能產(chǎn)生許多突變體，多數(shù)結(jié)合抗原，少數(shù)具有更高的親和力。通過(guò)限制DLL4，罕見(jiàn)的高親和力噬菌體能竟?fàn)巹俪?。為了保留所有較高親和力的突變體，可以將噬菌體與過(guò)量的生物素化DLL4—起溫育，但是生物素化DLL4的摩爾濃度低于DLL4的目標(biāo)摩爾親和常數(shù)。然后可通過(guò)鏈霉親合素包被的順磁珠捕捉高親和力的結(jié)合噬菌體。此類(lèi)"平衡捕捉"容許依照結(jié)合親和力來(lái)選擇抗體，其靈敏性容許從大大過(guò)量的低親和力噬菌體中分離出親和力只有原值2倍的突變體克隆。還可以操作用于清洗結(jié)合至固相的噬菌體的條件來(lái)進(jìn)行基于解離動(dòng)力學(xué)的區(qū)分?？笵LL4克隆可以進(jìn)行活性選擇。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了阻斷Notch受體(諸如Notchl、Notch2、Notch3和/或Notch4)與DLL4間結(jié)合但不阻斷Notch受體與第二蛋白質(zhì)間結(jié)合的抗DDL4抗體。對(duì)應(yīng)于此類(lèi)抗DLL4抗體的Fv克隆可以如下選擇(l)如上所述自噬菌體文庫(kù)分離抗DLL4克隆，并任選通過(guò)在合適的細(xì)菌宿主中培養(yǎng)群體來(lái)擴(kuò)增所分離的噬菌體克隆群體；(2)對(duì)想要阻斷活性的DLL4和想要不阻斷活性的第二蛋白質(zhì)進(jìn)行選擇；(3)將抗DLL4噬菌體克隆吸附至固定化的DLL4;(4)使用過(guò)量的所述第二蛋白質(zhì)洗脫任何識(shí)別與所述第二蛋白質(zhì)的結(jié)合決定簇交疊或共享的DLL4結(jié)合決定簇的不想要的克?。徊?5)洗脫在步驟(4)后保持吸附的克隆。任選地，具有期望的阻斷/不阻斷特性的克隆可通過(guò)一次或多次重復(fù)本文所述選擇規(guī)程來(lái)進(jìn)一步富集。編碼本發(fā)明雜交瘤衍生單克隆抗體或噬菌體展示Fv克隆的DNA易于使用常規(guī)規(guī)程分離和測(cè)序(例如通過(guò)使用設(shè)計(jì)成自雜交瘤或噬菌體DNA模板特異性擴(kuò)增感興趣的重鏈和輕鏈編碼區(qū)的寡核苷酸引物)。一旦分離，可將DNA置于表達(dá)載體中，然后將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到原本不生成免疫球蛋白蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞中，諸如大腸桿菌細(xì)胞、猿COS細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或骨髓瘤細(xì)胞，以在重組宿主細(xì)胞中獲得所需單克隆抗體的合成。關(guān)于編碼抗體的DNA在細(xì)菌中的重組表達(dá)的綜述性論文包括Skerra等，Cwr(9p/m'朋/,ww/朋/.,5:256(1993)及Pluckthun,/附m腦o/.Kevs.，130:151(1992)。編碼本發(fā)明Fv克隆的DNA可以聯(lián)合編碼重鏈和/或輕鏈恒定區(qū)的已知DNA序列(例如適宜的DNA序列可得自Kabat等，見(jiàn)上文)以形成編碼全長(zhǎng)或部分重鏈和/或輕鏈的克隆。應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會(huì)，任何同種型的恒定區(qū)都可用于此目的，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE恒定區(qū)，而且此類(lèi)恒定區(qū)可以得自任何人或動(dòng)物物種。衍生自一種動(dòng)物(諸如人)物種的可變域DNA,然后與另一動(dòng)物物種的恒定區(qū)DNA融合以形成"雜合的"全長(zhǎng)重鏈和/或輕鏈的編碼序列的Fv克隆包括在本文所用"嵌合"和"雜合"抗體的定義中。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，衍生自人可變DNA的Fv克隆與人恒定區(qū)DNA融合以形成完全人的、全長(zhǎng)或部分重鏈和/或輕鏈的編碼序列。還可以修飾編碼衍生自本發(fā)明雜交瘤的抗DLL4抗體的DNA,例如通過(guò)替代，即用人重鏈和輕鏈恒定域的編碼序列代替衍生自雜交瘤克隆的同源鼠序歹'J(例如如Morrison等，戶rac.Sc/.t/5^，81:6851-6855(1984)中的方法)?？梢赃M(jìn)一步修飾編碼雜交瘤或Fv克隆衍生抗體或片段的DNA,通過(guò)共價(jià)接合免疫球蛋白編碼序列和非免疫球蛋白多肽的整個(gè)或部分編碼序列?？梢砸栽摲绞街苽渚哂斜景l(fā)明的Fc克隆或雜交瘤克隆衍生抗體的結(jié)合特異性的"嵌合"或"雜合"抗體?？贵w片段本發(fā)明涵蓋抗體片段。在某些情況中，使用抗體片段，而不是完整抗體有優(yōu)勢(shì)。片段的較小尺寸容許快速清除，而且可導(dǎo)致更易于接近實(shí)體瘤。已經(jīng)開(kāi)發(fā)了用于生成抗體片段的多種技術(shù)。傳統(tǒng)上，通過(guò)蛋白水解消化完整抗體來(lái)衍生這些片段(參見(jiàn)例如Morimoto等，/oMma/o/5/oc/zem/cfl/歷，/zjw.ca/M"/zoA24:107-117(1992);Brennan等，5We"ce229:81(1985))。然而，現(xiàn)在可直接由重組宿主細(xì)胞生成這些片段。Fab、Fv和scFv抗體片段都可在大腸桿菌中表達(dá)及由大腸桿菌分泌，如此容許容易的生成大量的這些片段?？蓮纳衔挠懻摰氖删w抗體庫(kù)中分離抗體片段?；蛘?，可直接從大腸桿菌回收Fab'-SH片段并化學(xué)偶聯(lián)以形成F(ab')2片段(Carter等，所o/Tec/zwfogy10:163-167(1992))。依照另一種方法，可直接從重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物分離F(ab')2片段。包含補(bǔ)救受體結(jié)合表位殘基、具有延長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期的Fab和F(ab')2片段記載于美國(guó)專利No.5,869,046。用于生成抗體片段的其它技術(shù)對(duì)于熟練從業(yè)人員將是顯而易見(jiàn)的。在其它實(shí)施方案中，選擇的抗體是單鏈Fv片段(scFv)。參見(jiàn)WO93/16185;美國(guó)專利No.5,571,894;及5,587,458。Fv和sFv是具有完整結(jié)合位點(diǎn)、缺少恒定區(qū)的唯一類(lèi)型；如此，它們適于在體內(nèi)使用時(shí)降低非特異性結(jié)合?？蓸?gòu)建sFv融合蛋白以生成效應(yīng)器蛋白質(zhì)在sFv的氨基或羧基末端的融合。參見(jiàn)AntibodyEngineering,Borrebaeck編，見(jiàn)上文。抗體片段還可以是"線性抗體"，例如如美國(guó)專利No.5,641,870中所記載的。此類(lèi)線性抗體片段可以是單特異性的或雙特異性的。人源化抗體本發(fā)明涵蓋人源化抗體。本領(lǐng)域知道用于人源化非人抗體的多種方法。例如，人源化抗體可具有一個(gè)或多個(gè)從非人來(lái)源引入的氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基常常稱為"輸入，，殘基，它們通常取自"輸入"可變區(qū)?；旧峡勺裱璚inter及其同事的方法進(jìn)行人源化(Jones等(1986)7V^wre321:522-525;Riechmann等(1988)A/a似re332:323-327;Verhoeyen等(1988)5We"ce239:1534-1536)，即用非人高變區(qū)序列替代人抗體的對(duì)應(yīng)序列。因此，此類(lèi)"人源化，，抗體是嵌合抗體(美國(guó)專利No.4,816,567),其中顯著少于完整的人可變區(qū)用非人物種的相應(yīng)序列替代。在實(shí)踐中，人源化抗體通常是如下人抗體，其中有些高變區(qū)殘基和可能的有些FR殘基用嚙齒類(lèi)抗體類(lèi)似位點(diǎn)的殘基替代。用于制備人源化抗體的人輕鏈和重鏈可變區(qū)的選擇對(duì)于降低抗原性是非常重要的。依照所謂的"最適(best-fit)"方法，用嚙齒類(lèi)抗體的可變區(qū)序列對(duì)已知人可變區(qū)序列的整個(gè)文庫(kù)進(jìn)行篩選。然后選擇與嚙齒類(lèi)最接近的人序列作為人源化抗體的人框架(Sims等(1993)J7mmw"o/,151:2296;Chothia等(1987)/Afo/.所o/.196:901)。另一種方法使用由特定輕《連或重鏈亞組的所有人抗體的共有序列衍生的特定框架。相同框架可用于數(shù)種不同的人源化抗體(Carter等(1992)尸rac.A^/.爿cad[751489:4285;Presta等(1993)■/7mm謂o/.,151:2623)。更為重要的是，抗體在人源化后保留對(duì)抗原的高親和力和其它有利的生物學(xué)特性。為了達(dá)到此目的，依照一種方法，通過(guò)使用親本序列和人源化序列的三維模型分析親本序列和各種概念性人源化產(chǎn)物的過(guò)程來(lái)制備人源化抗體。通?？色@得免疫球蛋白三維模型，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的。還可獲得圖解和顯示所選候選免疫球蛋白序列的可能三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)程序。通過(guò)檢查這些顯示圖像能分析殘基在候選免疫球蛋白序列發(fā)揮功能中的可能作用，即分析影響候選免疫球蛋白結(jié)合其抗原的能力的殘基。這樣，可以從受體序列和輸入序列中選出FR殘基并組合，從而得到期望的抗體特征，諸如對(duì)靶抗原的親和力升高。一般而言，高變區(qū)殘基直接且最實(shí)質(zhì)的涉及對(duì)抗原結(jié)合的影響。人抗體本發(fā)明的人抗DLL4抗體可以通過(guò)如上所述聯(lián)合選自人衍生噬菌體展示庫(kù)的Fv克隆可變域序列與已知的人恒定域序列來(lái)構(gòu)建?；蛘?，可以通過(guò)雜交瘤方法來(lái)生成本發(fā)明的人單克隆抗DLL4抗體。用于生成人單克隆抗體的人骨髓瘤和小鼠-人異源骨髓瘤細(xì)胞系已有記載，例如KozborJ/mwww/.，133:3001(1984);Brodeur等，Momc/cwa/勘Z^o辦/V。<iw"/orec/2"—&saw//4萍/,ca/7'ora,pp.51-63(MarcelDekker,Inc.,NewYork,1987);及Boerner等，■//鐘畫(huà)/.,147:86(1991).現(xiàn)在有可能生成在缺乏內(nèi)源免疫球蛋白生成的情況下能夠在免疫后生成人抗體完整全集的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如小鼠)。例如，已經(jīng)記載了嵌合和種系突變小鼠中抗體重鏈連接區(qū)(JH)基因的純合刪除導(dǎo)致內(nèi)源抗體生成的完全抑制。在此類(lèi)種系突變小鼠中轉(zhuǎn)移大量人種系免疫球蛋白基因?qū)?dǎo)致在抗原攻擊后生成人抗體。參見(jiàn)例如Jakobovits等，尸rac.Va//.^c"dSd.90:2551(1993);Jakobovits等，AW匿362:255-258(1993);Bruggermann等，腸r/附mwwo/.7:33(1993)?；蚋慕M也可用于自非人(例如嚙齒類(lèi))抗體衍生人抗體，其中人抗體具有與起始非人抗體相似的親和力和特異性。依照此方法，它也稱為"表位印記"(epitopeimprinting),如上所述通過(guò)噬菌體展示技術(shù)得到的非人抗體片段的重鏈或輕鏈可變區(qū)用人V結(jié)構(gòu)域基因全集替換，產(chǎn)生非人鏈/人鏈scFv或Fab嵌合物群。用抗原進(jìn)行的選擇導(dǎo)致非人鏈/人鏈嵌合scFv或Fab的分離，其中人鏈在一級(jí)噬菌體展示克隆中消除相應(yīng)的非人鏈后恢復(fù)了遭破壞的抗原結(jié)合位點(diǎn)，即表位決定(印記，imprint)人鏈配偶體的選擇。在重復(fù)該過(guò)程以替換剩余非人鏈時(shí)，得到人抗體(參見(jiàn)PCTWO93/06213，公布于1993年4月l日)。與傳統(tǒng)的通過(guò)CDR移植進(jìn)行的非人抗體的人源化不同，此技術(shù)提供完全人的抗體，它們不含非人起源的FR或CDR殘基。雙特異性抗體雙特異性抗體指對(duì)至少兩種不同抗原具有結(jié)合特異性的單克隆抗體，優(yōu)選人抗體或人源化抗體。在本案中，結(jié)合特異性之一針對(duì)DLL4，另一結(jié)合特異性針對(duì)任何其它抗原。例示性的雙特異性抗體可結(jié)合DLL4蛋白質(zhì)的兩種不同表位。雙特異性抗體還可用于將細(xì)胞毒劑定位于表達(dá)DLL4的細(xì)胞。這些抗體擁有DLL4結(jié)合臂和結(jié)合細(xì)胞毒劑(例如肥皂草毒蛋白、抗干擾素-a、長(zhǎng)春花生物堿類(lèi)、蓖麻毒蛋白A鏈、曱氨蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂?？蓪㈦p特異性抗體制備成全長(zhǎng)抗體或抗體片段(例如F(ab')2雙特異性抗體)。用于構(gòu)建雙特異性抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。在傳統(tǒng)上，雙特異性抗體的重組生產(chǎn)基于兩對(duì)免疫球蛋白重鏈-輕鏈的共表達(dá)，其中兩種重鏈具有不同的特異性(Millstein和Cuello,A^w305:537(1983))。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機(jī)分配，這些雜交瘤(四源雜交瘤(quadroma))生成10種不同抗體分子的潛在混合物，其中只有一種具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。通常通過(guò)親和層析步驟進(jìn)行的正確分子的純化相當(dāng)麻煩且產(chǎn)物產(chǎn)量低。類(lèi)似的規(guī)程披露于WO93/08829,公布于1993年5月13日及Traunecker等，五7kffiOJ10:3655(1991)。依照一種不同且更優(yōu)選的方法，將具有期望結(jié)合特異性(抗體-抗原結(jié)合位點(diǎn))的抗體可變域與免疫球蛋白恒定域序列融合。優(yōu)選的是，與包含至少部分鉸鏈、CH2和CH3區(qū)的免疫球蛋白重鏈恒定域進(jìn)行融合。優(yōu)選在至少一58種融合物中存在包含輕鏈結(jié)合所必需的位點(diǎn)的第一重鏈恒定區(qū)(CHl)。將編碼免疫球蛋白重鏈融合物和，在需要時(shí)，免疫球蛋白輕鏈的DNA插入分開(kāi)的表達(dá)載體，并共轉(zhuǎn)染到合適的宿主生物體中。在用于構(gòu)建的三種多肽鏈比例不等時(shí)提供最佳產(chǎn)量的實(shí)施方案中，這為調(diào)整三種多肽片段的相互比例提供了極大的靈活性。然而，在至少兩種多肽鏈以相同比例表達(dá)導(dǎo)致高產(chǎn)量時(shí)或在該比例沒(méi)有特別意義時(shí)，有可能將兩種或所有三種多肽鏈的編碼序列插入一個(gè)表達(dá)載體。在該方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，雙特異性抗體由一個(gè)臂上具有第一結(jié)合特異性的雜合免疫球蛋白重鏈，和另一個(gè)臂上的雜合免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(duì)(提供第二結(jié)合特異性)構(gòu)成。由于免疫球蛋白輕鏈僅在半個(gè)雙特異性分子中的存在提供了便利的分離途徑，因此發(fā)現(xiàn)這種不對(duì)稱結(jié)構(gòu)便于將期望的雙特異性復(fù)合物與不想要的免疫球蛋白鏈組合分開(kāi)。該方法披露于WO94/046卯。關(guān)于生成雙特異性抗體的進(jìn)一步詳情參見(jiàn)例如Suresh等，MeAoA/"五"2^wo/ogy121:210(1986)。依照另一種方法，可改造一對(duì)抗體分子間的界面，以將從重組細(xì)胞培養(yǎng)物回收的異二聚體的百分比最大化。優(yōu)選的界面包含至少部分抗體恒定域CH3結(jié)構(gòu)域。在該方法中，將第一抗體分子界面的一個(gè)或多個(gè)小氨基酸側(cè)鏈用較大側(cè)鏈(例如酪氨酸或色氨酸)替換。通過(guò)將大氨基酸側(cè)鏈用較小氨基酸側(cè)鏈(例如丙氨酸或蘇氨酸)替換，在第二抗體分子的界面上產(chǎn)生與大側(cè)鏈相同或相似大小的補(bǔ)償性"空腔"。這提供了較之其它不想要的終產(chǎn)物諸如同二聚體提高異二聚體產(chǎn)量的機(jī)制。雙特異性抗體包括交聯(lián)或"異源偶聯(lián)"抗體。例如，異源偶聯(lián)物中的一種抗體可與親合素偶聯(lián)，另一種抗體與生物素偶^:。例如，此類(lèi)抗體已經(jīng)建議用于將免疫系統(tǒng)細(xì)胞靶向不想要的細(xì)胞(美國(guó)專利No.4,676,980),及用于治療HIV感染(WO91/00360;WO92/00373;和EP03089)?？墒褂萌魏伪憷慕宦?lián)方法來(lái)制備異源偶聯(lián)抗體。合適的交聯(lián)劑是本領(lǐng)域眾所周知的，連同許多交聯(lián)技術(shù)一起披露于美國(guó)專利No.4,676,980。文獻(xiàn)中還記載了由抗體片段生成雙特異性抗體的技術(shù)。例如，可使用化學(xué)連接來(lái)制備雙特異性抗體。Brennan等，Sc/e"ce229:81(1985)記載了通過(guò)蛋白水解切割完整抗體以生成F(ab')2片段的規(guī)程。將這些片段在存在二硫醇絡(luò)合劑亞砷酸鈉的情況下還原，以穩(wěn)定鄰近的二硫醇并防止分子間二硫鍵的形成。然后將產(chǎn)生的Fab，片段轉(zhuǎn)變?yōu)榱虼趸綍跛嵊现?TNB)衍生物。然后將Fab'-TNB衍生物之一通過(guò)巰基乙胺的還原重新恢復(fù)成Fab'-硫醇，并與等摩爾量的另一種Fab'-TNB衍生物混合，以形成雙特異性抗體。產(chǎn)生的雙特異性抗體可用作酶的選擇性固定化試劑。最新的進(jìn)展便于從大腸桿菌直接回收Fab'-SH片段，這些片段可化學(xué)偶聯(lián)以形成雙特異性抗體。Shalaby等，/.Me丄175:217-225(1992)記載了完全人源化的雙特異性抗體F(ab')2分子的生成。由大腸桿菌分開(kāi)分泌每種Fab'片段，并在體外進(jìn)行定向化學(xué)偶聯(lián)以形成雙特異性抗體。如此形成的雙特異性抗體能夠結(jié)合過(guò)表達(dá)HER2受體的細(xì)胞和正常人T細(xì)胞，以及觸發(fā)人細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞針對(duì)人乳腺肺瘤靶物的溶解活性。還記載了從重組細(xì)胞培養(yǎng)物直接生成和分離雙特異性抗體片段的多種技術(shù)。例如，已使用亮氨酸拉鏈生成雙特異性抗體。Kostelny等，//wmw"o/.，148(5):1547-1553(1992)。將來(lái)自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽通過(guò)基因融合與兩種不同抗體的Fab'部分連接?？贵w同二聚體在鉸鏈區(qū)還原以形成單體，然后重新氧化以形成抗體異二聚體。這種方法也可用于生成抗體同二聚體。Hollinger等，尸rac.A^/.^c^/."&490:6444-6448(1993)記載的"雙抗體"技術(shù)提供了構(gòu)建雙特異性抗體片段的替代機(jī)制。該片段包含通過(guò)接頭相連的重鏈可變域(Vh)和輕鏈可變域(vo，所述接頭太短使得同一條鏈上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間不能配對(duì)。因而，迫使一個(gè)片段上的VH和V^吉構(gòu)域與另一個(gè)片段上的互補(bǔ)V^和VH結(jié)構(gòu)域配對(duì)，由此形成兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。還報(bào)道了通過(guò)使用單鏈Fv(sFv)二聚體構(gòu)建雙特異性抗體片段的另一種策略。參見(jiàn)Gruber等，J/附mww/.152:5368(1994)。涵蓋具有超過(guò)兩個(gè)效價(jià)的抗體。例如，可制備三特異性抗體。Tutt等，J/扁歸/.147:60(1991)。多價(jià)抗體多價(jià)抗體可以比二價(jià)抗體更快的受到表達(dá)該抗體所結(jié)合抗原的細(xì)胞的內(nèi)在化(和/或異化)。本發(fā)明的抗體可以是可容易地通過(guò)編碼抗體多肽鏈的核酸的重組表達(dá)而生成的、具有三個(gè)或更多抗原結(jié)合位點(diǎn)(例如四價(jià)抗體)的多價(jià)抗體(IgM類(lèi)別以外的)。多價(jià)抗體可包含二聚化結(jié)構(gòu)域和三個(gè)或更多抗原結(jié)合位點(diǎn)。優(yōu)選的二聚化結(jié)構(gòu)域包含(或由其組成)Fc區(qū)或鉸鏈區(qū)。在這種情況中，抗體將包含F(xiàn)c區(qū)及Fc區(qū)氨基末端的三個(gè)或更多抗原結(jié)合位點(diǎn)。本文中優(yōu)選的多價(jià)抗體包含(或由其組成)三個(gè)至約八個(gè)，但優(yōu)選四個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。多價(jià)抗體包含至少一條多肽鏈(且優(yōu)選兩條多肽鏈)，其中所述多肽鏈包含兩個(gè)或多個(gè)可變域。例如，多肽鏈可包含VDl-(Xl)n-VD2-(X2)n-Fc，其中VD1是第一可變域，VD2是第二可變域，F(xiàn)c是Fc區(qū)的一條多肽鏈，X1和X2代表氨基酸或多肽，而n是0或l。例如，多肽鏈可包含VH-CHl-柔性接頭-VH-CHl-Fc區(qū)鏈；或VH-CH1-VH-CH1-Fc區(qū)鏈。本文中的多價(jià)抗體優(yōu)選進(jìn)一步包含至少兩條(且優(yōu)選四條)輕鏈可變域多肽。本文中的多價(jià)抗體可包含例如約兩條至約八條輕鏈可變域多肽。本文設(shè)想的輕鏈可變域多肽包含輕鏈可變域，且任選進(jìn)一步包含CL結(jié)構(gòu)域。抗體變體在有些實(shí)施方案中，涵蓋本文所述抗體的氨基酸序列修飾。例如，可能希望改進(jìn)抗體的結(jié)合親和力和/或其它生物學(xué)特性。抗體的氨基酸序列變體是通過(guò)將適宜的核苷酸變化引入抗體核酸或通過(guò)肽合成制備的。此類(lèi)修飾包括例如抗體氨基酸序列內(nèi)的殘基刪除和/或插入和/或替代?？蛇M(jìn)行任何刪除、插入和替代組合以獲得最終的構(gòu)建物，倘若最終的構(gòu)建物具有期望的特征。可在制備序列時(shí)將氨基酸改變引入受試抗體氨基酸序列?？捎糜阼b定抗體中作為優(yōu)選誘變位置的某些殘基或區(qū)域的一種方法稱為"丙氨酸掃描誘變"，如Cunningham和Wells(1989)&/e"ce，244:1081-1085中所述。這里，鑒定一個(gè)殘基或一組靶殘基(如帶電荷的殘基，諸如精氨酸、天冬氨酸、組氨酸、賴氨酸和谷氨酸)并用中性或帶負(fù)電荷的氨基酸(最優(yōu)選丙氨酸或多聚丙氨酸)替代，以影響氨基酸與抗原的相互作用。然后通過(guò)在或?qū)μ娲稽c(diǎn)引入更多或其它變體，推敲對(duì)替代展示出功能敏感性的那些氨基酸位置。由此，盡管用于引入氨基酸序列變異的位點(diǎn)是預(yù)先決定的，然而突變本身的本質(zhì)不必預(yù)先決定。例如，為了分析指定位點(diǎn)處突變的后果，在靶密碼子或區(qū)域進(jìn)行丙氨酸掃描或隨機(jī)誘變，并對(duì)所表達(dá)免疫球蛋白篩選期望的活性。氨基酸序列插入包括氨基和/或羧基末端的融合，長(zhǎng)度范圍由一個(gè)殘基至包含上百或更多殘基的多肽，以及單個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的序列內(nèi)插入。末端插入的例子包括具有N端曱硫氨酰殘基的抗體或與細(xì)胞毒性多肽融合的抗體?？贵w分子的其它插入變體包括將抗體的N或C末端與酶(例如用于ADEPT)或延長(zhǎng)抗體血清半衰期的多肽融合。多肽的糖基化典型的或是N-連接的或是O-連接的。N-連接指碳水化合物模塊附著于天冬酰胺殘基的側(cè)鏈。三肽序列天冬酰胺-X-絲氨酸和天冬酰胺-X-蘇氨酸(其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)是將碳水化合物模塊酶促附著于天冬酰胺側(cè)鏈的識(shí)別序列。如此，多肽中這些三肽序列任一的存在產(chǎn)生了潛在的糖基化位點(diǎn)。O-連接的糖基化指將糖類(lèi)N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附著于羥基氨基酸，最常見(jiàn)的是絲氨酸或蘇氨酸，但也可使用5-羥脯氨酸或5-羥賴氨酸。向抗體中添加糖基化位點(diǎn)可通過(guò)改變氨基酸序列使其包含一個(gè)或多個(gè)上述三肽序列而便利的完成(用于N-連接的糖基化位點(diǎn))。所述改變還可通過(guò)向原始抗體的序列中添加或替代一個(gè)或多個(gè)絲氨酸或蘇氨酸殘基來(lái)進(jìn)行(用于O-連接的糖基化位點(diǎn))。若抗體包含F(xiàn)c區(qū)，則可改變附著其上的碳水化合物。例如，美國(guó)專利申請(qǐng)US2003/0157108(Presta,L.)中記載了有缺乏巖藻糖的成熟碳水化合物結(jié)構(gòu)附著于抗體Fc區(qū)的抗體。還可參見(jiàn)US2004/0093621(KyowaHakkoKogyoCo.，Ltd.)。WO2003/011878(Jean-Mairet等)和美國(guó)專利第6，602，684號(hào)(Umana等)中提到了在附著于抗體Fc區(qū)的碳水化合物中有等分N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)的抗體。WO97/30087(Patel等)中報(bào)告了在附著于抗體Fc區(qū)的寡糖中有至少一個(gè)半乳糖殘基的抗體。關(guān)于有更改碳水化合物附著于其Fc區(qū)的抗體還可參見(jiàn)WO98/58964(Raju,S.)和WO99/22764(Raju，S.)。關(guān)于具有改良糖基化的抗原結(jié)合分子還可參見(jiàn)US2005/0123546(Umana等)。本文中的優(yōu)選糖基化變體包含F(xiàn)c區(qū)，其中附著于Fc區(qū)的碳水化合物結(jié)構(gòu)缺乏巖藻糖。此類(lèi)變體具有改進(jìn)的ADCC功能。任選的是，F(xiàn)c區(qū)還包含進(jìn)一步改進(jìn)ADCC的一個(gè)或多個(gè)氨基酸替代，例如Fc區(qū)位置298、333和/或334處的替代(Eu殘基編號(hào)方式)。涉及"脫巖藻糖型"或"巖藻糖缺乏型，，抗體的出版物的例子包括US2003/0157108;WO2000/61739;WO2001/29246;US2003/0115614;US2002/0164328;US2004/0093621;US2004/0132140;US2004/0110704;US2004/0110282;US2004/0109865;WO2003/085119;WO2003/084570;WO2005/035586;WO2005/035778;WO2005/053742;Okazaki等，J.Mo/.B/o/.336:1239-1249(2004);Yamane-Ohnuki等，歷ofec/z.87:614(2004)。生成脫巖藻糖化抗體的細(xì)胞系的例子包括蛋白質(zhì)巖藻糖化缺陷的Lecl3CHO細(xì)胞(Ripka等，Jrc/z.5/oc/2e肌所o;/z，.249:533-545(1986);美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)朥S2003/0157108Al,Presta，L;及WO2004/056312Al,Adams等，尤其是實(shí)施例ll)和敲除細(xì)胞系，諸如a-l，6-巖藻糖轉(zhuǎn)移酶基因，F(xiàn)6TS,敲除的CHO細(xì)胞(Yamane-Ohnuki等，所otec/z.87:614(2004))。另一類(lèi)變體是氨基酸替代變體。這些變體在抗體分子中有至少一個(gè)氨基酸殘基用不同殘基替代。最有興趣進(jìn)行替代誘變的位點(diǎn)包括高變區(qū)，但是也涵蓋FR改變。表l中"優(yōu)選替代"欄顯示了保守替代。如果此類(lèi)替代導(dǎo)致生物學(xué)活性變化，那么可導(dǎo)入表l中稱為"例示替代"的更實(shí)質(zhì)變化，或如下文參照氨基酸分類(lèi)進(jìn)一步所述，并篩選產(chǎn)物。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table>Tyr(Y)Trp;Phe;Thr;SerPheVal(V)lie;Leu;Met;Phe;Ala;正亮氨酸Leu對(duì)抗體生物學(xué)特性的實(shí)質(zhì)性修飾可通過(guò)選擇對(duì)維持以下方面的效果差異顯著的替代來(lái)實(shí)現(xiàn)(a)替代區(qū)域中多肽主鏈的結(jié)構(gòu)，例如為(折疊)片或螺旋構(gòu)象，(b)靶位點(diǎn)處分子的電荷或疏水性，或(c)側(cè)鏈的體積。根據(jù)共同的側(cè)鏈特性，天然存在殘基可如下分組(1)疏水性的正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、lie;(2)中性、親水性的Cys、Ser、Thr、Asn、Gin;(3)酸性的Asp、Glu;(4)石咸性的His、Lys、Arg;(5)影響鏈取向的殘基Gly、Pro;及(6)芳香族的Trp、Tyr、Phe。非保守替代需要用這些類(lèi)別之一的成員替換另一個(gè)類(lèi)別的。一類(lèi)替代變體牽涉替代親本抗體(例如人源化或人抗體)的一個(gè)或多個(gè)高變區(qū)殘基。通常，選擇用于進(jìn)一步開(kāi)發(fā)的所得變體相對(duì)于產(chǎn)生它們的親本抗體會(huì)具有改良的生物學(xué)特性。用于生成此類(lèi)替代變體的一種便利方法涉及使用噬菌體展示的親和力成熟。簡(jiǎn)而言之，將數(shù)個(gè)高變區(qū)位點(diǎn)(例如6-7個(gè)位點(diǎn))突變，在各個(gè)位點(diǎn)產(chǎn)生所有可能的氨基酸替代。將如此生成的抗體展示在絲狀噬菌體顆粒上，作為與各個(gè)顆粒內(nèi)包裝的M13基因III產(chǎn)物的融合物。然后如本文所公開(kāi)的對(duì)噬菌體展示的變體篩選其生物學(xué)活性(例如結(jié)合親和力)。為了鑒定用于修飾的候選高變區(qū)位點(diǎn)，可進(jìn)行丙氨酸掃描誘變以鑒定對(duì)抗原結(jié)合具有重要貢獻(xiàn)的高變區(qū)殘基?；蛘?另外，分析抗原-抗體復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)以鑒定抗體和抗原之間的接觸點(diǎn)可能是有益的。所述接觸殘基及鄰近殘基是依照本文詳述的技術(shù)進(jìn)行替代的候選位點(diǎn)。一旦產(chǎn)生這樣的變體，如本文所述對(duì)該組變體進(jìn)行篩選，可選^^在一種或多種相關(guān)測(cè)定法中具有優(yōu)良特性的抗體用于進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)。編碼抗體氨基酸序列變體的核酸分子可通過(guò)本領(lǐng)域知道的多種方法來(lái)制備。這些方法包括但不限于從天然來(lái)源分離(在天然發(fā)生氨基酸序列變體介導(dǎo)的(或定點(diǎn))誘變、PCR誘變和盒式誘變來(lái)制備。64可能希望在本發(fā)明免疫球蛋白多肽的FC區(qū)中引入一處或多處氨基酸修飾，由此生成Fc區(qū)變體。Fc區(qū)變體可包括在一個(gè)或多個(gè)氨基酸位置(包括鉸鏈半胱氨酸)包含氨基酸修飾(例如替代)的人Fc區(qū)序歹'j(例如人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4Fc區(qū))。依照此描述和本領(lǐng)域的教導(dǎo)，在有些實(shí)施方案中，本發(fā)多處改變。與它們的野生型對(duì)應(yīng)物相比，這些抗體仍將基本上保留治療功效所需要的相同特性。例如，認(rèn)為可在Fc區(qū)中進(jìn)行將會(huì)導(dǎo)致Clq結(jié)合和/或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)改變(即或是增強(qiáng)或是削弱)的某些改變，例如如W099/51642中所述。還可參見(jiàn)關(guān)注Fc區(qū)變體其它例子的Duncan和Winter,A^wre322:738-40(1988);美國(guó)專利5,648,260;美國(guó)專利5,624,821;及W094/2935LWO00/42072(Presta)和WO2004/056312(Lowman)記載了對(duì)FcR的結(jié)合提高或降低的抗體變體。在此明確收入這些專利出版物的內(nèi)容作為參考。還可參見(jiàn)Shields等，編.C/zem.9(2):6591-6604(2001)。半衰期延長(zhǎng)且對(duì)新生兒Fc受體(FcRn)(它負(fù)責(zé)將母體IgG轉(zhuǎn)移給胎兒)(Guyer等，//mmw"o/.117:587(1976)及Kim等，《//mww"o/,24:249(1994))的結(jié)合改良的抗體記載于US2005/0014934A1(Hinton等)。這些抗體包含具有一處或多處改進(jìn)Fc區(qū)與FcRn結(jié)合的替代的Fc區(qū)。具有改變的Fc區(qū)氨基酸序列且Clq結(jié)合能力升高或降低的多肽變體記載于美國(guó)專利No.6,194,551B1,W099/51642。在此明確收入這些專利出版物的內(nèi)容作為參考。還可參見(jiàn)Idusogie等，//mww朋/.164:4178-4184(2000)。抗體f斤生物可進(jìn)一步修飾本發(fā)明的抗體以包含本領(lǐng)域知道的且易于獲得的額外非蛋白質(zhì)性質(zhì)模塊。優(yōu)選的是，適于抗體衍生化的模塊是水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧曱基纖維素、右旋糖苷、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-l,3-二氧戊環(huán)、聚-1，3,6-三口惡烷、乙烯/馬來(lái)酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或隨機(jī)共聚物)、和右旋糖苷或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、環(huán)氧丙烷/環(huán)氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。由于其在水中的穩(wěn)定性，聚乙二醇丙醛在生產(chǎn)中可能具有優(yōu)勢(shì)。聚合物可以是任何分子量，而且可以是分支的或不分支的。附著到抗體上的聚合物數(shù)目可以變化，而且如果附著了超過(guò)一個(gè)聚合物，那么它們可以是相同或不同的型，包括但不限于待改進(jìn)抗體的具體特性或功能、抗體衍生物是否將用于指定條件下的治療等。篩選具有所需性質(zhì)的抗體本發(fā)明的抗體可以用本領(lǐng)域已知的各種測(cè)定法對(duì)其物理/化學(xué)性質(zhì)和生物學(xué)功能進(jìn)行表征。在一些實(shí)施方式中，抗體表征為如下任一種或多種特征結(jié)合DLL4，和/或減弱或者阻斷NOTCH受體活化，和/或減弱或者阻斷NOTCH受體下游分子信號(hào)傳導(dǎo)，和/或破壞或者阻斷NOTCH受體結(jié)合DLL4，和/或促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，和/或抑制內(nèi)皮細(xì)胞分化，和/或抑制動(dòng)脈分化，和/或抑制腫瘤血管灌注(tumorvascularperfusion),和/或治療和/或預(yù)防腫瘤、細(xì)胞增殖性病癥或癌癥，和/或治療或預(yù)防與DLL4表達(dá)和/或活性有關(guān)的病癥，和/或治療或預(yù)防與Notch受體表達(dá)和/或活性有'關(guān)的病癥。純化的抗體還可以通過(guò)一系列測(cè)定法進(jìn)行表征，包括但不限于N末端測(cè)序、氨基酸分析、非變性大小排阻高壓液相層析(HPLC)、質(zhì)譜、離子交換層析和木瓜蛋白酶消化。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，對(duì)此處制備的抗體分析它們的生物學(xué)活性。在有些實(shí)施方案中，對(duì)本發(fā)明的抗體檢驗(yàn)它們的抗原結(jié)合活性。本領(lǐng)域術(shù)的任何直接的或竟?fàn)幮缘慕Y(jié)合測(cè)定法Western印跡、放射免疫測(cè)定法、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法)、"夾心式/三明治式"免疫測(cè)定法、免測(cè)沉淀測(cè)定法、熒光免疫測(cè)定法和蛋白A免疫測(cè)定法。在下面的實(shí)施例部分提供了例示性的抗原結(jié)合測(cè)定法。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了與26.6、26.14、26.20、26.34、和/或26.82抗體竟?fàn)嶥LL4結(jié)合的抗DLL4單克隆抗體。此類(lèi)竟?fàn)幮钥贵w包括所識(shí)別的DLL4表位與抗體26.6、26.14、26.20、26.34、和/或26.82所識(shí)別的DLL4表位相同或交疊的抗體。此類(lèi)竟?fàn)幮钥贵w可以通過(guò)對(duì)抗DLL4雜交瘤上清液篩選與經(jīng)過(guò)標(biāo)記的26.6、26.14、26.20、26.34、和/或26.82抗體竟?fàn)帉?duì)固定化DLL4的結(jié)合來(lái)得到。與含有無(wú)關(guān)抗體或不含抗體的對(duì)照結(jié)合混合物中檢測(cè)到的結(jié)合的、經(jīng)過(guò)標(biāo)記的抗體的量相比，含有竟?fàn)幮钥贵w的雜交瘤上清液會(huì)減少測(cè)試竟?fàn)幗Y(jié)合混合物中檢測(cè)到的結(jié)合的、經(jīng)過(guò)標(biāo)記的抗體的量。本文所述任何竟?fàn)幗Y(jié)合測(cè)定法都適用于前述規(guī)程。另一方面，本發(fā)明提供了包含26.6、26.14、26.20、26.34、和/或26.82抗體的一個(gè)或多個(gè)(諸如2、3、4、5、和/或6個(gè))HVR的抗DLL4單克隆抗體。包含26.6、26.14、26.20、26.34、和/或26.82抗體的一個(gè)或多個(gè)HVR的抗DLL4單克隆抗體可以如下來(lái)構(gòu)建，即如上所述將26.6、26.14、26.20、26.34、和/或26.82抗體的一個(gè)或多個(gè)HVR移植到模板抗體序列上，例如最接近親本抗共有序列，并在重組宿主細(xì)胞中表達(dá)所得嵌合輕鏈和/或重鏈可變區(qū)序列，有或無(wú)伴隨的恒定區(qū)序列。何便利的方法對(duì)抗DLL4雜交瘤克隆篩選期望特性。例如，如果需要阻斷或不阻斷Notch受體結(jié)合DLL4的抗DLL4單克隆抗體，那么可以在結(jié)合竟?fàn)帨y(cè)定法中測(cè)試候選抗體，諸如竟?fàn)幮越Y(jié)合ELISA，其中板孔用DLL4包被，將感興趣Notch受體過(guò)量的抗體溶液鋪到經(jīng)過(guò)包被的板上，并酶法檢測(cè)結(jié)合的抗體，例如使結(jié)合的抗體接觸偶聯(lián)有HRP的抗Ig抗體或生物素化抗Ig抗體并顯現(xiàn)HRP顯色反應(yīng)，例如通過(guò)用鏈霉親合素-HRP和/或過(guò)氧化氫使板顯色并通過(guò)分光光度法用ELISA讀板儀在490nm檢測(cè)HRP顯色反應(yīng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涵蓋有一些但不是全部效應(yīng)器功能已有變化的抗體，這使其成為許多應(yīng)用的期望候選物，其中抗體在體內(nèi)的半衰期很重要但某些效應(yīng)器功能(諸如補(bǔ)體和ADCC)不是必需的或者是有害的。在某些實(shí)施方案中，測(cè)量所生成的免疫球蛋白的Fc活性以確保只有所需性質(zhì)得到保留?？梢赃M(jìn)行體外和/或體內(nèi)細(xì)胞毒性測(cè)定法以證實(shí)CDC和/或ADCC活性的降低/消減。例如，可以進(jìn)行Fc受體(FcR)結(jié)合測(cè)定法以確?？贵w缺失FcyR結(jié)合(因此可能缺失ADCC活性)，但保留FcRn結(jié)合能力。介導(dǎo)ADCC的主要細(xì)月包，nk細(xì)胞，只表達(dá)FcyRIII,而單核細(xì)胞表達(dá)FcyRI、FcyRII和FcyRIII。在Ravetch和Kinet,Wev./mmw"o/9:457-92(1991)第464頁(yè)的表3概述了造血細(xì)胞上的Fc樣達(dá)。美國(guó)專利No.5,500,362或5，821,337描述了用于評(píng)估感興趣分子的ADCC活性的體外測(cè)定法的一個(gè)例子。可用于這些測(cè)定法的有用效應(yīng)細(xì)胞包括外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)和天然殺傷(NK)細(xì)胞。或者/另夕卜，可以在體內(nèi)評(píng)估感興趣分子的ADCC活性，例如在諸如Clynes等，尸rac.67A^/.JcW.OS^95:652-656(1998)中公開(kāi)的動(dòng)物模型中。也可以進(jìn)行Clq結(jié)合測(cè)定法以證實(shí)抗體不能結(jié)合Clq從而缺失CDC活性。為了評(píng)估補(bǔ)體激活，可以進(jìn)4亍CDC觀寸定法，例^口長(zhǎng)口Gazzano-Santoro等，//mmwwo/.202:163(1996)所述。也可以利用本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行FcRn結(jié)合和體內(nèi)清除/半衰期測(cè)定，例如實(shí)施例部分所描述的那些。載體、宿主細(xì)胞和重組方法為了重組生產(chǎn)本發(fā)明的抗體，分離編碼它的核酸，并將其插入可復(fù)制載體，用于進(jìn)一步克隆(DNA擴(kuò)增)或表達(dá)?？墒褂贸Ｒ?guī)規(guī)程容易地分離編碼抗體的DNA并測(cè)序(例如使用能夠與編碼抗體重鏈和輕鏈的基因特異性結(jié)合的寡核苷酸探針)?？衫迷S多載體。載體的選擇部分取決于將要使用的宿主細(xì)胞。通常，優(yōu)選的宿主細(xì)胞是原核或真核(通常是哺乳動(dòng)物)起源的。應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會(huì)，任何同種型的恒定區(qū)可用于此目的，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE恒定區(qū)，而且此類(lèi)恒定區(qū)可以從任何人或動(dòng)物物種獲得。a.使用原核宿主細(xì)胞生成抗體i.載體構(gòu)建可使用標(biāo)準(zhǔn)重組技術(shù)來(lái)獲得編碼本發(fā)明抗體多肽構(gòu)件的多核苷酸序列?？蓮目贵w生成細(xì)胞諸如雜交瘤細(xì)胞分離期望的多核苷S吏序列并測(cè)序。或者，可使用核苷酸合成儀或PCR技術(shù)合成多核苷酸。一旦得到，將編碼多肽的序列插入能夠在原核宿主中復(fù)制并表達(dá)異源多核苷酸的重組載體。為了本發(fā)明，可使用本領(lǐng)域可獲得的且知道的許多載體。適宜載體的選擇將主要取決于將要插入載體的核酸的大小和將要用載體轉(zhuǎn)化的具體宿主細(xì)胞。根據(jù)其功能(擴(kuò)增或表達(dá)異源多核苷酸，或二者兼之)及其與它在其中駐留的具體宿主細(xì)胞的相容性，每種載體含有多種構(gòu)件。載體構(gòu)件通常包括但不限于復(fù)制起點(diǎn)、選擇標(biāo)志基因、啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)、信號(hào)序列、異源核酸插入片段、和轉(zhuǎn)錄終止序列。一般而言，與宿主細(xì)胞一起使用的質(zhì)粒載體包含衍生自與這些宿主相容物種的復(fù)制子和控制序列。載體通常攜帶復(fù)制位點(diǎn)，以及能夠在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中提供表型選擇的標(biāo)志序列。例如，通常用衍生自大腸桿菌物種的質(zhì)粒pBR322轉(zhuǎn)化大腸桿菌。pBR322包含編碼氨千青霉素(Amp)和四環(huán)素(Tet)抗性的基因，由此提供輕松鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞的手段。pBR322、其衍生物、或其它微生物質(zhì)?；蚴删w還可包含或經(jīng)修飾而包含可被微生物生物體用于表達(dá)內(nèi)源蛋白質(zhì)的啟動(dòng)子。Carter等，美國(guó)專利No.5,648，237中詳細(xì)記載了用于表達(dá)特定抗體的pBR322衍生物的例子。另外，可將包含與宿主微生物相容的復(fù)制子和控制序列的噬菌體載體用作這些宿主的轉(zhuǎn)化載體。例如，可使用噬菌體諸如入GEMTM-11來(lái)構(gòu)建可用于轉(zhuǎn)化易感宿主細(xì)胞諸如大腸桿菌LE392的重組載體。本發(fā)明的表達(dá)載體可包含兩種或多種啟動(dòng)子-順?lè)醋訉?duì)，它們編碼每一種多肽構(gòu)件。啟動(dòng)子是位于順?lè)醋由嫌?5')的非翻譯調(diào)控序列，它調(diào)控順?lè)醋拥谋磉_(dá)。原核啟動(dòng)子通常分成兩類(lèi)，誘導(dǎo)型的和組成性的。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子指響應(yīng)培養(yǎng)條件的變化(例如營(yíng)養(yǎng)物的存在與否或溫度變化)而啟動(dòng)受其控制的順?lè)醋拥纳咚睫D(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。眾所周知受到多種潛在宿主細(xì)胞識(shí)別的大量啟動(dòng)子。通過(guò)限制酶消化切下源DNA中的啟動(dòng)子并將分離的啟動(dòng)子序列插入本發(fā)明的載體，由此可將選擇的啟動(dòng)子與編碼輕鏈或重鏈的順?lè)醋覦NA可操作連接。天然啟動(dòng)子序列和許多異源啟動(dòng)子都可用于指導(dǎo)靶基因的擴(kuò)增和/或表達(dá)。在有些實(shí)施方案中，使用異源啟動(dòng)子，因?yàn)榕c天然靶多肽啟動(dòng)子相比，它們通常容許所表達(dá)靶基因的更高轉(zhuǎn)錄和更高產(chǎn)量。適用于原核宿主的啟動(dòng)子包括PhoA啟動(dòng)子、P-半乳糖香酶和乳糖啟動(dòng)子系統(tǒng)、色氨酸(trp)啟動(dòng)子系統(tǒng)、和雜合啟動(dòng)子諸如tac或trc啟動(dòng)子。然而，在細(xì)菌中有功能的其它啟動(dòng)子(諸如其它已知的細(xì)菌或噬菌體啟動(dòng)子)也是合適的。它們的核苷酸序列已經(jīng)發(fā)表，由此熟練工作人員能夠使用提供任何所需限制位點(diǎn)的接頭或銜接頭將它們與編碼靶輕鏈和重鏈的順?lè)醋涌刹僮鬟B接(Siebenlist等(1980)Cell20:269)。在本發(fā)明的一個(gè)方面，重組載體內(nèi)的每個(gè)順?lè)醋佣及笇?dǎo)所表達(dá)多肽穿膜轉(zhuǎn)運(yùn)的分泌信號(hào)序列構(gòu)件。一般而言，信號(hào)序列可以是載體的構(gòu)件，或者它可以是插入載體的靶多肽DNA的一部分。為了本發(fā)明而選^t奪的信號(hào)序列應(yīng)當(dāng)是受到宿主細(xì)胞識(shí)別并加工(即被信號(hào)肽酶切除)的信號(hào)序列。對(duì)于不識(shí)別并加工異源多肽的天然信號(hào)序列的原核宿主細(xì)胞，將信號(hào)序列用選自例如下組的原核信號(hào)序列替代堿性磷酸酶、青霉素酶、Ipp、或熱穩(wěn)定的腸毒素II(STII)前導(dǎo)序列、LamB、PhoE、Pe舊、OmpA和MBP。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)系統(tǒng)的兩個(gè)順?lè)醋又卸际褂玫男盘?hào)序列是STII信號(hào)序列或其變體。在另一方面，依照本發(fā)明的免疫球蛋白的生成可在宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中發(fā)生，因此不需要在每個(gè)順?lè)醋觾?nèi)存在分泌信號(hào)序列。在那點(diǎn)上，免疫球蛋白輕鏈和重鏈在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)、折疊和裝配而形成功能性免疫球蛋白。某些宿主菌抹(例如大腸桿菌trxB-菌抹)提供有利于二硫鍵形成的細(xì)胞質(zhì)條件，從而容許所表達(dá)蛋白質(zhì)亞基的正確折疊和裝配。Proba和Pliickthun,159:203(1995))。適于表達(dá)本發(fā)明抗體的原核宿主細(xì)胞包括古細(xì)菌(Archaebacteria)和真細(xì)菌(Eubacteria),諸如革蘭氏陰性或革蘭氏陽(yáng)性生物體。有用細(xì)菌的例子包括埃希氏菌屬(Escherichia)(例如大腸埃希氏菌Eco//)、芽孢桿菌屬(Bacillus)(例如枯草芽孢桿菌及ra磁s)、腸桿菌屬(Enterobacterial假單胞菌屬(Pseudomonas)(例如銅綠假單胞菌J3"en^7'"osa)物種、鼠傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonellatyphimurium)、粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescans)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、變形菌屬(Proteus)、志賀氏菌屬(Shigella)、根瘤菌屬(Rhizobium)、透明顫菌屬(Vitreoscilla)、或副球菌屬(Paracoccus)。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用革蘭氏陰性細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用大腸桿菌細(xì)胞作為本發(fā)明的宿主。大腸桿菌菌林的例子包括菌抹W3110(Bachmann,CellularandMolecularBiology,第2巻，Washington,D.C.,美國(guó)微生物學(xué)學(xué)會(huì)，1987,第1190-1219頁(yè)；ATCC⑧保藏號(hào)27,325)及其衍生物，包括具有基因型W3110AfhuA(AtonA)ptr3lacIqlacL8AompTA(nmpc-fepE)degP41kanR的菌林33D3(美國(guó)專利號(hào)No.5,639,635)。其它菌抹及其衍生物，諸如大腸桿菌294(ATCC31，446)、大腸桿菌B、大腸桿菌X1776(ATCC31,537)和大腸桿菌RV308(ATCC31,608)也是合適的。這些例子只是例示而非限制。本領(lǐng)域知道用于構(gòu)建具有指定基因型的任何上述細(xì)菌衍生物的方法，而且記載于例如Bass等，8:309-314(1990)。通常必需考慮復(fù)制子在細(xì)菌細(xì)胞中的可復(fù)制性來(lái)選擇適宜的細(xì)菌。例如，在使用眾所周知的質(zhì)粒諸如pBR322、pBR325、pACYC177或pKN410來(lái)提供復(fù)制子時(shí)，大腸桿菌、沙雷氏菌屬、或沙門(mén)氏菌屬物種可能適于用作宿主。通常，宿主細(xì)胞應(yīng)當(dāng)分泌最小量的蛋白水解酶，而且可能希望在細(xì)胞培養(yǎng)中摻入額外的蛋白酶抑制劑。ii.抗體生成用上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并在為了誘導(dǎo)啟動(dòng)子、選擇轉(zhuǎn)化子或擴(kuò)70增編碼期望序列的基因而適當(dāng)改動(dòng)的常規(guī)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。轉(zhuǎn)化即將DNA導(dǎo)入原核宿主，使得DNA能夠進(jìn)行復(fù)制，或是作為染色體外元件或是通過(guò)染色體成分。根據(jù)所用宿主細(xì)胞，使用適于這些細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。采用氯化鈣的鈣處理通常用于具有堅(jiān)固細(xì)胞壁屏障的細(xì)菌細(xì)胞。另一種轉(zhuǎn)化方法采用聚乙二醇/DMSO。使用的還有一種技術(shù)是電穿孑L在本領(lǐng)域知道的且適于培養(yǎng)選定宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基中培養(yǎng)用于生成本發(fā)明多肽的原核細(xì)胞。合適培養(yǎng)基的例子包括添加了必需營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充物的LB培養(yǎng)基(Luriabroth)。在有些實(shí)施方案中，培養(yǎng)基還含有根據(jù)表達(dá)載體的構(gòu)建而選擇的選擇劑，以選擇性容許包含表達(dá)載體的原核細(xì)胞生長(zhǎng)。例如，向用于培養(yǎng)表達(dá)氨千青霉素抗性基因的細(xì)胞的培養(yǎng)基中添加氨千青霉素。除了碳、氮、和無(wú)機(jī)磷酸鹽來(lái)源以外，還可含有適當(dāng)濃度的任何必需補(bǔ)充物，或是單獨(dú)加入或是作為與另一種補(bǔ)充物或培養(yǎng)基的混合物，諸如復(fù)合氮源。任選的是，培養(yǎng)基可含有一種或多種選自下組的還原劑谷胱甘肽、半胱氨酸、胱胺、巰基乙酸鹽/酯、二硫赤蘚糖醇和二石克蘇糖醇。在合適的溫度培養(yǎng)原核宿主細(xì)胞。例如，對(duì)于培養(yǎng)大腸桿菌，優(yōu)選的溫度范圍是約20。C至約39。C,更優(yōu)選約25。C至約37。C,甚至更優(yōu)選約30。C。主要取決于宿主生物體，培養(yǎng)基的pH可以是范圍為約5至約9的任何pH。對(duì)于大腸桿菌，pH優(yōu)選約6.8至約7.4，更優(yōu)選約7.0。如果本發(fā)明的表達(dá)載體中使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，那么在適于激活啟動(dòng)子的條件下誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)。在本發(fā)明的一個(gè)方面，使用PhoA啟動(dòng)子來(lái)控制多肽的轉(zhuǎn)錄。因此，為了誘導(dǎo)，在磷酸鹽限制培養(yǎng)基中培養(yǎng)經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。優(yōu)選地，磷酸鹽限制培養(yǎng)基是C.R.A.P培養(yǎng)基(參見(jiàn)例如Simmons等，J./mmw朋/.MeAods263:133-147(2002))。根據(jù)所采用的載體構(gòu)建物，可采用多種其它誘導(dǎo)物，正如本領(lǐng)域所知道的。在一個(gè)實(shí)施方案中，所表達(dá)的本發(fā)明多肽分泌到宿主細(xì)胞的周質(zhì)中并從中回收。蛋白質(zhì)回收通常牽涉破壞微生物，通常通過(guò)諸如滲壓震擾(osmoticshock)、超聲處理或裂解等手段。一旦細(xì)胞遭到破壞，可通過(guò)離心或過(guò)濾清除細(xì)胞碎片或整個(gè)細(xì)胞。可以通過(guò)例如親和樹(shù)脂層析進(jìn)一步純化蛋白質(zhì)?；蛘?，蛋白質(zhì)可能轉(zhuǎn)運(yùn)到培養(yǎng)液中并從中分離?？蓮呐囵B(yǎng)液清除細(xì)胞，并將培養(yǎng)物上清液過(guò)濾和濃縮，用于進(jìn)一步純化所生成蛋白質(zhì)。可使用普遍知道的方法諸如聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)和Western印跡測(cè)定法進(jìn)一步分離和鑒71定所表達(dá)多肽。在本發(fā)明的一個(gè)方面，通過(guò)發(fā)酵過(guò)程大量進(jìn)行抗體生產(chǎn)。多種大規(guī)模補(bǔ)料-分批發(fā)酵規(guī)程可用于生產(chǎn)重組蛋白。大規(guī)模發(fā)酵具有至少1000升的容量，優(yōu)選約1,000至100,000升的容量。這些發(fā)酵罐使用攪拌器葉輪來(lái)分配氧和養(yǎng)分，尤其是葡萄糖(優(yōu)選的碳源/能源)。小規(guī)模發(fā)酵通常指在體積容量不超過(guò)約100升的發(fā)酵罐中進(jìn)行的發(fā)酵，范圍可以是約1升至約100升。在發(fā)酵過(guò)程中，通常在將細(xì)胞在合適條件下培養(yǎng)至期望密度(例如OD550約180-220,在此階段細(xì)胞處于早期穩(wěn)定期)后啟動(dòng)蛋白質(zhì)表達(dá)的誘導(dǎo)。根據(jù)所采用的載體構(gòu)建物，可使用多種誘導(dǎo)物，正如本領(lǐng)域知道的和上文描述的?？稍谡T導(dǎo)前將細(xì)胞培養(yǎng)更短的時(shí)間。通常將細(xì)胞誘導(dǎo)約12-50小時(shí)，但是可使用更長(zhǎng)或更短的誘導(dǎo)時(shí)間。為了提高本發(fā)明多肽生產(chǎn)的產(chǎn)量和質(zhì)量，可修改多項(xiàng)發(fā)酵條件。例如，為了改善所分泌抗體多肽的正確裝配和折疊，可使用過(guò)度表達(dá)伴侶蛋白諸如I)sb蛋白(DsbA、DsbB、DsbC、DsbD和/或DsbG)或FkpA(具有伴侶活性的一種肽基脯氨酰-順式，反式-異構(gòu)酶)的額外載體來(lái)共轉(zhuǎn)化宿主原核細(xì)胞。已經(jīng)證明伴估蛋白促進(jìn)在細(xì)菌宿主細(xì)胞中生成的異源蛋白質(zhì)的正確折疊和溶解度。Chen等(1999)，腸/.C72艮274:19601-19605;Georgiou等，美國(guó)專利No.6,083,715;Georgiou等，美國(guó)專利No.6,027,888;Bothmann和Pliickthun(2000),J所o/.C/zem.275:17100-17105;Ramm和Pliickthun(2000)，J.淑.CW275:17106-17113;Arie等(2001)，M/.M'c油b/.39:199-210)。為了將所表達(dá)異源蛋白質(zhì)(尤其是對(duì)蛋白水解敏感的異源蛋白質(zhì))的蛋白水解降至最低，可將蛋白水解酶缺陷的某些宿主菌抹用于本發(fā)明。例如，可修飾宿主細(xì)胞菌抹，在編碼已知細(xì)菌蛋白酶的基因中進(jìn)行遺傳突變，諸如蛋白酶m、OmpT、DegP、Tsp、蛋白酶I、蛋白酶Mi、蛋白酶V、蛋白酶VI及其組合?？梢垣@得有些大腸桿菌蛋白酶缺陷菌抹，記載于例如Joly等，1998，見(jiàn)上文；Georgiou等，美國(guó)專利No.5,264,365;Georgiou等，美國(guó)專利No.5，508，192;Hara等，Mc油'a/i>wg2:63-72(1996)。在一個(gè)實(shí)施方案中，在本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)中使用蛋白水解酶缺陷且經(jīng)過(guò)過(guò)度表達(dá)一種或多種伴侶蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌抹作為宿主細(xì)胞。iii.抗體純化可采用本領(lǐng)域知道的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化方法。下面的規(guī)程是合適純化規(guī)程的例示免疫親和或離子交換柱上的分級(jí)、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土或陽(yáng)離子交換樹(shù)脂諸如DEAE上的層析、層析聚焦、SDS-PAGE、石克酸銨沉淀、和使用例如SephadexG-75的凝膠過(guò)濾。在一個(gè)方面，將固定化在固相上的蛋白A用于本發(fā)明全長(zhǎng)抗體產(chǎn)物的免疫親和純化。蛋白A是來(lái)自金黃色葡萄球菌(5yap/2_y/occws)的41kD細(xì)胞壁蛋白質(zhì)，它以高親和力結(jié)合抗體Fc區(qū)。Lindmark等(1983),J.Immunol.Meth.62:1-13)。蛋白A固定化其上的固相優(yōu)選具有玻璃或石英表面的柱子，更優(yōu)選可控孔徑玻璃柱或硅酸柱。在有些應(yīng)用中，柱子以諸如甘油等試劑包被，試圖防止污染物的非特異粘附。作為純化的第一步，將衍生自如上所述細(xì)胞培養(yǎng)物的制備物施加到蛋白A固定化固相上，使得目的抗體特異性結(jié)合蛋白A。然后清洗固相以清除與固相非特異性結(jié)合的污染物。最后通過(guò)洗脫從固相回收感興趣抗體。b.^使用真核宿主細(xì)胞生成抗體載體構(gòu)件通常包括但不限于如下一種或多種信號(hào)序列、復(fù)制起點(diǎn)、一種或多種標(biāo)志基因、增強(qiáng)子元件、啟動(dòng)子、和轉(zhuǎn)錄終止序列。(i)信號(hào)序列構(gòu)件在真核宿主細(xì)胞中使用的載體還可在感興趣成熟蛋白質(zhì)或多肽的N末端包含信號(hào)序列或具有特異性切割位點(diǎn)的其它多肽。優(yōu)選受到宿主細(xì)胞識(shí)別并加工(即被信號(hào)肽酶切除)的異源信號(hào)序列。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)中，可利用哺乳動(dòng)物信號(hào)序列以及病毒分泌前導(dǎo)，例如單純皰疹病毒gD信號(hào)。將此類(lèi)前體區(qū)的DNA連接到編碼抗體的DNA的讀碼框中。(ii)復(fù)制起點(diǎn)通常，哺乳動(dòng)物表達(dá)載體不需要復(fù)制起點(diǎn)構(gòu)件。例如，SV40起點(diǎn)通?？赡苤灰虬缙趩?dòng)子才使用。(iii)選擇基因構(gòu)件表達(dá)和克隆載體可包含選擇基因，也稱為選擇標(biāo)志。典型的選擇基因編碼如下蛋白質(zhì)(a)賦予對(duì)抗生素或其它毒素的抗性，例如氨千青霉素、新霉素、曱氨蝶呤或四環(huán)素；(b)補(bǔ)足相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)缺陷；或(c)提供不能從復(fù)合培養(yǎng)基獲得的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)物。選擇方案的一個(gè)例子利用藥物來(lái)阻滯宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)。經(jīng)異源基因成功轉(zhuǎn)化的那些細(xì)胞生成賦予藥物抗性的蛋白質(zhì)，因而幸免于選^^方案。此類(lèi)顯73性選擇的例子使用藥物新霉素、霉酚酸和潮霉素。適于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的選擇標(biāo)志的另一個(gè)例子是能夠鑒定有能力攝取抗體核酸的細(xì)胞的選擇標(biāo)志，諸如DHFR、胸苦激酶、金屬硫蛋白I和II優(yōu)選靈長(zhǎng)類(lèi)金屬硫蛋白基因、腺苷脫氨酶、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶等。例如，首先通過(guò)將所有轉(zhuǎn)化子在含有曱氨蝶呤(Mtx，DHFR的一種竟?fàn)幮赞卓箘?的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)來(lái)鑒定經(jīng)DHFR選擇基因轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。在采用野生型DHFR時(shí)，適宜的宿主細(xì)胞是DHFR活性缺陷的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系(例如ATCCCRL-9096)?；蛘?，可通過(guò)在含有針對(duì)選擇標(biāo)志的選擇劑諸如氨基糖苷抗生素例如卡那霉素、新霉素或G418的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞來(lái)選擇經(jīng)編碼抗體、野生型DHFR蛋白、和另一種選擇標(biāo)志諸如氨基糖苷3'-磷酸轉(zhuǎn)移酶(APH)的DNA序列轉(zhuǎn)化或共轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞(特別是包含內(nèi)源DHFR的野生型宿主)。參見(jiàn)美國(guó)專利No.4,965,199。(iv)啟動(dòng)子構(gòu)件表達(dá)和克隆載體通常包含受到宿主生物體識(shí)別的啟動(dòng)子，且與抗體多肽核酸可操作連接。已知真核細(xì)胞的啟動(dòng)子序列。事實(shí)上，所有真核基因都具有富含AT區(qū)，它位于起始轉(zhuǎn)錄的位點(diǎn)上游約25至30個(gè)堿基處。在許多基因的轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游70至80個(gè)堿基處發(fā)現(xiàn)的另一種序列是CNCAAT區(qū)，其中N可以是任何核苷酸(SEQIDNO:60)。在大多數(shù)真核基因的3'末端是AATAAA序列，它可能是向編碼序列的3'端添加聚腺苷酸(polyA)尾的信號(hào)(SEQIDNO:61)。所有這些序列合適地插入真核表達(dá)載體。在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中由載體轉(zhuǎn)錄抗體多肽受到例如從病毒(諸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(諸如2型腺病毒)、牛乳頭瘤病毒、禽類(lèi)肉瘤病毒、巨細(xì)胞病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、乙肝病毒、和猿病毒40(SV40))基因組獲得的、來(lái)自異源哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子(如肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子或免疫球蛋白啟動(dòng)子)的、來(lái)自熱休克啟動(dòng)子的啟動(dòng)子的控制，倘若這些啟動(dòng)子與宿主細(xì)胞系統(tǒng)相容的話。方便的以SV40限制性片段的形式獲得SV40病毒的早期和晚期啟動(dòng)子，該片段還包含SV40病毒復(fù)制起點(diǎn)。方便的以HindIIIE限制性片段的形式獲得人巨細(xì)胞病毒的立即早期啟動(dòng)子。美國(guó)專利No.4，419,446中公開(kāi)了使用牛乳頭瘤病毒作為載體在哺乳動(dòng)物宿主中表達(dá)DNA的系統(tǒng)。美國(guó)專利No.744，601,978中記載了該系統(tǒng)的一種修改?；蛘撸墒褂脛谑先饬霾《鹃L(zhǎng)末端重復(fù)序列作為啟動(dòng)子。(V)增強(qiáng)子元件構(gòu)件常常通過(guò)在載體中插入增強(qiáng)子序列來(lái)提高高等真核細(xì)胞對(duì)編碼本發(fā)明抗體多肽的DNA的轉(zhuǎn)錄?，F(xiàn)在知道來(lái)自哺乳動(dòng)物基因(球蛋白、彈性蛋白酶、清蛋白、曱胎蛋白和胰島素)的許多增強(qiáng)子序列。然而，通常會(huì)使用來(lái)自真核細(xì)胞病毒的增強(qiáng)子。例子包括SV40復(fù)制起點(diǎn)晚期側(cè)的增強(qiáng)子(bp100-270)、巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子增強(qiáng)子、多瘤病毒復(fù)制起點(diǎn)晚期側(cè)的增強(qiáng)子、和腺病毒增強(qiáng)子。關(guān)于激活真核啟動(dòng)子的增強(qiáng)元件還可參見(jiàn)Yaniv,A^we297:17-18(1982)。增強(qiáng)子可剪接到載體中，位于抗體多肽編碼序列的5'或3'位置，但是優(yōu)選位于啟動(dòng)子的5'位點(diǎn)。(vi)轉(zhuǎn)錄終止構(gòu)件在真核宿主細(xì)胞中使用的表達(dá)載體通常還包含終止轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定mRNA所必需的序列。此類(lèi)序列通常可從真核或病毒DNA或cDNA非翻譯區(qū)的5'端和偶爾的3'端獲得。這些區(qū)域包含在編碼抗體的mRNA的非翻譯區(qū)中轉(zhuǎn)錄成聚腺苦酸化片段的核苷酸區(qū)段。一種有用的轉(zhuǎn)錄終止構(gòu)件是牛生長(zhǎng)激素聚腺苷酸化區(qū)。參見(jiàn)W094/11026及其中公開(kāi)的表達(dá)載體。(vii)宿主細(xì)胞的選擇和轉(zhuǎn)化適于克隆或表達(dá)本文載體中的DNA的宿主細(xì)胞包括本文描述的高等真核細(xì)胞，包括脊推動(dòng)物宿主細(xì)胞。脊推動(dòng)物細(xì)胞在培養(yǎng)(組織培養(yǎng))中的繁殖已經(jīng)成為常規(guī)規(guī)程。有用哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系的例子有經(jīng)SV40轉(zhuǎn)化的猴腎CV1系(C0S-7，ATCCCRL1651)、人胚腎系(293細(xì)胞或?yàn)閼腋∨囵B(yǎng)而亞克隆的293細(xì)胞，Graham等，JGe".Wra/.36:59(1977))、幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(BHK，ATCCCCLIO)、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞ADHFR(CHO，Urlaub等，P亂A^/.^cfldaSL477:4216(1980))、小鼠塞托利(Sertoli)細(xì)胞(TM4，Mather,歷o/.Weprat/.23:243-251(1980))、猴腎細(xì)胞(CV1，ATCCCCL70)、非洲綠猴腎細(xì)胞(VERO-76，ATCCCRL1587)、人宮頸癌細(xì)胞(HELA，ATCCCCL2)、犬腎細(xì)胞(MDCK,ATCCCCL34)、牛鼠(buffalorat)肝細(xì)胞(BRL3A，ATCCCRL1442)、人肺細(xì)胞(W138，ATCCCCL75)、人肝細(xì)胞(HepG2,HB8065)、小鼠乳瘤(MMT060562,ATCCCCL51)、TRI細(xì)胞(Mather等，/f朋a/s383:44-68(1982))、MRC5細(xì)月包、FS4細(xì)胞和人肝瘤(hepatoma)系(HepG2)。為了生成抗體，用上文所述表達(dá)或克隆載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并在為了誘導(dǎo)啟動(dòng)子、選擇轉(zhuǎn)化子或擴(kuò)增編碼期望序列的基因而適當(dāng)改動(dòng)的常規(guī)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。(viii)宿主細(xì)胞的培養(yǎng)可在多種培養(yǎng)基中培養(yǎng)用于生成本發(fā)明抗體的宿主細(xì)胞。商品化培養(yǎng)基諸如Ham氏FlO(Sigma)、極限必需培養(yǎng)基(MEM，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、和Dulbecco氏改良Eagle氏培養(yǎng)基(DMEM,Sigma)適于培養(yǎng)宿主細(xì)胞。另外，可使用下列文獻(xiàn)中記載的任何培養(yǎng)基作為宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基Ham等，58:44(1979);Barnes等，腸c/z置102:255(1980);美國(guó)專利No.4,767,704;4,657,866;4,927,762;4,560,655;5,122,469;WO90/03430;WO87/00195;或美國(guó)專利Re.30,985。任何這些培養(yǎng)基可4艮據(jù)需要補(bǔ)充激素和/或其它生長(zhǎng)因子(諸如胰島素、運(yùn)鐵蛋白或表皮生長(zhǎng)因子)、鹽(諸如氯化鈉、鉤、鎂和磷酸鹽)、緩沖劑(諸如HEPES)、核苷酸(諸如腺苷和胸苷)、抗生素(諸如GENTAMYCINTM藥物)、痕量元素(定義為通常以^:摩爾范圍的終濃度存在的無(wú)機(jī)化合物)、和葡萄糖或等效能源。還可以適宜濃度含有本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的任何其它必需補(bǔ)充物。培養(yǎng)條件諸如溫度、pH等即為表達(dá)而選擇的宿主細(xì)胞先前所用的，這對(duì)于普通技術(shù)人員是顯然的。(ix)抗體的純4匕在使用重組技術(shù)時(shí)，可在細(xì)胞內(nèi)生成抗體，或者直接分泌到培養(yǎng)基中。如果在細(xì)胞內(nèi)生成抗體，那么首先需要通過(guò)例如離心或超濾清除^f鼓粒碎片，或是宿主細(xì)胞或是裂解片段。如果抗體分泌到培養(yǎng)基中，那么通常首先使用商品化蛋白質(zhì)濃縮濾器(例如Amicon或MilliporePellicon⑧超濾單元)濃縮來(lái)自這些表達(dá)系統(tǒng)的上清液。可在任何上述步驟中包括蛋白酶抑制劑諸如PMSF以抑制蛋白水解，而且可包括抗生素以防止外來(lái)污染物的生長(zhǎng)?？墒褂美缌u磷灰石層析、凝膠電泳、透析和親和層析(優(yōu)選的純化技術(shù)是親和層析)來(lái)純化從細(xì)胞制備的抗體組合物。蛋白A作為親和配體的適宜性取決于抗體中存在的任何免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域的種類(lèi)和同種型。蛋白A可用于純化基于人yl、y2、或y4重鏈的抗體(Lindmark等，//wmw"o/.Me仇62:1-13(1983))。蛋白G推薦用于所有小鼠同種型和人y3(Guss等，￡MB(9』5:1567-1575(1986))。親和配體所附著的基質(zhì)最常用的是瓊脂糖，但是可使用76其它基質(zhì)。物理穩(wěn)定的基質(zhì)諸如可控孔徑玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯能獲得比瓊脂糖更快的流速和更短的加工時(shí)間。若抗體包含CH3結(jié)構(gòu)域，則可使用BakerbondABXTM樹(shù)脂(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)進(jìn)行純化。根據(jù)待回收的抗體，也可使用其它蛋白質(zhì)純化技術(shù)諸如離子交換柱上的分級(jí)、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土上的層析、肝素SEPHAROSETM上的層析、陰離子或陽(yáng)離子交換樹(shù)脂(諸如聚天冬氨酸柱)上的層析、層析聚焦、SDS-PAGE和硫酸4妄沉淀。在任何初步純化步驟之后，可將含有目的抗體和污染物的混合物進(jìn)行j氐pH疏水相互作用層析，使用pH約2.5-4.5的洗脫緩沖液，優(yōu)選在低鹽濃度(例如約0-0.25M鹽)進(jìn)行。免疫偶聯(lián)物本發(fā)明還提供了包含偶聯(lián)有細(xì)胞毒劑的本文所述任何抗DLL4抗體的免疫偶聯(lián)物(可互換的稱為"抗體-藥物偶聯(lián)物"或"ADC")，所述細(xì)胞毒劑諸如化療劑、藥物、生長(zhǎng)抑制劑、毒素(例如細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物起源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射偶聯(lián)物)。抗體-藥物偶聯(lián)物在癌癥治療中用于局部投遞細(xì)胞毒劑或細(xì)胞抑制劑(即用于殺死或抑制腫瘤細(xì)胞的藥物)的用途(Syrigos和Epenetos(1999)JwZicawceri^e<arc/z19:605-614;Niculescu-Duvaz和Springer(1997)DragDe/.Tev.26:151-172;美國(guó)專利No.4,975,278)能將藥物才莫塊靶向投遞至腫瘤，并在那兒進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)積累，而系統(tǒng)施用這些未經(jīng)偶聯(lián)的藥物試劑可能在試圖消除的腫瘤細(xì)胞以外導(dǎo)致不可接受的對(duì)正常細(xì)胞的毒性水平(Baldwin等(1986)丄離e，第603-05頁(yè)(1986年5月15曰);Thorpe(1985)"AntibodyCarriersOfCytotoxicAgentsInCancerTherapy:AReview",在《MonoclonalAntibodies'84:BiologicalAndClinicalApplications》中，A.Pinchera等編，第475-506頁(yè))。由此試圖獲得最大功效及最小毒性。多克隆抗體和單克隆抗體皆有4艮道可用于這些策略(Rowland等(1986)C""cer/w附w"o/./wmwm^/zgK,21:183-87)。這些方法中所使用的藥物包括道諾霉素(daunomycin)、多柔比星(doxorubicin)、曱氨蝶呤(methotrexate)和長(zhǎng)春地辛(vindesine)(Rowland等，1986,見(jiàn)上文)?？贵w-毒素偶聯(lián)物中所使用的毒素包括細(xì)菌毒素諸如白喉毒素、植物毒素諸如蓖麻毒蛋白、小分子毒素諸如格爾德霉素(geldanamycin)(Mandler等(2000)Jowo"/ze淑Ca膨r她92(19):1573-1581(2000);Mandler等(2000)歷oorgam.c&Met/.C/zew.10:1025-1028;Mandler等(2002)^ocow/"g"feC/e附.13:786-791(2002))、美登木素生物石咸類(lèi)(EP1391213;Liu等(1996)尸亂編.爿c^/.5W.,93:8618-8623)、和加利車(chē)霉素(Lode等(1998)CancerRes.58:2928;Hinman等(1993)Owcer53:3336-3342)。毒素可通過(guò)包括微管蛋白結(jié)合、DNA結(jié)合或拓樸異構(gòu)酶抑制在內(nèi)的機(jī)制發(fā)揮其毒害細(xì)胞和抑制細(xì)胞的效果。有些細(xì)胞毒藥物在與大的抗體或蛋白質(zhì)受體配體偶聯(lián)時(shí)趨于失活或活性降低。ZEVALIN(ibritumomabtiuxetan，Biogen/Idec)是由針對(duì)在正常和惡性B淋巴細(xì)胞表面上發(fā)現(xiàn)的CD20抗原的鼠IgGlk單克隆抗體與通過(guò)硫脲接頭-螯合劑所結(jié)合的'"In或卯Y放射性同位素構(gòu)成的抗體-放射性同位素偶聯(lián)物(Wiseman等(2000)￡wJo,jVwc/.Afe/.27(7):766-77;Wiseman等(2002)飾。d99(12):4336-42;Witzig等(2002)C7/w.20(10):2453-63;Witzig等(2002)7C//".6>"co/.20(15):3262-69)。盡管ZEVALIN具有針對(duì)B細(xì)胞非何杰金氏(Hodgkin)淋巴瘤(NHL)的活性，然而施藥在大多數(shù)患者中導(dǎo)致嚴(yán)重且長(zhǎng)時(shí)間的血細(xì)月包減少。MYLOTARGTM(gemtuzumabozogamicin，WyethPharmaceuticals),即由人CD33抗體與加利車(chē)霉素連接而構(gòu)成的抗體-藥物偶聯(lián)物，在2000年批準(zhǔn)用于經(jīng)注射治療急性骨髓性白血病(Drw^尸z^/re(2000)25(7):686;美國(guó)專利No.4970198;5079233;5585089;5606040;5693762;5739116;5767285;5773001)。Cant腿mabmertansine(Imm畫(huà)genInc.),即由huC242抗體經(jīng)二硫化物接頭SPP與美登木素生物堿藥物模塊DM1連接而構(gòu)成的抗體-藥物偶聯(lián)物，正在進(jìn)行用于治療表達(dá)CanAg的癌癥諸如結(jié)腸癌、胰腺癌、胃癌和其它癌的II期試驗(yàn)。MLN-2704(MillenniumPharm.,BZLBiologies,ImmunogenInc.),即由抗前列腺特異性膜抗原(PSMA)單克隆抗體與美登木素生物堿藥物模塊DMl連接而構(gòu)成的抗體-藥物偶聯(lián)物，正在進(jìn)行用于前列腺腫瘤潛在治療的開(kāi)發(fā)。將多拉司他汀(dolastatin)的合成類(lèi)似物auristatin肽、auristatinE(AE)和單曱基auristatin(MMAE)與嵌合單克隆抗體cBR96(對(duì)癌瘤上的LewisY特異)和cAC10(對(duì)惡性血液肺瘤上的CD30特異)偶聯(lián)(Doronina等(2003)Atowre所otec/z"o/ogy21(7):778-784)，且正在進(jìn)行治療性開(kāi)發(fā)。本文(例如上文)描述了可用于生成免疫偶聯(lián)物的化療劑?？墒褂玫拿富钚远舅丶捌淦伟ò缀矶舅谹鏈、白喉毒素的非結(jié)合活性片段、外毒素A《連(來(lái)自4同鄉(xiāng)錄4艮單月包菌/^ewdcwo"(asaerwg^osa)、蓖麻毒蛋白(ricin)A4連、相思豆毒蛋白(abrin)A鏈、蒴蓮根毒蛋白(modeccin)A鏈、a畫(huà)帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutitesfordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陸(Phytolacaamericana)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordicacharantia)抑制物、麻瘋杉于毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、月巴鬼草(sapaonariaofficinalis)抑制物、白樹(shù)毒蛋白(gelonin)、絲林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依諾霉素(enomycin)和單端孑包菌素(trichothecenes)。參見(jiàn)例如1993年10月28日公布的WO93/21232。多種放射性核素可用于生成》文射偶聯(lián)抗體。例子包括^Bi、131I、131In、WY和湯Re?？贵w和細(xì)胞毒劑的偶聯(lián)物可使用多種雙功能蛋白質(zhì)偶聯(lián)劑來(lái)制備，諸如N-琥珀酰亞氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，亞氨基^5克烷(IT)，亞氨酸酯(諸如鹽酸己二酰亞氨酸二甲酯)、活性酯類(lèi)(諸如辛二酸二琥珀酰亞氨基酯)、醛類(lèi)(諸如戊二醛)、雙疊氮化合物(諸如雙(對(duì)-疊氮苯曱?；?己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對(duì)-重氮苯曱?；?乙二胺)、二異氰酸酯(諸如曱苯2,6-二異氰酸酯)、和雙活性氟化合物(諸如l,5-二氟-2,4-二硝基苯)的雙功能衍生物。例如，可如Vitetta等，6We"ce238:1098(1987)中所述制備蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14標(biāo)記的1-異硫氰酸苯曱基-3-曱基二亞乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于將放射性核苦酸與抗體偶聯(lián)的例示性螯合劑。參見(jiàn)WO94/11026。本文還涵蓋抗體與一種或多種小分子毒素諸如加利車(chē)霉素(calicheamicin)、美登木素生物石咸類(lèi)(maytansinoids)、多司他汀類(lèi)(dolostatins)、aurostatins、單端孢霉素(trichothecene)和CC1065及這些毒素具有毒素活性的片段的偶聯(lián)物。i.美登素和美登木素生物堿類(lèi)在有些實(shí)施方案中，免疫偶聯(lián)物包含偶聯(lián)有一個(gè)或多個(gè)美登木素生物堿分子的本發(fā)明抗體(全長(zhǎng)或片段)。美登木素生物堿類(lèi)是通過(guò)抑制微管蛋白多聚化來(lái)發(fā)揮作用的有絲分裂抑制劑。美登素最初從東非灌木齒葉美登木(Maytenusserrata)分離得到(美國(guó)專利No.3,896,111)。隨后發(fā)現(xiàn)某些微生物也生成美登木素生物堿類(lèi)，諸如美登醇和C-3美登醇酯(美國(guó)專利No.4,151,042)。例如下列美國(guó)專利公開(kāi)了合成美登醇及其衍生物和類(lèi)似物4,137,230;4,248,870;4,256,746;4,260,608;4,265,814;4,294,757;4,307,016;4,308,268;4,308,269;4，309，428;4,313,946;4,315,929;4,317,821;4,322,348;4,331,598;4,361,650;4，364，866;4,424,219;4,450,254;4,362,663;及4，371,533。美登木素生物堿類(lèi)藥物模塊在抗體藥物偶聯(lián)物中是有吸引力的藥物模塊，因?yàn)樗鼈?i)相對(duì)易于通過(guò)發(fā)酵或發(fā)酵產(chǎn)物的化學(xué)修飾、衍生化來(lái)制備；(ii)易于用適于通過(guò)非二硫化物接頭偶聯(lián)抗體的官能團(tuán)衍生化；(iii)在血漿中穩(wěn)定；且(iv)有效針對(duì)多種腫瘤細(xì)胞系。例如下列專利公開(kāi)了包含美登木素生物堿類(lèi)的免疫偶聯(lián)物及其制備和治療用途美國(guó)專利No.5,208,020;5,416,064;及歐洲專利EP0425235Bl，明確將其公開(kāi)內(nèi)容收入本文作為參考。Liu等，Prac.Ato/.ylcad5W.93:8618-8623(1996)記載了包含與針對(duì)人結(jié)腸直腸癌的單克隆抗體C242連接的稱為DM1的美登木素生物堿的免疫偶聯(lián)物。發(fā)現(xiàn)該偶聯(lián)物具有針對(duì)培養(yǎng)的結(jié)腸癌細(xì)胞的高度細(xì)胞毒性，而且在體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)測(cè)定法中顯示抗腫瘤活性。Chari等，CancerResearch52:127-131(1992)記載了其中美登木素生物堿經(jīng)二硫化物接頭與結(jié)合人結(jié)腸癌細(xì)胞系上抗原的鼠抗體A7或結(jié)合HER-2/neu癌基因的另一種鼠單克隆抗體TA.1偶聯(lián)的免疫偶聯(lián)物。在體外在人乳癌細(xì)胞系SK-BR-3上測(cè)試了TA.1-美登木素生物堿偶聯(lián)物的細(xì)胞毒性，該細(xì)胞系每個(gè)細(xì)胞表達(dá)3xl()S個(gè)HER-2表面抗原。藥物偶聯(lián)物達(dá)到了程度與游離美登木素生物堿藥物相似的細(xì)胞毒性，這可通過(guò)增加每個(gè)抗體分子偶聯(lián)的美登木素生物堿分子數(shù)目來(lái)提高。A7-美登木素生物堿偶聯(lián)物在小鼠中顯示低系統(tǒng)性細(xì)胞毒性?？贵w-美登木素生物堿偶聯(lián)物可通過(guò)將抗體與美登木素生物堿分子化學(xué)連接且不顯著削弱抗體或美登木素生物堿分子的生物學(xué)活性來(lái)制備。參見(jiàn)例如美國(guó)專利No.5,208,020,明確將其公開(kāi)內(nèi)容收入本文作為參考。每個(gè)抗體分子偶聯(lián)平均3-4個(gè)美登木素生物堿分子在增強(qiáng)針對(duì)靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性中顯示功效，且對(duì)抗體的功能或溶解度沒(méi)有負(fù)面影響，盡管預(yù)計(jì)甚至每個(gè)抗體一個(gè)分子毒素也將較之棵抗體的使用增強(qiáng)細(xì)胞毒性。美登木素生物堿類(lèi)在本領(lǐng)域是眾所周知的，而且可通過(guò)已知技術(shù)合成或從天然來(lái)源分離。例如美國(guó)專木素生物堿類(lèi)。優(yōu)選的美登木素生物堿類(lèi)是美登醇和美登醇分子的芳香環(huán)或其它位置經(jīng)過(guò)修飾的美登醇類(lèi)似物，諸如各種美登醇酯。80本領(lǐng)域知道許多連接基團(tuán)可用于制備抗體-美登木素生物堿偶聯(lián)物，包括例如美國(guó)專利No.5，208，020或歐洲專利0425235Bl;Chari等，C加ceri^騰/z52:127-131(1992);2004年10月8日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)No.10/960,602中所公開(kāi)的，明確將其公開(kāi)內(nèi)容收入本文作為參考。包含接頭構(gòu)件SMCC的抗體-美登木素生物堿類(lèi)偶聯(lián)物可以如2004年10月8日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)No.10/960,602中所披露的來(lái)制備。連接基團(tuán)包括二硫化物基團(tuán)、疏醚基團(tuán)、酸不穩(wěn)定基團(tuán)、光不穩(wěn)定基團(tuán)、肽酶不穩(wěn)定基團(tuán)、或酯酶不穩(wěn)定基團(tuán)，正如上文所述專利中所公開(kāi)的，優(yōu)選二硫化物和硫醚基團(tuán)。本文中描述和例示了別的連接基團(tuán)。可使用多種雙功能蛋白質(zhì)偶聯(lián)劑來(lái)制備抗體和美登木素生物堿的偶聯(lián)物，諸如N-琥珀酰亞氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亞氨基-4-(N-馬來(lái)酰亞氨基曱基)環(huán)己烷-l-羧酸酯(SMCC)，亞氨基硫烷(IT)，亞氨酸酯類(lèi)(諸如鹽酸己二酰亞氨酸二曱酯)、活性酯類(lèi)(諸如辛二酸二琥珀酰亞氨基酯)、醛類(lèi)(諸如戊二醛)、雙疊氮化合物(諸如雙(對(duì)-疊氮苯曱?；?己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對(duì)-重氮苯曱?；?-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如曱苯2,6-二異氰酸酯)、和雙活性氟化合物(諸如l,5-二氟-2,4-二硝基苯)的雙功能衍生物。特別優(yōu)選的偶聯(lián)劑包括N-琥珀酰亞氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)(Carlsson等，5/oc/ze附./173:723-737(1978))和N-琥珀酰亞氨基-4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP),由此提供二碌^建連接。根據(jù)連接的類(lèi)型，可將接頭附著于美登木素生物堿分子的多個(gè)位置。例如，可使用常規(guī)偶聯(lián)技術(shù)通過(guò)與羥基的反應(yīng)來(lái)形成酯鍵。反應(yīng)可發(fā)生在具有羥基的C-3位置、經(jīng)羥曱基修飾的C-14位置、經(jīng)羥基修飾的C-15位置、和具有羥基的C-20位置。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在美登醇或美登醇類(lèi)似物的C-3位置形成鍵連接。ii.Auristatin和多拉司他打在有些實(shí)施方案中，免疫偶聯(lián)物包含與多拉司他汀類(lèi)(dolastatins)或多拉司他汀肽類(lèi)似物及衍生物、auristatin類(lèi)偶聯(lián)的本發(fā)明抗體(美國(guó)專利No.5,635,483;5,780,588)。多拉司他汀類(lèi)和auristatin類(lèi)已經(jīng)顯示出干擾微管動(dòng)力學(xué)、GTP水解、及核和細(xì)胞分裂(Woyke等(2001)^""m/craZ.C7zewW/zer45(12):3580-3584)且具有抗癌(US5,663,149)和抗真菌活性(Pettit等(1998)j//w/cra6.C7zemoAeK42:2961-2965)。多拉司他汀或auristatin藥物才莫81塊可經(jīng)由肽藥物模塊的N(氨基)末端或C(羧基)末端附著于抗體(WO02/088172)。例示性的auristatin實(shí)施方案包括N-末端連接的單曱基auristatin藥物模塊DE和DF，披露于"MonomethylvalineCompoundsCapableofConjugationtoLigands",2004年11月5日提交的美國(guó)流水號(hào)10/983,340，明確將其^>開(kāi)內(nèi)容完整收入本文作為參考。典型的是，基于肽的藥物模塊可通過(guò)在兩個(gè)或多個(gè)氨基酸和/或肽片段之間形成肽鍵來(lái)制備。此類(lèi)肽鍵可依照例如肽化學(xué)領(lǐng)域眾所周知的液相合成法來(lái)制備(參見(jiàn)E.Schr6der和K.Liibke，ThePeptides,巻l,頁(yè)76-136,1965，AcademicPress)。auristatin/多拉司他汀藥物才莫塊可依照以下文獻(xiàn)中的方法來(lái)制備US5,635,483;US5,780,588;Pettit等(1989)/」w.CTew.5bc.111:5463-5465;Pettit等(1998)爿油:Ca"ce"DragDeWg"13:243-277;Pettit等5y"/ZzM&，1996,719-725;Pettit等(1996)乂CZ/em.>Sbc.尸eA/"Trara.15:859-863;及Doronina(2003)tVW.歷ofec/z"o/.21(7):778-784;"MonomethylvalineCompoundsCapableofConjugationtoLigands"，2004年11月5日提交的美國(guó)流水號(hào)10/983,340，將其完整收入本文作為參考(披露了例如制備諸如MMAE和MMAF偶聯(lián)至接頭的單曱基纈氨酸化合物的接頭和方法)。iii.加利車(chē)霉素在其它實(shí)施方案中，免疫偶聯(lián)物包含偶聯(lián)有一個(gè)或多個(gè)加利車(chē)霉素分子的本發(fā)明抗體。加利車(chē)霉素抗生素家族能夠在亞皮摩爾濃度生成雙鏈DNA斷裂。關(guān)于加利車(chē)霉素家族偶聯(lián)物的制備參見(jiàn)美國(guó)專利5,712,374;5,714,586;5,739,116;5,767,285;5,770,701;5,770,710;5,773,001;5,877,296(都授予美國(guó)Cyanamid公司)?？捎玫募永?chē)霉素結(jié)構(gòu)類(lèi)似物包括但不限于y,1、0^、a,N-乙?；?V、PSAG和9、(Hinman等，Ca"ceri^ecwr/753:3336-3342(1993);Lode等，C朋cerie^wc/z58:2925-2928(1998);及上述授予美國(guó)Cyanamid公司的美國(guó)專利)。可與抗體偶聯(lián)的另一種抗腫瘤藥物是QFA，它是一種抗葉酸藥物。加利車(chē)霉素和QFA都具有胞內(nèi)作用位點(diǎn)，且不易穿過(guò)質(zhì)膜。因此，這些試劑經(jīng)由抗體介導(dǎo)的內(nèi)在化的細(xì)胞攝取大大增強(qiáng)了它們的細(xì)胞毒效果。iv.其它細(xì)胞毒劑可與本發(fā)明抗體偶聯(lián)的其它抗腫瘤劑包括BCNU、鏈佐星(streptozoicin)、咬、美國(guó)專利5，053，394、5,770,710中記載的統(tǒng)稱為L(zhǎng)L-E33288復(fù)合物的試劑家族、及埃斯波霉素類(lèi)(esperamicins)(美國(guó)專利5，877,296)?？捎玫拿富钚远舅丶捌淦伟ò缀矶舅谹鏈、白喉毒素的非結(jié)合活性片段、外毒素A鏈(來(lái)自銅綠假單胞菌P化M^WMWosaerag/"cwa)、荒麻毒蛋白(ricin)A鏈、相思豆毒蛋白(abrin)A《連、蒴蓮才艮毒蛋白(modeccin)A鏈、a-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutitesfordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陸(Phytolacaamericana)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordicacharantia)抑制物、麻瘋樹(shù)毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonariaofficinalis)4中制物、白氺對(duì)毒蛋白(gelonin)、絲力木霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、盼霉素(phenomycin)、依諾霉素(enomycin)和單端孢菌素(trichothecenes)。參見(jiàn)例如1993年10月28日7^布的WO93/21232。本發(fā)明還涵蓋抗體和具有核酸降解活性的化合物(例如核糖核酸酶或DNA內(nèi)切核酸酶，諸如脫氧核糖核酸酶；DNA酶)之間形成的免疫偶聯(lián)物。為了選擇性破壞腫瘤，抗體可包含高度放射性原子。多種放射性同位素可用于生成放射偶聯(lián)抗體。例子包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb^和Lu的放射性同位素。在將偶聯(lián)物用于檢測(cè)時(shí)，可包含放射性原子用于閃爍照相研究，例如Tc"m或I123，或是包含自旋標(biāo)記物用于核磁共振(NMR)成像(也稱為磁共振成像，mri)，諸如碘-123、硪-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、禮、錳或鐵?？梢砸阎绞綄⒎派湫曰蚱渌鼧?biāo)記物摻入偶聯(lián)物。例如，可生物合成肽，或是通過(guò)化學(xué)氨基酸合成法合成肽，其中使用牽涉例如氟-19代替氫的合適氨基酸前體?？山?jīng)肽中的半胱氨酸殘基來(lái)附著標(biāo)記物，諸如Tc"m或I123、Re186、Re鵬和In111?？梢越?jīng)賴氨酸殘基來(lái)附著釔-90。IODOGEN法(Fraker等(1978)所oc/zem.S/c^/y^.Ommw".80:49-57)可用于才參入石典-123。《MonoclonalAntibodiesinImmunoscintigraphy》(Chatal，CRCPress,1989)^"纟田i己載了其它方法。可使用多種雙功能蛋白質(zhì)偶聯(lián)劑來(lái)制備抗體和細(xì)胞毒劑的偶聯(lián)物，諸如N-琥珀酰亞氨基-3-(2-吡^定基二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亞氨基-4-(N-馬來(lái)酰亞氨基曱基)環(huán)己烷-l-羧酸酯(SMCC),亞氨基硫烷(IT)，亞氨酸酯類(lèi)(諸如鹽酸己二酰亞氨酸二曱酯)、活性酯類(lèi)(諸如辛二酸二琥珀酰亞氨基酯)、83醛類(lèi)(諸如戊二醛)、雙疊氮化合物(諸如雙(對(duì)-疊氨苯曱?；?己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對(duì)-重氮苯曱酰基)-乙二胺)、二異硫氰酸酯(諸如曱苯2,6-二異氰酸酯)、和雙活性氟化合物(諸如l，5-二氟-2，4-二硝基苯)的雙功能衍生物。例如，可如Vitetta等，5We"ce238:1098(1987)中所述制備蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14標(biāo)記的l-異硫氰酸苯曱基-3-曱基二亞乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于將放射性核苦酸與抗體偶聯(lián)的例示性螫合劑。參見(jiàn)WO94/11026。接頭可以是便于在細(xì)胞中釋放細(xì)胞毒藥物的"可切割接頭"。例如，可使用酸不穩(wěn)定接頭、肽酶敏感接頭、光不穩(wěn)定接頭、二曱基接頭、或含二硫化物接頭(Chari等，OmcerWeyewc/z52:127-131(1992);美國(guó)專利5,208,020)。本發(fā)明的化合物明確涵蓋但不限于用下列交聯(lián)劑制備的ADC:商品化(例如購(gòu)自PierceBiotechnologyInc.,Rockford，IL,U.S.A.)的BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、sulfo-EMCS、sulfo-GMBS、sulfo-K而S、sulfo-MBS、sulfo-SIAB、sulfo-SMCC和sulfo-SMPB、和SVSB(琥珀酰亞氨基-(4-乙烯基砜)苯曱酸酯)。見(jiàn)2003-2004年度應(yīng)用手冊(cè)和產(chǎn)品目錄(ApplicationsHandbookandCatalog)第467-498頁(yè)。v.抗體-藥物偶聯(lián)物的制備在本發(fā)明的抗體-藥物偶聯(lián)物(ADC)中，將抗體(Ab)經(jīng)接頭(L)與一個(gè)或多個(gè)藥物模塊(D)偶聯(lián)，例如每個(gè)抗體偶聯(lián)約1個(gè)至約20個(gè)藥物模塊?？刹捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員知道的有機(jī)化學(xué)反應(yīng)、條件和試劑通過(guò)數(shù)種路徑來(lái)制備通式I的ADC，包括(l)抗體的親核基團(tuán)經(jīng)共價(jià)鍵與二價(jià)接頭試劑反應(yīng)，形成Ab-L，隨后與藥物模塊D反應(yīng)；和(2)藥物模塊的親核基團(tuán)經(jīng)共價(jià)鍵與二價(jià)接頭試劑反應(yīng)，形成D-L,隨后與抗體的親核基團(tuán)反應(yīng)。本文中描述了用于制備ADC的別的方法。Ab-(L-D)pI接頭可以由一種或多種接頭構(gòu)件構(gòu)成。例示性的接頭構(gòu)件包括6-馬來(lái)酰亞氨基己?；?"MC")、馬來(lái)酰亞氨基丙?；?"MP")、纈氨酸-瓜氨酸("val-cit")、丙氨酸-苯丙氨酸("ala-phe")、對(duì)氨基午氧羰基("PAB")、N-琥珀酰亞氨基4-(2-吡咬基硫代)戊酸酯("SPP")、N-琥珀酰亞氨基4-(N-馬來(lái)酰亞胺曱基)環(huán)己烷-l羧酸酯("SMCC')、和N-琥珀酰亞氨基(4-碘-乙?；?氨基苯曱酸酯("SIAB")。本領(lǐng)域知道別的接頭構(gòu)件，本文也描述了一些。還可參見(jiàn)"MonomethylvalineCompoundsCapableofConjugationtoLigands，，,2004年11月5曰提交的美國(guó)流水號(hào)No.10/983，340，將其完整內(nèi)容收入本文作為參考。在有些實(shí)施方案中，接頭可包含氨基酸殘基。例示性的氨基酸接頭構(gòu)件包括二肽、三肽、四肽或五肽。例示性的二肽包括纈氨酸-瓜氨酸(vc或val-cit)、丙氨酸-苯丙氨酸(af或ala-phe)。例示性三肽包括甘氨酸-纈氨酸-瓜氨酸(gly-val-cit)和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-gly)。構(gòu)成氨基酸接頭構(gòu)件的氨基酸殘基包括那些天然存在的氨基酸，以及次要的氨基酸和非天然存在的氨基酸類(lèi)似物，諸如瓜氨酸。氨基酸接頭構(gòu)件可以在它們的特定酶(例如肝瘤相關(guān)蛋白酶，組織蛋白酶B、C和D，或纖溶酶蛋白酶)的酶促切割的選擇性方面進(jìn)行設(shè)計(jì)和優(yōu)化?？贵w的親核基團(tuán)包括但不限于(i)N末端胺基；(ii)側(cè)鏈胺基，例如賴氨酸；(iii)側(cè)鏈巰基，例如半胱氨酸；和(iv)糖基化抗體中糖的羥基或氨基。胺基、巰基、和羥基是親核的，能夠與接頭模塊上的親電子基團(tuán)反應(yīng)而形成共價(jià)鍵，而接頭試劑包括(i)活性酯類(lèi)，諸如NHS酯類(lèi)、HOBt酯類(lèi)、囟代曱酸酯類(lèi)、和酸性囟化物；(ii)烴基和苯曱基囟化物，諸如卣代乙酰胺；(iii)醛類(lèi)、酮類(lèi)、羧基和馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)。某些抗體具有可還原的鏈間二碌^建，即半胱氨酸橋?？赏ㄟ^(guò)還原劑諸如DTT(二硫蘇糖醇)處理使抗體具有與接頭試劑偶聯(lián)的反應(yīng)活性。每個(gè)半胱氨酸橋理論上將由此形成兩個(gè)反應(yīng)性硫醇親核體?？山?jīng)由賴氨酸與2-亞氨基硫烷(Traut氏試劑)的反應(yīng)，導(dǎo)致胺轉(zhuǎn)變?yōu)榱虼?，從而將額外親核基團(tuán)引入抗體?？梢酝ㄟ^(guò)導(dǎo)入一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、或更多個(gè)半胱氨酸殘基(例如制備包含一個(gè)或多個(gè)非天然半胱氨酸氨基酸殘基的突變型抗體)而將反應(yīng)性硫醇基導(dǎo)入抗體(或其片段)。還可通過(guò)修飾抗體來(lái)生成本發(fā)明的抗體-藥物偶聯(lián)物，即引入可與接頭試劑或藥物上的親核取代基反應(yīng)的親電子模塊?？捎美绺叩馑猁}氧化劑氧化糖基化抗體的糖類(lèi)，從而形成可與接頭試劑或藥物模塊的胺基團(tuán)反應(yīng)的醛或酮基團(tuán)。所得亞胺Schiff堿基可形成穩(wěn)定的鍵，或者可用例如硼氫化物試劑還原而形成穩(wěn)定的胺連接。在一個(gè)實(shí)施方案中，糖基化抗體的碳水化合物模塊與半乳糖氧化酶或偏高碘酸鈉的反應(yīng)可在蛋白質(zhì)中生成羰(醛和酮)基團(tuán)，它可與藥物上的適宜基團(tuán)反應(yīng)(Hermanson，BioconjugateTechniques)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，包含N末端絲氨酸或蘇氨酸殘基的蛋白質(zhì)可與偏高碘酸鈉反應(yīng)，導(dǎo)致在第一個(gè)氨基酸處生成醛(Geoghegan和Stroh(1992)歷oco"j'wga^3:138-146;US5,362,852)。該醛可與藥物才莫塊或4妄頭親核體反應(yīng)。同樣，藥物模塊上的親核基團(tuán)包括但不限于胺、硫醇、羥基、酰肼、肟、肼、縮氨基硫脲、肼羧酸酯、和芳基酰肼基團(tuán)，它們能夠與接頭模塊上的親電子基團(tuán)反應(yīng)而形成共價(jià)鍵，而接頭試劑包括(i)活性酯類(lèi)，諸如NHS酯類(lèi)、HOBt酯類(lèi)、卣代甲酸酯類(lèi)、和酸性卣化物；(ii)烴基和苯曱基卣化物，諸如卣代乙酰胺；(iii)酪類(lèi)、酮類(lèi)、羧基、和馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)。或者，可通過(guò)例如重組技術(shù)或肽合成來(lái)制備包含抗體和細(xì)胞毒劑的融合蛋白。DNA的長(zhǎng)度可包含各自編碼偶聯(lián)物兩個(gè)部分的區(qū)域，或是彼此毗鄰或是由編碼接頭肽的區(qū)域分開(kāi)，該接頭肽不破壞偶聯(lián)物的期望特性。在又一個(gè)實(shí)施方案中，可將抗體與"受體，，(諸如鏈霉親合素)偶聯(lián)從而用于腫瘤預(yù)先靶向，其中對(duì)患者施用抗體-受體偶聯(lián)物，接著使用清除劑由循環(huán)中清除未結(jié)合的偶聯(lián)物，然后施用與細(xì)胞毒劑(例如放射性核苷酸)偶聯(lián)的"配體"(例如親合素)。藥用配制劑可通過(guò)將具有期望純度的抗體與任選的生理學(xué)可接受載體、賦形劑或穩(wěn)定劑混合來(lái)制備包含本發(fā)明抗體的治療用配制劑，以水溶液、凍干或其它干燥劑型的開(kāi)j式貝i存(ie附/"gto":7TzeSc/ewcePrac"cei^aTwacy第20版(2000))?？山邮艿妮d體、賦形劑或穩(wěn)定劑在所采用的劑量和濃度對(duì)接受者是無(wú)毒的，而且包括緩沖劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽、組氨酸和其它有機(jī)酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和曱硫氨酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基千基銨；氯化己烷雙胺；苯扎氯銨、苯索氯銨；酚、丁醇或笨曱醇；對(duì)羥基苯曱酸烴基酯，諸如對(duì)羥基苯曱酸曱酯或丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3_戊醇；和間曱酚)；低分子量(少于約10個(gè)殘基)多肽；蛋白質(zhì)，諸如血清清蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，諸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA;糖類(lèi)，諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽相反離子，諸如鈉；金屬?gòu)?fù)合物(例如Zn-蛋白質(zhì)復(fù)合物)；和/或非離子表面活性劑，諸如TWEENTM、PLURONICStm或聚乙二醇(PEG)。本文中的配制劑還可含有所治療具體適應(yīng)癥所必需的超過(guò)一種活性化合物，優(yōu)選活性互補(bǔ)且彼此沒(méi)有不利影響的。合適的是，此類(lèi)分子以對(duì)于預(yù)定目的有效的量組合?；钚猿煞诌€可包載于例如通過(guò)凝聚技術(shù)或通過(guò)界面聚合制備的微膠嚢中(例如分別是羥曱基纖維素或明膠微膠嚢和聚(曱基丙烯酸曱酯)微膠嚢)、在膠狀藥物傳遞系統(tǒng)中(例如脂質(zhì)體、清蛋白微球體、微乳劑、納米顆粒和納米膠嚢)、或在粗滴乳狀液中。此類(lèi)技術(shù)公開(kāi)于例如Aemz'wgtow.'77ze5Weceawe/iVac&ceo/T^/M^macy第20片反(2000)。用于體內(nèi)施用的配制劑必須是無(wú)菌的。這可容易的通過(guò)使用無(wú)菌濾膜過(guò)濾來(lái)實(shí)現(xiàn)。可制備持續(xù)釋放配制劑。持續(xù)釋放配制劑的合適例子包括含有本發(fā)明免疫球蛋白的固體疏水性聚合物半透性基質(zhì)，該基質(zhì)以定型產(chǎn)品的形式存在，例如薄膜或微膠嚢。持續(xù)釋放基質(zhì)的例子包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基-曱基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美國(guó)專利No.3,773,919)、L-谷氨酸和Y-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯共聚物、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物諸如LUPRONDEPOT(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林構(gòu)成的可注射微球體)及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。雖然諸如乙烯-乙酸乙烯和乳酸-乙醇酸等聚合物能夠釋放分子100天以上，但是某些水凝膠釋放蛋白質(zhì)的時(shí)間較短。當(dāng)膠嚢化免疫球蛋白在體內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間維持時(shí)，它們可能由于暴露于37。C的潮濕環(huán)境而變性或聚集，導(dǎo)致生物學(xué)活性損失和免疫原性可能改變?？筛鶕?jù)相關(guān)機(jī)制來(lái)設(shè)計(jì)合理的穩(wěn)定化策略。例如，如果發(fā)現(xiàn)聚集機(jī)制是經(jīng)由硫醇-二硫化物互換而形成分子間S-S鍵，那么可通過(guò)》務(wù)飾巰基殘基、自酸性溶液凍干、控制濕度、采用適宜添加劑和開(kāi)發(fā)特定的聚合物基質(zhì)組合物來(lái)實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定。用途本發(fā)明的抗體可用于例如體夕卜、回體(exvivo)和體內(nèi)治療方法。一方面，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防與DLL4表達(dá)和/或活性升高有關(guān)的腫瘤、癌癥、和/或細(xì)胞增殖性病癥的方法，該方法包括給需要此類(lèi)治療的受試者施用有效量的抗DLL4抗體。87一方面，本發(fā)明提供了降低、抑制、阻斷、或預(yù)防肺瘤或癌生長(zhǎng)的方法，該方法包括給需要此類(lèi)治療的受試者施用有效量的抗DLL4抗體。一方面，本發(fā)明提供了治療肺瘤、癌癥、和/或細(xì)胞增殖性病癥的方法，該方法包括給需要此類(lèi)治療的受試者施用有效量的抗DLL4抗體。一方面，本發(fā)明提供了抑制血管發(fā)生的方法，該方法包括給需要此類(lèi)治療的受試者施用有效量的抗DLL4抗體。一方面，本發(fā)明提供了治療與血管發(fā)生有關(guān)的病理學(xué)疾患的方法，該方法包括給需要此類(lèi)治療的受試者施用有效量的抗DLL4抗體。在有些實(shí)施方案中，所述與血管發(fā)生有關(guān)的病理學(xué)疾患是腫瘤、癌癥、和/或細(xì)胞增殖性病癥。在有些實(shí)施方案中，所述與血管發(fā)生有關(guān)的病理學(xué)疾患是眼內(nèi)新血管疾病。此外，本發(fā)明的至少一些抗體可結(jié)合來(lái)自其它物種的抗原。因而，本發(fā)明的抗體可用于結(jié)合特定抗原活性，例如，在包含抗原的細(xì)胞培養(yǎng)物中、在試者中(例如黑猩猩、狒狒、狨、獼猴和恒河猴，豬或小鼠)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體可用于抑制抗原活性，通過(guò)使抗體與抗原接觸使得抗原活性受到抑制。優(yōu)選的是，所述抗原是人蛋白質(zhì)分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體可用于結(jié)合患有與抗原表達(dá)和/或活性升高有關(guān)的病癥的受試者體內(nèi)抗原的方法，包括給受試者施用本發(fā)明的抗體使得受試者體內(nèi)的抗原得到結(jié)合。優(yōu)選的是，所述抗原是人蛋白質(zhì)分子且所述受試者是人受試者?；蛘?，受試者可以是表達(dá)本發(fā)明抗體所結(jié)合的抗原的哺乳動(dòng)物。又或者，受試者可以是其中導(dǎo)入了抗原(例如通過(guò)施用抗原或通過(guò)表達(dá)抗原轉(zhuǎn)基因)的哺乳動(dòng)物?？沙鲇谥委熌康膶⒈景l(fā)明的抗體施用于人受試者。此外，可出于獸醫(yī)目的將本發(fā)明的抗體施用于表達(dá)免疫球蛋白與之交叉反應(yīng)的抗原的非人哺乳動(dòng)物(例如靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物、豬或小鼠)，或是人疾病的動(dòng)物模型。關(guān)于后者，此類(lèi)動(dòng)物模型可用于評(píng)估本發(fā)明抗體的治療功效(例如測(cè)試施藥的劑量和時(shí)程)。本發(fā)明的抗體可用于治療、抑制、延緩進(jìn)展、預(yù)防/延緩復(fù)發(fā)、改善或預(yù)防與一種或多種抗原分子的表達(dá)和/或活性相關(guān)的疾病、病癥或疾患。例示性的病癥包括癌瘤、淋巴瘤、母細(xì)胞瘤、肉瘤、和白血病或淋巴樣惡性腫瘤。此類(lèi)癌癥的更具體例子包括鱗狀細(xì)胞癌(例如上皮鱗狀細(xì)胞癌)、88肺癌(包括小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、肺的腺癌和肺的鱗癌)、腹膜癌、肝纟田月包癌(hepatocellularcancer)、胃癌(gastricorstomachcancer)(包4舌胃腸癌)、胰腺癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌(livercancer)、膀胱癌、尿道癌、肝瘤(hepatoma)、乳腺癌、結(jié)腸癌、直腸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌(kidneyorrenalcancer)、前列腺癌、夕卜陰癌、曱狀腺癌、肝癌(hepaticcarcinoma)、膽門(mén)癌、陰莖癌、黑素瘤、多發(fā)性骨髓瘤和B細(xì)胞淋巴瘤、腦、以及頭頸癌、及相關(guān)轉(zhuǎn)移。在有些實(shí)施方案中，癌癥選自小細(xì)胞肺癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、黑素瘤、乳腺癌、胃癌、結(jié)腸直腸癌(CRC)、和肝細(xì)胞癌。在有些實(shí)施方案中，所述癌癥選自非小細(xì)胞肺癌、結(jié)腸直腸癌和乳腺癌，包括這些癌癥的轉(zhuǎn)移形式。在某些實(shí)施方案中，將包含偶聯(lián)有一種或多種細(xì)胞毒劑的抗體的免疫偶聯(lián)物施用于患者。在有些實(shí)施方案中，免疫偶聯(lián)物和/或它所結(jié)合的抗原由細(xì)胞內(nèi)在化，導(dǎo)致免疫偶聯(lián)物殺傷它所結(jié)合的靶細(xì)胞的治療功效提高。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞毒劑靶向或干擾靶細(xì)胞中的核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞毒劑靶向或干擾微管聚合。此類(lèi)細(xì)胞毒劑的例子包括本文所述任何化療劑(諸如美登木素生物堿類(lèi)、auristatin、多拉司他汀、或加利車(chē)霉素)、放射性同位素、或核糖核酸酶或DNA內(nèi)切核酸酶。在治療中，本發(fā)明的抗體可單獨(dú)使用，或者與其它組合物聯(lián)用。例如，本發(fā)明的抗體可與另一種抗體、化療劑(包括化療劑混合物)、其它細(xì)胞毒劑、抗血管發(fā)生劑、細(xì)胞因子、和/或生長(zhǎng)抑制劑共施用。當(dāng)本發(fā)明的抗體抑制腫瘤生長(zhǎng)時(shí)，可能特別希望將其聯(lián)合一種或多種同樣抑制腫瘤生長(zhǎng)的其它治療劑，例如抗VEGF藥劑，包括針對(duì)VEGF的抗體。或者/另外，患者可接受聯(lián)合放射療法(例如外部射束照射或使用放射性標(biāo)記藥劑諸如抗體的療法)。上文所述此類(lèi)聯(lián)合療法包括聯(lián)合施藥(當(dāng)兩種或多種藥劑包含在相同或分開(kāi)的配制劑中時(shí))和分開(kāi)施藥，在后一種情況中，本發(fā)明抗體的施用可發(fā)生在輔助療法的施用之前和/或之后。聯(lián)合療法如上所述，本發(fā)明提供了聯(lián)合療法，其中抗DLL4抗體與另一療法一起施用。例如，抗DLL4抗體與抗癌治療劑或抗新血管形成療法聯(lián)合使用以治療各種贅生性或非贅生性疾患。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述贅生性或非贅生性疾患的特征在于與異?；虿幌胍难馨l(fā)生有關(guān)的病理學(xué)病癥。抗DLL4抗體可以與對(duì)那些目的有效的另一藥劑序貫或聯(lián)合施用，或是在同一組合物中或是作為分開(kāi)的組合物?；蛘?另外，可以施用DLL4的多種抑制劑?？笵LL4抗體的施用可以同時(shí)進(jìn)行，例如作為單一組合物或者作為兩種或更多不同的組合物，使用相同或不同的施用路徑?；蛘?另外，施藥可以以任一次序順次進(jìn)行。在某些實(shí)施方案中，兩種或多種組合物的施用之間可以有范圍為數(shù)分鐘至數(shù)天、至數(shù)周、至數(shù)月的時(shí)間間隔。例如，可以先施用抗癌劑，接著是DLL4抑制劑。然而，也涵蓋同時(shí)施用或先施用抗DLL4抗體。與抗DLL4抗體聯(lián)合施用的治療劑的有效量取決于醫(yī)師或獸醫(yī)的判斷。完成劑量施用和調(diào)整以實(shí)現(xiàn)對(duì)待治療疾患的最大控制。此外劑量取決于諸如待使用的治療劑的類(lèi)型和所治療的特定患者等因素。抗癌劑的合適劑量就是當(dāng)前所用的那些，而且可以由于抗癌劑與抗DLL4抗體的聯(lián)合作用(協(xié)同)而降低。在某些實(shí)施方案中，抑制劑的組合增強(qiáng)單一抑制劑的功效。術(shù)語(yǔ)"增強(qiáng)"指治療劑在其常用或批準(zhǔn)的劑量功效得到提高。還可參見(jiàn)本文中標(biāo)題為"藥用組合物"的部分。典型的是，抗DLL4抗體和抗癌劑適于相同或相似的疾病以阻斷或降低病理學(xué)病癥，諸如腫瘤生長(zhǎng)或癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗癌劑是抗血管發(fā)生劑。與癌癥有關(guān)的抗血管發(fā)生療法是致力于抑制為支持腫瘤生長(zhǎng)而提供養(yǎng)分所需要的腫瘤血管發(fā)育的癌癥治療策略。因?yàn)檠馨l(fā)生牽涉原發(fā)性腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移二者，所以本發(fā)明提供的血管發(fā)生治療不但能夠在原發(fā)性位點(diǎn)抑制腫瘤的贅生性生長(zhǎng)，而且能夠預(yù)防腫瘤在繼發(fā)性位點(diǎn)的轉(zhuǎn)移，從而容許由其它治療劑攻擊腫瘤。本領(lǐng)域已經(jīng)鑒定和知道許多抗血管發(fā)生劑，包括本文所列的那些，例如定義中所列的，還可參見(jiàn)例如Carmeliet和Jain，A^we407:249-257(2000);Ferrara等，iVa/"wreWeWeM^.'Z)n/gZ)/scove^y，3:391-400(2004);Sato/"A/C7/".(9wco/.,8:200-206(2003)。還可參見(jiàn)美國(guó)專利申請(qǐng)US20030055006。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗DLL4抗體與抗VEGF中和性抗體(或片段)和/或另一VEGF拮抗劑或VEGF受體拮抗劑(包括但不限于例如可溶性VEGF受體(例如VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、neuropillins(例如NRP1、NRP2))片段)、能夠阻斷VEGF或VEGFR的適體、中和性抗VEGFR抗體、VEGFR酪氨酸激酶(RTK)的低分子量抑制劑、VEGF的反義策略、針對(duì)VEGF或VEGF受體的核酶、VEGF的拮抗性變體、及其組合聯(lián)合使用?；蛘?另外，任選的是，可以在VEGF拮抗劑和其它藥劑外對(duì)患者共施用兩種或更多血管發(fā)生抑制劑。在某些實(shí)施方案中，可以與抗DLL4抗體、VEGF拮抗劑和抗血管發(fā)生劑聯(lián)合施用一種或多種別的治療劑，例如抗癌劑。在本發(fā)明的某些方面，可用于抗DLL4抗體的聯(lián)合腫瘤療法的其它治療劑包括其它癌癥療法(例如手術(shù)、放射學(xué)治療(例如牽涉照射或施用放射性物質(zhì))、化療、本文所列和本領(lǐng)域知道的抗癌劑的治療、或其組合)。或者/另外，結(jié)合本文^皮露的相同抗原或兩種或更多本文4皮露的不同抗原的兩種或更多抗體可以共施用于患者。有時(shí)，還對(duì)患者施用一種或多種細(xì)胞因子可能是有益的?；焺┰谀承┓矫妫景l(fā)明提供了阻斷或降低肺瘤生長(zhǎng)或癌細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，其通過(guò)對(duì)易感于或診斷有癌癥的患者施用有效量的DLL4拮抗劑和/或血管發(fā)生抑制劑和一種或多種化療劑來(lái)實(shí)現(xiàn)。多種化療劑可用于本發(fā)明的聯(lián)合治療方法。本文在"定義"中提供了所涵蓋的化療劑的例示性和非限制性列表。正如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會(huì)理解的，化療劑的適宜劑量一般在單獨(dú)或聯(lián)合其它化療劑施用該化療劑的臨床療法中早就采用的那些劑量附近。根據(jù)所治療的疾患，劑量有可能發(fā)生變化。施行治療的醫(yī)師能夠?yàn)槭茉囌邆€(gè)體確定適宜的劑量。本發(fā)明還提供了用于抑制或預(yù)防復(fù)發(fā)性腫瘤生長(zhǎng)或復(fù)發(fā)性癌細(xì)胞生長(zhǎng)的方法和組合物。復(fù)發(fā)性腫瘤生長(zhǎng)或復(fù)發(fā)性癌細(xì)胞生長(zhǎng)用于描述正在接受一種或多種當(dāng)前可用療法(例如癌癥療法，諸如化療、放療、手術(shù)、激素療法和/或生物學(xué)療法/免疫療法、抗VEGF抗體療法，特別是特定癌癥的標(biāo)準(zhǔn)治療方案)或用一種或多種當(dāng)前可用療法治療過(guò)的患者在臨床上不足以治療該患者或不再由該療法取得任何有益效果使得這些患者需要?jiǎng)e的有效療法的狀況。在用于本文時(shí)，該表述還可指"無(wú)響應(yīng)/頑固性"患者的狀況，例如描述患者對(duì)療法有響應(yīng)但遭受副作用、形成抗性、對(duì)療法不響應(yīng)、對(duì)療法的響應(yīng)不令人滿意等。在各種實(shí)施方案中，癌癥是復(fù)發(fā)性腫瘤生長(zhǎng)或復(fù)發(fā)性癌細(xì)胞生長(zhǎng)，其中癌細(xì)胞數(shù)目沒(méi)有令人滿意的減少，或者增多了，或者腫瘤尺寸沒(méi)有顯著的縮小，或者增大了，或者癌細(xì)胞的尺寸或數(shù)目未能進(jìn)一步縮小或減少。確定癌細(xì)胞是否是復(fù)發(fā)性腫瘤生長(zhǎng)或復(fù)發(fā)性癌細(xì)胞生長(zhǎng)可以在體內(nèi)或在體外進(jìn)行，通過(guò)本領(lǐng)域知道的用于測(cè)定治療對(duì)癌細(xì)胞有效性的任何方法，在這樣的語(yǔ)境中使用本領(lǐng)域公認(rèn)的"復(fù)發(fā)性"或"頑固性"或"無(wú)響應(yīng)"的含義。對(duì)抗VEGF治療有抗性的肺瘤是復(fù)發(fā)性腫瘤生長(zhǎng)的一個(gè)例子。本發(fā)明提供了在受試者中阻斷或降低復(fù)發(fā)性腫瘤生長(zhǎng)或復(fù)發(fā)性癌細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，其通過(guò)施用一種或多種抗DLL4抗體以阻斷或降#^受試者中的復(fù)發(fā)性肺瘤生長(zhǎng)或復(fù)發(fā)性癌細(xì)胞生長(zhǎng)來(lái)實(shí)現(xiàn)。在某些實(shí)施方案中，可以在癌癥治療劑之后施用拮抗劑。在某些實(shí)施方案中，與癌癥療法同時(shí)施用抗DLL4抗體。或者/另外，抗DLL4抗體療法與另一癌癥療法交替施行，這可以以任意次序進(jìn)行。本發(fā)明還涵蓋施用一種或多種抑制性抗體來(lái)預(yù)防癌癥在有癌癥素因的患者中發(fā)作或復(fù)發(fā)的方法。一般地，受試者同時(shí)正在進(jìn)行癌癥療法。在一個(gè)實(shí)施方案中，癌癥療法是使用抗血管發(fā)生劑的治療，例如VEGF拮抗劑。抗血管發(fā)生劑包括本領(lǐng)域知道的那些和本文定義中所列的那些。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗血管發(fā)生劑是抗VEGF中和性抗體或片段(例如AVASTIN(Genentech,SouthSanFrancisco,CA)或LUCENTIS⑧(Genentech,SouthSanFrancisco,CA)、Y0317、M4、G6、B20、2C3等)。參見(jiàn)例如美國(guó)專利6，582,959，6,884,879,6,703,020;W098/45332;WO96/30046;WO94/10202;EP0666868B1;美國(guó)專利申請(qǐng)20030206899，20030190317,20030203409，20050112126;Popkov等，Tow固//m纖"o/og/c"/MefWs288:149-164(2004);及W02005012359。別的藥劑可以與VEGF拮抗劑和抗DLL4抗體聯(lián)合施用以阻斷或降低復(fù)發(fā)性肺瘤生長(zhǎng)或復(fù)發(fā)性癌細(xì)胞生長(zhǎng)，例如見(jiàn)本文中標(biāo)題為"聯(lián)合療法"的部分。本發(fā)明的抗體(和輔助治療劑)通過(guò)任何合適手段來(lái)施用，包括胃腸外、皮下、腹膜內(nèi)、肺內(nèi)和鼻內(nèi)，以及損傷內(nèi)或玻璃體內(nèi)(如果希望局部治療的話)施用。胃腸外輸注包括肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)或皮下施用。另外，脈沖輸注抗體也是合適的，特別是抗體劑量衰減時(shí)?？赏ㄟ^(guò)任何合適路徑服藥，例如通過(guò)注射，諸如靜脈內(nèi)或皮下注射，這部分取決于施藥是短期的還是長(zhǎng)期的?？梢耘c優(yōu)良醫(yī)學(xué)實(shí)踐一致的方式配制、劑量給藥和施用本發(fā)明的抗體組合物。在此內(nèi)容中考慮的因素包括所治療的具體病癥、所治療的具體哺乳動(dòng)物、患者個(gè)體的臨床狀況、病癥的起因、沖殳遞藥劑的部位、施藥的方法、施藥的日程安排、和醫(yī)學(xué)從業(yè)人員知道的其它因素。不是必需而是任選將抗體92與目前用于預(yù)防或治療所討論病癥的一種或多種藥劑一起配制。此類(lèi)其它藥劑的有效量取決于配制劑中存在的本發(fā)明抗體的量、病癥或治療的類(lèi)型、和上文討論的其它因素。這些通常是以與上文所用相同劑量和施用路徑使用，或是迄今所用劑量的大約1-99%。對(duì)于疾病的預(yù)防或治療，本發(fā)明抗體的適宜劑量(當(dāng)單獨(dú)使用或者與其它藥劑諸如化療劑聯(lián)用時(shí))將取決于待治療疾病的類(lèi)型、抗體的類(lèi)型、疾病的嚴(yán)重程度和病程、施用抗體是用于預(yù)防還是治療目的、先前的療法、患者的臨床史和對(duì)抗體的應(yīng)答、及主治醫(yī)師的判斷。將抗體一次性或者在一系列治療中適當(dāng)?shù)氖┯糜诨颊摺８鶕?jù)疾病的類(lèi)型和嚴(yán)重程度，大約lpg/kg到15mg/kg(例如O.1mg/kg-1Omg/kg)抗體是施用于患者的初始候選劑量，無(wú)論是例如通過(guò)一次或多次分開(kāi)施用，或者是通過(guò)連續(xù)輸注。典型每日劑量的范圍可以為大約l嗎/kg到100mg/kg或者更多，取決于上述因素。對(duì)于持續(xù)數(shù)天或更長(zhǎng)時(shí)間的重復(fù)給藥，根據(jù)疾患，治療維持到直至發(fā)生期望的疾病癥狀抑制?？贵w的例示性劑量的范圍為大約0.05mg/kg到大約10mg/kg。如此，可以給患者施用大約0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任意組合)的一劑或多劑。所述劑可以間歇施用，例如每周或每三周(一次)(例如使得患者接受大約2到大約20，例如大約6劑抗體)。可以施用一劑較高的初始加載劑(loadingdose),接著是一劑或多劑較低的后續(xù)劑。一種例示性的劑量給藥方案包括施用一劑大約4mg/kg的初始加載劑，繼之以每周一劑的大約2mg/kg抗體的維持劑。然而，其他劑量方案可能也是有用的?？梢苑奖愕耐ㄟ^(guò)常規(guī)技術(shù)和測(cè)定法來(lái)監(jiān)測(cè)這種療法的進(jìn)展。定法(諸如診斷或預(yù)后測(cè)定法)，其中所述抗體如下所述進(jìn)行標(biāo)記和/或固定化在不溶性基質(zhì)上。另一方面，本發(fā)明提供了用于檢測(cè)DLL4的方法，該方法包括檢測(cè)樣品中的DLL4-抗DLL4抗體復(fù)合物。術(shù)語(yǔ)"檢測(cè)"在用于本文時(shí)包括定性和/或定量檢測(cè)(測(cè)量水平)，有或無(wú)參照對(duì)照。另一方面，本發(fā)明提供了診斷與DLL4表達(dá)和/或活性有關(guān)的病癥的方法，該方法包括對(duì)來(lái)自患有或懷疑患有所述病癥的患者的生物學(xué)樣品檢測(cè)01^1^-抗DLL4抗體復(fù)合物。在一些實(shí)施方案中，DLL4表達(dá)是升高的表達(dá)或異常(不想要)的表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，所述病癥是腫瘤、癌癥、和/或細(xì)胞增殖寸生病癥。另一方面，本發(fā)明提供了本文所述任何抗DLL4抗體，其中所述抗DLL4抗體包含可檢測(cè)的標(biāo)記物。另一方面，本發(fā)明提供了本文所述任何抗DLL4抗體與DLL4的復(fù)合物。在一些實(shí)施方案中，復(fù)合物是體內(nèi)的或體外的。在一些實(shí)施方案中，復(fù)合物包含癌細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，抗DLL4抗體是可檢測(cè)標(biāo)記的。抗DLL4抗體可用于大量公知檢測(cè)測(cè)定法中任一種的DLL4檢測(cè)。例如，可以如下對(duì)生物學(xué)樣品測(cè)定DLL4，即從期望來(lái)源獲得樣品，將樣品與抗DLL4抗體混合以允許抗體與混合物中存在的任何DLL4形成抗體/DLL4復(fù)合物，并檢測(cè)混合物中存在的任何抗體/DLL4復(fù)合物。可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的適于特定樣品的方法制備生物學(xué)樣品供測(cè)定法用。根據(jù)所使用的測(cè)定法的類(lèi)型來(lái)選擇混合樣品與抗體的方法和檢測(cè)抗體/DLL4復(fù)合物的方法。此類(lèi)測(cè)定法包括免疫組織化學(xué)、竟?fàn)幮院腿髦?夾心式測(cè)定法、和空間阻抑測(cè)定法(stericinhibitionassay)。DLL4的分析方法均使用一種或多種以下試劑經(jīng)過(guò)標(biāo)記的DLL4類(lèi)似物、固定化的DLL4類(lèi)似物、經(jīng)過(guò)標(biāo)記的抗DLL4抗體、固定化的抗DLL4抗體和空間偶聯(lián)物。經(jīng)過(guò)標(biāo)記的試劑還稱為"示蹤劑"。使用的標(biāo)記物是不干擾DLL4與抗DLL4抗體結(jié)合的任何可檢測(cè)官能團(tuán)。許多標(biāo)記物已知用于免疫測(cè)定法，例子包括可以直接檢測(cè)的模塊，諸如熒光染料、化學(xué)發(fā)光和放射性標(biāo)記物，以及必須反應(yīng)或衍生化才能檢測(cè)的模塊，諸如酶。此類(lèi)標(biāo)記物的例子包括使用的標(biāo)記物是不干擾DLL4與抗DLL4抗體結(jié)合的任何可檢測(cè)官能團(tuán)。許多標(biāo)記物已知用于免疫測(cè)定法，例子包括可以直接檢測(cè)的模塊，諸如熒光染料、化學(xué)發(fā)光和放射性標(biāo)記物，以及必須反應(yīng)或衍生化才能檢測(cè)的模塊，諸如酶。此類(lèi)標(biāo)記物的例子包括放射性同位素"P、14C、1251、^和1311,熒光團(tuán)諸如稀土螯合物或熒光素及其衍生物，若丹明及其衍生物，丹酰，傘形酮，螢光素酶，例如螢火蟲(chóng)營(yíng)光素酶和細(xì)菌螢光素酶(美國(guó)專利No.4,737,456),勞光素，2，3-二氫酞。秦二酮，辣根過(guò)氧化物酶(HRP),堿性磷酸酶，(3-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖類(lèi)氧化酶例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶、和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，雜環(huán)氧化酶諸如尿酸酶和黃嘌呤氧化酶，偶聯(lián)有使用過(guò)氧化氫來(lái)氧化染料前體的酶諸如HRP，乳過(guò)氧化物酶，或纟敖過(guò)氧化物酶，生物素/親合素，自旋標(biāo)記物，噬菌體標(biāo)記物，穩(wěn)定自由基，等等。已經(jīng)有將這些標(biāo)記物共價(jià)結(jié)合至蛋白質(zhì)或多肽的常規(guī)方法。例如，偶聯(lián)劑諸如二醛、碳二亞胺、雙馬來(lái)酰亞胺、雙亞氨酸酯、雙重氮化聯(lián)苯胺等可用于給抗體標(biāo)記上上述熒光、化學(xué)發(fā)光和酶標(biāo)記物。參見(jiàn)例如美國(guó)專利No.3,940,475(熒光測(cè)定法)和3,645，090(酶)；Hunter等，A^we,144:945(1962);I)avid等，歷oc/2e服;^y，13:1014-1021(1974);Pain等，/附ww"o/.MeAoA,40:219-230(1981);及Nygren,/^toc/zem.C,oc&m.,30:407-412(1982)。本文中優(yōu)選的標(biāo)記物是酶，諸如辣根過(guò)氧化物酶和堿性磷酸酶。將此類(lèi)標(biāo)記物(包括酶)與抗體偶聯(lián)對(duì)于熟悉免疫測(cè)定技術(shù)的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是一種標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程。參見(jiàn)例如O'Sullivan等，"MethodsforthePreparationofEnzyme-antibodyConjugatesforUseinEnzymeImmunoassay",于Mef/0(isz>/i，"2ym0/0gy,J.J.Langone禾口H.VanVunakis纟扁,巻73(AcademicPress,NewYork,NewYork,1981),pp.147-166。某些測(cè)定法需要試劑的固定化。固定化能夠?qū)⒖笵LL4抗體與仍然在溶液中游離的任何DLL4分開(kāi)。為此，或是通過(guò)吸附至不溶于水的基質(zhì)或表面(Bennich等，U.S.3,720,760)、通過(guò)共價(jià)偶聯(lián)(例如利用戊二醛交Jf關(guān))在測(cè)定法規(guī)程前使抗DLL4抗體或DLL4類(lèi)似物不溶解，或是例如通過(guò)免測(cè)沉淀，在測(cè)定法規(guī)程之后使抗DLL4抗體或DLL4類(lèi)似物不溶解。可以利用免疫組織化學(xué)和染色方案來(lái)檢查樣品中的蛋白質(zhì)表達(dá)。組織切片的免疫組織化學(xué)染色已經(jīng)證明是一種評(píng)估或檢測(cè)樣品中蛋白質(zhì)存在的可靠方法。免疫組織化學(xué)("IHC，，)技術(shù)利用抗體來(lái)探查和顯現(xiàn)原位細(xì)胞抗原，通常通過(guò)顯色或者熒光方法。對(duì)于樣品制備，可以使用來(lái)自哺乳動(dòng)物(典型的是人類(lèi)患者)的組織或細(xì)胞樣品。樣品的例子包括但不限于癌細(xì)胞，諸如結(jié)腸癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、淋巴瘤、和白血病癌細(xì)胞?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的多種規(guī)程來(lái)獲得樣品，包括但不限于手術(shù)切除、抽吸或活檢。組織可以是新鮮的或冷凍的。在一個(gè)實(shí)施方案中，樣品是固定和包埋在石蠟或類(lèi)似物中的。可以通過(guò)常規(guī)方法來(lái)固定(即保存)組織樣品。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將領(lǐng)會(huì)，固定劑的選擇由樣品是用于組織學(xué)染色還是其他分析的目的來(lái)決定。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員還將領(lǐng)會(huì)，固定時(shí)長(zhǎng)取決于組織樣品的大小和所使用的固定劑。IHC可以與別的技術(shù)諸如形態(tài)學(xué)染色和/或熒光原位雜交一起實(shí)施?，F(xiàn)有95兩種常用的IHC方法直接和間接測(cè)定法。根據(jù)第一種測(cè)定法，直接測(cè)定抗體與靶抗原(例如DLL4)的結(jié)合。這種直接測(cè)定法使用經(jīng)過(guò)標(biāo)記的試劑，諸如熒光標(biāo)簽或酶標(biāo)記的第一抗體，其不需要進(jìn)一步的抗體相互作用就能顯現(xiàn)。在一種典型的間接測(cè)定法中，未偶聯(lián)的第一抗體結(jié)合至抗原，然后經(jīng)過(guò)標(biāo)記的第二抗體結(jié)合至第一抗體。若第二抗體偶聯(lián)有酶標(biāo)記物，則添加顯色底物或熒光底物以提供抗原的顯現(xiàn)。因?yàn)閿?shù)個(gè)第二抗體可以與第一抗體上的不同表位反應(yīng)，所以發(fā)生信號(hào)放大。用于免疫組織化學(xué)的第一和/或第二抗體通常用可檢測(cè)模塊進(jìn)行標(biāo)記?，F(xiàn)有多種標(biāo)記物，它們通?？梢苑殖上铝蓄?lèi)型在上文討論的樣品制備規(guī)程外，可能還需要在IHC之前、期間或之后對(duì)組織切片進(jìn)行進(jìn)一步的處理。例如，可以實(shí)施表位修復(fù)法，諸如在檸檬酸鹽緩沖液中對(duì)組織樣品進(jìn)行力口熱(參見(jiàn)例如Leong等^p;/./mwM"o/z/Woc/zem.4(3):201(1996))。在任選的封閉步驟后，將組織切片在合適條件下暴露于第一抗體足夠時(shí)間，使得第一抗體結(jié)合至組織樣品中的靶蛋白抗原。實(shí)現(xiàn)這一目的的適宜條件可以通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定。抗體與樣品的結(jié)合程度通過(guò)使用上文討論的任一種可4全測(cè)標(biāo)記物來(lái)測(cè)定。優(yōu)選地，標(biāo)記物是酶標(biāo)記物(例如HRPO)，其催化顯色底物諸如3,3'-二氨基聯(lián)苯胺色原體的化學(xué)變化。優(yōu)選的是，將酶標(biāo)記物偶聯(lián)至特異性結(jié)合第一抗體的抗體(例如第一抗體是家兔多克隆抗體，第二抗體是山羊抗家兔抗體)?？梢詫⑷绱酥苽涞臉?biāo)本放置好并蓋上蓋玻片。然后進(jìn)行載玻片評(píng)估，例如利用顯微鏡，并且可以采用本領(lǐng)域常規(guī)使用的染色強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)。染色強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)可以如下評(píng)估表2染色樣式得分在細(xì)胞中沒(méi)有觀察到染色。0在超過(guò)10%的細(xì)胞中檢測(cè)到微弱/剛剛可察覺(jué)的染色。1+在超過(guò)10%的細(xì)胞中觀察到弱至中等的染色。2+在超過(guò)10%的細(xì)胞中觀察到中等至強(qiáng)的染色。3+典型的，在IHC測(cè)定法中得分為約2+或更高的染色樣式是"^斷性和/或預(yù)后性的。在有些實(shí)施方案中，得分為約l+或更高的染色樣式是診斷性和/或預(yù)后性的。在其它實(shí)施方案中，得分為約3或更高的染色樣式是診斷性和/或預(yù)后性的。應(yīng)當(dāng)理解，在使用IHC檢查來(lái)自肺瘤或結(jié)腸腺瘤的細(xì)胞和/或組織時(shí)，一般測(cè)定或評(píng)估腫瘤細(xì)胞和/或組織(而非樣品中可能存在的基質(zhì)或周?chē)M織)中的染色。稱為竟?fàn)幮曰蛘邐A心測(cè)定法的其它測(cè)定法已經(jīng)明確建立并廣泛用于商業(yè)it斷工業(yè)。竟?fàn)幏治龇ㄒ蕾囉陲@跡物DLL4類(lèi)似物與待測(cè)樣品DLL4竟?fàn)幱邢蘖康目笵LL4抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)的能力。竟?fàn)幥昂罂笵LL4抗體通常是不溶解的，然后將結(jié)合抗DLL4抗體的顯跡物和DLL4與未結(jié)合的顯跡物和DLL4分離。通過(guò)輕輕倒出(其中結(jié)合伴倡是預(yù)先不溶解的)或者通過(guò)離心(其中結(jié)合伴侶在竟?fàn)幏磻?yīng)后沉淀)實(shí)現(xiàn)這種分離。待測(cè)樣品DLL4的量與結(jié)合的顯跡物的量成反比，所述結(jié)合顯跡物的量通過(guò)標(biāo)記物質(zhì)的量測(cè)定。繪制DLL4量已知的劑量應(yīng)答曲線，與試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較以定量確定待測(cè)樣品中存在的DLL4的量。當(dāng)使用酶作為可檢測(cè)標(biāo)記物時(shí)，這些測(cè)定法被稱為ELISA系統(tǒng)。稱為"均相，，測(cè)定法的另一種竟?fàn)幏治龇ú恍枰喾蛛x。此處，制備并使用酶與DLL4的偶聯(lián)物，這樣的話當(dāng)抗DLL4抗體結(jié)合DLL4時(shí)，抗DLL4抗體的存在改變酶活性。在這種情況下，DLL4或者其免疫活性片段與雙功能有機(jī)橋偶聯(lián)到酶例如過(guò)氧化物酶上。選擇偶聯(lián)物以與抗DLL4抗體一起使用以便抗DLL4抗體的結(jié)合抑制或者增強(qiáng)標(biāo)記物的酶活性。該方法本身被廣泛使用，稱作EMIT。空間偶聯(lián)物用于均相測(cè)定法的位阻方法。通過(guò)將低分子量半抗原共i^介連接到小DLL4片段來(lái)合成這些偶聯(lián)物，以便針對(duì)半抗原的抗體基本上不會(huì)與抗DLL4抗體同時(shí)結(jié)合偶if關(guān)物。在此測(cè)定步驟下待測(cè)樣品中存在的DLL4將結(jié)合抗DLL4抗體，從而允許抗半抗原結(jié)合所述偶聯(lián)物，導(dǎo)致偶聯(lián)物的半抗原特性的變化，例如，當(dāng)半抗原是熒光基團(tuán)時(shí)熒光的變化。夾心測(cè)定法尤其可用于DLL4或者抗DLL4抗體的測(cè)定。在順次夾心測(cè)定法(s叫uentialsandwichassays)中固定化的抗DLL4抗體用于吸附待測(cè)樣品DLL4，通過(guò)洗滌去除待測(cè)樣品，結(jié)合的DLL4用于吸附經(jīng)過(guò)標(biāo)記的第二抗DLL4抗體，然后從殘余顯跡物中分離結(jié)合的材料。結(jié)合顯跡物的量與待測(cè)樣品DLL4成正比。"平行，，夾心測(cè)定法中在添加經(jīng)過(guò)標(biāo)記的抗DLL4前不分離待測(cè)樣品。使用抗DLL4單克隆抗體作為一種抗體和多克隆抗DLL4抗體作為另一種抗體的順次夾心測(cè)定法可用于檢測(cè)樣品中的DLL4。上文僅僅是DLL4的示范性檢測(cè)分析法?，F(xiàn)在或者此后發(fā)展的使用抗物測(cè)定法。制品在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了包含可用于治療、預(yù)防和/或診斷上文所述病癥的物質(zhì)的制品。制品包括容器和貼在所述容器上或與其相關(guān)的標(biāo)簽或包裝插頁(yè)。合適的容器包括例如瓶子、小管、注射器等。容器可用各種材料制成，諸如玻璃或塑料。容器中裝有其自身或在聯(lián)合其它組合物時(shí)有效治療、預(yù)防和/或診斷疾患的組合物，而且可具有無(wú)菌存取口(例如容器可以是具有皮下注射針可刺穿的塞子的靜脈內(nèi)溶液袋或小管)。組合物中的至少一種活性劑是本發(fā)明的抗體。標(biāo)簽或包裝插頁(yè)指示該組合物用于治療選擇的疾患，諸如癌癥。此外，制品可包括(a)其中裝有組合物的第一容器，其中所述組合物包含本發(fā)明的抗體；和(b)其中裝有組合物的第二容器，其中所述組合物包含別的治療劑，包括例如化療劑或抗血管發(fā)生劑，包括例如抗VEGF抗體(例如貝伐單抗)。本發(fā)明此實(shí)施方案中的制品還可包括指示第一和第二抗體組合物可用于治療特定疾患例如癌癥的包裝插頁(yè)?；蛘?另外，制品還可包括第二(或第三)容器，其中裝有藥學(xué)可接受的緩沖劑，諸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸鹽緩沖鹽水、林格氏(Ringer)溶液和右旋糖溶液。它還可包括商業(yè)和用戶立場(chǎng)上所需的其它物質(zhì)，包括其它緩沖劑、稀釋劑、濾器、針頭和注射器。下面是本發(fā)明方法和組合物的實(shí)施例。應(yīng)當(dāng)理解，根據(jù)上文提供的一般描述，可實(shí)施各種其它實(shí)施方案。實(shí)施例除非另有說(shuō)明，實(shí)施例中提及的商品化試劑依照制造商的說(shuō)明書(shū)使用。下文實(shí)施例和整篇說(shuō)明書(shū)中以ATCC編號(hào)所鑒別的那些細(xì)胞的來(lái)源是美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(Manassas,VA20108)。在實(shí)施例之后列出了實(shí)施例中所引用的參考文獻(xiàn)。由此本文收入所有引用的參考文獻(xiàn)作為參考。實(shí)施例l:材料和方法98實(shí)施例中使用了下列材料和方法。HUVEC血纖蛋白凝膠珠測(cè)定法。HUVEC血纖蛋白凝膠珠測(cè)定法的詳情已有記載(Nakatsu,M.N.等，MicrovascRes66，102-12(2003))。簡(jiǎn)言之，以350-400個(gè)HUVEC/珠包被CytodexTM3珠(AmershamPharmaciaBiotech)。將約200個(gè)HUVEC包被的珠子埋入12孔組織培養(yǎng)板的一個(gè)孔中的血纖蛋白凝塊。將8x10"個(gè)SF細(xì)胞鋪于該凝塊之上。第7天和第9天之間終止測(cè)定以免疫染色和成像。在有些實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)用生物素-抗CD31(克隆WM59，eBioscience)和鏈霉親合素-Cy3染色來(lái)使HUVEC芽顯現(xiàn)。為了HUVEC細(xì)胞核染色，將血纖蛋白凝膠在2。/。低聚曱醛(PFA)中固定過(guò)夜，并用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI,Sigma)染色。為了Ki67染色，將血纖蛋白凝膠用IOX胰蛋白酶-EDTA處理5分鐘以去除上層SF，用PBS中的10。/。FBS中和，并在4。/。PFA中固定過(guò)夜。然后將血纖蛋白凝膠用PBST中的10。/。山羊血清封閉4小時(shí)，與家兔抗小鼠Ki67(Ready-To-Use，克隆Sp6，LabVision)—起溫育過(guò)夜，接著用抗家兔lgG-Cy3(JacksonImmunoResearch)進(jìn)行二級(jí)檢測(cè)。所有過(guò)夜溫育在4。C進(jìn)行。小鼠新生視網(wǎng)膜研究。在P1和P3，給來(lái)自同一窩的新生CDl小鼠i.p.注射PBS或YW26.82(10mg/kg)。在P5，收集眼睛，并用PBS中的4%PFA固定過(guò)夜。將解剖的視網(wǎng)膜用PBST中的10。/。山羊血清封閉3小時(shí)，然后與一抗一起溫育過(guò)夜。一級(jí)混合物(cocktail)包括生物素化的異凝集素B4(25iug/m1,西非單葉豆CSaw(iez'raeaSigma)和下列之一家兔抗小鼠Ki67(1:1,Ready-To-Use,克隆Sp6,LabVision)或小鼠Cy3偶聯(lián)的抗aSMA(1:2000，Sigma-Aldrich)，及PBLEC(1%TritonX-IOO，0.1mMCaCl2，0.1mMMgCl2，0.1mMMnCl2,在PBSpH6.8中)中的10%血清。然后將視網(wǎng)膜在PBST中清洗，并與AlexaFluor488鏈霉親合素(1:200;MolecularProbes)和Cy3-抗家兔IgG(1:200;JacksonImmunoResearch)的二抗組合物一起溫育過(guò)夜。在完成染色后，將視網(wǎng)膜用PBS中的4。/。PFA后固定。所有過(guò)夜溫育在4。C進(jìn)行。通過(guò)共焦焚光顯微術(shù)捕獲平展視網(wǎng)膜的圖像。腫瘤模型。使用8-10周齡的米色雌性棵小鼠。為了獲得皮下腫瘤，給小鼠在右后體側(cè)注射含有500/。matrigel(BDBioscience)的0.1ml纟田胞懸液。將5xl(^個(gè)人結(jié)腸癌HM7細(xì)胞、10xl(^個(gè)人結(jié)腸癌Colo205細(xì)胞、10xl(^個(gè)人肺癌Calu6細(xì)胞、10xl()S個(gè)人肺癌MV-522細(xì)胞、10xl0MH、鼠白血病WEHI-3細(xì)99胞、10xl()6個(gè)小鼠淋巴瘤EL4細(xì)胞、10xl()6個(gè)人卯巢癌SK-OV-3Xl細(xì)胞、10xl(^個(gè)小鼠肺癌LL2細(xì)胞、10xl(^個(gè)白血病/淋巴瘤EL4細(xì)胞或10xl(^個(gè)非小肺癌H1299細(xì)胞注射入每只小鼠。對(duì)于人黑素瘤MDA-MB-435模型，給小鼠在乳房脂肪墊中注射含有50%matrigel的0.1ml細(xì)胞(5乂106個(gè))懸液。經(jīng)i.p.施用抗DLL4抗體YW26.82(10mg/kg體重，每周兩次)。對(duì)于下列腫瘤才莫型，每只試驗(yàn)小鼠在右體側(cè)接受植入的皮下肺瘤碎塊(lmm3》非小肺癌SKMES-1、人乳腺癌MX-1、人結(jié)腸直腸癌SW620和人腺癌LS174T。通過(guò)測(cè)徑器測(cè)量來(lái)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)定量。通過(guò)測(cè)量長(zhǎng)度(l)和寬度(w)并計(jì)算體積(V=lw2/2)來(lái)測(cè)定腫瘤體積(mm3)。每組中包括10至15只動(dòng)物。使用雙尾Student氏t檢驗(yàn)(two-tailedStudent'st-test)實(shí)施處理組的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。腫瘤血管標(biāo)記和免疫組織化學(xué)。用異氟烷麻醉小鼠。i.v.注射FITC標(biāo)記的番茄(丄少copera/cowascw/ew似w)凝集素(150嗎，在150|110.9%NaCl中；VectorLaboratories),并容許循環(huán)5分鐘，之后系統(tǒng)灌注。用PBS中的1%PFA對(duì)血管結(jié)構(gòu)經(jīng)過(guò)心臟地(transcardially)灌注3分鐘。取出腫瘤，并通過(guò)在相同的固定劑中浸沒(méi)2小時(shí)來(lái)后固定，接著為了防凍在30%蔗糖中溫育過(guò)夜，然后在OCT中包埋。將切片(4pm厚度)用抗小鼠CD31(l:50,BDPharmingen)，接著用Alexa594山羊抗大鼠IgG(1:800,MolecularProbes)染色。小鼠腸的組織學(xué)和免疫組織化學(xué)。將福爾馬林固定且石蠟包埋的小鼠小腸組織切片成3pm厚度。如制造商(PolyScientific)所推薦的，使用Alcian藍(lán)實(shí)施腸細(xì)胞類(lèi)型的組織化學(xué)鑒定。為了抗Ki67染色，將切片用靶物恢復(fù)液(S1700，DAKO)預(yù)處理，并與家兔抗Ki67(1:200，克隆SP6，Neomarkers)—起溫育。用VectastainABCElite試劑盒(VectorLabs)檢測(cè)7.5g/ml的二級(jí)山羊抗家兔(VectorLabs)。用Mayer氏蘇木精復(fù)染所有Ki67染色切片。為了HES-1染色，使用抗大鼠HES-1(克隆NM1,MBL，International),接著是TSA-HRP。RNA干擾。靶向人DLL4的SMART集合小干擾RNA(siRNA)雙鏈體和Si對(duì)照無(wú)靶siRNA#2(SiControlNon-TargetsiRNA#2)購(gòu)自Dharmacon。使用OptiMEM-1⑧和LipfectamineTM2000(Invitroger丄)，以40%匯合的HUVEC進(jìn)行siRNA雙鏈體(50nM)的轉(zhuǎn)染。siRNA轉(zhuǎn)染后48小時(shí)進(jìn)行FACS分析。4種抗DLL4SMART集合siRNA的序列如下CAACTGCCCTTATGGCTTTTT(SEQIDNO:62)(寡聚物1，有義)，AAAGCCATAAGGGCAGTTGTT(SEQIDNO:63)(寡聚物l,反義)，CAACTGCCCTTCAATTTCATT(SEQIDNO:64)(寡聚物2，有義)，TGAAATTGAAGGGCAGTTGTT(SEQIDNO:65)(寡聚物2，反義)，TGACCAAGATCTCAACTACTT(SEQIDNO:66)(寡聚物3，有義)，GTAGTTGAGATCTTGGTCATT(SEQIDNO:67)(寡聚物3，反義)，GGCCAACTATGCTTGTGAATT(SEQIDNO:68)(寡聚物4，有義)，TTCACAAGCATAGTTGGCCTT(SEQIDNO:69)(寡聚物4，反義)。Notch配體Notch阻斷ELISA。用0.5|ig/ml重組大鼠Notchl-Fc(rrNotchl-Fc,R&DSystems)包被96孔微量滴定板。在該測(cè)定法中使用含有DI丄4-AP(融合至人胎盤(pán)堿性磷酸酶的DLL4的第l-404位氨基酸)的條件化培養(yǎng)基。為了制備條件化培養(yǎng)基，用表達(dá)DLL4-AP的質(zhì)粒及Fugen6試劑(RocheMolecularBiochemicals)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后5天，收獲條件化培養(yǎng)基，過(guò)濾，并存儲(chǔ)在4。C。將0.15-25嗎/ml滴定的純化的抗體與下述稀釋度的DLL4-AP條件化培養(yǎng)基在室溫預(yù)溫育1小時(shí)，在該稀釋度的DLL4-AP條件化培養(yǎng)基賦予對(duì)所包被rrNotch1-Fc的50%最大可實(shí)現(xiàn)結(jié)合。然后將該抗體/DLL4-AP混合物在室溫添加至rrNotchl-Fc包被的平板l小時(shí)，之后將平板在PBS中清洗數(shù)次。使用一步PNPP(Pierce)作為底物和OD405nm吸光度測(cè)量來(lái)檢測(cè)所結(jié)合的DLL4-AP。用DLL1-AP(人DLLl,氨基酸1-445)實(shí)施同樣的測(cè)定法。用純化的DLL4-His(C末端加His標(biāo)簽的人DLL4，氨基酸l-404)和Jagl-His(R&DSystem)實(shí)施類(lèi)似的測(cè)定法。用小鼠抗His單抗(liug/m1,RocheMolecularBiochemicals)、生物素4匕的山羊4元小鼠(JacksonImmunoResearch)和鏈霉親合素-AP(JacksonImmunoResearch)檢測(cè)所結(jié)合的加His標(biāo)簽的配體。RNA提取和實(shí)時(shí)定量RT-PCR。使用RNeasy⑧迷你試劑盒(Qiagen)按照制造商的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行從2-D培養(yǎng)物中的HUVEC提取總RNA。為了從在血纖蛋白凝膠中生長(zhǎng)的HUVEC提取總RNA,用10X胰蛋白酶-EDTA(Gibco)處理血纖蛋白凝月交5分鐘以去除上層成纖維細(xì)胞，接著用PBS中的10。/oFBS中和。然后將該凝膠凝塊自組織培養(yǎng)孔取出，并在微量管中進(jìn)行離心(10K、5分鐘)以去除過(guò)量液體。將所得凝膠"沉淀物"用溶解緩沖液(RNeasy⑧迷你試劑盒)溶解，并像2-D培養(yǎng)物中的HUVEC那樣進(jìn)一步處理。使用RNA6000納米芯片和Agilent2100生物分析儀(AgilentTechnologies)評(píng)估RNA質(zhì)量。使用7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(AppliedBiosystems)—式三份進(jìn)行實(shí)時(shí)定量RT-PCR。使用人101GAPDH作為參照基因以標(biāo)準(zhǔn)化。將表達(dá)水平表述為相對(duì)于來(lái)自3次分別測(cè)定的對(duì)照的均值(土SEM)mRNA倍數(shù)變化。VEGFR2、TGF(32和GAPDH的正向和反向S1物及探針序列如下TGFb2正向GTAAAGTCTTGCAAATGCAGCTA(SEQIDNO:70)反向CATCATCATTATCATCATCATTGTC(SEQIDNO:71)探針AATTCTTGGAAAAGTGGCAAGACCAAAAT(SEQIDNO:72)VEGFR2正向CTTTCCACCAGCAGGAAGTAG(SEQIDNO:73)反向TGCAGTCCGAGGTCCTTT(SEQIDNO:74)探針CGCATTTGATTTTCATTTCGACAACAGA(SEQIDNO:75)GAPDH正向GAAGATGGTGATGGGATTTC(SEQIDNO:76)反向GAAGGTGAAGGTCGGAGTC(SEQIDNO:77)探針CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC(SEQIDNO:78)實(shí)施例2:噬菌體抗DLL4抗體的生成通過(guò)在重鏈和輕鏈的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)內(nèi)引入多樣性來(lái)在單個(gè)框架(人源化抗ErbB2抗體，4D5)上構(gòu)建合成噬菌體抗體文庫(kù)(Lee,C.V.等，JMo/所o/340,1073-93(2004);Liang,W.C.等，J編Ozem281,951-61(2006))。針對(duì)固定化在MaxiSorpTM免疫板上的加His標(biāo)簽的人DLL4(氨基酸1-404)實(shí)施對(duì)未免疫(naive)文庫(kù)的平板淘選。四輪富集后，隨機(jī)挑取克隆，并使用噬菌體ELISA鑒定特異性結(jié)合物。用加His標(biāo)簽的鼠DLL4蛋白進(jìn)一步篩選所得hDLL4結(jié)合克隆以鑒定跨物種克隆。對(duì)于各個(gè)陽(yáng)性噬菌體克隆，將重鏈和輕鏈可變區(qū)亞克隆入被改造成表達(dá)全長(zhǎng)IgG鏈的pRK表達(dá)載體。將重鏈和輕鏈構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染入293或CHO細(xì)胞，并使用蛋白A親和柱從無(wú)血清培養(yǎng)基中純化所表達(dá)的抗體。通過(guò)ELISA測(cè)試純化后的抗體阻新DLL4和大鼠Notchl-Fc之間的相互作用，并通過(guò)FACS測(cè)試其對(duì)表達(dá)全長(zhǎng)人DLL4或鼠DLL4的穩(wěn)定細(xì)胞系的結(jié)合。為了親和力成熟，通過(guò)軟隨機(jī)化策略(softrandomizationstrategy)構(gòu)建具有衍生自感興趣初始克隆的CDR環(huán)(CDR-L3、-Hl、和-H2)的三種不同組合的噬菌體文庫(kù)，使得各個(gè)選定位置突變成非野生型殘基或者以約50:50頻率維持野生型(Liang等，2006,見(jiàn)上文)。然后通過(guò)四輪針對(duì)人和鼠二者的加His標(biāo)簽的DLL4蛋白的、逐漸提高嚴(yán)格性的溶液相淘選來(lái)鑒定高親和力克隆。實(shí)施例3:抗DDL4抗體的表征為了測(cè)定抗DLL4單抗的結(jié)合親和力，使用表面等離振子共振(SRP)測(cè)量及BIAcoreTM-3000(BIAcore，Inc.,Piscataway,NJ)。筒言之，將羧曱基化的右旋糖苷生物傳感器芯片(CM5，BIAcoreInc.)用鹽酸N-乙基-N，-(3-二曱基氨基丙基)-碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)依照供應(yīng)商的說(shuō)明書(shū)來(lái)活化。用10mM乙酸鈉(pH4.8)將抗DLL4抗體稀釋成5iig/ml，之后以5|^1/分鐘的流速注射以獲得約500個(gè)響應(yīng)單位(RU)的偶聯(lián)抗體。隨后，注射1M乙醇胺封閉未反應(yīng)的基團(tuán)。為了動(dòng)力學(xué)測(cè)量，在25。C以25^il/分鐘的流速注射含0.05。/c)Tween20的PBS中的人或鼠DLL4-His分子的二倍連續(xù)稀釋液(0.7nM至500nM)。使用簡(jiǎn)單一對(duì)一朗格繆爾(Langmuir)結(jié)合模型(BIAcoreEvaluationSoftware3.2版)計(jì)算結(jié)合速率(k。J和解離速率(k。ff)。平衡解離常數(shù)(Kd)以比率k。ff/k。n計(jì)算。該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示在表3中?？贵wYW26.81針對(duì)人和鼠DLL4展現(xiàn)出相似的Kd值(Kd值分別為O.lnM和0.09nM)，使其能在小鼠模型中進(jìn)行評(píng)估。表3:抗DI丄4抗體對(duì)人和小鼠DLL4的結(jié)合親和力和動(dòng)力學(xué)。"NA"表示沒(méi)有實(shí)施該測(cè)量?？寺∈蟮露?(ECD5.5)人德耳塔4(ECD5.5)kon/105W10-4Kd(nM)Wio5Wio-4Kd(nM)YW260.5716280.37.425YW26.64.10.610.1520.490.25YW26.143.30.730.221.80.660.37YW26.20"10.31.70.790.46YW26.343.60.650.181.90.670.35YW26.825.40.460.092.40.370.15實(shí)施例4:抗DDL4抗體的進(jìn)一步表征抗DLL4單抗YW26.82的表位作圖?？笵LL4單抗26.82識(shí)別存在于人103DLL4胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)的EGF樣重復(fù)序列編號(hào)2(EGL2)中的結(jié)合決定簇。EGL2包含人DLL4ECD的氨基酸252-282。簡(jiǎn)言之，使DLL4ECD突變體表達(dá)為堿性磷酸酶融合蛋白，并評(píng)估與抗體的結(jié)合。圖lla描繪了表達(dá)為C末端人胎盤(pán)堿性磷酸酶(AP)融合蛋白的一組DLL4突變體的圖示。圓括號(hào)指出該融合蛋白中所包括的DLL4序列。在用純化的抗DLL4單抗(YW26.82,0.5嗎/ml)包被的96孔微量滴定板上測(cè)試含該融合蛋白的293T細(xì)胞條件化培養(yǎng)基。使用一步PNPP(Pierce)作為底物和OD405nm吸光度測(cè)量來(lái)4企測(cè)所結(jié)合的DLL4.AP。單抗YW26.82結(jié)合包含DLL4EGL2結(jié)構(gòu)域的構(gòu)建體，而不結(jié)合缺乏DLL4EGL2結(jié)構(gòu)域的構(gòu)建體。這證明抗DLL4單抗YW26.82識(shí)別人DLL4ECD的EGL2結(jié)構(gòu)域中的表位。單抗YW26.82選擇性結(jié)合小鼠和人DLL4。如所指示的(l(ig/ml)用純化的重組蛋白包被96孔NuncMaxisorp平板。通過(guò)ELISA測(cè)定法測(cè)量在指定濃度的YW26.82的結(jié)合。使用TMB作為底物和OD450nm吸光度測(cè)量用抗人抗體HRP偶聯(lián)物來(lái)檢測(cè)所結(jié)合的抗體。使用抗HER2和重組ErbB2-ECD作為測(cè)定對(duì)照(圖llb)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在圖llb中。單抗YW26.82結(jié)合人和小鼠DLL4，而沒(méi)有可檢測(cè)地結(jié)合人DLL1和人JAG1。這些結(jié)果證明單抗YW26.82選擇性結(jié)合DLL4。經(jīng)載體、全長(zhǎng)DLL4、Jagl或DLLl瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞的FACS分析也證明單抗YW26.82選擇性結(jié)合DLL4。如圖llc所示，僅在經(jīng)DLL4轉(zhuǎn)染的細(xì)胞上檢測(cè)到Y(jié)W26.82的顯著結(jié)合(頂部小圖)。在經(jīng)DLLl或Jagl轉(zhuǎn)染的細(xì)胞上沒(méi)有^企測(cè)到顯著結(jié)合。分別通過(guò)重組大鼠Notchl-Fc(rrNotchl-Fc，中間小圖)和重組大鼠Notch2-Fc(rrNotch2-Fc，底部小圖)證實(shí)Jagl和DLLl的表達(dá)。使用2(ig/ml的YW26.82、rrNotchl-Fc或rrNotch2-Fc(R&DSystem),接著使用山羊抗人IgG-PE(1:500,JacksonImmunoResearch)。竟?fàn)帉?shí)驗(yàn)證明單抗YW26.82高效且選4奪性阻斷Notch與DLL4的相互作用，但不阻斷Notch與其它Notch配體的相互作用。如圖lld所示，抗DLL4單抗阻斷DLL4-AP而一一DLL1-AP與所包被的rNotch1的結(jié)合，計(jì)算IC50約為12nM(左邊小圖)?？笵LL4單抗阻斷DLL4-His而非Jagl-His與所包被的rNotchl的結(jié)合，計(jì)算IC50約為8nM(右邊小圖)。抗DLL4單抗YW26.82特異性結(jié)合人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)中內(nèi)源表達(dá)的DLL4。經(jīng)對(duì)照或DLL4特異性siRNA轉(zhuǎn)染的HUVEC的FACS分析。使用2fig/ml的YW26.82,接著使用山羊抗人IgG-PE(1:500，JacksonImmimoResearch)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在圖11e中。觀察到對(duì)未轉(zhuǎn)染的HUVEC(對(duì)照)和對(duì)經(jīng)對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染的HUVEC的結(jié)合。與之相比，結(jié)合在經(jīng)DLL4siRNA轉(zhuǎn)染的HUVEC中顯著降低。這些實(shí)驗(yàn)證明抗DLL4單抗YW26.82特異性結(jié)合HUVEC中內(nèi)源表達(dá)的DLL4。實(shí)施例5:抗DDL4抗體處理增加了體外內(nèi)皮細(xì)胞增殖在存在共培養(yǎng)的人皮膚成纖維細(xì)胞(SF)時(shí)，在血纖蛋白凝膠中生長(zhǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮纟田胞(HUVEC)生成具有獨(dú)特腔管樣結(jié)構(gòu)的芽(Nakatsu,M.N.等M/cravaycWm66，102-12(2003))。抗DLL4抗體YW26.82的添加明顯增加了芽的長(zhǎng)度和數(shù)目(圖7a)。由蛋白質(zhì)復(fù)合物的？分泌酶活性所催化的Notch蛋白水解加工是Notch活化過(guò)程中一個(gè)至關(guān)重要的步驟(Baron,M.Ce〃Dev傷o/14,113-9(2003))。有趣的是，Y-分泌酶抑制劑二苯并氮卓(dibenzazepine，DBZ)(vanEs,J.H.等，胸匿435,959-63(2005);Milano，J.等,7bx/co/82,341-58(2004))對(duì)HUVEC萌芽具有相同的效果?？紤]到這兩種處理具有不同的機(jī)制，萌芽的增強(qiáng)顯然可歸因于Notch信號(hào)傳導(dǎo)的衰減。Ki67染色揭示EC萌芽的增強(qiáng)是由于細(xì)胞增殖的提高(圖7b)。在最初的血纖蛋白凝膠測(cè)定法中，共培養(yǎng)的SF細(xì)胞支持HUVEC萌芽和隨后的腔管形成。通過(guò)用條件化培養(yǎng)基替代SF細(xì)胞，抗DLL4單抗和DBZ都仍能夠增強(qiáng)HUVEC萌芽(圖lc)，這支持DLL4/Notch信號(hào)傳導(dǎo)的EC自主性作用。在相反的實(shí)驗(yàn)中，由固定化DI丄4蛋白進(jìn)行的Notch活化導(dǎo)致顯著的生長(zhǎng)抑制(圖7e)。這些發(fā)現(xiàn)表明DLL4/Notch信號(hào)傳導(dǎo)的活化狀態(tài)與EC增殖密切相關(guān)。實(shí)施例6:抗DDL4抗體處理增加了體內(nèi)內(nèi)皮細(xì)胞增殖早期的出生后小鼠視網(wǎng)膜以清楚定義的一系列事件發(fā)展成定型的(stereotypic)血管模式(Stone,J.和Dreher,Z.JCowp7Vewra/255，35-49(1987);Gerhardt,H.等，JCe〃歷o/161，1163-77(2003);Fruttiger,M./"veWQp/^a/mo/Ry43,522-7(2002))。新生視網(wǎng)膜中正在生長(zhǎng)的EC中顯著且動(dòng)態(tài)的DLL4表達(dá)表明DLL4可能的作用是調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜血管發(fā)育(Claxton,S.和Fruttiger,M.Gewe五x;rPa股m5,123-7(2004))。YW26.82的系統(tǒng)遞送引起深刻的視網(wǎng)膜血管結(jié)構(gòu)改變。在視網(wǎng)膜中發(fā)生EC的大量積累，產(chǎn)生具有原始血管形態(tài)學(xué)的片樣(sheet-like)結(jié)構(gòu)(圖7d)。觀察到EC中Ki67標(biāo)記的顯著增加，表明EC增殖得到提高(圖7h)。因此，新生小鼠中DLL4阻斷后視網(wǎng)膜EC的這種過(guò)度增殖表型確證了體外發(fā)現(xiàn)。實(shí)施例7:DLL4/Notch在調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞增殖中的重要作用VEGF控制EC的數(shù)個(gè)基本方面(Ferrara，N.209-31(2005);Coultas,L.等，Atow438,937-45(2005))。然而，知之甚少的是，VEGF信號(hào)傳導(dǎo)是如何整合入復(fù)雜的血管過(guò)程，諸如動(dòng)靜脈(AV)分化和等級(jí)血管組織(hierarchicalvascularorganization),即明顯需要?jiǎng)e的高度協(xié)調(diào)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑的事件。斑用(Lawson，N.D.等，Z)eve/o/meW128,3675-83(2001))。我們發(fā)現(xiàn)用VEGF刺激HUVEC引起DLL4表面表達(dá)升高(未顯示的數(shù)據(jù))，這與最近關(guān)于VEGF刺激DLL4mRNA上調(diào)的報(bào)道一致(Patel,N.S.等，Ca"cw65,8690-7(2005))。有趣的是，在Notch活化后DLL4自身上調(diào)(圖12),這表明有一種正反饋機(jī)制，通過(guò)該機(jī)制DLL4有效傳遞VEGF信號(hào)傳導(dǎo)至Notch途徑。簡(jiǎn)言之，在沒(méi)有DBZ或存在DBZ(0.08(iM)時(shí)，用固定化的C末端加His標(biāo)簽的人DLL4(氨基酸1-404)刺激HUVEC。刺激后36小時(shí)，通過(guò)使用抗DLL4抗體的FACS分析來(lái)檢查內(nèi)源DLL4表達(dá)。值得注意的是，由于阻斷Notch信號(hào)傳導(dǎo)而產(chǎn)生的EC過(guò)度增殖仍依賴于VEGF。在3-D血纖蛋白凝膠培養(yǎng)物中，抗VEGF單抗處理消除了大多數(shù)EC萌芽，或是在存在DBZ時(shí)或是在沒(méi)有DBZ時(shí)(圖7f)，這提出如下的可能性，即過(guò)度增殖行為可能的部分原因是VEGF信號(hào)傳導(dǎo)的增強(qiáng)。確實(shí)，YW26.82或DBZ對(duì)Notch的阻斷導(dǎo)致VEGFR2上調(diào)(圖7g)。相反地，固定化DLL4對(duì)Notch的活化抑制VEGFR2表達(dá)(圖7g)。因此，盡管VEGF可以在DLL4/Notch途徑上游起作用，DLL4/Notch能夠通過(guò)負(fù)調(diào)節(jié)VEGFR2表達(dá)來(lái)微調(diào)應(yīng)答。實(shí)施例8:抗DLL4抗體處理陣斷內(nèi)皮細(xì)胞分化且阻斷動(dòng)脈發(fā)育在EC增殖增加外，拮抗DLL4/Notch引起血纖蛋白凝膠中EC芽顯著的形態(tài)學(xué)變化。多細(xì)胞腔管樣結(jié)構(gòu)基本不存在(圖8a)，這表明EC分化有缺陷。在單抗YW26.82處理的視網(wǎng)膜中，放射狀交互的動(dòng)脈和靜脈的特征樣式受到嚴(yán)重破壞。與視網(wǎng)膜動(dòng)脈有關(guān)的抗a平滑肌肌動(dòng)蛋白(ASMA)染色完全不存在106(圖8c)。該觀察結(jié)果與DLL4+Z-胚胎中有缺陷的動(dòng)脈發(fā)育非常類(lèi)似。從不同角度的這些發(fā)現(xiàn)突出了DLL4/Notch在調(diào)節(jié)EC分化中的重要作用。實(shí)施例9:TFG卩表達(dá)與Notch活化狀態(tài)有聯(lián)系類(lèi)似于Notch途徑，TGF(3信號(hào)傳導(dǎo)是環(huán)境依賴性的，且對(duì)細(xì)胞分化、增殖和生長(zhǎng)抑制具有不同效果，且常常是相反的效果。此外，已經(jīng)將TGF卩途徑與血管過(guò)程聯(lián)系起來(lái)(Urness,L.D.等，7Va/26,328-31(2000);Oshima,M.等，Dev歷o/179，297-302(1996);Larsson，J.等，五w^J20，1663-73(2001))。例如，激活素受體樣激酶l(ALK1)(—種EC特異性I型TGF(3受體)的缺陷導(dǎo)致卵黃嚢中的原始EC網(wǎng)絡(luò)和動(dòng)靜脈功能失常(AVM)，即具有有缺陷的Notch信號(hào)傳導(dǎo)的小鼠所共享的表型(Urness，L.D.等，2《328-31(2000);Iso，T.等，JWe"'仍c/erT7zram6所o/23，543-53(2003))。這引導(dǎo)我們?nèi)フ{(diào)查這兩種途徑之間的可能聯(lián)系。我們發(fā)現(xiàn)TGFP2表達(dá)(圖8b)與Notch活化狀態(tài)密切聯(lián)系，這表明TGFp途徑可能在Notch途徑下游起作用。綜上所述，我們的發(fā)現(xiàn)支持如下的模型，其中充當(dāng)"信號(hào)傳導(dǎo)路由器"("signalingrouter")的DLL4/Noteh軸通過(guò)調(diào)節(jié)DLL4表達(dá)來(lái)整合VEGF信號(hào)傳導(dǎo)，并使TGF(3途徑參與促進(jìn)EC分化。實(shí)施例10:抗DLL4抗體處理抑制體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)為了直接研究DLL4/Notch信號(hào)傳導(dǎo)在腫瘤血管發(fā)生過(guò)程中的可能作用，我們調(diào)查了在臨床前腫瘤模型中阻斷DLL4對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響(圖9a-d)。在HM7、Colo205和Calu6異種移植物肺瘤模型中(圖9a-c)，在肺瘤確立(腫瘤大小2250mm3)后啟動(dòng)YW26.82處理。在所有三種沖莫型中，對(duì)照和處理組之間的生長(zhǎng)速率分離在定量給藥后三天變得明顯。處理組的腫瘤體積在處理的兩周里保持不變。在皮下腫瘤外，抗DLL4單抗還抑制在小鼠乳房脂肪墊中生長(zhǎng)的腫瘤。在MDA-MB-435腫瘤模型中，在注射腫瘤細(xì)胞后14天開(kāi)始處理。對(duì)照和處理組之間的腫瘤生長(zhǎng)曲線的差異在定量給藥后6天內(nèi)是明顯的，且隨著處理的持續(xù)而變得越發(fā)顯著(圖9d)。我們還調(diào)查了在臨床前腫瘤模型中阻斷DLL4和/或VEGF對(duì)許多腫瘤生長(zhǎng)的影響(圖9e-f;i-p)。在MV-522和WEHI3異種移植物腫瘤模型中，在腫瘤確立(腫瘤大小2250mm3)后啟動(dòng)YW26.82處理和/或抗VEGF處理。在MV-552模型中，YW26.82和抗VEGF處理都單獨(dú)地抑制腫瘤生長(zhǎng)，但這兩種處理的聯(lián)合是最有效的。在WEHI3模型中，抗VEGF處理對(duì)肺瘤生長(zhǎng)不顯示效果，而YW26.82處理顯示對(duì)肺瘤生長(zhǎng)的顯著抑制。在SK-OV-3Xl、LL2、EL4、H1299、SKMES-1、MX-1、SW620和LS174T才莫型中，在肺瘤確立后施用YW26.82處理(5mg/kg,IP，每周兩次)和/或抗VEGF處理(5mg/kg,IP,每周兩次)。在這些^f莫型的每種中，YW26.82處理單獨(dú)地抑制腫瘤生長(zhǎng)。此外，在測(cè)試了聯(lián)合的所有這些模型中，YW26.82與抗VEGF的聯(lián)合表現(xiàn)出增強(qiáng)的功效。實(shí)施例ll:抗DLL4抗體處理增加了腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖鑒于腫瘤生長(zhǎng)抑制，我們將EL4小鼠淋巴瘤腫瘤模型用于血管組織學(xué)研究。我們發(fā)現(xiàn)抗DLL4單抗處理導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞密度的顯著增加(圖9g)。相反地，抗VEGF具有完全相反的效果(圖9g),盡管這兩種處理在該模型中表現(xiàn)出相似的功效。實(shí)施例12:抗DLL4抗體處理抑制肺瘤血管灌注因?yàn)镈LL4/Notch途徑的體外阻斷削弱了由EC形成腔管樣結(jié)構(gòu)(圖8a)，因此調(diào)查了抗DLL4單抗處理是否引起肺瘤血管結(jié)構(gòu)中的相似缺陷，并影響有效的血流。FITC-凝集素的系統(tǒng)灌注揭示了抗DLL4單抗處理導(dǎo)致腫瘤血管的凝集素標(biāo)記的顯著降低(圖9h)。值得注意的是，已經(jīng)顯示了ALK1缺陷小鼠中動(dòng)靜脈功能失常引起異常的血液循環(huán)(Urness，L.D.等，Ato26,328-31(2000))?？紤]到DLL4/Notch信號(hào)傳導(dǎo)在AV分化中的重要作用，在胚胎和早期的出生后^L網(wǎng)膜中，抗DLL4單抗都可能影響腫瘤EC的細(xì)胞命運(yùn)指定(cellfatespecification),并引起有缺陷的定向血流。確實(shí)，在經(jīng)抗DLL4單抗處理的Colo205肺瘤中，存在這樣的區(qū)域，其中高EC密度與低可存活腫瘤細(xì)胞含量有關(guān)，這表明血管功能差。洞察精確的血管缺陷需要利用血管成像技術(shù)的進(jìn)一步研究。實(shí)施例13:DLL4/Notch在小鼠腸穩(wěn)態(tài)中不是必需的考慮到Notch信號(hào)傳導(dǎo)在調(diào)節(jié)出生后自我更新系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)中的多效性作用，關(guān)于Notch全局抑制的主要顧慮是其可能有害。例如，維持未分化的腸內(nèi)隱窩祖細(xì)胞需要Notch信號(hào)傳導(dǎo)(vanEs,J.H.等，A^ww435,959-63(2005);108Fre,S.等，Atowe435，964-8(2005))。確實(shí)，由于隱窩區(qū)室內(nèi)杯形細(xì)胞的大量增加，y-分泌酶抑制劑(其會(huì)不加選擇地阻斷所有Notch活性)在嚙齒類(lèi)動(dòng)物中引起不想要的副作用(Milano，J.等,7bx/co"c/82，341-58(2004);Wong,G.T.等，J歷o/CAem279,12876-82(2004))。通過(guò)免疫組織化學(xué)分析，我們檢查了用抗DLL4單抗處理的小鼠的小腸。與DBZ處理形成對(duì)比，處理六周后抗DLL4單抗和對(duì)照組之間沒(méi)有鑒別出上皮隱窩細(xì)胞分化或增殖概況(proliferationprofile)的差異(圖10)。此外，抗DLL4單抗沒(méi)有改變快速分裂的移行擴(kuò)增(transitamplifying,TA)群體中Notch靶基因HES-l的表達(dá)(圖10)。這些結(jié)果支持如下觀點(diǎn)，即DLL4/Notch信號(hào)傳導(dǎo)主要局限于血管系統(tǒng)。實(shí)施例14:抗DLL4抗體處理不影響成年視網(wǎng)膜血管結(jié)構(gòu)盡管DLL4的阻斷對(duì)新生小鼠中視網(wǎng)膜血管發(fā)育具有深刻的影響，但抗DLL4抗體的施用對(duì)成年視網(wǎng)膜血管結(jié)構(gòu)沒(méi)有可見(jiàn)的影響(圖8d)。如此，DLL4/Notch信號(hào)傳導(dǎo)在活躍的血管發(fā)生過(guò)程中是關(guān)鍵性的，但在正常血管維持中發(fā)揮不太重要的作用。與該觀點(diǎn)一致，在抗DLL4單抗處理過(guò)程中，在每周兩次服用10mg/kg長(zhǎng)達(dá)8周的攜瘤小鼠中沒(méi)有觀察到明顯的體重減輕或動(dòng)物死亡。在腫瘤模型中，抗DLL4單抗和抗VEGF對(duì)腫瘤血管結(jié)構(gòu)展現(xiàn)出相反的效果，這表明不相交疊的作用機(jī)制。盡管為了清楚理解的目的已經(jīng)通過(guò)舉例說(shuō)明的方式較為詳細(xì)的描述了上述發(fā)明，說(shuō)明書(shū)和實(shí)施例不應(yīng)解釋為限制本發(fā)明的范圍。109權(quán)利要求1.一種分離的抗DLL4抗體，其包含(a)至少一種、兩種、三種、四種或五種高變區(qū)(HVR)序列，其選自下組(i)HVR-L1，其包含序列A1-A11，其中A1-A11是RASQDVSTAVA(SEQIDNO10)(ii)HVR-L2，其包含序列B1-B7，其中B1-B7是SASFLYS(SEQIDNO11)(iii)HVR-L3，其包含序列C1-C9，其中C1-C9是QQSYTGTVT(SEQIDNO18)(iv)HVR-H1，其包含序列D1-D10，其中D1-D10是GFTFTDNWIS(SEQIDNO1)；(v)HVR-H2，其包含序列E1-E18，其中E1-E18是GYISPNSGFTYYADSVKG(SEQIDNO8)和(vi)HVR-H3，其包含序列F1-F15，其中F1-F15是VYYCARDNFGGYFDY(SEQIDNO9)；和(b)至少一種變體HVR，其中該變體HVR序列包含SEQIDNO1-18中所述序列的至少一個(gè)殘基的修飾。2.—種分離的抗DLL4抗體，其包含(a)至少一種、兩種、三種、四種或五種高變區(qū)(HVR)序列，其選自下組(i)HVR-Ll,其包含序列Al-All,其中A1-A11是RASQDVSTAVA(SEQIDNO:IO)(ii)HVR-L2,其包含序列B1-B7，其中B1-B7是SASFLYS(SEQIDNO:11)(iii)HVR-L3,其包含序列C1-C9，其中C1-C9是QQSYNGPST(SEQIDNO:15)(iv)HVR-H1,其包含序列D1-D10，其中D1-D10是GFTFTDNWIS(SEQIDNO:1)(v)HVR-H2,其包含序列E1-E18,其中E1-E18是GVINPNSGATEYADSVKG(SEQIDNO:5)和(vi)HVR-H3,其包含序列F1-F15，其中F1-F15是VYYCARDNFGGYFDY(SEQIDNO:9);和(b)至少一種變體HVR，其中該變體HVR^列包含SEQIDNO:1-18中所述序列的至少一個(gè)殘基的修飾。3.權(quán)利要求1或2的抗體，其中HVR-L3變體包含下列位置任何組合中的l-6(1、2、3、4、5或6)處替K:91(S或W)、92(Y或F)、93(T、N或S)、94(T或G)、95(P、Q、A或T)、和/或96(P、S、A或V)。4.權(quán)利要求1或2的抗體，其中HVR-H2變體包含下列位置任何組合中的1-4(1、2、3或4)處替代50(V、L或Y)、52(N或S)、52a(P或S)、或53(N、Q、T或I)。5.—種分離的抗DLL4抗體，其包含一種、兩種、三種、四種、五種或六種HVR,其中每種HVR包含選自SEQIDNO:l-18的序列、由其組成或基本上由其組成，且其中SEQIDNO:IO對(duì)應(yīng)HVR-Ll,SEQIDNO:11對(duì)應(yīng)HVR-L2，SEQIDNO:12、13、14、15、16、17或18對(duì)應(yīng)HVR-L3，SEQIDNO:1或2對(duì)應(yīng)HVR-H1，SEQIDNO:3、4、5、6、7或8對(duì)應(yīng)HVR-H2,及SEQIDNO:9對(duì)應(yīng)HVR-H3。6.權(quán)利要求5的抗體，其中該抗體包含HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3、HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3，其中分別依次包含SEQIDNO:10、11、14、2、3和9。7.權(quán)利要求5的抗體，其中該抗體包含HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3、HVR-Hl、HVR-H2和HVR-H3，其中每個(gè)依次包含SEQIDNO:10、11、15、1、5和9。8.權(quán)利要求5的抗體，其中該抗體包含HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3、HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3,其中每個(gè)依次包含SEQIDNO:10、11、16、1、6和9。9.權(quán)利要求5的抗體，其中該抗體包含HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3、HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3，其中每個(gè)依次包含SEQIDNO:10、11、17、1、7和9。10.權(quán)利要求5的抗體，其中該抗體包含HVR-Ll、HVR-L2、HVR-L3、HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3，其中每個(gè)依次包含SEQIDNO:10、11、(18、1、8和9。11.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的抗體，其中至少一部分框架序列是人共有框架序列。12.權(quán)利要求1或2的抗體，其中所述修飾是替代、插入或刪除。13.權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的抗體，其中該抗體包含人K亞組共有框架序歹'J。14.權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的抗體，其中該抗體包含人重鏈III亞組共有框架序列。15.權(quán)利要求14的抗體，其中該抗體包含第71位、第73位或第78位中的一處或多處替代。16.權(quán)利要求15的抗體，其中所述替代是R71A、N73T或N78A中的一個(gè)或多個(gè)。17.—種多核苷酸，其編碼權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的抗體。18.—種載體，其包含權(quán)利要求17的多核苷酸。19.權(quán)利要求18的載體，其中該載體是表達(dá)載體。20.—種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求18或19的載體。21.權(quán)利要求20的宿主細(xì)胞，其中該宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞。22.權(quán)利要求20的宿主細(xì)胞，其中該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞。23.權(quán)利要求20的宿主細(xì)胞，其中該宿主細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。24.—種用于制備抗DLL4抗體的方法，所述方法包括(a)在適合的宿主細(xì)胞中表達(dá)權(quán)利要求19的載體，和(b)回收該抗體。25.—種用于制備抗DLL4免疫偶聯(lián)物的方法，所述方法包括(a)在適合的宿主細(xì)胞中表達(dá)權(quán)利要求19的載體，和(b)回收該抗體。26.權(quán)利要求24或25的方法，其中所述宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞。27.權(quán)利要求24或25的方法，其中所述宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞。28.—種用于檢測(cè)DLL4的方法，該方法包括在生物學(xué)樣品中檢測(cè)DLL4-抗DLL4抗體復(fù)合物。29.—種用于診斷與DLL4表達(dá)有關(guān)的病癥的方法，該方法包括在來(lái)自患有或懷疑患有該病癥的患者的生物學(xué)樣品中檢測(cè)DLL4-抗DLL4抗體復(fù)合物。30.權(quán)利要求28-29中任一項(xiàng)的方法，其中所述抗DLL4抗體是可檢測(cè)標(biāo)記的。31.—種組合物，其包含權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的抗DLL4抗體。32.—種組合物，其包含權(quán)利要求17-19中任一項(xiàng)的多核苷酸。33.權(quán)利要求31或32的組合物，其中該組合物還包含載體。34.—種用于治療腫瘤、癌癥或細(xì)胞增殖性病癥的方法，包括給需要此類(lèi)治療的受試者施用有效量的權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的抗體，由此治療該腫瘤、癌癥或細(xì)"包增殖性病癥。35.權(quán)利要求34的方法，其中所述腫瘤、癌癥或細(xì)胞增殖性病癥是結(jié)腸癌、肺癌或乳腺癌。36.權(quán)利要求34或35的方法，還包括施用有效量的抗血管發(fā)生劑。37.權(quán)利要求36的方法，其中所述抗血管發(fā)生劑是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的拮抗劑。38.權(quán)利要求37的方法，其中所述VEGF拮抗劑是抗VEGF抗體。39.權(quán)利要求38的方法，其中所述抗VEGF抗體是貝伐單抗。40.權(quán)利要求34-39中任一項(xiàng)的方法，還包括施用有效量的化療劑。41.一種在患有與血管發(fā)生有關(guān)的病理學(xué)疾患的受試者中增強(qiáng)抗血管發(fā)生劑功效的方法，包括在該抗血管發(fā)生劑之外給該受試者施用有效量的權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的抗體，由此提高所述抗血管發(fā)生劑的功效。42.權(quán)利要求41的方法，其中所述與血管發(fā)生有關(guān)的病理學(xué)疾患是腫瘤、癌癥和/或'細(xì)胞增殖性病癥。43.權(quán)利要求41的方法，其中所述與血管發(fā)生有關(guān)的病理學(xué)疾患是眼內(nèi)新血管疾病。全文摘要本發(fā)明提供了抗DLL4抗體、包含這些抗體的組合物、及使用這些抗體的方法。文檔編號(hào)C07K16/18GK101490084SQ200780026035公開(kāi)日2009年7月22日申請(qǐng)日期2007年6月6日優(yōu)先權(quán)日2006年6月6日發(fā)明者嚴(yán)民宏,雁吳申請(qǐng)人:健泰科生物技術(shù)公司