專利名稱：特異序列基礎(chǔ)的水通道蛋白4高效價(jià)抗體的制備及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程中的DNA重組技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及特異序列基礎(chǔ)的原核表達(dá) GST-AQP4融合蛋白的多克隆抗體及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
水通道蛋白(aquaporin，AQP)是一類廣泛存在于原核和真核生物細(xì)胞膜上，選擇性高效轉(zhuǎn)運(yùn)水分子的特異孔道，目前在哺乳類已發(fā)現(xiàn)至少12個(gè)成員。研究表明，AQP家族 在多種組織的液體轉(zhuǎn)運(yùn)生理和病理中發(fā)揮重要作用。水通道AQP4在腦的星形細(xì)胞、眼睛、 耳朵、骨骼肌、胃腔壁細(xì)胞以及腎的集合管等處高表達(dá)，并在滲透壓驅(qū)動(dòng)的跨內(nèi)皮水轉(zhuǎn)運(yùn)中 發(fā)揮重要作用。自2003年美國兩位科學(xué)家因在膜通道研究領(lǐng)域的一些開創(chuàng)性工作而獲當(dāng)年的諾 貝爾化學(xué)獎(jiǎng)以來，水通道蛋白結(jié)構(gòu)與功能的研究已成為熱點(diǎn)。對于一種新蛋白質(zhì)說來，抗體 是研究其功能最有力的工具之一。在抗原_抗體相互作用基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一系列技術(shù)， 如免疫組織化學(xué)、免疫印跡和免疫沉淀等，在蛋白質(zhì)的檢測和功能研究中都有著廣泛的應(yīng)用。水通道蛋白4作為一種跨膜的蛋白分子，其中的疏水片段是無法進(jìn)行原核表達(dá) 的，而膜外小的親水區(qū)域無抗原性或抗原性較小。現(xiàn)世面出售的AQP4抗體是以人工合成短 肽鏈作為抗原制備而成，其抗原蛋白的空間結(jié)構(gòu)較AQP4蛋白的空間結(jié)構(gòu)有很大差異。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是建立一種能夠用于AQP4的檢測的模型，為從蛋白水平深入研究 AQP4功能及相關(guān)疾病提供必要的實(shí)驗(yàn)工具。利用基因工程技術(shù)，將小鼠AQP4基因近3'端親水區(qū)克隆到原核表達(dá)載體 PGEX-4T-1中。經(jīng)酶切和序列分析后，用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，并經(jīng)異丙基-β -D-硫 代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)產(chǎn)生GST-AQP4融合蛋白。以純化的融合蛋白免疫新西蘭兔制備抗 血清。抗血清的效價(jià)及特異性采用ELISA和Western blot檢測。本發(fā)明的GST-AQP4融合蛋白是將利用特殊序列(小鼠AQP4基因近3'端親水區(qū)) 構(gòu)建GST-AQP4融合蛋白原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化BL21得到的高效表達(dá)特異性的GST-AQP4融合 蛋白，這段近3'端親水區(qū)基因核苷酸序列為781tgtcctgatg tggagctcaa acgtcgcctt841 aaggaagcct tcagcaaagc cgcgcagcag acaaaaggga gctacatgga ggtggaggac901 aaccggagcc aagtggagac ggaagacttg atcctg所表達(dá)蛋白的氨基酸序列為tkgsymev ednrsqvete dlilkpgvvh vididrgeek kgkd這種GST-AQP4融合蛋白及其多克隆抗體制備包括以下步驟第一步，克隆載體的構(gòu)建
從小鼠AQP4基因全長上應(yīng)用PCR技術(shù)以p8p64為模板，擴(kuò)增得到的目的片段與 PMD18-T載體連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化、提取等步驟得到重組質(zhì)粒后，酶切鑒定并測序。第二步，原核表達(dá)載體PGEX-4T-1的構(gòu)建將克隆質(zhì)粒和質(zhì)粒pGEX-4T-l雙酶切后，利用回收試劑盒獲得AQP4基因該區(qū)片段和載體連接。經(jīng)轉(zhuǎn)化、提取等步驟獲得重組的表達(dá)載體。酶切鑒定重組體，并且測序進(jìn)一步 確定。第三步，GST-AQP4融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化重組質(zhì)粒PGEX-4T-1/AQP1轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，利用IPTG誘導(dǎo)，GST-AQP4融合蛋 白的表達(dá)。以SDS-PAGE進(jìn)行鑒定，并優(yōu)化表達(dá)條件，進(jìn)行大量擴(kuò)增誘導(dǎo)。用超聲裂解細(xì)菌， 所獲蛋白用Glutathione-S印harose 4B柱純化，SDS-PAGE鑒定純化產(chǎn)物。第四步，兔抗AQP4抗血清的制備，即獲得該發(fā)明的多克隆抗體以純化的AQP4融合蛋白免疫雄性新西蘭大白兔，初次免疫用500yg融合蛋白，與 等體積的完全弗氏佐劑充分混勻乳化后背部皮下多點(diǎn)注射。免疫前取耳靜脈血分離血清， 作為免疫前的血清對照。2wk后進(jìn)行第1次加強(qiáng)免疫，500 μ g純化的GST-AQP4融合蛋白與 不完全弗氏佐劑等體積混勻，前后四腳掌肌肉注射。之后每隔2wk加強(qiáng)免疫1次。于末次 免疫后Iwk取耳血，用ELISA法測定抗體的效價(jià)，當(dāng)抗體效價(jià)達(dá)到1 100 000時(shí)，頸動(dòng)脈 放血，收集血清，應(yīng)用多種免疫學(xué)方法檢測其效價(jià)及特異性。我們應(yīng)用該進(jìn)行免疫組化鑒定，即取野生型小鼠腦，以AQP4敲除鼠腦做對照，做 免疫組化。將組織剪碎加適量RIPA裂解液
，充分研磨后，離心收集上清。 取等量的細(xì)胞總蛋白進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳分離，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂奶粉封 閉Ih ；與自制的I級(jí)抗體室溫反應(yīng)lh，PBS洗3次；再與HRP標(biāo)記的羊抗兔II級(jí)抗體 (Jacksonlmmunoresearch Laboratories)室溫反應(yīng) lh, PBS 洗 3 次，用 ECL 光化學(xué)試劑盒 (AmershamPhamacia)檢測信號(hào)，X光片曝光顯影。結(jié)果顯示該兔抗GST-AQP4血清可特異性 的與AQP4蛋白結(jié)合，成功對AQP4進(jìn)行了檢測圖7。利用選取的3'端親水區(qū)基因序列成功地構(gòu)建GST-AQP4融合蛋白原核表達(dá)載 體，轉(zhuǎn)化BL21后可高效表達(dá)特異性的GST-AQP4融合蛋白。以該融合蛋白免疫兔子獲得抗 GST-AQP4融合蛋白的高效價(jià)抗血清且特異性良好，克服了現(xiàn)存的以人工合成肽制備的抗體 時(shí)，其抗原空間結(jié)構(gòu)與表達(dá)蛋白差異大的缺點(diǎn)，所得到的抗體的效價(jià)和特異性都有大幅提 升?？蓱?yīng)用于對AQP4的檢測，推進(jìn)從蛋白水平AQP4功能的深入研究。


圖1為PCR擴(kuò)增出的AQP4基因近3 ‘端親水區(qū)DNA瓊脂糖凝膠電泳圖；圖2為雙酶切質(zhì)粒PGEX-4T-1瓊脂糖凝膠電泳圖；圖3為pGEX-4T-l/AQP4重組體測序結(jié)果；圖4 為純化后的 GST 及 GST-AQP4 融合蛋白 SDS-PAGE 圖，其中 1、2. GST(26KD) ；3、4. GST-AQP4 (30KD)；圖5為間接ELISA法測定抗體的效價(jià)；圖6為抗血清特異性的Western blot分析，其中1，2，4.野生型⑶1小鼠腦組織；3. buffer 對照；圖7為抗GST-AQP4血清免疫組化鑒定結(jié)果，其中左側(cè)為野生鼠的腦組織，右側(cè)為 敲除鼠的腦組織。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 抗GST-AQP4血清的在制備1. PCR-PMD18-T/AQP4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建小鼠AQP4基因全長從Genebank得到，基因序列號(hào)為NM009700。以p8p64為 模板，上游引物為5 ’ -GAATTCGACAACCGGAGCCAAGTG (含EcoRl酶切位點(diǎn))；下游引物為 5，-CTCGAGTACGGAAGACAATACCTC (含XhoI酶切位點(diǎn))。應(yīng)用PCR成功擴(kuò)增出了 AQP4基因近 3'端親水區(qū)DNA序列，長度102bp，編碼34個(gè)氨基酸圖1。擴(kuò)增得到的片段與PMD18-T 載體連接，將連接產(chǎn)物 轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌DH5 α中，在含Amp+瓊脂平板上挑選克隆，以堿 裂解法小提重組質(zhì)粒后，以EcoR I和Xhol I雙酶切鑒定。2.原核表達(dá)載體pGEX-4T-l的構(gòu)建將含有AQP4基因近3'端親水區(qū)片段的pMD18_T質(zhì)粒經(jīng)EcoR I和Xhol雙酶切 后，利用回收試劑盒獲得AQP4基因該區(qū)片段，同時(shí)用相同的酶處理質(zhì)粒PGEX-4T-圖2。 然后將回收的AQP4基因近3'端親水區(qū)片段和經(jīng)酶切的載體PGEX-4T-1在T4 DNA連接酶 作用下于16°C連接過夜。酶切鑒定重組體，并且測序進(jìn)一步確定圖3，結(jié)果顯示該AQP4 片段正確。3. GST-AQP4融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化重組質(zhì)粒PGEX-4T-1/AQP1轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，挑取單菌落接入LB/Ampr培養(yǎng)基 中，37°C振搖培養(yǎng)過夜。次日，將培養(yǎng)物按1 50的比例轉(zhuǎn)接于含Amp+的LB培養(yǎng)基中， 繼續(xù)在37°C搖床培養(yǎng)至對數(shù)生長中期。在培養(yǎng)液的A600為0. 5 0. 6時(shí)，加入IPTG至終 濃度為0. 08mmol/L,不加入IPTG者為陰性對照，置25°C繼續(xù)培養(yǎng)4 5h。離心收集菌體， 以SDS-PAGE進(jìn)行鑒定GST-AQP4融合蛋白的表達(dá)，并優(yōu)化表達(dá)條件，進(jìn)行大量擴(kuò)增誘導(dǎo)。以 5000r/min于4°C離心5min，收集菌體，用60mL冰預(yù)冷的NETN懸浮IL菌液的沉淀。用超聲 裂解細(xì)菌，再以9600rpm，于4°C離心15min，取上清，過Glutathione-S印harose 4B柱，先以 等體積洗脫緩沖液1 (含20mM谷胱甘肽、50mMTriSCl，pH = 8. 0)洗脫，收集洗脫液，再以等 體積洗脫緩沖液2 (含IOOmM谷胱甘肽)洗兩遍，收集洗脫液，SDS-PAGE鑒定純化產(chǎn)物圖 4。1、兔抗AQP4抗血清的制備及分析i.抗血清的制備以純化的AQP4融合蛋白免疫雄性新西蘭大白兔，初次免疫用500yg融合蛋白，與 等體積的完全弗氏佐劑充分混勻乳化后背部皮下多點(diǎn)注射。免疫前取耳靜脈血分離血清， 作為免疫前的血清對照。2wk后進(jìn)行第1次加強(qiáng)免疫，500 μ g純化的GST-AQP4融合蛋白與 不完全弗氏佐劑等體積混勻，前后四腳掌肌肉注射。之后每隔2wk加強(qiáng)免疫1次。于末次 免疫后Iwk取耳血，用ELISA法測定抗體的效價(jià)，當(dāng)抗體效價(jià)達(dá)到1 100 000時(shí)，頸動(dòng)脈 放血，收集血清。ii.抗血清效價(jià)的測定
用GST-AQP4融合蛋白免疫前的新西蘭大白兔血清作為對照，取末次加強(qiáng)免疫后 第7天的血清。血清先稀釋10倍再倍比稀釋后，用間接ELISA測定抗體的效價(jià)。結(jié)果顯示， 免疫前的兔血清未測出抗融合蛋白GST-AQP4的抗體，末次免疫后抗血清中抗GST-AQP4抗 體的滴度高達(dá)1 50 000以上圖5。iii抗血清特異性的Western blot分析以可溶性GST-AQP4融合蛋白作為免疫原制備的兔抗GST-AQP4血清進(jìn)行Western blot，將純化的融合蛋白GST2LZP3樣品，經(jīng)SDS-PAGE分離后再電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。 以5%脫脂奶粉封閉lh，依次滴加兔抗鼠LZP3抗血清(室溫2h、PBS洗3次)及山羊抗兔 IgG2HRP (室溫反應(yīng)lh、PBS洗滌3次)，最后加底物DAB顯色，并拍照。在Mr X 103為30處 出現(xiàn)1條特異的蛋白帶，說明抗GST-AQP4血清具有較好的特異性圖6。實(shí)施例2 抗GST-AQP4血清的應(yīng)用應(yīng)用該進(jìn)行免疫組化鑒定，即取野生型小鼠腦，以AQP4敲除鼠腦做對照，做免 疫組化。將組織剪碎加適量RIPA裂解液W. SDS, 150Mm NaCl, IOMm Tris, (pH7. 4)， 1 % Triton X-100,1% sodium deoxycho late, ImM PMSF]，充分研磨后，離心收集上清。 取等量的細(xì)胞總蛋白進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳分離，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂奶粉封 閉Ih ；與自制的I級(jí)抗體室溫反應(yīng)lh，PBS洗3次；再與HRP標(biāo)記的羊抗兔II級(jí)抗體 (Jacksonlmmunoresearch Laboratories)室溫反應(yīng) lh, PBS 洗 3 次，用 ECL 光化學(xué)試劑盒 (AmershamPhamacia)檢測信號(hào)，X光片曝光顯影，結(jié)果顯示該兔抗GST-AQP4血清可特異性 的與AQP4蛋白結(jié)合，成功對AQP4進(jìn)行了檢測圖7。
權(quán)利要求
特異序列基礎(chǔ)的原核表達(dá)GST-AQP4融合蛋白的多克隆抗體，其特征在于利用特異序列原核表達(dá)的GST-AQP4融合蛋白作為抗原免疫動(dòng)物產(chǎn)生抗血清而獲得，該抗血清中抗GST-AQP4抗體的滴度高達(dá)1∶50000，并經(jīng)過Western blot和免疫組化鑒定抗GST-AQP4血清具有較好的特異性，其中，所述的特異序列是指AQP4基因近3′端親水區(qū)的一段序列，其氨基酸序列為tkgsymev ednrsqvete dlilkpgvvh vididrgeek kgkd核苷酸序列為781 tgtcctgatg tggagctcaa acgtcgcctt841aaggaagcct tcagcaaagc cgcgcagcag acaaaaggga gctacatgga ggtggaggac901aaccggagcc aagtggagac ggaagacttg atcctg
2.如權(quán)利要求1所述的原核表達(dá)GST-AQP4融合蛋白的多克隆抗體的制備方法，其特征 在于利用GST表達(dá)系統(tǒng)獲得GST-AQP4融合蛋白，再經(jīng)免疫兔獲得抗GST-AQP4抗血清，具體 包括四步第一步，PCR-PMD18-T/AQP4重組質(zhì)粒的構(gòu)建，小鼠AQP4基因全長從Genebank得到， 基因序列號(hào)為NM009700，以p8p64為模板，上游引物為5，-GAATTCGACAACCGGAGCCAAGTG，含 EcoRl酶切位點(diǎn)；下游引物為5，-CTCGAGTACGGAAGACAATACCTC，含Xhol酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增得到 的片段與PMD18-T載體連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌DH5 a中，在含Amp+瓊脂平 板上挑選克隆，以堿裂解法小提重組質(zhì)粒后，以EcoR I和Xhol I雙酶切鑒定并測序；第二步，原核表達(dá)載體PGEX-4T-1的構(gòu)建，將含有AQP4基因近3'端親水區(qū)片段的 PMD18-T質(zhì)粒經(jīng)EcoR I和Xhol雙酶切后，利用回收試劑盒獲得AQP4基因該區(qū)片段，同時(shí)用 相同的酶處理質(zhì)粒PGEX-4T-1，然后將回收的AQP4基因近3'端親水區(qū)片段和經(jīng)酶切的載 體pGEX-4T-l在T4 DNA連接酶作用下于16°C連接過夜，酶切鑒定重組體，并且測序進(jìn)一步 確定；第三步，GST-AQP4融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化，重組質(zhì)粒PGEX-4T-1/AQP1轉(zhuǎn)化大腸桿 菌BL21，挑取單菌落接入LB/Ampr培養(yǎng)基中，37°C振搖培養(yǎng)過夜，次日，將培養(yǎng)物按1 50 的比例轉(zhuǎn)接于含Amp+的LB培養(yǎng)基中，繼續(xù)在37°C搖床培養(yǎng)至對數(shù)生長中期，在培養(yǎng)液的 A600為0. 5 0. 6時(shí)，加入IPTG至終濃度為0. 08mmol/L,不加入IPTG者為陰性對照，置 25°C繼續(xù)培養(yǎng)4 5h，離心收集菌體，以SDS-PAGE進(jìn)行鑒定GST-AQP4融合蛋白的表達(dá)， 并優(yōu)化表達(dá)條件，進(jìn)行大量擴(kuò)增誘導(dǎo)，以5000r/min于4°C離心5min，收集菌體，用60mL冰 預(yù)冷的NETN懸浮1L菌液的沉淀，用超聲裂解細(xì)菌，再以9600rpm，于4°C離心15min，取上 清，過Glutathione-S印harose 4B柱，先以等體積洗脫緩沖液1，含20mM谷胱甘肽、50mM Triscl，pH = 8. 0，洗脫，收集洗脫液，再以等體積洗脫緩沖液2，含100mM谷胱甘肽，洗兩遍， 收集洗脫液，SDS-PAGE鑒定純化產(chǎn)物；第四步，兔抗AQP4抗血清的制備及免疫學(xué)檢測，以純化的AQP4融合蛋白免疫雄性新西 蘭大白兔，初次免疫用500 yg融合蛋白，與等體積的完全弗氏佐劑充分混勻乳化后背部皮 下多點(diǎn)注射，免疫前取耳靜脈血分離血清，作為免疫前的血清對照，2wk后進(jìn)行第1次加強(qiáng) 免疫，500 y g純化的GST-AQP4融合蛋白與不完全弗氏佐劑等體積混勻，前后四腳掌肌肉注 射，之后每隔2wk加強(qiáng)免疫1次，于末次免疫后lwk取耳血，用ELISA法測定抗體的效價(jià)，當(dāng) 抗體效價(jià)達(dá)到1 100000時(shí)，頸動(dòng)脈放血，收集血清，采用間接ELISA方法測定血清抗體的效價(jià)，并采用Western blot方法分析抗AQP4血清特異性，將純化的融合蛋白GST2LZP3樣 品，經(jīng)SDS-PAGE分離后再電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，以5%脫脂奶粉封閉lh，依次滴加兔抗 鼠LZP3抗血清，室溫2h、PBS洗3次，山羊抗兔IgG2HRP，室溫反應(yīng)lh、PBS洗滌3次，最后 加底物DAB顯色，并拍照。
3.如權(quán)利要求1所述的GST-AQP4融合蛋白的原核表達(dá)的多克隆抗體在檢測水通道蛋 白4(AQP4)和深入研究水通道蛋白4(AQP4)功能中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及特異序列基礎(chǔ)的水通道蛋白4高效價(jià)抗體的制備及應(yīng)用，利用基因工程技術(shù)，將小鼠AQP4基因近3′端親水區(qū)克隆到原核表達(dá)載體中。經(jīng)酶切和序列分析后，用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并經(jīng)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)產(chǎn)生GST-AQP4融合蛋白。以純化的融合蛋白免疫新西蘭兔制備抗血清。抗血清的效價(jià)及特異性采用ELISA和Western blot檢測。構(gòu)建融合蛋白原核表達(dá)載體，可高效表達(dá)特異性的融合蛋白，獲得抗GST-AQP4融合蛋白的高效價(jià)抗血清。該抗AQP4多克隆抗體效價(jià)與特異性均較良好，適合對AQP4的檢測應(yīng)用。為從蛋白水平深入研究AQP4功能提供了必要的實(shí)驗(yàn)工具。
文檔編號(hào)C12N15/70GK101830983SQ20101016485
公開日2010年9月15日 申請日期2010年5月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月7日
發(fā)明者關(guān)新剛, 張淑芝, 李曉萌, 楊南揚(yáng), 汪小莞, 麻彤輝 申請人:東北師范大學(xué)