專利名稱：對(duì)水痘帶狀皰疹病毒具有特異性的抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從噬菌體展示文庫(kù)分離的具有特異于病毒的生物 學(xué)活性的新抗體序列。
背景技術(shù)：
噬菌體展示技術(shù)利用絲狀p藍(lán)菌體(如M13)基因組的小尺寸和 適應(yīng)性，該絲狀p藍(lán)菌體感染細(xì)菌細(xì)l包(例如大腸4干菌(￡^c/ en'c/^(3 co/O細(xì)胞)以克隆、選擇以及遺傳改造在它們的表面上表達(dá)的多 肽(抗體片段、生物活性肽、酶等)并且可以在它們與靶標(biāo)(target) 相互作用之后發(fā)揮生物學(xué)功能。
對(duì)于不同的應(yīng)用，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了用于繁殖噬菌體以及篩選測(cè)定的 多種克隆和表達(dá)策略、載體、文庫(kù)、方法，如在i侖文(Bradbury A and Marks J, 2004; Mancini et al., 2004; Conrad U and Scheller J, 2005; Hust M and Dubel S， 2005 )、以及書l務(wù)("Phage display: A Practical Approach", vol. 266， ed. Clackson and Lowman H， Oxford Univ. Press, 2004; "Phage Display: A Laboratory Manual", ed. Burton D et al" CSHL Press, 2001 )中綜述的。
噬菌體展示文庫(kù)由重組噬菌體群體構(gòu)成，其每一個(gè)代表蛋白序 列所有組成成分的單個(gè)元件。表達(dá)特定蛋白的噬菌體可以通過(guò)基于 親和性(親和力)和/或功能的迭代選擇過(guò)程("淘選(panning)") 從文庫(kù)中分離。例如，該蛋白可以是抗體片段，為可變重鏈/輕《連雜
4二聚體(或異源二聚體，heterodimers)的形式(通常稱為Fab )或 單鏈可變區(qū)片段(scFv)的形式，可以基于它們對(duì)純化抗原的親和 性或基于生物學(xué)測(cè)定中的活性進(jìn)行分離和表征。
尤其是，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了篩選過(guò)程以鑒定對(duì)病原體和生物學(xué)把標(biāo)具 有高親和性和特異性的抗體片段，有時(shí)具有與這樣的結(jié)合性能有關(guān)
的相關(guān)生物學(xué)活性。事實(shí)上，整個(gè)治療方式(稱為被動(dòng)免疫療法或
的抗原-結(jié)合特性上建立(Dunman P and Nesin M, 2003; Keller M and Stiehm E, 2000 )。 一皮動(dòng)免疫療法包括^合予個(gè)體藥物組合物，其中該 藥物組合物包括對(duì)病原性抗原(例如，毒素、人類蛋白、病毒或寄 生蟲)具有指定結(jié)合特異性的治療性抗體。
被動(dòng)免疫療法已經(jīng)引入到臨床實(shí)踐，迅速擴(kuò)展了用于治療各種 疾病(包括感染性疾病、免疫介導(dǎo)疾病和癌癥)的4幾會(huì)。這種方式 在免疫系統(tǒng)不能以阻斷和/或消除靶向分子所需的量和/或特異性產(chǎn) 生它們的患者中可以是特別有歲文的(Chatenoud L， 2005; Laffly E and Sodoyer R， 2005 )。
在可以利用治療性抗體輩巴向的病原性抗原中，感染人類細(xì)月包的 病毒是特別重要的。這樣的抗體的給予可以抑制病毒在患者體內(nèi)增 殖，并且潛在地阻斷該種群中病毒感染的暴發(fā)?？商鎿Q地，該抗體
可以向具有弱免疫系統(tǒng)的患者*會(huì)予或多或少延長(zhǎng)的時(shí)間l殳(例
如，免疫抑制、老年或移一直個(gè)體)，其對(duì)感染性疾病包4舌那些對(duì)免 疫竟?fàn)幮詡€(gè)體的1^康通常不會(huì)有嚴(yán)重和/或永久后果的疾病變4尋更
力口敏感。
水痘帶狀皰滲病毒(vzv，水痘)是導(dǎo)致免疫缺失個(gè)體中這樣 的潛在威脅生命的感染的病毒之一。VZV是一種a皰滲病毒，編碼 至少70種不同的開(kāi)方文閱讀沖匡(ORF)，它們中的大多l(xiāng)t與皰滲單純病毒密切相關(guān)(Mori I and Nishiyama Y， 2005 )。 VZV在人群中通過(guò) 直接接觸皮膚病變或呼吸分泌物中的感染性病毒而傳播，表明對(duì)于 皮膚和T細(xì)胞的特異趨向性。初次VZV感染涉及淋巴細(xì)胞，隨后 是細(xì)胞相關(guān)病毒血癥、器官中的病毒復(fù)制、以及由于繼發(fā)性病毒血 癥導(dǎo)致的彌散性皮滲。VZV感染可以通過(guò)釋放病毒體(或病毒粒子， virions)或通過(guò)細(xì)胞間傳播而擴(kuò)散，并且在感覺(jué)神經(jīng)節(jié)中建立潛i"犬 期(Arvin A， 1996; Quinlivan M and Breuer J, 2006 )。
單個(gè)VZV攻擊或種痘(或疫苗4妄種，vaccination )通常f武予纟冬 身保護(hù)。然而，VZV具有允許該病毒逃避先天和后天(獲耳又)免疫 應(yīng)答的內(nèi)在性能。VZV再感染或再激活仍然是可能的，也因?yàn)閂ZV 特異性抗體可能丟失，盡管在種痘之后具有可4全測(cè)的細(xì)月包介導(dǎo)免疫 性(Ludwig B et al" 2006 )。
對(duì)感染和種痘的免疫應(yīng)答的^/^制和效力已經(jīng)在人類和動(dòng)物才莫 型(Maple P et al.， 2006; Matsuo K et al" 2003; Kutinova L et al" 2001; Massaer M et al" 1999; Haumont M et al" 1997; Hasnie F et al" 2007 ) 或體夕卜培養(yǎng)系統(tǒng)(Fin腿R et al" 2006; Andrei G et al" 2005a )中進(jìn)
行了研究。vzv發(fā)病機(jī)理和免疫生物學(xué)可以利用體外人類皮膚或神
經(jīng)節(jié)模型在轉(zhuǎn)基因小鼠模型中進(jìn)行研究(Baiker A et al., 2004; Ku C et al.， 2005; Taylor S and Moffat J, 2005; Zerboni L et al" 2005 )。以這 種方式，已經(jīng)鑒定了細(xì)胞型特異性VZV細(xì)胞凋亡活性(Hood C et al., 2003 )以及VZV感染的細(xì)月包/病毒遞質(zhì)(或介質(zhì)，mediators) (Berarducci B et al., 2006; Chen J et al., 2004; Li Q et al.， 2007; Hambleton S et al.， 2007 )。
一種活的弱化水痘疫苗(Oka/Merck抹)是可利用的，并且推 薦用于常^見(jiàn)兒童免疫和成人中，假定其具有安全性和有效性 (Oxman M et al.， 2006; Arvin A, 1996 )。盡管VZV種痘在發(fā)達(dá)國(guó)家 工業(yè)化世界已廣泛建立并且在短/中期減少所有形式的水痘(特別是嚴(yán)重疾病)中是高度有效的，種群中的潛伏或進(jìn)化野生型病毒池表
現(xiàn)出持續(xù)的威月辦(Hambleton S and Gershon A, 2005 )。
VZV抹與VZV轉(zhuǎn)錄本(轉(zhuǎn)錄物)中的特定遺傳突變(Grose C， 2006)相關(guān)并且與三種主要的不同基因型(Norberg P et al.， 2006 ) 相關(guān)。遺傳變體(或變異體，variants)與在免疫化人類宿主中4全測(cè) 的皮滲形成VZV基因型才目關(guān)(QuinlivanMet al., 2007 )。 it匕夕卜，VZV 免疫水平在不同人群，例如在歐洲地區(qū)人群中變化相當(dāng)大(Nardone A et al., 2007 )。
帶習(xí)犬皰滲(herpes zoster或shingles )在臨床實(shí)踐中仍然經(jīng)常只見(jiàn) 察到，特別是在老年人中由于細(xì)胞介導(dǎo)免疫性的年齡相關(guān)性減弱， 或者是由于在不同年齡范圍內(nèi)的VZV再激活的危險(xiǎn)因子，并且具 有由于癌癥、免疫抑制性治療或甾類激素治療的伴發(fā)免疫缺陷。帶 狀皰滲的并發(fā)癥可以是神經(jīng)病學(xué)的(皰滲后神經(jīng)痛、腦血管炎、腦 炎、無(wú)菌性腦"莫炎、顱神經(jīng)麻痹、或腦膜腦炎)、眼^f牛的(眼部帶 狀皰?cǎi)?Herpes Zoster Ophthalmicus)、葡萄月莫炎、4見(jiàn)網(wǎng)月莫i不死、浮見(jiàn)一申 經(jīng)炎、或角膜炎)或內(nèi)臟的(肝炎、肺炎、心肌炎)。對(duì)于帶狀皰 滲的危險(xiǎn)因子變得更好理解，但它們的增加數(shù)量和在感覺(jué)神經(jīng)節(jié)和
眼表面中的VZV存留意p未著需要在成人中更廣泛的種痘以及更有
效的抗VZV治療(Dworkin R et al" 2007; Weinberg J, 2007; Liesegang T， 2004 )。
VZV感染在免疫抑制患者中是極其危險(xiǎn)的，在這樣的患者中不 建議使用疫苗。事實(shí)上，VZV在移植醫(yī)院病室中是一個(gè)極大的問(wèn)題， 在該移才直醫(yī)院病室中處于免疫抑制狀態(tài)的單個(gè)個(gè)體中的單個(gè)VZV 再激活或再感染可以感染多個(gè)患者， -使得VZV可能^f曼入多種組織， 包括脊髓或腦動(dòng)脈(Chaves Tdo S. et al" 2005; Gilden D， 2004 )。在
妊娠中，VZV感染也可以通過(guò)子宮內(nèi)佶4番或#斤生兒感染而擴(kuò)展到胎 兒，引起子宮內(nèi)死亡或先天性水痘綜合癥，伴隨嚴(yán)重皮月夫病變以及月支體和器官發(fā)育的在夾陷(Schleiss M, 2003; Sauerbrei A and Wutzler P, 2007 )。
除了種痘(其具有一些重要的禁忌癥)(Arvin A, 1996)，抗病 毒治療是可利用的(如阿昔洛韋(acyclovir)、伐昔洛韋(valaciclovir )、 泛昔洛韋(famciclovir)和溴夫定(brivudin ))。然而，除了抗藥性 VZV4朱的問(wèn)題以外，這些4匕合物也可能具有禁忌癥，例3o由于與人 體酶相互作用(Andrei G et al.， 2005b; Abdel-Haq N et al. 2006 )。其 他治療如皮質(zhì)甾類或抗驚厥藥用于提供另外的疼痛減輕，但它們的 副作用分布(adverse effect profile)限制了應(yīng)用，特別是對(duì)于皰滲 后神經(jīng)痛(Tyring S, 2007 )。因此，當(dāng)用于預(yù)防的現(xiàn)有手4殳不可用 或不再有歲丈時(shí)，需要可替4奐的方式(Hambleton S and Gershon A, 2005 )。鑒于疫苗無(wú)效和減弱的疫苗誘導(dǎo)免疫性，現(xiàn)在推薦第二疫 苗劑量(Chaves S et al., 2007 )。
為了早期鑒定VZV感染，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了多種it斷試-驗(yàn)用于在類 似患者群體、以及在老年人或暴露于VZV感染危險(xiǎn)的免疫缺失個(gè) 體中，才企測(cè)VZV特異性抗體、抗原或轉(zhuǎn)錄本(Hambleton S and Gershon A, 2005; Smith J et al., 2001 )。
VZV特異性免疫活性在關(guān)聯(lián)VZV相關(guān)眼部感染(Kezuka， T. 2004 )、血管病變(Burgoon M et al., 2003 )、或流4亍病學(xué)研究(Talukder Yetal., 2005)的血清、腦脊液或口月空液中鑒定。已經(jīng)才是出和i式馬全了 VZV暴露后預(yù)防，尤其是利用可以給予以防止感染的具有顯著抗 VZV效丫介的人類4元體純4匕制劑(或制備4勿，preparations ) ( Keller M and Stiehm E, 2000 )。已經(jīng)描述了具有高抗VZV抗體效j介的人類免 疫球蛋白的特異性可靜脈內(nèi)注射的制劑(US4717564; CDC， 2006 )。 它們的應(yīng)用(單獨(dú)或與其他化合物組合作為VZV特異性抗病毒劑 (antivirals ))已經(jīng)在移植患者、孕婦或新生嬰兒中進(jìn)行了試-驗(yàn) (Huang Y et al" 2001; Carby M et al" 2007; Koren G et al" 2002 )。
8vzv特異性抗原、vzv^f唐蛋白的變體、以及它們的免疫原表
位已經(jīng)利用不同的抗體制劑如人血清(US6960442; Fowler W et al., 1995; Kjartansdottir A et al.， 1996; WO 96/01900 )、非人多克隆血清 (US5306635; WO 92/06989)進(jìn)行了描述。針對(duì)VZV的單克隆抗 體利用人類(WO 86/02092; WO 91/16448; WO 95/04080; EP148644; Nemeckova S et al., 1996; Fo皿g S et al.， 1985; Sugano T et al.， 1987; Yokoyama T et al., 2001; Ito M et al., 1993 )或鼠類來(lái)源(EP321249; Vafai A and Yang W, 1991; Montalvo E and Grose C 1986; Forghani B et al., 1994; Grose C et al., 1983; Lloyd-Evans P and Gilmour J, 2000; Shankar V et al" 2005; Garcia-Valcarcel M et al., 1997 )的三源雜交瘤 或雜交瘤來(lái)分離和表達(dá)。重組的VZV結(jié)合和/或中和性抗體片段已
經(jīng)在噬菌體展示文庫(kù)中進(jìn)行了鑒定并且作為單鏈可變區(qū)片段
(Kausmally L et al" 2004; Drew P et al., 2001 )或Fab( Suzuki K et al., 2007; Williamson R et al.， 1993 )而表達(dá)?？筕ZV鼠類單克隆抗體已 被人源化(WO 95/31546)。
雖然疫苗和系統(tǒng)性抗病毒劑都已帶來(lái)重大改進(jìn)，^f旦是該疾病仍 持續(xù)存在。治療減少但并沒(méi)有消除可能以不可預(yù)測(cè)模式顯示的許多 VZV并發(fā)癥?？梢愿袣q支地4全測(cè)和阻斷VZV在種群中感染和繁殖 的新抗體和抗體片段的鑒定以及生產(chǎn)，對(duì)于建立這種感染性疾病的 治療和/或預(yù)防的改進(jìn)治療仍然是特別重要的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供新抗體序列，其結(jié)合并中和vzv，并且可以用于檢 測(cè)、治療、抑制、預(yù)防和/或減輕vzv感染或vzv相關(guān)疾病。
一組人類抗體序列在重組噬菌體上展示并且vzv特異性結(jié)合 活性已在嗟菌體文庫(kù)中檢測(cè)到。編碼兩個(gè)抗體片段的重鏈和輕鏈可
變區(qū)并且具有VZV中和性活性的DAN序列一皮鑒定并稱為DDF-VZV1和DDF-VZV2。確定了負(fù)責(zé)VZV特異生物學(xué)活性的相 應(yīng)蛋白序列和互^卜決定區(qū)(CDR)。
本發(fā)明的序列可以利用用來(lái)用于生產(chǎn)重組蛋白的適當(dāng)技術(shù)，用 于生產(chǎn)具有VZV特異結(jié)合性和中和性性能的重組蛋白，其為全長(zhǎng) 抗體、抗體片段形式，或功能蛋白(尤其是融合蛋白)的任何其他 形式。
在VZV感染和VZV相關(guān)疾病的管理中具有治療、預(yù)防和/或 診斷效用的組合物可以利用本發(fā)明的蛋白來(lái)制備。這樣的組合物可 以用來(lái)補(bǔ)充或代替基于抗病毒化合物和/或靜脈內(nèi)免疫3求蛋白 (IVIg )制劑的現(xiàn)有VZV治療。
本發(fā)明的另外的實(shí)施方式，包4舌分離的DNA禾口蛋白序列、載 體、重組噬菌體和宿主細(xì)^^包以及醫(yī)學(xué)方法和用途，在以下描述中才是 供。


圖1:對(duì)于表達(dá)DDF-VZV1 ( VZV陽(yáng)1 )、 DDF國(guó)VZV2 ( VZV國(guó)2 ) 的重組噬菌體制劑、或用作陰性對(duì)照的不相關(guān)人類Fab (e-137)的 VZV結(jié)合活性的特異性。該結(jié)合活性利用用于纟反涂^隻(或4反包#皮， plate coating)的指定抗原以總蛋白揭:耳又物(對(duì)于MRC-5細(xì)胞)或 純化蛋白(對(duì)于牛血清白蛋白，BSA)形式在ELISA中測(cè)量。
圖2: ( A)對(duì)于DDF-VZV1的重《連可變區(qū)的DNA (小寫字母) 和蛋白(大寫字母)序列的比對(duì)(DDF-VZV1 VH; SEQ ID NO.: 1 和2 )。予貞測(cè)的CDR ( HCDR1 、 HCDR2和HCDR3; SEQ ID NO.: 3、 4禾口 5 )力口下劃纟戔。(B )只于于DDF畫VZV1的豐至4連可變區(qū)的DNA (小 寫字母)和蛋白(大寫字母)序列的比對(duì)(DDF-VZV1 VL; SEQ ID
10NO.: 6和7 )。予貞測(cè)的CDR ( LCDR1、 LCDR2和LCDR3 )力口下劃線。
圖3: ( A)只寸于DDF-VZV2的重《連可變區(qū)的DNA (小寫字母) 和蛋白(大寫字母)序列的比對(duì)(DDF-VZV2 VH; SEQ ID NO.: 8 和9 )。預(yù)測(cè)的CDR( HCDR1 、 HCDR2和HCDR3; SEQ ID NO.: 10、 11和12)力口下劃線。(B)對(duì)于DDF-VZV2的輕4連可變區(qū)的DNA (小寫字母)和蛋白(大寫字母)序列的比對(duì)(DDF-VZV2 VL; SEQ ID NO.: 13和14 )。預(yù)測(cè)的CDR ( LCDR1 、 LCDR2和LCDR3 ) 力p下劃線。
圖4: VZV感染的MRC-5細(xì)J包并用DDF-VZV1 (A)和 DDF-VZV2 (B)染色的免疫熒光。細(xì)胞膜用白線指示而核膜用白 色虛線指示。在未感染細(xì)胞上利用這些Fab沒(méi)有獲得染色。
圖5:，于于DDF-VZV1 ( A )和DDF-VZV2 ( B )的VZV中和 活'1"生，^口在p藍(lán)菌體衣殼蛋白(phage cost proteins )上展示的部分純 化的人類重組Fab所表達(dá)的。噬斑減少的劑量響應(yīng)分析與相應(yīng)濃度 的不相關(guān)人類Fab (el37)平行實(shí)施。百分比值通過(guò)比較在沒(méi)有任 何Fab的情況下利用VZV預(yù)孵育獲得的凝:據(jù)而進(jìn)行計(jì)算。
圖6: (A)對(duì)于FLAGhis標(biāo)簽的正向連接物(pDD-FLAGhis 正向SEQIDNO:15)利用Spel和Nhel消4匕，并克隆入用于取 cp3申序列的pDD載體中，其中FLAGhis標(biāo)簽帶有在其與相應(yīng)的反 向引物(pDD-FLAGhis反向SEQ ID NO: 16 )商己對(duì)之后連續(xù)由該 寡核芬酸編碼的蛋白標(biāo)簽(FLAGhis標(biāo)簽SEQ ID NO: 17)的指 示(WO 07/007154)。 (B)含有一皮克隆入pDLacI-FLAGhis載體中 的抗體片段的重鏈(HC)和輕鏈(LC)的DNA片段的示意圖。該 HC序列被克隆入在Pe舊4言號(hào)序列(Pe舊)與FLAGhis標(biāo)簽序列 (FLAGhis )之間的框架中。該LC序列一皮克隆入帶有PelB信號(hào)序列(Pe舊)的框架中并且其表達(dá)由LacZ啟動(dòng)子(LacZ )驅(qū)動(dòng)。在 該兩個(gè)表達(dá)單元之間，才示i己基因(Zeocin; Zeo基因)和4空制LacZ 啟動(dòng)子的基因(Lacl基因)利用它們自身的啟動(dòng)子進(jìn)行克隆。編碼 cp8f的序列(cp8*)在缺乏功能啟動(dòng)子和翻譯起點(diǎn)的情況下不被轉(zhuǎn) 錄和翻譯。相關(guān)限制^f立點(diǎn)(restricyion sites )，尤其是用于克隆HC (Spel和Xhol )、 LC ( Xbal和Sacl)以及Lacl基因(Stul)的那 些被指示。利用pDLac系統(tǒng)表達(dá)DDF-VZV1的相應(yīng)Nhel-Bgll片,殳 作為SEQ ID NO.: 18 4是供。(C )利用pDLac-VZVl-FLAGhis純化 表達(dá)的DDF-VZVl-FLAGhis的考馬,斤(coomassie )染色。該圖示 出了從親和層析柱中洗脫的五個(gè)連續(xù)流分(部分，fractions )。這些 流分收集到一起，濃縮并儲(chǔ)存在-20。C以備將來(lái)4吏用。
圖7: (A)人類Fab DDF-VZV1的重《連的蛋白序列，如利用 pDLac-VZVl-FLAGhis表達(dá)的(DDF-VZV1 CHTag; SEQ ID NO.: 20 )。相應(yīng)的DNA序列作為SEQ ID NO.: 19才是供。利用pDD載體 初始克隆的該重《連的可變區(qū)(SEQIDNO.:2)加下劃線。PelB序列 包括在氨基酸1和26之間。氨基酸155-260對(duì)應(yīng)于人類Ig Y-l鏈C 區(qū)的氨基酸1-106 ( SwissProt登錄號(hào)P01857)。氨基酸262-275對(duì) 應(yīng)于FLAGhis序列。(B )人類Fab DDF-VZV1輕4連的蛋白序列， ^口矛J用pDLac-VZVl-FLAGhis表達(dá)的(DDF-VZV1 CL; SEQ ID NO.: 22)。相應(yīng)的DNA序列作為SEQIDNO.: 19^是供。利用pDD載體 初始克隆的該輕f連的可變區(qū)(SEQIDNO.:7)力卩下劃線。PelB序列 包括在氨基酸1和22之間。氨基酸129-234對(duì)應(yīng)于Ig k鏈C區(qū)的 氨基酸1-106( SwissProt登錄號(hào)P01834 )。 ( C )人類Fab DDF-VZV2 重鏈的蛋白序列，如利用pDLac-VZV2-FLAGhis表達(dá)的(DDF-VZV2 CHTag; SEQ ID NO.: 24 )。相應(yīng)的DNA序列4乍為SEQ ID NO.: 23 提供。利用pDD載體初始克隆的該重《連的可變區(qū)(SEQIDNO.:9) 加下劃線。Pe舊序列包括在氨基酸1和26之間。氨基酸152-257 只寸應(yīng)于人類Ig Y-l鏈C區(qū)的氨基酉臾1-106 (SwissProt登錄號(hào)P01857 )。氨基酸259-272對(duì)應(yīng)于FLAGhis序列。(D)人類Fab DDF國(guó)VZV2輕《連的蛋白序列，如利用pDLac畫VZV2-FLAGhis表達(dá)的 (DDF-VZV2 CL; SEQ ID NO.: 26 )。相應(yīng)的DNA序列4乍為SEQ ID NO.:25^是供。利用pDD載體初始克隆的該輕鏈的可變區(qū)(SEQ ID NO.: 14 )力口下劃線。PelB序列包括在氨基酸1和22之間。氨基酸 135-240對(duì)應(yīng)于Ig k《連C區(qū)的氨基酸1-106 ( SwissProt登錄號(hào) P01834)。
圖8: 3n利用pDLac系統(tǒng)表達(dá)和純4b的人類Fab DDF-VZVI和 DDF-VZV2的VZV中和活性。(A )每種Fab以指定濃度4吏用并且 計(jì)算噬斑減少。(B)每種Fab以指定濃度單獨(dú)使用或以包含等量的 每種Fab的Fab制劑j吏用。噬斑減少的劑量響應(yīng)分析與利用相同系 統(tǒng)(el37)產(chǎn)生的相應(yīng)濃度的不相關(guān)人類Fab平行實(shí)施。百分比數(shù) 值通過(guò)比較在沒(méi)有4壬何Fab的情況下(陰性對(duì)照)利用VZV預(yù)孵 育獲得的數(shù)據(jù)而計(jì)算-。
具體實(shí)施例方式
在WO 07/007154中描述的pDD噬菌粒和相關(guān)方法允i午融合至 兩種預(yù)定噬菌體衣殼蛋白的一種或另一種的蛋白序列的克隆、表達(dá) 和選4奪。這種方式允許選擇鑒定可以在重組噬菌體表面上差異表達(dá) 或展示的蛋白序列，因此以不同效力從噬菌體展示文庫(kù)選擇。
在本實(shí)例中，噬菌體文庫(kù)通過(guò)克隆人類重《連和輕《連免疫3求蛋白 的可變區(qū)在pDD噬菌粒中構(gòu)建。該文庫(kù)針對(duì)VZV蛋白才是取物進(jìn)行 淘選(或盤選，panned),并且對(duì)所選的克隆體隨后在基于細(xì)胞的測(cè) 定中進(jìn)4亍測(cè)試以確定呈現(xiàn)VZV中和活性的那些，如實(shí)施例中所示 出的。
13確定編碼兩種最有希望的克隆體(即DDF-VZV1 和 DDF-VZV2)的DNA序列，然后克隆入用于細(xì)菌表達(dá)的恰當(dāng)載體 中。這些Fab的VZV-中和活性已利用用于VZV感染的體外模型， 作為在重組噬菌體(純化自細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)物)表面上的兩種融合蛋 白或作為親和性純化的重組人類Fab進(jìn)4亍測(cè)試。
本發(fā)明l是供了能夠結(jié)合和中和VZV并且包4舌在Fab DDF-VZV1或DDF-VZV2中鑒定的特定CDR (互補(bǔ)決定區(qū))的新 蛋白序列。尤其是，本發(fā)明的HCDR3 (重4連可變區(qū)的CDR3 )中的 每一個(gè)(SEQ ID NO.: 5和SEQ ID NO.: 12 )分別表4i DDF畫VZV1 和DDF-VZV2的抗原結(jié)合部分。
抗體的HCDR3可以祐 〖人為表征這才羊的抗體的抗原結(jié)合部分， 該部分能夠結(jié)合抗原并因此發(fā)揮生物學(xué)活性(例如，結(jié)合和中和 VZV,如在實(shí)施例中示出的)。即使抗體的多個(gè)或所有CDR通常是 獲得完整抗原結(jié)合表面所必要的，但HCDR3是不僅相對(duì)于序列而 且相對(duì)于長(zhǎng)度在抗體之間表現(xiàn)出最高差異的CDR。事實(shí)上，HCDR3 序列和長(zhǎng)度的差異性(多樣性)是用于確定對(duì)大多數(shù)抗體的特異性 的基礎(chǔ)(Xu J and Davies M, 2000; Barrios Y et al. 2004; Bond C et al., 2003 )。
含有本發(fā)明的特異性HCDR3 (組合或不組合來(lái)自相同F(xiàn)ab的 其他CDR)作為VZV結(jié)合部分的蛋白(其中這樣的HCDR3已鑒 定)，可以在抗體蛋白框架內(nèi)產(chǎn)生(KnappikAeta1.,2000)。 CDR的 組合可以在非常短的蛋白中彼此連接，該非常短的蛋白保持原始結(jié) 合性能，甚至在與抗體結(jié)構(gòu)不相關(guān)的蛋白框架內(nèi)并且沒(méi)有破壞原始 結(jié)合活性(Ladner R, 2007; Kiss C et al" 2006 )。
在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種蛋白，包括與Fab DDF-VZV1的HCDR3具有至少90%同一'f生(或一致性，identity)的序列。連同HCDR1和HCDR2( SEQ ID NO.: 3和SEQ ID NO.: 4; 圖2A)，該HCDR3包4舌在DDF-VZVl Fab的重《連可變區(qū)中 (DDF-VZVl VH; SEQ ID NO.: 2 )。已經(jīng)確定了形成該Fab的輕4連 可變區(qū)(DDF-VZVl VL: SEQ ID NO.: 7 )，及其特定LCDR (輕4連可 變區(qū)的CDR)(圖2B)。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明才是供了包括與FabDDF-VZV2的 HCDR3具有至少90%同 一性的序列的蛋白。連同HCDR1和HCDR2 (SEQ ID NO.: 10和SEQ ID NO.: 11;圖3A )，該HCDR3包括在 DDF-VZV2的重《連可變區(qū)中(DDF國(guó)VZV2 VH; SEQ ID NO.: 9 )。已 經(jīng)確定了形成該Fab的專至t連可變區(qū)(DDF-VZVl VL; SEQ ID NO.: 14 )及其特異性LCDR (圖3B )。
如果本發(fā)明的蛋白是基于DDF-VZVl的序列，則它們應(yīng)該包 括與SEQ ID NO.: 5具有至少90%同一'1"生的序列。尤其是，它們應(yīng) 該包括與SEQ ID NO.: 2具有至少90%同一性的序列。更具體地， 這樣的蛋白還應(yīng)該包括選自由SEQ ID NO.: 3和SEQ ID NO.: 4組成 的纟且中的一個(gè)或多個(gè)序列。
可替換地，如果本發(fā)明的蛋白是基于DDF-VZV2的序列，則 它們應(yīng)該包4舌與SEQ ID NO.: 12具有至少90%同一性的序列。尤其 是，它們應(yīng)該包4舌與SEQ ID NO.: 9具有至少90%同一性的序列。 更具體;也，這才羊的蛋白還應(yīng)該包4舌選自由SEQ ID NO.: 10和SEQ ID NO.: 11《且成的組中的一個(gè)或多個(gè)序列。
本發(fā)明的其他實(shí)施方式是編碼兩種Fab的重《連和輕《連可變區(qū)的 DNA序列，尤其是那些與對(duì)于DDF-VZVl的可變區(qū)(對(duì)于重4連為 SEQ ID NO.: 1;對(duì)于輕4連的為SEQ ID NO.: 6 )和DDF-VZV2的可 變區(qū)(對(duì)于重鏈的為SEQIDNO.: 8;對(duì)于輕鏈為SEQ ID NO.: 13 ) 已尋皮克隆和確定的原始DNA序列具有至少90%同一性的序列。這些DNA序列(或所選的部分，如由圖2和圖3易于確定的編碼分 離HCDR和LCDR的那些部分)可以轉(zhuǎn)移到其4也載體中，用于在 重紐j元體的已4口形式(侈'B口，全長(zhǎng)、親和't"生成熟的(affinity-matured )、 CDR移植(CDR-grafted)、或片,炎)之一或它們乂于其I武予VZV結(jié) 合性和中和性性能的融合蛋白中表達(dá)它們。
無(wú)i侖什么地方指出同一性水平，該同一性水平應(yīng)該是在本發(fā)明 的相關(guān)序列的全長(zhǎng)上確定的。
形成DDF-VZV1或DDF-VZV2 (或所選的部分，如分離的 HCDR和LCDR )的重《連和輕《連的可變區(qū)可以包4舌在具有特定亞型 的^元體內(nèi)，尤其在全長(zhǎng)人類重紐—抗體內(nèi)。這種4元體可以包括「 DDF-VZV1或DDF-VZV2的VL和VH序列作為通過(guò)兩個(gè)輕4連和兩 個(gè)重《連形成的四聚復(fù)合體自然構(gòu)象中的輕鏈和重《連可變區(qū)。當(dāng)期望 全長(zhǎng)人類抗體時(shí)，該抗體應(yīng)該進(jìn)一步包括選自由人類IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4、 IgM、 IgA和IgE恒定區(qū)組成的組中的重《連恒定區(qū)。 例如，IgG亞型(或同種型，isotype)是幾乎所有批準(zhǔn)治療用抗體 的抗體形式(LafflyEand Sodoyer R， 2005)。然而，分離自人類IgGl 的抗原結(jié)合部分可以轉(zhuǎn)移到人類IgA序列上，并且所4尋的重紐—抗體 保持原始IgGl的活性，如最近利用能夠抑制HIV感染的抗體所示 出的(Mantis N et al.， 2007 )。
可^,才灸地，形成DDF-VZV1或DDF-VZV2 (或所選的部分， 如分離的HCDR和LCDR )的重《連和輕鏈的可變區(qū)可以包括在用于 功能抗體片段的任何其他蛋白形式中，如在文獻(xiàn)中以不同名稱如 Scfv (單鏈可變區(qū)片段)、Fab (可變重鏈/輕鏈雜二聚體)、雙特異 抗體、多聚肽體(peptabody )、 VHH (重鏈抗體的可變結(jié)構(gòu)域)、分 離的重鏈或輕鏈、雙特異性抗體、以及用于非臨床/臨床應(yīng)用的其他 改造抗體變體(Jain M et al" 2007; Laffly E and Sodoyer R, 2005 )描 述的。DDF-VZV 1或DDF-VZV2的重組變體利用以標(biāo)記Fab形式
16的pDD相容性表達(dá)載體(稱為pDLac-FLAGhis )來(lái)生產(chǎn)(圖6B是 相關(guān)DNA片,殳的示意圖；SEQ ID NO.: 18是DNA序列的一個(gè)實(shí)例， 該DNA序列是針對(duì)用于產(chǎn)生DDF-VZV1的這樣的片段)。產(chǎn)生包 括DDF-VZV1和DDF-VZV2標(biāo)i己形式的基于pDLac-FLAGhis的載 體并用于生產(chǎn)DDF-VZV 1 HCtag以及DDF-VZV 1 LC( SEQ ID NO.: 19-22;圖7A禾口 B )，或DDF-VZV2 HCtag以及DDF-VZV2 LC( SEQ ID NO.: 23-26;圖7C和D )。
另外的抗體和抗體片萃殳可以通過(guò)用于改組輕鏈的方法，利用 DDF-VZV 1或DDF-VZV2的序列來(lái)產(chǎn)生。事實(shí)上，多種不同4元體 可以產(chǎn)生并利用單個(gè)重4連可變結(jié)構(gòu)i或VH^f特定生物學(xué)活性進(jìn)4亍測(cè) 試(如DDF-VZV 1或DDF-VZV2之一 )，該單個(gè)重f連可變結(jié)構(gòu)i或 VH例如利用共同噬菌體展示(common phage display)才支術(shù)或在 WO 07/007154中描述的那些^支術(shù)與VL序列的文庫(kù)進(jìn)4亍組合。這種 方式可以允許依據(jù)親和性、穩(wěn)定性、特異性、和/或重組生產(chǎn)來(lái)確定 具有改進(jìn)性能的VH/VL組合(Ohlin M et al., 1996; Rojas G et al., 2004; S腿ki K et al., 2007 )。
此夕卜，已知的是，抗體可以在特定位置加以修飾以便4吏抗體具 有改進(jìn)的特性，尤其是用于臨床應(yīng)用(如更好的藥代動(dòng)力學(xué)分布或 對(duì)抗原更高的親和性)。這些改變可以在DDF-VZV1或DDF-VZV2 的CDR和/或框架中形成。序列可以通過(guò)采用用于合理設(shè)計(jì)抗體的 <壬<可專門4支術(shù)力o以確定，其中利用親和性成熟(affinity maturation ) 和其他方法(Kim S et al.， 2005; Jain M et al., 2007 )。
用于開(kāi)發(fā)新的生物活性肽的基于抗體的策略還表明，合成含有 L-氨基S臾和/或D-氨基酸的CDR來(lái)源肽的可行性。這些分子可以在 以更加適當(dāng)?shù)乃幚韺W(xué)學(xué)分布下保持原始活性的特定活性(Levi M et al.， 2000; Wijkhuisen A et al., 2003 )。因jt匕，本發(fā)明的每一個(gè)HCDR3 以及與它們高度相似的序列、含有它們的融合蛋白、以及來(lái)源于它們的合成月太(例,含有D誦氨基酸或?yàn)槟娣礃?gòu)象(retro-inverso conformation ))可以進(jìn)行測(cè)試并用作VZV結(jié)合蛋白。
本發(fā)明的蛋白可以作為結(jié)合并中和VZV的4元體、4元體片,殳、 生物活性肽、或融合蛋白提供。這些可替換的蛋白應(yīng)保持(如果沒(méi) 有增強(qiáng))這才羊的性能，如對(duì)于DDF-VZV1和DDF-VZV2 Fab確定 的。在融合蛋白的情況下，異源(heterologous)蛋白序列可以位于 VZV特異性部分(例如，特異性HCDR3或抗體片4殳的可變區(qū))的 N-端或C-端位置，不會(huì)影響其正確表達(dá)和生物學(xué)活性。
術(shù)語(yǔ)"異源蛋白"是指，蛋白序列不是天然存在于該VZV特 異性部分(例如，抗體片^史)的N-端或C-端位置中。編碼這種蛋 白序列的DNA序列通常通過(guò)重組DNA寺支術(shù)融合，并且包4舌編碼至 少5個(gè)氨基酸的序列。目前通常選擇這種異源序列用于對(duì)該VZV 特異性融合蛋白提供附加性能。這樣的附加性能的實(shí)例包括對(duì)于該 融合蛋白的檢測(cè)或純化、另外的結(jié)合部分或生物學(xué)配體、或翻譯后 修飾的更好手段(例如，磷酸化、糖基化、泛素化(或遍在蛋白化， ubiquitination )、 SUMO 4匕(或蘇素4匕，SUMOylation )、或內(nèi)蛋白 酵切割(endoproteolytic cleavage ))。
可替換地(或除了融合至一個(gè)或多個(gè)異源蛋白序列之外地)， 本發(fā)明的蛋白的活性可以利用軛合至不同化合物如治療劑、穩(wěn)定劑 或診斷劑來(lái)改進(jìn)。這些藥劑的實(shí)例是可以利用化學(xué)連4妄物或聚合物 結(jié)合的可檢測(cè)標(biāo)記(例如，放射性同位素、熒光化合物、毒素、金 屬原子、膠體金屬、化學(xué)發(fā)光化合物、生物發(fā)光化合物、或酶)。
本發(fā)明蛋白的vzv-特異生物學(xué)活性可以通過(guò)與化合物融合而改 進(jìn)，如在診斷或治療應(yīng)用中改變代謝和/或穩(wěn)定性的聚合物。治療活 性可以通過(guò)與另 一治療性蛋白融合而改進(jìn)，如另 一抗病毒蛋白或改 變細(xì)胞代謝和/或活性的蛋白。用于選擇和"i殳計(jì)蛋白部分、配體和適當(dāng)連接物的手,殳(means )， 以及用于構(gòu)建、純化、4企測(cè)和^吏用融合蛋白的方法和策略在文獻(xiàn) (Nilsson et al., 1997; "Applications Of Chimeric Genes And Hybrid Proteins" Methods Enzymol. Vol. 326-328, Academic Press, 2000; WO01/77137 )中提供，并且在臨床和研究實(shí)驗(yàn)室中通常是可利用 的。例如，融合蛋白可以含有由商購(gòu)抗體(包括標(biāo)簽如聚組氨酸、 FLAG、 c-Myc、或HA標(biāo)簽)識(shí)別的序列，其可以有利于該融合蛋 白的體內(nèi)和/或體外鑒定、或其純化。其他蛋白序列可以通過(guò)直4妄熒 光分析(如在綠色熒光蛋白的情況下)、或通過(guò)特定底物或酶(例 如利用蛋白水解位點(diǎn))易于鑒定。
VZV特異性抗體、抗體片段和融合蛋白的穩(wěn)定性可以利用與熟 ^口的載體蛋白如p藍(lán)菌體衣殼蛋白(cp3或cp8，分離或包4舌在重紅L嗟 菌體中)、麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)、胎牛血清白蛋白(BSA)、或 谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的融合而改進(jìn)。
本發(fā)明的蛋白也可以用于表4正在VZV外殼(envelope )上的中 和性抗原。事實(shí)上，DDF-VZV1和DDF-VZV2已凈皮初始克隆，這 是因?yàn)樗鼈冊(cè)贓LISA中與來(lái)源于VZV感染細(xì)胞系的細(xì)月包^是耳又物的 特異性結(jié)合(圖1)，并且它們中和VZV感染的能力也利用VZV參 照(或?qū)φ?，reference) 4朱通過(guò)體外中和測(cè)定來(lái)確定(圖5和圖8 )。 因此，本發(fā)明的蛋白可以用來(lái)定義與DDF-VZV1或DDF-VZV2竟 爭(zhēng)的其他VZV結(jié)合性蛋白(例如為全長(zhǎng)抗體、Fab和其他抗體片段、 生物活性肽、或融合蛋白形式)。這才羊的竟?fàn)幮缘鞍卓梢院?jiǎn)單地含 有上文限定的任何HCDR3序列，可選地連同部分或完全不同于在 原始DDF-VZV1或DDF-VZV2序列中鑒定的那些HCDR和LCDR。
這樣的竟?fàn)幮缘鞍?如對(duì)于本發(fā)明的抗體、抗體片段、生物活 性肽、或融合蛋白)可以通過(guò)展示它們與本發(fā)明的蛋白竟?fàn)幍哪芰Α?然后它們中和VZV感染的能力而進(jìn)行選擇和分離，如通過(guò)4壬何相關(guān)測(cè)定確定的，如在實(shí)施例或文獻(xiàn)中描述的。本發(fā)明的背景4支術(shù)提 供了關(guān)于用于確定類似活性的不同方式的多篇參考文獻(xiàn)。尤其是，
本發(fā)明的抗體、抗體片段、以及其他蛋白可以在用于表征vzv特
異生物學(xué)活性和只于于4元體片^殳(Kausmally L et al., 2004; Drew P et al., 2001; Suzuki K et al., 2007 )、鼠類或人類單克隆抗體(Grose C et al.， 1983; Montalvo E and Grose C, 1986; Sugano T et al" 1987; Forghani B et al" 1994; Lloyd-Evans P and Gilmour J, 2000 )、以及非 人/人類血清(Fowler W et al" 1995; Haumont M et al" 1997; Garcia-Valcarcel M et al., 1997 )的表^f立的測(cè)定中進(jìn)4亍測(cè)試。
免疫熒光研究(圖4 )表明，DDF-VZV1和DDF-VZV2識(shí)別不 同的VZV抗原，如過(guò)去對(duì)其他抗體和抗體片4殳所進(jìn)^f亍的一樣 (S畫ki K et al.， 2007; Wu L and Forghani B, 1997; Grose C et al" 1983 )。文獻(xiàn)提供了多個(gè)技術(shù)實(shí)例，利用它們可以確定VZV抗原和 由每一個(gè)Fab識(shí)別的特定表位并與過(guò)去確定的那些進(jìn)4亍比4交。例如， 利用VZV蛋白和相關(guān)截短變體或合成肽的ELISA、免疫沉淀或蛋 白質(zhì)印跡已用來(lái)確定相關(guān)表4立(Krah D， 1996, Sauerbrei A禾口 Wutzler P， 2006 )。尤其是，這樣的表位已在糖蛋白E或糖蛋白B ( Fowler W et al., 1995; Haumont M et al" 1997; Garcia-Valcarcel M et al" 1997; Kjartansdottir Aet al., 1996 )以及并唐蛋白L:灃唐蛋白H復(fù)合體(Forghani B et al" 1994; Yokoyama T et al.， 2001 ; S腿ki K et al" 2007 )中被鑒 定。
因此，對(duì)于本發(fā)明蛋白的VZV相關(guān)預(yù)防、診斷和治療用途的
更廣泛表征和確認(rèn)可以利用在文獻(xiàn)中纟皮露的用于研究vzv發(fā)病機(jī) 理和免疫生物學(xué)的體外或體內(nèi)測(cè)定(組織基或細(xì)胞基測(cè)定，在嚙齒 動(dòng)物中建立的疾病才莫式)中的一種或多種來(lái)實(shí)施，如在本發(fā)明的背
景4支術(shù)中斗既述的(Forghani B et al.， 1994; Vafai A et al.， 1991; Wu and Forghani, 1997; Fowler W et al" 1995; Maple P et al" 2006; Matsuo K et al., 2003; Kutinova L et al" 2001 ; Massaer M et al" 1999; Haumont
20M et al.， 1997; Grose C, 2006; Baiker 2004; Ku C et al., 2005; Taylor S and Moffat J., 2005; Zerboni L et al" 2005 )。
本發(fā)明的其他目的是編碼上述抗體、抗體片,殳、融合蛋白或分 離CDR中任一種的核酸。實(shí)施例提供了這樣的序列，尤其是編碼 DDF-VZVl或DDF-VZV2重《連和輕《連的全長(zhǎng)可變區(qū)(SEQ ID NO.: 1、 6、 8禾口13)。該才亥酉史應(yīng)該與SEQIDNO.: 1、 SEQ ID NO.: 6、 SEQ ID NO.: 8和/或SEQ ID NO.: 13具有至少90%的同 一'性。這才羊的序 列，尤其是在它們中與特定CDR相關(guān)的那些(參見(jiàn)圖2和圖3)可 以包括在載體和DNA表達(dá)盒(或表達(dá)框,expression cassette )中， 例如,皮可才喿作地連4妄于表達(dá)載體中的啟動(dòng)子或克隆入基于pDD的 噬菌粒，以及在任何其他噬菌粒中。因此，包括表達(dá)本發(fā)明蛋白的 噬菌粒載體的重組噬菌體(如實(shí)施例中所示)可以用作用于纟企測(cè)和 /或中和VZV感染的手^:。
當(dāng)期望全長(zhǎng)人類抗體時(shí)，表達(dá)載體應(yīng)進(jìn)一步包括選自由IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4、 IgM、 IgA和IgE恒定區(qū)組成的組中的重鏈恒 定區(qū)。編碼感興趣的重鏈和輕鏈的相關(guān)可變區(qū)的核酸序列應(yīng)該被適 當(dāng)?shù)乜寺∪胍粋€(gè)載體或不同載體的表達(dá)盒中，在這里它們被可操作 地連接至適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)序列(例如，啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄終止子)。表達(dá)盒 應(yīng)包括啟動(dòng)子、核4唐體結(jié)合位點(diǎn)(如果需要)、起始/終止密碼子、 以及前導(dǎo)/分泌序列，其可以驅(qū)動(dòng)單或雙順?lè)醋愚D(zhuǎn)錄本對(duì)期望蛋白的 表達(dá)。
上文限定為能夠結(jié)合和中和VZV的本發(fā)明的抗體、抗體片段、 HCDR、融合蛋白以及任何其他化合物可以利用用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃?主細(xì)胞的這樣的載體以及允許將它們作為重組蛋白表達(dá)的良好建 立的技術(shù)來(lái)生產(chǎn)。這些制劑應(yīng)提供足夠量的重組蛋白(從微克到毫 克范圍)以進(jìn)行更廣泛的表征和確i人用于VZV相關(guān)預(yù)防、-珍斷和 治療用途?；趐DD的噬菌粒(其中本發(fā)明的序列已借助相應(yīng)的重組噬 菌體被克隆和表征)包含可轉(zhuǎn)移(部分或全部)到載體中的DNA 序列，在這里原始Fab、或來(lái)源于它們的蛋白序列可以在宿主細(xì)胞 中作為重組蛋白凈皮適當(dāng)表達(dá)(如在利用pDLac-FLAGhis系統(tǒng)的實(shí)施 例中示出的)。這些載體應(yīng)允許該重組蛋白在轉(zhuǎn)錄起始/終止調(diào)節(jié)序 列(其一皮選擇為組成型活性或誘導(dǎo)型)的控制下在原核或真核宿主 細(xì)月包中表達(dá)。
包括本發(fā)明的核酸的宿主細(xì)月包可以是原核或真核宿主細(xì)J包，并 且應(yīng)允i午分泌期望的重組蛋白?；旧细患@樣的細(xì)月包的細(xì)月包系然 后可以被分離以提供穩(wěn)定的細(xì)胞系。用于生產(chǎn)這樣的蛋白的方法包
載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)月包，以及/人該宿主細(xì)月包i咅養(yǎng)物中回收蛋白。
這些核酸、重組噬菌體和宿主細(xì)月包可以通過(guò)采用普通重《且DNA :技術(shù)用于生產(chǎn)本發(fā)明的蛋白。簡(jiǎn)而言之，期望的DNA序列可以利 用限制酶消化噬菌粒進(jìn)行才是取，或者使用原始噬菌粒作為用于聚合 酶鏈反應(yīng)(PCR)的模板以及用于特異性地?cái)U(kuò)增重鏈和輕鏈的全長(zhǎng) 可變區(qū)或僅僅它們的部分(如HCDR3 )的PCR引物進(jìn)行擴(kuò)增。
這樣的DNA片段然后可以轉(zhuǎn)移到更適當(dāng)?shù)妮d體中，用于在原 核或真沖亥宿主細(xì)月包中的進(jìn)一步》務(wù)飾和/或表達(dá)，如在i午多書籍以及關(guān) 于如何克隆和生產(chǎn)重組蛋白的評(píng)論中描述的，包括由牛津大學(xué)出版 社出版的A Practical Approach"系列中的某些主題"("DNA Cloning 2: Expression Systems" ， 1995; "DNA Cloning 4: Mammalian Systems" ,1996; "Protein Expression" ,1999; "Protein Purification Techniques" , 2001 )。
乂于于真核宿主(例如，酵母、昆蟲或哺乳動(dòng)物細(xì)月包)，可以采 用不同的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)序列，這耳又決于宿主的特性。它們可以來(lái)源于病毒源，如&泉病毒、牛乳頭瘤病毒、猿猴病毒等，其中調(diào)節(jié)信
號(hào)與具有高表達(dá)水平的特定基因有關(guān)。實(shí)例是皰滲病毒的TK啟動(dòng)子、SV40早期啟動(dòng)子、酵母gal4基因啟動(dòng)子等?？梢赃x擇轉(zhuǎn)錄起始(transcriptional initiation)調(diào)節(jié)^f言號(hào)，其允i午瞬時(shí)(或纟且成型)
抑制和激活，并因此用于調(diào)節(jié)基因表達(dá)。在進(jìn)一步克隆步-驟期間，編碼抗體或融合蛋白的序列可以修改并再克隆入其他載體中，用于
在DNA水平的特定》務(wù)飾， <又在DNA和蛋白水平可以例如利用用于選擇DNA序列的軟件來(lái)確定，其中密碼子使用和限制位點(diǎn)對(duì)利用凈爭(zhēng)定載體和宿主細(xì)月包來(lái)克隆和表達(dá)重《且蛋白是最適當(dāng)?shù)?Rodi D etal" 2002; Grote Aet al.， 2005; Carton J et al., 2007 )。蛋白序歹'J也可以與期望的抗體形式(Scfv、 Fab、全長(zhǎng)人類抗體等)關(guān)聯(lián)，或與一個(gè)或多個(gè)內(nèi)在氨基酸的插入、耳又^或消除相關(guān)地添加。
這些4支術(shù)也可以用于抗體治療性能的進(jìn)一步結(jié)構(gòu)和功能表征和優(yōu)化(Kim S et al., 2005 )，或用于產(chǎn)生允許它們穩(wěn)定的體內(nèi)遞送的載體(Fang J et al., 2005 )。例如，重組4元體也可以通過(guò)選4奪待融合至可變區(qū)的4爭(zhēng)定Fc區(qū)(Furebring C et al., 2002; Logtenberg T,2007)、通過(guò)產(chǎn)生重組單《連抗體片,殳(Gilliland Let al., 1996)、通過(guò)融合穩(wěn)定化肽序列(WO 01/49713 )、或者通過(guò)將ii射性化學(xué)品或聚合物加入到化學(xué)ff^飾的殘基中(Chapman A et al., 1999 )而在結(jié)構(gòu)和/或活性水平上進(jìn)行修飾。
編碼展示和所選蛋白序列的DNA序列， 一旦4翁入到合適游離基因(episomal)或非同源性或同源性整合載體中，就可以通過(guò)任何合適手段(轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、軛合、原生質(zhì)體融合、電穿孔、磷酸鈣沉淀、直4妄樣史注射等)而引入到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中以轉(zhuǎn)化它們。當(dāng)選擇特定質(zhì)?；虿《据d體時(shí)要考慮的重要因素包括包含該載體的宿主細(xì)月包可以祐j只別并乂人不包含該載體的那些細(xì)月包中選擇出來(lái)的便利性；在特定宿主中期望的載體拷貝的數(shù)量；以及是否期望"穿梭(shuttle )"不同物種的宿主細(xì)月包之間的載體。
已經(jīng)通過(guò)引入的DNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞也通過(guò)引入一個(gè)或多個(gè)允i午選才奪包含表達(dá)載體的宿主細(xì)月包的標(biāo)i己物而加以選4奪。標(biāo)i己物也可以為營(yíng)養(yǎng)缺陷型宿主(auxotropic host)才是供光營(yíng)養(yǎng)、殺菌劑抗性，例如抗生素，或重金屬如銅等，并且如果需要其可以是可切割的或抑制的。可選的標(biāo)記基因可以直接連接至待表達(dá)的DNA基因序列，或通過(guò)共轉(zhuǎn)染引入到相同細(xì)胞中。另外的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)性元件也可以是最佳表達(dá)所需的。
宿主細(xì)月包可以是原核或真核的。在原核宿主細(xì)月包之中，4尤選的是枯草軒菌(及^/Z^7&)和大腸桿菌(五.co//)。在真核宿主細(xì)胞之中，優(yōu)選的是酵母、昆蟲細(xì)胞(使用基于桿狀病毒的表達(dá)系統(tǒng))、或哺乳動(dòng)物細(xì)胞如人類、猴、小鼠、昆蟲(使用基于桿狀病毒的表
達(dá)系統(tǒng))和中華倉(cāng)鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary， CHO )纟田月包，因?yàn)樗鼈儗?duì)蛋白分子4是供翻譯后^務(wù)飾，包4舌正確4斤疊或在正確部位的某些形式的糖基化。酵母細(xì)胞也可以實(shí)現(xiàn)翻譯后肽》務(wù)飾，包括糖基化。存在大量重組DNA策略，其利用強(qiáng)啟動(dòng)子序列和高拷貝數(shù)的質(zhì)粒(其可以用于在酵母中生產(chǎn)期望的蛋白)。酵母識(shí)別克隆哺乳動(dòng)物基因產(chǎn)品中的前導(dǎo)序列并分泌帶有前導(dǎo)序列的肽(即，前肽)。
可利用作為用于表達(dá)的宿主的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系在本領(lǐng)域中是已知的，并且包4舌許多可乂人美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(美國(guó)才莫式菌種收集中心，American Type Culture Collection ) ( ATCC )獲4尋的7么生化細(xì)胞系，包括但不限于中華倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、海拉細(xì)胞(Hela)、幼倉(cāng)鼠腎(BHK)纟田月包、猴腎細(xì)胞(COS)、 C127、 3T3、BHK、 HEK 293 、 Per.C6、黑色素瘤細(xì)月包和人肝細(xì)月包癌(例如Hep G2 )細(xì)胞和大量其他細(xì)胞系。在桿狀病毒系統(tǒng)中，用于桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的材沖牛是以試劑盒形式可商購(gòu)獲得的(例如，由
Invitrogen銷售的)。
對(duì)于重組多肽的長(zhǎng)期、高產(chǎn)率生產(chǎn)，優(yōu)選穩(wěn)定表達(dá)。例如，穩(wěn)定表達(dá)感興趣多肽的細(xì)胞系可以利用表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，該表達(dá)載體可以包含復(fù)制和/或內(nèi)源性表達(dá)元件的病毒起點(diǎn)以及在相同或單獨(dú)載體上的可選擇標(biāo)記基因。在引入載體之后，允許細(xì)胞在它們轉(zhuǎn)換至選4^性培養(yǎng)基之前在富集培養(yǎng)基(enriched media)中生長(zhǎng)l-2天?？蛇x4奪標(biāo)記物的目的是對(duì)選擇賦予抗性，并且其存在允許成功表達(dá)所^ 1入序列的細(xì)月包生長(zhǎng)和回收。穩(wěn)、定轉(zhuǎn)化的細(xì)月包的抗性克隆可以利用適于該細(xì)胞型的組織培養(yǎng)^支術(shù)增殖。基本上富集這才羊的細(xì)胞的細(xì)胞系然后可以分離以才是供穩(wěn)定的細(xì)胞系。宿主細(xì)月包可以基于重組蛋白的表達(dá)水平進(jìn)一步選擇。
在利用噬菌體展示技術(shù)分離的免疫球蛋白可變鏈(尤其是人類免疫球蛋白可變鏈)的情況下，重要的修飾是所選Fab或scFV轉(zhuǎn)化成具有優(yōu)選亞型和恒定區(qū)的全長(zhǎng)免疫王求蛋白。這種》務(wù)飾允i午例如產(chǎn)生由噬菌體展示文庫(kù)來(lái)源的單鏈Fv或Fab構(gòu)建的所有亞型的全長(zhǎng)人類單克隆抗體，并在哺乳動(dòng)物或昆蟲細(xì)胞中表達(dá)。如在文獻(xiàn)中廣;乏4笛述的(Persic L et al.， 1997; Guttieri M et al" 2003 )，載體斗爭(zhēng)另'J設(shè)計(jì)用于表達(dá)抗體，允許該序列融合至期望亞型(例如人類IgG )的恒定(Fc)區(qū)?？贵w或融合蛋白可以在原核有才幾體(例i口大腸才干菌；Sorensen H and Mortensen K, 2005; Venturi M et al., 2002 )、植物(MaJetal.，2005)、或真核細(xì)月包中作為重組蛋白表達(dá)，其允i午作為瞬時(shí)或穩(wěn)、定轉(zhuǎn)化細(xì)月包的高水平表達(dá)(Dinnis D and James D， 2005 )。這在抗體的表征必須利用更多要求和/或體內(nèi)測(cè)定來(lái)實(shí)施時(shí)尤其是需要的。
形式的蛋白提供了不同策略，如在論文和書籍章段中綜述的("Phage display: A Practical Approach" , vol.266, ed. Clackson andLowman H, Oxford Univ. Press, 2004; "Phage Display: A LaboratoryManual" ， ed. Burton D et al., CSHL Press, 2001; Corisdeo S and WangB, 2004; Benharl, 2001 )。
中表達(dá)時(shí)，不同載體和表達(dá)系統(tǒng)已設(shè)計(jì)用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的穩(wěn)定池(Aldrich T et al., 2003; Bianchi A and McGrew J, 2003 )。重組抗體的高 K平、伊"匕的3急定表達(dá)已纟至實(shí)王見(jiàn)(Schlatter S et al., 2005 )，也由于細(xì)胞培養(yǎng)條件的優(yōu)化(Grunberg J et al" 2003; Yoon S et al.,2004 )并通過(guò)選纟奪或改造具有更高水平纟元體生產(chǎn)和分泌的克隆體(Bohm E et al.， 2004; Butler M, 2005 )而實(shí)現(xiàn)。
上述限定為能夠結(jié)合和中和VZV的4元體、4元體片l殳、生物活
性肽、融合蛋白、以及任何其他蛋白可以利用良好建立的技術(shù)進(jìn)行純化，這些技術(shù)允許從細(xì)胞培養(yǎng)物或從合成制劑中分離非重組/重組蛋白，即涉及才是取、沉淀、層一斤、電泳等的任何傳統(tǒng)程序。用于抗
體純化的方法可以利用容納在柱中的固定化凝膠基質(zhì)(NisnevitchM and Firer M, 2001; Huse K et al" 2002; Horenstein A et al" 2003 ),并且尤其是在用于底物如蛋白A、蛋白G或合成底物的抗體的一般親和力上(Verdoliva A et al" 2002; Roque A et al" 2004 ),以及通過(guò)基于4元原或表4立的親禾口層才斤(Murray A et al., 2002; Jensen L et al.，2004)。在清洗之后，蛋白通過(guò)pH或離子強(qiáng)度的變化而從凝膠洗脫。可4#纟灸;也，可以4吏用HPLC (高效液相色i普)。該洗脫可以利用通常用于蛋白純化的水-乙腈基溶劑來(lái)實(shí)施。
上述限定為能夠結(jié)合和中和VZV的抗體、抗體片,殳、生物活性肽、融合蛋白以及任何其他化合物可以用來(lái)檢測(cè)、治療、抑制、預(yù)防和/或減輕VZV感染。為此，這樣的化合物可以用來(lái)制備診斷、治療或預(yù)防組合物用于VZV感染和VZV相關(guān)疾病的醫(yī)學(xué)管理。這些組合物可以包4舌上述基于人類DDF-VZV1和DDF-VZV2 的序列和活性的抗體、抗體片,殳、融合蛋白、CDR、以及4壬4可其他 化合物。這些組合物可以進(jìn)一步包括不同的VZV中和性抗體或抗 體片段、靜脈內(nèi)免疫球蛋白(IVIg)制劑、類固醇、和/或抗病毒化 合物。不同的VZV中和性抗體或抗體片段應(yīng)通過(guò)不同表位表征， 如已在文獻(xiàn)中描述的那些。事實(shí)上，該文獻(xiàn)示出了i午多實(shí)施例，其 中當(dāng)針對(duì)病毒或人類耙標(biāo)的兩種或更多種抗體在藥物組合物中組 合時(shí)，所得的組合物可以具有改進(jìn)的治療效力，這不是因?yàn)楹?jiǎn)單的 加和步文應(yīng)(加性#文應(yīng))而是因?yàn)樘囟ǖ膮f(xié)同效應(yīng)(Logtenberg T, 2007 )。
藥物組合物可以可選地包括任何藥用賦形劑(vehicle )或載體。 這些組合物可以進(jìn)一步包括(或者可以一起給予)任何另外的治療 劑或預(yù)防劑，如疫苗、免疫調(diào)節(jié)l爭(zhēng)月永內(nèi)免疫球蛋白制劑、類固醇、 或抗病毒化合物。文獻(xiàn)提供了作用于VZV復(fù)制的這樣的化合物的 一些實(shí)例，并且已在人類中單獨(dú)或聯(lián)合靜脈內(nèi)免疫球蛋白制劑進(jìn)行 了試驗(yàn)(Huang Y et al., 2001; Ca勿M et al" 2007; Koren G et al" 2002)。此外，最近的文獻(xiàn)才是出，人類單克隆抗體可以用來(lái)補(bǔ)充(如 果可能并代替)現(xiàn)有治療如靜脈內(nèi)免疫球蛋白制劑、類固醇、和/ 或抗病毒化合物，提供了降低這樣的藥物組合物的頻率和/或劑量的 機(jī)會(huì)(Bayry J et al., 2007 )。
包括上述任一種蛋白(例如，抗體、抗體片,史、融合蛋白、生 物活性肽)和^f壬一種核酸的組合物可以以VZV相關(guān)i貪斷、治療或 預(yù)防目的而給予個(gè)體。這些組合物可以纟會(huì)予，作為用于VZV特異 性一皮動(dòng)免疫的手段，其^是供通過(guò)靶向VZV病毒體可以抑制該病毒 在所治療患者體內(nèi)傳播，并潛在地阻斷病毒感染在該種群中爆發(fā)的 治療性化合物(尤其是治療性抗體或治療性抗體片段)。取決于特定用途，該《且合物應(yīng)向人類受治療者(是一皮vzv感
染或由于住院、免疫4中制性或化療治療或^妻觸患vzv感染個(gè)體而 被認(rèn)為處于vzv危險(xiǎn)的嬰兒、孕婦、老年個(gè)體或任何其他個(gè)體) 4是供該化合物達(dá)一個(gè)4交長(zhǎng)或4交短的時(shí)間l殳。為此，該組合物可以以 單個(gè)或多個(gè)劑量和/或利用適當(dāng)?shù)难b置給予，其中通過(guò)不同途徑肌 內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、局部、粘膜、通過(guò)霧化器、吸入器或作為滴眼 液，在非生物/生物可降解基質(zhì)才才#牛中，或利用特定藥物遞送系統(tǒng)如 微珠。
尤其是，該組合物可以允i午局部和眼部給予，其表示々I定在皮 月夫和眼中存在VZV的有用方式(Arvin A， 1996; Quinlivan M and Breuer J, 2006; Iiesegang 丁， 2004 )。 jt匕夕卜，^元體禾口^元體片l爻在局吾戸施 加到角月莫時(shí)可以是有-文的(Brereton H et al., 2005; Nwanegbo E et al., 2007 )。
藥物組合物應(yīng)向受治療者^(guò)是供治療或預(yù)防有歲文量的化合物，其 允許該化合物在足夠時(shí)間段中發(fā)揮其活性，尤其是用于局部給予， 假定在與繼發(fā)性病毒血癥相關(guān)的皮滲中存在病毒。期望的效果是通
過(guò)控制vzv感染、再激活和/或再感染，以及通過(guò)減少vzv感染的 至少一些臨床表現(xiàn)而改善患者的狀態(tài)。例如，該組合物應(yīng)該以約
0.005至約50 mg/kg/體重的有效量給予，這取決于給予途徑、給予 劑量次凄t、以及個(gè)體狀態(tài)。
在具有i貪斷用途的組合物的情況下，該化合物應(yīng)利用通常在用 于才企測(cè)生物學(xué)樣品中的病毒的臨床和研究實(shí)驗(yàn)中建立的^支術(shù)(例 如，ELISA或其他血清學(xué)測(cè)定)進(jìn)行才企測(cè)，或者當(dāng)體內(nèi)給予受治療 者時(shí)，在全合予后至少1、 2、 5、 10、 24或更多個(gè)小時(shí)4企測(cè)。VZV的 檢測(cè)可以利用本發(fā)明的蛋白來(lái)實(shí)施，代替或結(jié)合已建立用于監(jiān)控處 于免疫竟?fàn)幮院兔庖呷笔运拗鞯奈ｋU(xiǎn)人群中的慢性或急性VZV 感染的已知手,殳和禾呈序。本發(fā)明的蛋白還可以用于制備用于檢測(cè)、治療、抑制、預(yù)防和
/或減輕vzv感染、以及vzv相關(guān)疾病的組合物。這些疾病可能由
VZV感染的并發(fā)癥導(dǎo)致(Dworkin R et al.， 2007; ^Weinberg J, 2007 )。
如在背景技術(shù)中指出的，存在大量帶狀皰滲的帶狀皰療并發(fā) 癥，其具有神經(jīng)、目艮部或內(nèi)臟作用，可以具有顯著和減弱作用，如 在皰滲后一申經(jīng)痛的'l"青形中一沖羊(Oxman M et al., 2006; Liesegang T, 2004 )。此夕卜，VZV和相關(guān)并發(fā)癥的再激活也已經(jīng)在癌癥患者 (Sandherr M et al., 2006 )或受炎癥結(jié)締《且織疾病影響的患者，以 及通常在免疫抑制性治療如皮質(zhì)類固醇或化療和其他基于抗體免 疫抑制性方案的患者中發(fā)現(xiàn)。
用于治療、予貞防或i貪斷vzv或vzv相關(guān)疾病的方法可以包括
給予如上限定的蛋白或核酸。該方法可以進(jìn) 一 步包括給予不同的
VZV中和性抗體或抗體片,殳、靜脈內(nèi)免疫5求蛋白(IVIg)制劑、類
固醇和/或4元病毒4匕合物。
臨床開(kāi)發(fā)和應(yīng)用應(yīng)基于抗體藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)的表征(Lobo E et al., 2004 )、臨床前和臨床安全性凄t才居(Tabrizi M and Riskos L, 2007 )、以及符合對(duì)于治療性重組抗體的商業(yè)生產(chǎn)規(guī)模配制和分析 表4正的官方要求(Harris R et al., 2004 )。
現(xiàn)在，將借助于以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行描述，這些實(shí)施例不 應(yīng)解釋為以4壬何方式限制本發(fā)明。
實(shí)施例
實(shí)施例1: ELISA中結(jié)合VZV蛋白換_取物的人類Fab的表達(dá) 和選捧才才泮+和方法
#4居文獻(xiàn)(Burioni et al., 1998; "Phage Display: A laboratory Manual" , Burton DR et al., CSHL Press, 2001 )，編碼人類IgGl的重 鏈和輕鏈的cDNA獲自淋巴細(xì)胞，該淋巴細(xì)胞獲自VZV-血清陽(yáng)性 個(gè)體。才艮據(jù)PCT專利申請(qǐng)WO07/007154中描述的4支術(shù)，噬菌體文 庫(kù)利用與pDD載體相容的克隆盒(或框，cassette)來(lái)構(gòu)建，并且 Fab在文庫(kù)中的重組噬菌體表面上表達(dá)。
通過(guò)基于pDD的Fab文庫(kù)的淘選(或盤選，panning ) ,口陽(yáng)寸生 克隆的測(cè)序進(jìn)4亍人類Fab的選4奪，如文獻(xiàn)(Burioni R et al. 1998 )
中所描述的。
特異性Fab的CDR通過(guò)比4交預(yù)測(cè)和通過(guò)IMGT/V-QUEST (Giudicelli V et al., 2004 ) 4是供的序列比對(duì)以及含有人類抗體的蛋 白序列的其他數(shù)據(jù)庫(kù)(如由歐洲生物信息研究所提供且利用FASTA (http:〃www.ebi.ac.uk/fasta33/index.html)可4叟索的那些)來(lái)P艮定。
來(lái)《^#的入類#恥敏的蛋冷提承#的*備
細(xì)胞系MRC-5 ( ATCC登錄號(hào)CCL-171 )，其是通常用于VZV 分離和增殖的人類胚胎肺成纖維細(xì)胞細(xì)胞系，被用于制備用來(lái)淘選
噬菌體展示文庫(kù)和在ELISA中測(cè)試Fab的VZV特異性材并牛。MRC-5 細(xì)胞保持在含有失活的10%胎牛血清(FBS)、 50 (ig/ml的青霉素、 100 pg/ml《連霉素(streptomycine )和2mM L-谷氨酰胺的？文進(jìn)的^f尹 戈?duì)?Eagle) i咅養(yǎng)基中。這些細(xì)月包(VZV感染或未感染的MRC-5) 一皮刮耳又并再懸浮在 250 ml的溶解纟爰沖液(50 mM Tris-HCl pH 8.0; 150 mM NaCl; 0.02% 疊氮化鈉；0.5% Triton-X)中，在冰上聘育20分鐘，然后在4。C 下以12000 rpm離心2分鐘。所得上清液的蛋白濃度利用BCATM 蛋白測(cè)定試劑盒(Pierce) —式兩份地確定。未知樣品的蛋白濃度 參照在已知濃度的牛血清白蛋白(BSA)的連續(xù),希釋(0mg/ml二空 白-2.000 mg/m卜最大值)加以確定和報(bào)告。所有樣品的吸光度利用 設(shè)置為540 nm的分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)量。
^/^蛋^提承^^力萄逸fp五丄75^
蛋白涂4隻利用以下抗原在96孑L板上實(shí)施用VZV感染的 MRC-5人類成纖維細(xì)胞的細(xì)胞溶解產(chǎn)物(ELLEN抹；ATCC;登錄 號(hào)VR-586 );流感病毒抗原的商購(gòu)制劑(Virion Ltd.);未感染MRC-5 的細(xì)月包溶解產(chǎn)物；牛血清白蛋白(BSA)。每一個(gè)才羊品在碳J菱鹽IC 沖液中稀釋(每孔為25 jil終體積中100納克的總蛋白)并且該板 在4。C下孵育過(guò)^復(fù)。在用蒸4留水洗f條之后，該寺反在37。C下通過(guò)在 具有P/。BSA的PBS中孵育1小時(shí)而去于閉。
z使用在文獻(xiàn)中4皮露的方案，利用40 jil含有以下Fab的未稀釋 樣品來(lái)實(shí)施ELISA: DDF-VZV1、 DDF-VZV2和e137、制備的不相 關(guān)Fab ( Bugli F et al., 2001 )。該Fab在一式兩份孔中測(cè)試。在37°C 下利用每種Fab孵育1小時(shí)并利用具有0.1%吐溫-20 (Tween-20) 的PBS清洗5次之后，加入40 pi羊抗-人Fab、過(guò)氧化酶-輒合物 (Sigma; Cat no. A0293 )并在37°C下孵育1小時(shí)。3口上重復(fù)4反清洗 并通過(guò)向每個(gè)孑L中力口入40 pi的底物(TMB底物i式劑盒；Pierce) 而進(jìn)行酶促反應(yīng)。ELISA反應(yīng)在37。C下進(jìn)行15分鐘。通過(guò)加入終 止溶液(H2S04)來(lái)終止酶活性并且利用設(shè)置在450nm的分光光度 計(jì)來(lái)測(cè)量吸光度。^ f ￡丄/&4 #。哞和^y定的FW斜W
方案與在利用pDD或其他噬菌粒如pGem變體的文獻(xiàn)中描述 由々刃卩些類4以("Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Sambrook et al., Cold Spring Harbor Press, NY, 1989; Burioni R et al., 1998; Burioni R et al.， 2001 ; WO07/007154 )。
簡(jiǎn)而言之，文庫(kù)的單個(gè)大腸4干菌(Eco/O克隆在具有抗生素 并^卜充了 IPTG的200 ml超級(jí)肉湯(super broth ) ( SB; 3.5%月夷酵解 胨(細(xì)菌用胰蛋白胨)，2%酵母提取物，0.5。/。NaCl)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)， 收獲并用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)清洗。細(xì)胞溶解限于通過(guò)利用受 控月永沖在4。C下聲波降解的周質(zhì)空間。周質(zhì)揭:耳又物中的Fab通過(guò)在 4。C下在JA-10轉(zhuǎn)子中通過(guò)以12000 rpm超離心45分4中而部分純化。 產(chǎn)物利用Centricon過(guò)濾器(Centricon filters )過(guò)濾并;農(nóng)縮10次。
部分純4匕的Fab的;農(nóng)度通過(guò)利用免疫純(ImmunoPure)羊抗-人IgG [F(ab,)2](其纟吉合至'』96孑L才反(Costar; Cat no. 3690 ) 6勺表面 上)(Pierce; Cat. No. 31132)的夾心ELISA在周質(zhì)l是取物中確定。 在37。C下孵育1小時(shí)后，該4反用去離子水清洗6次并利用具有3% BSA的170 jal/孑LPBS封閉。在37°C下再孵育1小時(shí)后，向每個(gè)孔 加入在具有1% BSA的PBS中的50 fil每個(gè)Fab的連續(xù)3倍稀釋液、 或已知濃度的對(duì)照人類Fab( Cappel; Cat. No. 6001-0100 )，并在37°C 下孵育1小時(shí)。然后該^反用TPBS (具有0.05%。土溫-20的PBS )清 洗6次。然后抗體結(jié)合通過(guò)力。入50 pl的石咸性石粦酸酶專厄合的羊抗-人 抗體(Pierce; Cat. No. 31312)來(lái)確定，并在37。C下孵育1小時(shí)。 利用TPBS如上重復(fù)才反清洗，并且向每個(gè)孑L中加入100 (al對(duì)；肖基苯 基磷酸二鈉(Sigma )。 ELISA反應(yīng)進(jìn)行60分鐘并且將結(jié)果與對(duì)照 人類Fab對(duì)比i會(huì)制成圖。
結(jié)果重組噬菌體的文庫(kù)才艮據(jù)pDD #支術(shù)(WO07/007154)來(lái)產(chǎn)生并 在從用VZV臨床分離物感染的人類成纖維細(xì)胞的細(xì)胞系獲得的蛋 白提取物上進(jìn)行淘選。還與利用來(lái)自沒(méi)有感染VZV的相同細(xì)胞系 的對(duì)照蛋白拔:耳又物的相同文庫(kù)平行地實(shí)施5 4侖淘選。
通過(guò)第三輪，針對(duì)對(duì)照蛋白提取物淘選的樣品的噬菌體效價(jià)低 于104,同時(shí)針對(duì)VZV提取物淘選的樣品的噬菌體效價(jià)在第三輪高 于104,在第五l侖達(dá)到105。該值表明在它們結(jié)合VZV抗原的表面 Fab上表達(dá)的重組噬菌體中的文庫(kù)的進(jìn)步性富集。
在第五4侖淘選之后獲得的多于260個(gè)克隆在ELISA中單個(gè)測(cè) 試，并且它們中的86個(gè)被確認(rèn)為陽(yáng)性。所選克隆中HCDR3的PCR 和序列分析鑒定了表征人類Fab (現(xiàn)在稱為DDF-VZV1和 DDF-VZV2)的兩個(gè)重《連。表達(dá)DDF-VZV1或DDF-VZV2的重組 噬菌體的反應(yīng)活性針對(duì)VZV特異性蛋白提取物以及針對(duì)不相關(guān)抗 原(未感染細(xì)胞，牛血清白蛋白)進(jìn)行測(cè)試，證實(shí)了他們?cè)贓LISA 形式中的強(qiáng)結(jié)合活性(圖1 )。結(jié)合的特異性也利用流感病毒抗原(所 選Fab對(duì)其不顯示任何顯著親和力)力。以證實(shí)。
對(duì)于DDF-VZV1和DDF-VZV2，確定了這些Fab的全長(zhǎng)重《連 和輕《連可變區(qū)的DNA序列，以及相應(yīng)的CDR (圖2和圖3 )。利用 用于蛋白表達(dá)的基于大腸桿菌(Eco/O的系統(tǒng)，這些Fab還是再次 克隆入其他載體中，用于獲得進(jìn)一步測(cè)定的足夠的重組蛋白。
實(shí)施例2:在VZV感染的細(xì)JJ&^^N^上測(cè)試的DDF-VZV1和 DDF-VZV2的性肯fe
材料和方法
KZ廠#一弄^人類/^6的哞^^/，刀^/;t利用104-105 MRC-5細(xì)月包在Costar 24孔才反中進(jìn)4亍噬斑減少測(cè) 定，這些細(xì)胞在其中在37。C下孵育72小時(shí)之后通常形成匯合單層 的條件下接種到該板中。使用的VZV病毒4朱是臨床分離物。
Fab如實(shí)施例1中指出的那樣部分純化并以具有相同體積的懸 浮在維持i咅養(yǎng)基(maintenance medium )的無(wú)VZV細(xì)月包原'液(ELLEN 抹；感染0.01復(fù)數(shù)(或多重性，multiplicity))的各種濃度(0.01、 0.1、 1、 10和50 pg/ml)混合。在沒(méi)有Fab (空白對(duì)照)或存在對(duì) 人類丙肝病毒特異的不相關(guān)Fab ( el37; Bugli F et al., 2001 )的情 況下，對(duì)照由相同體積的維持培養(yǎng)基和病毒構(gòu)成。
在37°C下孵育1小時(shí)之后，將250 jal的病毒片段Fab混合物 或?qū)φ栈旌衔锝臃N到孔中(一式兩4分)并從其中回收培養(yǎng)基。板在 37°C下孵育2小時(shí)以允許吸附未中和的病毒。移出培菌液(或接種 物，inocula)并加入1.5ml的維持培養(yǎng)基。在細(xì)l包培養(yǎng)條件下孵育 1周之后，用PBS清洗細(xì)胞，利用乙醇在室溫下固定10分鐘并用 1%結(jié)晶紫溶液染色10分鐘。用蒸餾水清洗才反三次并計(jì)lt溶菌斑。 每一個(gè)Fab的中和能力通過(guò)計(jì)凄t單個(gè)溶菌斑和計(jì)算與對(duì)照才羊品相比 病毒扭王計(jì)lt減少的百分lt而確定。
每一個(gè)Fab的中和能力通過(guò)借助于焚光顯樣"竟(Olympus)計(jì) 數(shù)單個(gè)熒光細(xì)胞，以及計(jì)算與對(duì)照樣品相比VZV陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量減 少的百分凄t來(lái)確定。
名建處^為Vf
MRC-5細(xì)胞在含有無(wú)菌玻璃蓋玻片的Costar 24-孔板中進(jìn)^亍培 養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)物以單層匯合(通常在37。C下孵育7天后形成) 時(shí)，細(xì)胞用病毒-Fab混合物或?qū)φ栈旌衔锔腥救缦?。移出i咅養(yǎng)基， 并利用VZV Ellen參照4朱以高感染復(fù)數(shù)對(duì)細(xì)胞單層進(jìn)行感染(250ial/孔；感染0.1-1的復(fù)凄t),用指定濃度的半純化Fab預(yù)先孵育，在 37°C下孵育1小時(shí)。在沒(méi)有Fab (空白對(duì)照)或存在只于人類丙肝病 毒特異性的不相關(guān)Fab (e8)的情況下，對(duì)照由等體積的維持培養(yǎng) 基和病毒構(gòu)成。在37°C下孵育^反2小時(shí)以允許吸收未中和的病毒。 移出i備菌液并向每個(gè)孑L中》文入1.5ml的具有2% FBS的MEM。
在VZV感染后72小時(shí)進(jìn)行免疫熒光測(cè)定。在移出培養(yǎng)基后， 細(xì)月包單層用PBS清洗一次，并在室溫下在,令曱醇-丙酮;容液(1:2比 例；保存在-20。C下)固定10分鐘。固定的細(xì)胞利用DDF-VZV1 或DDF隱VZV2的酉己制4勿4乍為#刀;欠4元體(或一#元，primary antibody ) 在潮濕環(huán)境中在37。C下孵育30分鐘，用PBS清洗，最后用抗-人 類IgG Fab特異性FITC-軛合物(Sigma )在潮濕環(huán)境中在37°C下 孵育30分鐘。作為對(duì)照，細(xì)胞〗叉利用二次FITC標(biāo)記的抗體制備， 其中商購(gòu)抗-VZV抗體4要照制造商的i兌明書4吏用(Argene; Cat. No. 11-017)。另夕卜，用巨細(xì)月包病毒感染的MRC-5細(xì)月包利用相同的 DDF-VZV1或DDF-VZV2的制劑作為初次抗體進(jìn)4亍測(cè)試。載3皮片 用伊文思藍(lán)對(duì)比染色，用甘油纟爰沖液固定，最后通過(guò)熒光顯孩吏4竟 (Olympus)進(jìn)行觀察。
結(jié)果
對(duì)于DDF-VZV1和DDF-VZV2兩者的中和和結(jié)合活性的進(jìn)一 步分4斤通過(guò)利用部分純4匕的Fab制劑來(lái)進(jìn)4亍。
相比于表現(xiàn)出在感染細(xì)月包中的核染色的商業(yè)鼠類單克隆抗體， 在免疫熒光中，DDF-VZV1 4朱更強(qiáng)烈地染色在核(周)區(qū)域中的 VZV感染細(xì)胞，在這里組裝VZV病毒體。DDF-VZV2抹更強(qiáng)烈地 染色月包質(zhì)區(qū)中的VZV感染細(xì)月包(圖4)。在沒(méi)有初次4元體或利用 DDF-VZV1和DDF-VZV2情況下在纟殳有感染或感染巨細(xì)月包病毒的 MRC-5細(xì)力包上沒(méi)有獲4尋染色。這些凝:才居還通過(guò)在由用VZV感染的個(gè)體皮膚獲得的細(xì)胞(其已經(jīng);故短暫培養(yǎng)然后在免疫熒光中進(jìn)行觀 察)上實(shí)施的免疫熒光而確i人。
p藍(lán)斑減少的凄t才居表明，當(dāng)用VZV預(yù)先孵育時(shí)，DDF-VZV1和 DDF-VZV2被賦予強(qiáng)的中和活性。事實(shí)上，當(dāng)相比于對(duì)照(沒(méi)有 Fab或有不相關(guān)Fab的VZV )時(shí)，這些Fab的加入以劑量依賴性方 式?jīng)Q定p藍(lán)扭王形成的減少(圖5)。
實(shí)施例3:利用pDD-相^l'l!i^Ji載體來(lái)產(chǎn)生和確i人DDF-VZVl 和DDF-VZV2
才才一+禾口方法
^Z)丄ac-i^JG/^我雄的設(shè)##。^7建
含有DDb盒(其中Zeocine基因用作標(biāo)記基因(WO 07/007154 )) 的pDD載體已通過(guò)用含有兩個(gè)標(biāo)簽和終止密碼子的Nhel-Spel合成 連接物代替包括0口3*序列的5^/-A^e/片4爻進(jìn)行修飾。這樣的連接 物通過(guò)退火兩個(gè)寡核香酸(SEQ ID NO:15和16)產(chǎn)生。所得的雙 鏈DNA分子用S/7e/和A^e/進(jìn)行消化并制備用于克隆到相應(yīng)線性化 pDD載體中的步驟。最后的載體通過(guò)限制和序列分析進(jìn)行表征以便 確i人兩個(gè)標(biāo)簽序列的框內(nèi)插入。LacI基因/人稱為pET28的商購(gòu)質(zhì)粒 (Invitrogen )進(jìn)行PCT擴(kuò)增，然后插入到Zeocin基因與驅(qū)動(dòng)待融 合至FLAGhis標(biāo)簽的蛋白表達(dá)的LacZ啟動(dòng)子之間的Stul位點(diǎn)中。
利用含有DNA沖莫板(20-30 ng)、商購(gòu)PCR緩沖液(lx; Invitrogen )、引物(0,2 (iM )、 dNTP ( 0.25 mM )、 Taq DNA聚合酶 (0.25單4立；Invitrogen )以及 jc (至50 pi的纟冬體禾口、)的;昆合4勿來(lái) 進(jìn)4亍PCR反應(yīng)。反應(yīng)在熱循環(huán)4義(Perkin-Elmer)中進(jìn)4亍如下5 分4中94°C， 30個(gè)4盾環(huán)的94。C 30秒、50-55。C 30秒、72°C 1分鐘。^f立點(diǎn)定向突變(或定點(diǎn)突變，site directed mutagenesis) PCR利用 Pfti融合Taq聚合酶(Stratagene )如上所述在相同的擴(kuò)增條件下進(jìn) 行。用限制性酶對(duì)DNA的消化4要照制造商的i兌明書實(shí)施(New England Biolabs )。細(xì)菌p藍(lán)菌體T4-DNA連4妄酶(Boehringer )用于 使所制得的DNA片段連接到適當(dāng)?shù)妮d體中。載體:插入DNA的摩 爾比為1:3并且DNA的總濃度為約50 ng。連4妄反應(yīng)在20 jxl中進(jìn) 4亍如下DNA (50 ng),連4妄纟爰沖液(lx )， 10 mM ATP( 1 |il )， T4 DNA 連_|妻酶(4單位)以及水(直至20 fil )。 T4連接反應(yīng)在15。C下實(shí) 施過(guò)夜。TG1或XL-1藍(lán)色大腸桿菌竟?fàn)幮约?xì)胞利用CaCl2方案制備 并用包括pDLac-FLAGhis載體的連接混合物轉(zhuǎn)化。
編碼DDF-VZV1和DDF-VZV2的重《連和輕《連的序列利用適當(dāng) 的限制^立點(diǎn)克隆入 pDLac-FLAGhis 中。最纟冬載體 (pDLac-VZVl-FLAGhis和pDLac畫VZV2畫FLAGhis )通過(guò)限制和序 列分析進(jìn)行表征以-使確認(rèn)兩個(gè)抗體序列的框內(nèi)插入(或符合讀框的 才翁入,in frame insertion )。
大腸桿菌(E.coli ) XL-1 藍(lán)是待用作對(duì)照的轉(zhuǎn)化 pDLac畫VZVl-FLAGhis、 pDLac-VZV2畫FLAGhis 、或表達(dá)e509的 pDLac-FLAGhis變體、HCV特異性Fab ( Bugli et al.， 2001 )。
所得^^朱用于在細(xì)菌培養(yǎng)物中生產(chǎn)Fab。為此，將由轉(zhuǎn)化獲得的 單個(gè)菌落接種到10 ml的含有四環(huán)素(10 jig/ml)、氨千西林(100 jug/ml)禾口十專萊審素(zeocin) (50 pg/ml)的SBi咅養(yǎng)基中。 <吏纟田菌 在37°C下生長(zhǎng)12小時(shí)。在該孵育時(shí)間之后，將500jal它們稀釋在 100 mL的補(bǔ)充了相同抗生素的SB中并4吏其生長(zhǎng)6-8小時(shí)直至它們 達(dá)到0.6 OD。加入異丙基-|3 -D-石克代-半乳糖普(IPTG )至1 mM的 終濃度，并將細(xì)胞在30。C下在旋轉(zhuǎn)搖床中孵育另外的14小時(shí)。通過(guò)以5000 g離心20分鐘來(lái)收獲細(xì)菌，再懸浮在1 mL的磷酸鹽緩沖 鹽水(PBS )中，并通過(guò)冷凍-解凍(或凍融)程序(在-80。C和37°C 下的三個(gè)步驟)溶解。細(xì)胞石爭(zhēng)片通過(guò)在室溫下以15000 g在離心沖幾 (microfuge )中離心5分4中而移出。
上清液用于利用抗-Fab和抗-His抗體4全測(cè)的蛋白質(zhì)印跡分析， 以便;險(xiǎn)測(cè)Fab表達(dá)。進(jìn)行SDS-PAGE，加載有或沒(méi)有|3-巰基乙醇的 樣品(還原和非還原條件下)，然后以350mA實(shí)施2小時(shí)印跡；硝 基纖維素紙首先用麗春鄉(xiāng)工(Ponceaus Red)染色以確i人出現(xiàn)的印跡， 然后利用10。/o牛奶/PBS/吐溫0.1% (封閉溶液)4吏其在4。C下攪拌 過(guò)^_。在用PBS/吐溫0.1%清洗一次之后，硝基纖維素利用-束才艮過(guò) 氧4b物酶(HRP) 4厄合的抗-Fab抗體(Sigma)或利用HRP庫(kù)厄合的 抗-His標(biāo)簽抗體(Roche)在室溫下在攪拌下孵育1小時(shí)。在用PBS/ 吐溫0.1 %清洗三次之后，力口入SuperSignal West Pico 4匕學(xué)發(fā)光底物 (Pierce )并分別對(duì)膜顯影30秒、1分鐘和5分鐘。
將用抗-Fab 4企測(cè)的〗言號(hào)與抗-His HRP-扼合的4企測(cè)進(jìn)4亍比4交。它 們兩者顯示 60 kDa的大條帶，只于應(yīng)于天然形式的Fab片|殳(當(dāng)'澄 清細(xì)胞提取物利用非還原條件而在凝膠中運(yùn)行時(shí))。當(dāng)利用還原條 件4吏相同的樣品經(jīng)受SDS-PAGE時(shí)，如果4吏用抗-His抗體^f義為重《連 ( 25kDa)。利用抗-Fab的4企測(cè)表明存在由于未凈皮標(biāo)記而不能纟企測(cè) 的輕鏈。
對(duì)于FLAGhis標(biāo)記的Fab的較大規(guī)模生產(chǎn)，含有四環(huán)素(10 (ig/ml)、氨千西林(100 (ag/ml)和博萊霉素(zeocin ) (50 jag/ml) 的超級(jí)肉湯的一升等分試樣利用用特異性pDLac-FLAGhis載體轉(zhuǎn) 化的一個(gè)細(xì)菌菌落進(jìn)行接種，并在旋轉(zhuǎn)搖床中在37。C下生長(zhǎng)7h， 如所述利用IPTG誘導(dǎo)并在30。C下生長(zhǎng)過(guò)^復(fù)。細(xì)胞通過(guò)離心收獲， 利用25mL的PBS再懸浮并聲波降解。細(xì)胞碎片通過(guò)離心(15000 g， 50分鐘)去除，并通過(guò)IMAC對(duì)0.22 pm過(guò)濾的上清液進(jìn)4亍純化。標(biāo)準(zhǔn)Qiagen純化方案如下將NiNTA樹脂(Qiagen )用結(jié)合 緩沖溶液(磷酸鹽纟爰沖液，10mM咪峻)平4軒，然后4吏過(guò)濾的上清 液與該樹脂(300laL樹脂/100mL培養(yǎng)物)混合并在4°C下在攪拌 下留置1小時(shí)。該溶液以400 g離心5分鐘以回收連接至該樹脂的 Fab片段并收集流出物。樹脂用5倍體積的結(jié)合緩沖液10 mM咪唑 清洗以去除非特異性結(jié)合。His-Flag Fab片段用3倍體積洗脫緩沖 液(石粦酸鹽纟爰沖液，500 mM NaCl, 500 mM 。米峻)進(jìn)4亍洗脫。洗 脫的等分試樣通過(guò)SDS/12.5。/。聚丙烯酰胺凝力交電泳進(jìn)行分析，并利 用考馬斯亮藍(lán)染色和蛋白質(zhì)印跡進(jìn)行才企測(cè)。
結(jié)果
DDF-VZV1和DDF-VZV2的活性已經(jīng)作為部分純4b的Fab和 重組噬菌體進(jìn)行了初步測(cè)試。進(jìn)一步的確認(rèn)需要利用適當(dāng)?shù)募?xì)菌表 達(dá)系統(tǒng)測(cè)試以純化重組蛋白形式的這樣的抗體片段。
帶有感興趣Fab的噬菌粒通常轉(zhuǎn)移到用于生產(chǎn)可溶性分子的合 適表達(dá)載體和/或適當(dāng)?shù)募?xì)菌抹(例如，琥珀非抑制劑(amber non-suppressor)中。在避免這才羊的專毛時(shí)分子克隆步驟的情況下，更 有效的方式是產(chǎn)生一種具有與原始pDD載體中的那些相容的限制 位點(diǎn)的表達(dá)載體，其中原始pDD載體用于鑒定這樣的Fab。此夕卜， 標(biāo)簽序列的存在允i午更容易;也純化和;險(xiǎn)測(cè)Fab。
i殳計(jì)并構(gòu)建這樣的表達(dá)載體，稱為pDLac-FLAGhis。其基于 pDD載體，其中用于cp3W々編碼序列^L編碼兩種蛋白標(biāo)簽(FLAG 肽，包含8個(gè)氨基酸和6-組氨酸標(biāo)簽)的序列代替，隨后是終止密 碼子(圖6A)。組氨酸標(biāo)簽使Fab可以通過(guò)親和層析進(jìn)行純化，例 ^口利用IMAC (固定4匕金屬親詳口層才斤，immobilization metal affinity chromatography )純4b系統(tǒng)。FLAG標(biāo)簽在才企測(cè)測(cè)定(例如ELISA ) 中可以是非常有用的。其中這兩個(gè)標(biāo)簽已被克隆和融合至重組蛋白的載體、以及用于斥企測(cè)或純^匕FLAGhis才示i己的蛋白的手革殳已經(jīng)描述 在文獻(xiàn)中(Pagny S et al" 2000; Koivunen P et al" 2004; Komatsu M et al.， 2004 )。
已經(jīng)利用pDD噬菌粒初始鑒定和表征的Fab(或任何其他蛋白 序歹'J )可以利用DD盒才是取，該DD盒然后定向地克隆入 pDLac-FLAGhis載體中。以這種方式，原始融合至衣殼蛋白的序列 現(xiàn)在,皮克隆入在C-端具有FLAG標(biāo)簽和聚組氨酸標(biāo)簽的才匡架中。所 得載體含有在DD盒內(nèi)的原始標(biāo)記基因(例如Zeocin基因)，允許 選捧含有期望插入物的載體。作為用于^空制;f寺利用pDLac-FLAGhi 載體中的LacZ啟動(dòng)子表達(dá)的蛋白的轉(zhuǎn)錄的手段，已將LacI基因插 入到原始DD盒中(圖6B )。
這種克隆策略提供兩個(gè)優(yōu)點(diǎn)。第一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是增大原始DD盒中 的兩個(gè)LacZ啟動(dòng)子區(qū)之間的空間，避免可能的同源性重組。第二 個(gè)優(yōu)點(diǎn)是從Lacl基因編碼的阻遏蛋白，已知能夠下調(diào)表達(dá)系統(tǒng)阻斷 其結(jié)合至LacZ啟動(dòng)子的操縱子區(qū)。然后利用適當(dāng)濃度的IPTG和/ 或葡萄糖調(diào)節(jié)誘導(dǎo)。在誘導(dǎo)之后，在LacZ啟動(dòng)子控制下克隆的序 列/PelB信號(hào)序列均被表達(dá)并耙向周質(zhì)，在這里pe舊序列隨后被酶 信號(hào)肽酶切割。在周質(zhì)內(nèi)，適當(dāng)?shù)难趸瘲l件允許在重組蛋白中形成 二硫鍵和正確的蛋白折疊(例如組裝到異質(zhì)二聚體蛋白中的Fab的 輕鏈和重鏈)。FlAGhis標(biāo)記的蛋白可以通過(guò)洗脫和測(cè)試用于親和層 析的柱子的流分而純化至同質(zhì)性(圖6B)。然后，這種蛋白可以在 利用例如商購(gòu)抗-FLAG單克隆抗體(可獲自Sigma)的蛋白質(zhì)印跡 或免疫熒光中鑒定。
利用這種方式，生產(chǎn)DDF-VZV1和DDF-VZV2的FLAGhis標(biāo) 記形式(圖7)以及對(duì)照Fab，并在上述測(cè)定中進(jìn)行測(cè)試。所選Fab 的這些重組變體i正實(shí)了關(guān)于VZV中和活性的原始7見(jiàn)察結(jié)果，表明 IC50為約2 (ig/ml (圖8A )。然而，當(dāng)兩種Fab組合到單個(gè)制劑中時(shí)，這種制劑的VZV中和活性導(dǎo)致優(yōu)異于含有相同量的單個(gè)Fab 的制劑。事實(shí)上，當(dāng)Fab濃度從1 [xg/ml升至2嗎/ml時(shí)，如果含有 單個(gè)Fab的制劑增加其活性10-15%，則含有1 jxg/ml的DDF-VZV1 和1 (ig/ml的DDF-VZV2的制劑具有顯著更高的VZV中和活性， 其中IC50值低于2嗎/ml (圖8B)。這種效應(yīng)，可能由于由兩種Fab 識(shí)別的不同VZV特異性表位(參見(jiàn)圖4),表明含有DDF-VZV1和 DDF-VZV2 (或具有類似性能的兩種抗體或抗體片段)的藥物組合 物可以4是供針對(duì)VZV感染和VZV相關(guān)疾病的更好治療或予貞防作 用。
這里才是供的實(shí)-險(xiǎn)證據(jù)4吏得DDF-VZV1和DDF-VZV2 (或基于 它們的特異性HCDR3并表現(xiàn)出類似性能的可替換蛋白序列)成為 用于涉及VZV感染和VZV相關(guān)疾病的it斷、治療或預(yù)防應(yīng)用的候 選化合物。73: 313-21.Aldrich T et al" (2003). Biotechnol Prog. 19: 1433-8.Andrei G et al., (2005a). Antimicrob Agents Chemother. 49: 4671-80.Andrei G et al., (2005b). Antimicrob Agents Chemother. 49: 1081-6.Arvin A (1996). Clin Microbiol Rev. 9: 361-81.Baiker A et al., (2004). Proc Natl Acad Sci U S A. 101: 10792-7.Barrios Y et al" (2004). J Mol Recognit. 17,:332-8.Bayry J et al" (2007). Nat Clin Pract Neurology. 3:120-1.Benhar I, (2001). Biotechol Adv. 19: 1-33.Berarducci B et al" (2006). J Virol 80: 9481-96.Bianchi A and McGrew J, (2003). Biotechnol Bioeng. 84 : 439-44.Bohm E et al" (2004). Biotechnol Bioeng. 88: 699-706.Bond C et al., (2003). J Mol Biol. 332: 643-55.Bradbury A and Marks J (2004). J Imimmol Methods. 290: 29-49.Brereton H et al., (2005). Br J Ophthalmol. 89: 1205-9.Bugli F et al., (2001). J. 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1.一種蛋白，包括與SEQ ID NO.5具有至少90％同一性的序列。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白，其中，所述蛋白包括與SEQ ID NO.: 2具有至少90%同一'f生的序列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的蛋白，其中，所述蛋白進(jìn)一步包括 與SEQ ID NO.: 7具有至少90%同一性的序列。
4. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的蛋白，其中，所述蛋白是抗 體、抗體片,殳、生物活性肽、或融合蛋白。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的蛋白，其中，所述抗體片段是可變重鏈 /輕鏈異質(zhì)二聚體、或單鏈可變區(qū)片段。
6. 根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的蛋白，其中，所述蛋白結(jié)合并中 和水痘帶狀皰滲病毒(VZV)。
7. —種編碼前述斥又利要求中4壬一項(xiàng)所述的蛋白的核酸分子。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的核酸分子，其中，所述核酸與SEQ ID NO.: 1具有至少90%的同一'I"生。
9. 一種載體，包括根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的核酸。
10. —種重組噬菌體、 一種原核宿主細(xì)胞、或一種真核宿主細(xì)月包， 包括根據(jù)權(quán)利要求7-8中任一項(xiàng)所述的核酸。
11. 根據(jù)權(quán)利要求7至9中任一項(xiàng)所述的核酸或者根據(jù)權(quán)利要求 10所述的重組噬菌體或宿主細(xì)胞在生產(chǎn)根據(jù)權(quán)利要求1至6 中4壬一項(xiàng)所述的蛋白中的應(yīng)用。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的蛋白在制備用于檢測(cè)、治 療、抑制、預(yù)防和/或減輕VZV感染或VZV相關(guān)疾病的組合 物中的應(yīng)用。
13. —種治療、預(yù)防或診斷組合物，包括根據(jù)權(quán)利要求1至6中任 一項(xiàng)所述的蛋白。
14. 才艮據(jù)^5l利要求13所述的組合物，其中，所述組合物用于眼部 或局部給予。
15. 根據(jù)權(quán)利要求13或14所述的組合物，進(jìn)一步包括不同的VZV-中和抗體、VZV-中和抗體片段、靜脈內(nèi)免疫球蛋白制劑、類 固醇、和/或4元病毒4匕合物。
全文摘要
本發(fā)明提供結(jié)合水痘帶狀皰疹病毒(VZV)并中和VZV感染的新抗體序列。該新序列可以被用于VZV感染的醫(yī)學(xué)管理，尤其用于檢測(cè)該病毒或用于制備在預(yù)防性或治療性處理VZV感染中使用的藥物組合物。
文檔編號(hào)C07K16/08GK101663318SQ200880011074
公開(kāi)日2010年3月3日 申請(qǐng)日期2008年2月6日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月6日
發(fā)明者羅伯托·布廖尼, 馬西莫·克萊門蒂 申請(qǐng)人:里博瓦克斯生物工藝有限公司