專利名稱：：用于增加宿主細胞中重組蛋白表達的重組表達載體元件(reves)的制作方法用于增加宿主細胞中重組蛋白表達的重組表達載體元件(REVES)相關申請的交叉參考本申請要求于2007年3月30日提交的美國臨時申請第60/921,141號的優(yōu)先權。發(fā)明背景使用核酸載體分子用于在不同和廣泛種類的真核或原核宿主細胞內(nèi)表達重組蛋白的多種系統(tǒng)是可利用的。使用何種載體/宿主細胞對的決定通常視何種系統(tǒng)提供呈最優(yōu)選適于其所欲用途的形式的所要重組基因產(chǎn)物的最高產(chǎn)率而定。例如，如果諸如糖基化作用的翻譯后修飾對所要重組蛋白的需要(例如，就抗原性、活性、構象等等而言)是關鍵的，則真核宿主細胞系統(tǒng)將是所期望的，因為原核細胞在特征上缺乏翻譯后糖基化活性。還重要的為，載體/宿主細胞對不僅產(chǎn)生呈所希望形式的表達基因產(chǎn)物，而且所希望表達基因產(chǎn)物的分子可易于從產(chǎn)生其的細胞分離。由于涉及開發(fā)欲用于人類療法的重組蛋白的成本逐步升高，仍需不斷努力以增加該重組蛋白的表達水平，尤其在使用真核宿主細胞的系統(tǒng)中的表達水平。已表征各種順式和反式作用調(diào)節(jié)元件，其具有可改善所要重組基因產(chǎn)物的表達效率和/或總產(chǎn)率的核苷酸序列(DNA或RNA)。這樣的調(diào)節(jié)元件包括但不限于高度有效啟動子、轉(zhuǎn)錄增強子序歹寸(參見，例如，Dillon和Grosveld的評論，7>e"AGe"".，9:134(1993))、基因座控制區(qū)(LCR;參見，例如，Grosveld等人，Ce〃,5/:975(1987))、基質(zhì)或支架附著區(qū)(MAR、SAR;參見，例如，美國專利第7,129,062號；Bode等人，/"f.iev.Q^/.,/6Z4:389-454(1995);Bode等人，CWf.Aev.五wto，"'cG匿Ex戸肌》w,6:115-138(1996));P鬲離子元件(參見，例如，Kellum等人，Ce〃，"941(1991);和內(nèi)部核糖體進入位點(IRES;參見，例如，McBratney等人的評論，Cw".(9p/".Ce〃說o/.,5:961(1993))。隨后發(fā)現(xiàn)這樣的元件的一些核酸序列擁有可影響表達的特定子序列。盡管對于在可影響重組蛋白在各種類型的宿主細胞內(nèi)的表達的各種序列及其它因素的了解有進展，但仍需要改善重組蛋白的產(chǎn)率，尤其在當這樣的重組蛋白欲用于治療或其它特殊應用時。發(fā)明概述本發(fā)明提供了分離的核酸分子(多核苷酸分子)，其包含增加重組蛋白的表達的核苷酸堿基序列。這樣的核酸分子在本文中稱為重組表達載體元件(rEVE)。與不存在rEVE的表達水平相比，rEVE在表達載體上的存在增加一種或多種重組蛋白的表達水平，所述重組蛋白是由一個或多個駐留在表達載體上的功能基因來編碼。無論rEVE位于編碼所關注重組蛋白的基因的5'、3'還是5'和3'(例如旁側)，重組蛋白的表達水平的該rEVE介導的增加均是可能的。無論編碼在單獨相應基因上還是編碼在表達載體上存在的單一多順反子基因上，表達載體上存在的rEVE可增加一種或多種重組蛋白的表達。REVE可用于使用穩(wěn)定表達系統(tǒng)和瞬時表達系統(tǒng)來增加重組蛋白的表達水平。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了分離的rEVE多核苷酸分子，其包含選自下列的核苷酸堿基序列SEQIDNO:l("ARMl")的堿基序列、SEQIDNO:2("ARM2")的堿基序列和前述序列的任一個的增加表達部分，其中當rEVE多核苷酸作為編碼所關注重組蛋白的重組基因存在于相同表達載體上時，重組蛋白的表達水平與不存在rEVE的表達水平相比是增加的。本發(fā)明的優(yōu)選rEVE分子包括2329堿基對(bp)的rEVE核酸分子，其具有SEQIDNO:1的核苷酸堿基序列；和2422bp的rEVE核酸分子，其具有SEQIDNO:2的核苷酸堿基序列。SEQIDNO:2的序列的3'末端區(qū)含有對于rEVE介導的蛋白表達增加而言是關鍵的序列。這樣的優(yōu)選的SEQIDNO:2的3'末端區(qū)序列包括SEQIDNO:2的堿基462-2422的序列和SEQIDNO:2的堿基1087-2422的序列。包含本文中所述的一個或多個核苷酸堿基序列的分離的rEVE核酸分子可具有多種形式中的任一個，包括但不限于直鏈核酸分子、質(zhì)粒、真核病毒分子、原核病毒(噬菌體)分子、人工染色體和重組染色體。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供了包含至少一種本文中所述rEVE的表達載體。與在攜帶缺乏rEVE的相同表達載體的宿主細胞中的表達水平相比，該含rEVE的表達載體在適當宿主細胞中提供了至少一個編碼在表達載體上的重組蛋白的增加(提高)的表達水平。適用于本發(fā)明的表達載體包括任何核酸載體分子，其可經(jīng)工程化以在適當(同源)宿主細胞中編碼和表達一種或多種重組蛋白。這樣的表達載體包括但不限于真核質(zhì)粒載體、真核病毒載體、原核質(zhì)粒、噬菌體載體、穿梭載體(例如可在真核和原核細胞中復制的載體)、微型染色體(mini畫chromosome)和各種人工染色體。優(yōu)選i也,表達載體為質(zhì)粒表達載體，更優(yōu)選為穩(wěn)定整合到真核宿主細胞基因組中的質(zhì)粒表達載體，且甚至更優(yōu)選為通過非同源重組而穩(wěn)定整合到宿主細胞基因組中的質(zhì)粒表達載體。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了宿主細胞，其含有包含本文中所述的rEVE和指導至少一種重組蛋白在宿主細胞內(nèi)表達的重組基因的表達載體。宿主細胞可為真核或原核宿主細胞。適用于本發(fā)明的優(yōu)選真核宿主細胞包括但不限于哺乳動物宿主細胞、植物宿主細胞、真菌宿主細胞、真核藻類宿主細胞、原生動物宿主細胞、昆蟲宿主細胞和魚類宿主細胞。更優(yōu)選地，適用于本發(fā)明的宿主細胞為哺乳動物宿主細胞，包括但不限于中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、COS細胞、Vero細胞、SP2/0細胞、NS/0骨髓瘤細胞、人類胚腎(HEK293)細胞、幼倉鼠腎(BHK)細胞、Hela細胞、人類B細胞、CV-1/EBNA細胞、L細胞、3T3細胞、HEPG2細胞、PerC6細胞和MDCK細胞。特別優(yōu)選的為CHO細胞，其可用標準曱氨喋呤處理方案處理以擴增插入宿主細胞中的表達載體上的重組基因的拷貝數(shù)量?？稍诒景l(fā)明中用作宿主細胞的真菌細胞包括但不限于子嚢菌(Ascomycete)細胞，諸如曲霉屬(/^;^g/〃z^)、鏈孢霉屬(AAewravora)，和酵母細胞，尤其為選自下列的屬的酵母酵母菌屬(Sacc/zaramyce力、畢赤酵母屬(尸/c/z,a)、漢森酵母屬(Z/aw"w"/a)、裂殖酵母屬(Sc/z/zc^(2cc/zar函;vc—、克魯維酵母屬(^7t(yvera考ces)、耶氏酵母屬(K^raM^)和念珠菌屬(Omt/z^)。可根據(jù)本發(fā)明用作用于表達重組蛋白的宿主細胞的優(yōu)選酵母物種包括但不限于釀酒酵母(Sacc/zaromyces、多形漢森酵母(//0"化""/(3/70(ym077/2a)、乳酸克魯維酵母(^7t(yveraw少c^/"cto)、曱醇酵母(尸/c/z/a/a^or&)、粟酒裂歹直酵母(Sc/n'zos73cc/z"romyces/ow6e)禾口耶羅纟,亞解月旨酵母(KarrovW"/^0(y"ca)?？筛鶕?jù)本發(fā)明用于表達重組蛋白的原核宿主細胞包括但不卩艮于大腸4干菌(E^c/^n'c/zz'acoh')、腸道妙、門氏菌(5^/wowe〃ae/^en'ca)的血清型變體，志賀桿菌種(57z/^〃"《/^"^)、產(chǎn)琥珀酸沃廉菌(『o〃,"e〃"wcc,"oge"es)、普通變形桿菌(尸ra&wsvw/gan力、雷特才各氏變形桿菌(尸ra&M薦m&7/力、遲緩愛德華氏菌(^/wara^e〃a,ara^f)、弗氏衧檬酸^干菌(Oo6ac/er/rew"t^7)、巴氏斥干菌種(尸aWewe〃(2j/ec7'e力、p耆血4干菌種(/Z(2emo;/n7wss/ec/es)、，支單月包菌種(尸化wt/omowcws/ec/e力、^干菌種(5""'〃waj/e"W)、葡萄球菌種(S啤/^/occocwss/g"'e5)和鏈球菌種(5^eAococcw^ec/e力?？刹鹏迵?jù)本發(fā)明用作表達重組蛋白的宿主細胞的其它細胞包括原生動物細胞，諸如錐蟲類宿主蜥蜴利什曼原蟲(丄e/s/2wam'"fare"fo/"e),和線蟲類秀麗引4干線蟲(C^ewor/w(i"^e/egaw"的細月包。如本文中所述的rEVE多核苷酸、包含一個或多個本文中所述的rEVE的載體和包含這樣的包括一個或多個如本文中所述rEVE的載體的宿主細胞可用于與所關注重組蛋白的表達有關的多種方法中。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了增加所關注重組蛋白在宿主細胞中的表達的方法，所述方法包括以下步驟將重組表達載體插入宿主細胞內(nèi)，該重組表達載體包含本文中所述的rEVE和編碼所關注重組蛋白且指導所關注重組蛋白在宿主細胞中的合成的重組基因；和在促進重組蛋白表達的條件下培養(yǎng)宿主細胞。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了產(chǎn)生甲氨喋呤抗性宿主細胞的方法，所述宿主細胞在不存在曱氨喋呤("MTX")時，即在不存在用于通過甲氨喋呤的存在所提供的重組蛋白的提高表達的選擇性壓力時，以增加水平穩(wěn)定(與瞬時對比)表達重組蛋白。該方法包括以下步驟將表達載體插入宿主細胞中，該表達載體包含編碼所關注重組蛋白的重組基因、本文中所述的rEVE和編碼二氫葉酸還原酶("DHFR")的基因；在甲氨喋呤存在下使宿主細胞生長以選擇表達所關注重組蛋白的甲氨喋呤抗性宿主細胞；和分離曱氨喋呤抗性宿主細胞，其中甲氨喋呤抗性宿主細胞以比甲氨喋呤敏感性宿主細胞更高的水平來表達所關注重組蛋白，并且其中當在存在或不存在甲氨喋呤下生長時，曱氨喋呤抗性宿主細胞穩(wěn)定表達提高水平的所關注重組蛋白。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，用于該方法中的rEVE包含SEQIDNO:2的序列或其增加表達部分，當作為編碼所關注重組蛋白的基因存在于相同表達載體上時，其增加重組蛋白在宿主細胞中的表達水平。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了在用于擴增重組蛋白表達的DHFR-甲氨喋呤程序中產(chǎn)生對于曱氨喋呤的存在具有增加或改善適應性的宿主細胞群體的方法，所述方法包括以下步驟將表達載體插入宿主細胞中，該表達載體包含編碼所關注重組蛋白的基因、本文中所述的rEVE和DHFR基因，其中與攜帶缺乏rEVE序列的表達載體的宿主細胞群體相比，含有表達載體的宿主細l包群體適應更好，即在曱氨喋呤存在下，具有更高存活性和/或更高生長速率。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了增加重組蛋白在使用DHFR-甲氨喋呤程序獲得的宿主細胞中的擴增(升高)表達的方法，所述方法包括以下步驟將表達載體插入宿主細胞中，該表達載體包含編碼所關注重組蛋白的重組基因、本文中所述的rEVE和DHFR基因；在曱氨喋呤存在下使宿主細胞生長以選擇表達所關注重組蛋白的曱氨喋呤抗性宿主細胞；和分離甲氨喋呤抗性宿主細胞，其中分離的曱氨喋呤抗性宿主細胞在甲氨喋呤存在下，以比含有缺乏rEVE的相同表達載體的曱氨喋呤抗性宿主細胞的更高的水平表達重組蛋白。盡管諸如5nM至10pM的更低和更高濃度也可成功用于這樣的方法中以選4奪所關注重組蛋白的擴增表達，但甲氨噪呤可方便地以20nM至500nM的范圍用于本文中所述的方法中。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了減少、顯著抑制或基本上沉默重組蛋白從表達載體表達的方法。所述方法使用包含rEVE的一個或多個片段的表達載體，該rEVE提供比使用包含SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的序列的rEVE所提供的更低水平的特定重組基因產(chǎn)物的表達。這樣的片段具有SEQIDNO:2的特定截短變體，其包括SEQIDNO:2的堿基1-1086或SEQIDNO:2的堿基1-461的核芬酸堿基序列。具有由SEQIDNO:2的堿基1-461組成的截短ARM2序列的核酸分子尤其適用于抑制或,基本上沉默重組蛋白從宿主細胞中的載體分子的表達。這樣的發(fā)現(xiàn)還指示SEQIDNO:2的核普酸石咸基462-2422的序列和SEQIDNO:2的核苷酸石咸基1087-2422的序列對于最大rEVE介導的重組蛋白表達的增加而言是最優(yōu)選的。其表達可通過一種或多種本文中所述rEVE分子來增加的重組蛋白可為任何蛋白(包括肽、多肽和寡聚蛋白)，其功能基因可被工程化到用于在適當宿主細胞中表達的核酸載體分子中。這樣的蛋白包括但不限于可溶性蛋白、膜蛋白、結構蛋白(即，向細胞、組織或器官提供結構或支撐的蛋白)、核糖體蛋白、酶、酶原、抗體分子、細胞表面受體蛋白、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白、翻譯調(diào)節(jié)蛋白、染色質(zhì)蛋白(例如組蛋白)、激素、細胞周期調(diào)節(jié)蛋白、G蛋白、神經(jīng)活性肽、免疫調(diào)節(jié)蛋白(例如介白素、細胞因子)、血液組分蛋白、離子門(iongate)蛋白、熱休克蛋白、二氫葉酸還原酶、抗生素抗性蛋白、其功能片段、其含表位的片段及其組合。含有本文中所述的rEVE的序列或其部分的核酸分子還可作為核酸探針用于通過核酸雜交來鑒定其它核酸分子中rEVE序列的存在，或者作為適用于各種聚合酶鏈反應(PCR)程序中的引物來源，例如可用于操縱、鑒定、產(chǎn)生或擴增本文中所述rEVE序列。諸如ARM1(SEQIDNO:l)和ARM2(SEQIDNO:2)的那些序列的REVE序列可包含一個或多個基質(zhì)附著區(qū)(MAR)序列。MAR序列可在rEVE序列內(nèi)以群集形式出現(xiàn)，包括在rEVE序列的5'和/或3'末端區(qū)處呈群集形式。如本文中所述的rEVE多核苷酸為MAR序列的適用來源。因此，本發(fā)明提供了適用于增加核酸分子中的MAR序列的組合物和方法，所述方法包括將含有一個或多個MAR序列的本文中所述rEVE或本文中所述rEVE的一部分插入核酸分子中。本文中所述的核普酸堿基序列還用以提供其互補序列。本文中所述的DNA分子和核苷酸堿基序列還提供相應RNA分子和堿基序列，其中胸腺嘧啶(T)是被尿嘧啶(U)置換，和與其互補的核酸序列。附圖簡述圖1顯示用以表達免疫球蛋白重鏈和K輕鏈的質(zhì)粒表達載體pA205的示意圖，這樣的免疫球蛋白重鏈和K輕鏈在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子中形成活性人類抗-TNF-aIgGl分子("阿達木單抗(adalim腿b)")?？s寫"增強子"是指細胞巨細胞病毒(CMV)的中間早期基因增強子；"ADENO啟動子"是指腺病毒的主要晚期啟動子；"阿達木單抗重鏈"是指阿達木單抗的IgGl重鏈的編碼區(qū)；"SV40PolyA"是指猴病毒40聚腺苷酸化位點；"胃泌素終止子"是指人類胃泌素基因的轉(zhuǎn)錄終止信號；"SV40啟動子，，為猴病毒40啟動子；"DHFR，，是指小鼠二氫葉酸還原酶基因；"TKPolyA，，是指單純皰滲病毒胸普激酶基因的聚腺苷酸化位點；"阿達木單抗輕鏈"是指阿達木單抗的k輕鏈的編碼區(qū)；"ORI"是指在大腸桿菌中起作用的質(zhì)粒ColEl原核的復制起源；"P(BLA)"是指P-內(nèi)酰胺酶基因(氨節(jié)青霉素抗性基因)的原核啟動子且小箭頭指示轉(zhuǎn)錄方向；"Apr"("氨千青霉素抗性")是指p-內(nèi)酰胺酶的編碼區(qū)。箭頭指示轉(zhuǎn)錄方向(5'至3')。圖2為質(zhì)粒表達載體pA205Genomic的示意圖，其中具有SEQIDNO:1的核苷酸堿基序列的ARM1("A1")核酸插入表達載體pA205(圖l)中腺病毒主要晚期啟動子和阿達木單抗IgGl重鏈編碼區(qū)上游處，且具有SEQIDNO:2的核苷酸堿基序列的ARM2("A2，，)核酸插入阿達木單抗k輕鏈編碼區(qū)的下游中。關于其它縮寫，參見上文圖1的描述。圖3為質(zhì)粒表達載體pA205Al的示意圖，其中具有SEQIDNO:1的序列的ARMl("Al")核酸插入表達載體pA205(圖l)中adeno啟動子和阿達木單抗IgGl重鏈編碼區(qū)上游處。關于其它縮寫，參見上文圖1的描述。圖4為質(zhì)粒表達載體pA205A2的示意圖，其中具有SEQIDNO:2的核苦酸堿基序列的ARM2("A2")核酸插入阿達木單抗k輕鏈編碼區(qū)的下游中。關于其它縮寫，參見上文圖1的描述。圖5為用以表達免疫球蛋白重鏈和k輕鏈的質(zhì)粒表達載體pCHOEL246GGhum的示意圖，這樣的免疫球蛋白重鏈和k輕鏈在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子中形成活性人類抗-EL-選擇蛋白IgGl分子。"抗-EL-選擇蛋白重鏈"是指人類抗-EL-選擇蛋白IgGl抗體的重鏈的編碼區(qū)；"抗-EL-選擇蛋白輕鏈"是指人類抗-EL-選擇蛋白IgGl抗體的k輕鏈的編碼區(qū)。關于其它縮寫，參見上文圖1的描述。圖6為質(zhì)粒表達載體pA-Gen-EL-選擇蛋白的示意圖，其中具有SEQIDNO:1的核苦酸堿基序列的ARM1("A1")核酸插入表達載體pCHOEL246GGhum(圖5)中抗-EL-選擇蛋白IgGl重鏈編碼區(qū)上游處，且具有SEQIDNO:2的核苷酸堿基序列的ARM2("A2")核酸插入抗-EL-選擇蛋白k輕鏈編碼區(qū)的下游中。關于其它縮寫，參見上文圖1的描述。圖7為用以在CHO細胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子中表達增強綠色熒光蛋白13(eGFP)的質(zhì)粒表達載體pA205-eGFP的示意圖。eGFP編碼區(qū)("EGFP，，)插入pA205(圖l)中腺病毒主要晚期啟動子("ADENO啟動子，，)的下游處，輕鏈編碼區(qū)、近端啟動子和近端增強子和重鏈編碼區(qū)已從該pA205缺失。關于其它縮寫，參見上文圖1的描述。圖8為質(zhì)粒表達載體pA205G-eGFP的示意圖，其中具有SEQIDNO:1的核苷酸堿基序列的ARM1("A1")核酸插入表達載體pA205-eGFP(圖7)中eGFP編碼區(qū)("EGFP")的上游處，且具有SEQIDNO:2的核苷酸石咸基序列的ARM2("A2")核酸插入eGFP編碼序列的下游中。關于其它縮寫，參見上文圖1的描述。圖9為質(zhì)粒表達載體pA205A2-Spe-trunc的示意圖，除ARM2(SEQIDNO:2)已經(jīng)截短ARM2變體"A2(bpl-1086)"置換外，該質(zhì)粒表達載體基本上與圖4中所示的表達載體pA205A2相同，該截短ARM2變體由于ARM2核酸被限制性核酸內(nèi)切酶印e/的消化而具有SEQIDNO:2的堿基1-1086的核苦酸堿基序列。關于其它縮寫，參見上文圖1的描述。圖10為質(zhì)粒表達載體pA205A2-Swa-trunc的示意圖，除ARM2(SEQIDNO:2)已經(jīng)截短ARM2變體"A2(bpl-461)"置換外，該質(zhì)粒表達載體基本上與圖4中所示的表達載體pA205A2相同，該截短ARM2變體由于ARM2核酸凈皮限制性核酸內(nèi)切酶Swa/的消化而具有SEQIDNO:2的堿基1-461的核苦酸堿基序列。關于其它縮寫，參見上文圖1的描述。發(fā)明詳述本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn)一種或多種分離的核酸分子(多核苷酸分子)，所述核酸分子包含SEQIDNO:l的核普酸序列aattgaattcgttccctttagtgagggttaattccgcggccgcgtcgacagctctagagggagtgccaggataggctccaaagctaC8C3g3g33tCCCtgtttca3犯a3CC33aaa3a犯33aata肌333t3a3333taa3助gt3gggt3Cag3tCt333t3g3C33ttctc幼t3g3gg犯tct肌犯tgcctg3幼g3ca犯t幼g幼3gtgttc肌c3tcctt3gccatcaggg3犯tgc幼3tc幼犯c33CtCtgag3t3Ct3tCtt3CtCCtgtcat福ggCC幼3ttC咖幼C3Ct肌tg3CElgttC3tgttgg3g3g幼tgtgg3g3幼g3ggagcacttctccactgctggtgggagtgccaacttggacagccactttggaaatcagtatggctactcctcaagaaaatggaaatc3gttt3CC8caag3tcc3gc犯ttcc3ctc3ggC3t8t3ccca幼agaaccgC3ttC3t3c犯gcaat3tctgttc3acg3tgttc3tagcagctctatttgtaacagccagaaactggaagcagcctagttgcacctcaaccaaagaaatggatagagaaaatatggtacatttetgc犯tggagt3ct3ctc3gcgg幼肌gtec犯tgg幼tcttg3幼tttgc幼g3aaatgg3tgg犯ct3g幼g幼3cctttctg3gc肌ggt幼ctc肌tC3咖幼3g3ca肌catg3t3tgt犯tC3Ctc3tatgtggatttt堪3C3C3gtgt3肌gg3tt3Ccagcctac福cc3C3Ctgcc幼3g肌cct犯t3aaca3gg3ggaccct幼ggg3g3C3tacatggtcccctggEig3tgggg幼tgggtcaagatatgctgagcaaagtgggaacatgggaagaggggggaaggagctaggaaattgagaaagggagaaaaggagggatgc卿ggac3taagggagcag幼ac3ttg3ctcaggg3atg3atcg幼gat幼caagcc3tgg3gatatcitaatag3ggg3g3C3ttttgggtat3C3g3g3犯tc3ggc3Cttggg3肌tgtctgg3幼tct3C3幼gtat肌caccaggt肌c幼tct犯gc幼c8gaggagaggctaccttaaatgtcctaccctgatagtgagattgatgactaacttatatgccatgttatagccttcatccagcagctggtgg33gteg33gcag織ccc3t肌ct幼tc3Cgg幼ctg肌ctgg肌ccc3g3ttc，g肌ggatg3gtga3gggC3cag3ggtCC3g3CC3ggCtggtg幼3CCC3C幼咖C3gttg咖tg犯t3tCggtg幼CtCttgCtCCCC3g3Ctg加gCtgg肌t3ccagcatgggactgatccagactccaggaacatgagttcctgtgaggaaacctcggaaatctaagggacctcctgtagaagttcagt3cttatccct3gca1;aggtgtgg3ctg8gggagcccattccatat2ig2igg3at3ctctctggEigcc犯cac3catgggggtgggc3taggccctttccc朋agcatac幼tagactcggatgawccct3tggaaggcctcatc3tccagggggagcag3犯ggat3tgtgatagacagggtttcagttgggagccgggtagtgggaggggagaattggtggaagaaggaaaccgggattgtcatgtaaatc3atgctgtttctaattC33at肌g肌3gttg幼aa幼幼g3幼actg自cttattgcaccatgta3tgttetg幼atggc3tttgctgtt犯g3tg3gc3gtct3tctgct犯tctccct3gctggcttgtg肌cttgttet3tggac3肌gctggtctc幼3ttC3幼g3t3tttgcgt3tgtctgtctcctg2igtgttg3g3gtec肌gt3tgtacc3cc幼tccctttg3tt3tac3att3C3tttga幼acagtttg，ttt幼tt3ta3ct3tgc肌tc肌ttcaa犯t3由a3ttt肌atctc3tatttgtcttt2iggtgg肌atctgtt3atateicatcatgatt3t3t3tttt幼tttatt由tgttttct3gg3c幼3at3t3ct3aaatg肌atct肌ggctct肌acat3c肌幼ctgtatgcat3g3t織tcacg3tcat3t幼tttcc3tg3C3tgct3ttcggg幼t由atg3tctacctgc3gtaatgatt3atttgga幼tgctg幼t3c幼ctgcttctcttttg3犯由ca幼ttcctt3catttgt肌tct3ttt肌tttt咖ggttgt3cccc3g3幼gt3gtg3attctt叫或SEQIDNO:2的核芬酸序列肌g肌t3tgctc肌tgta2it3ccc2itggc3ggc3ttc助tgtttgtctgtcttc由ttg肌g3ta幼cag3tgt3t3tc3t由c犯肌atattt幼tgtga3gttgtccatgtgttcaggatct3t3tactttc肌3犯tctttttcc3t3ttcttttctta3tcctcctg肌gtgt3g3cc3tt3tactggaa幼ccgtC3ctattgtBC3ggat3ggagcctttgactctgagaggatcccat3cattgattgtettttcaaat自ttttggctgcttttctccatgtgatatttggcaatctggagaggcatttgctcctggaaatttatcaatgttgacaatgttgtttacatgttttaagt幼ctattttgctacc幼ggaaactgcttceictccctttcac3tataa肌ctc3t肌a3tattg幼aggctccaat幼gttt肌atcattctgtattgctcatggagatttaaatttcagtgctaattttttattagcactttaatttagaaggcaccaggtttctacaagatttaaaattattggagc3tttc3333tttt3t33gctttcc3gt33ggttgtggct3tg3ttctttgcttgta33gtaa3gtgca3ttta33gttaatttaa3t83ttt3actgCtgC3g3CattttaggElg3attgtttgtatttC333Ctg3aattC3gggt3g3C33tt3g33t38tttt3C333g3gg犯3t3tttttctaataataaattagtaactctaacttatattaaaatttaagtcctcattgctttcaatattttaacaaccctattgtattatttttcttataaat3tttg33ttt3t33tg3tC33ag33tttCtttg3t3C33gtgtCtaa3tgatt3CC3tC333Ctgttggt3gg3gCttgttat3tatgtgttttaccttatgttttttgatacttcatttgttactgtactgtgatcgagttaattccctactgaaactaaaaatgctatcacatagttttagcatcatctgttggggaaatggctattttaactactctgagatgagaaattcaacaecattcactaacaatatagggaaactagtgttggtagattgttgagtgcttatacatatatcttgtcccatggttaactataagttggtgtctgttgctgccacccagtatggaaacacattatgttttttctttttttttttttatagccatgagaaagaccaaaattctatacttgaaaaaccgtttatattgaatgtgtattcctttcacgtccaccttagattca3CtCCt33gtC肌ttt3tggt3aagC3t3g3tC3tCtgCttg3C33C3gtttgg3tg3tgatCttgga3犯肌tgCCtt3tt3t3tg3t3caatggaattaatgatatgagctgaataaatatatcaatattcaaatgacatactaatatttatgtctaagagaatgtgttcaaagtagatga肌gtgCCttC3Cttg3333ttCBtctg3gtta333C3g3t3gttgCttCggttttagtt3tttC3g3ggt3ttC3agttg3C83Ct3eigaatagccgtcacagatacatatcaattatggacccaaattctattgaatgtcagctacatattcttatagaaaataggaacctagatgaggccgtgttcttggaatgaattttcaacacattgtatgagggttttattgtggttttggttgttgttttactttcctttttttccatagacaaatttgtccc3tgt3ccc3C3aggtg3cc3gtggtg3CB3gcctactcc3gg3gtcctggtgaat33agattat3caagatagtag3gactC3tC犯3aC33t3ag333肌g3g肌t3C3tagggCag幼3tttCtC3ttttCtC8gCt3tggtatCCt3tttC3CtCttgt3Ct3ttCt3Ctc3ct3ga3gtc3gtg3ct3ccat3actc3gtggctgtgccct3gatc3幼gga33cattatttc3aggcatgaatgtc3gccac3cCttC3t3gtgggtt3Ctttt33tttgttt3gt33g33t3g3C3CCCtaCtttggtt3gg33eiC3ta33Ctt3C幼gaCattC3ttggtttttCtttactaaattaaatcattaagaaaatcgtaattatcagagtttaaatggcatgaaacatagaaatactcatttgctgccctgatttattttcCC幼ga3t3ttttC3atgtCttCtttgga3gCtCCttggt3a3tgCactttCtttC3CtC3ttt3tg3ggtCtgtgC3C3tC3C3gtC3at犯3ggCCtgCagt3ttga3tC3gCC3t3C3g3C3ta3ttCat33C柳ttCt3tttCtCatg3BtCa3at3ttgtt3ttgCtgt3C3t3333t3atgaatcaaagtataggtctaga，所述核酸分子可被工程化到表達載體分子中，以增加一種或多種重組蛋白從存在于表達載體分子上的一個或多個基因的表達。包含SEQIDNO:1或SEQIDN0:2的核苷酸序列的分離的多核苷酸分子在本文中是指重組表達載體元件(rEVE)。本發(fā)明的rEVE還包括4旦不限于包含SEQIDNO:l("ARMl")或SEQIDNO:2("ARM2")中所示的序列的增加表達部分的多核苷酸分子。來自ARM2SEQIDNO:2的3'末端區(qū)的序列，諸如具有SEQIDNO:2的堿基462-2422和SEQIDNO:2的堿基1087-2422的序列的那些序列，尤其適用于提供所關注重組蛋白的增加表達。本文中所述的rEVE可與當前可用以增加重組蛋白在宿主細胞中的產(chǎn)生的其它控制序列、調(diào)節(jié)子和程序組合使用。為更清楚描述本發(fā)明，定義以下術語如本文中所使用和理解，術語"抗體"或"抗體分子"廣泛是指包含4個多肽鏈，即2個重(H)鏈和2個輕(L)鏈的任何免疫球蛋白(Ig)分子，或其任何功能片段、突變體、變體或衍生物，其保留Ig分子的基本表位結合特征。這樣的突變體、變體或衍生物抗體在本領域中為已知的且包括下文所討論的非限制性實施方案。在全長抗體中，各重鏈包含重鏈可變區(qū)(VH)和重鏈恒定區(qū)。重鏈恒定區(qū)包含3個域，即CH1、CH2和CH3。各輕鏈包含輕鏈可變區(qū)(VL)和輕鏈恒定區(qū)。輕鏈恒定區(qū)包含一個域(CL)。VH和VL區(qū)域可另外再分成具有高變性的區(qū)域，稱為互補決定區(qū)(CDR),其被更保守的區(qū)域(稱為框架區(qū)(FR))間隔開。各VH和VL包含3個CDR和4個FR,其按以下順序從氨基末端排列至羧基末端FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。免疫球蛋白分子可為任何類型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY),類另'J(例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2)或子類。術語"抗體"和"抗體分子"還涵蓋保留特異結合于抗原的能力的抗體的一個或多個片段。已顯示抗體的抗原結合功能可通過全長抗體的片段來執(zhí)行。這樣的抗體實施方案還可為雙特異(bispecific)、雙重特異性(dualspecific)或多重特異性；其與兩種或兩種以上不同抗原特異性結合。涵蓋于術語"抗體"內(nèi)的結合片段的實例包括Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1域組成的單價(l個結合位點)片段；F(ab')2片段，即包含2個通過在鉸鏈區(qū)處的二硫鍵連接的Fab片段的二價(2個結合位點)片段；由VH和CH1域組成的Fd片段；由抗體的單臂的VL和VH域組成的Fv片段；單域抗體(dAb)(Ward等人，A^w"，3W:544-546(1989);Winter等人，PCTpublicationWO90/05144Al，其以引用的方式并入本文)，其包含單一可變域；雙可變域(DVD)抗體(參見，例如PCT公開第WO2007/024715號)；和分離的互補決定區(qū)(CDR)。此外，盡管Fv片段的2個域，即VL和VH是由分離基因編碼，但可使用重組方法，通過合成連接子來連接其，該合成連接子能使其成為單一蛋白鏈，其中VL和VH區(qū)域配對以形成單價分子(稱為單鏈Fv(scFv),參見，例如，Bird等人Sc/e薦，423-426(1988);Huston等人，尸rac.淑/./4cWU&4，5879-5883(1988))。這樣的單鏈17抗體是由術語"抗體"和"抗體分子'，所涵蓋。雙功能抗體還由術語"抗體"和"抗體分子"所涵蓋。雙功能抗體為二價、雙特異性抗體，其中VH和VL域在單一多肽鏈上表達，但其使用太短以致于不能允許在相同鏈上2個域之間的配對的連接子，進而迫使域與另一鏈的互補域配對且產(chǎn)生2個抗原結合位點(參見，例如，Holliger爭乂，尸rac.A^//.Jed園，卯6444-6448(1993);Poljak等人，5"，2:1121-1123(1994))。術語"抗體"和"抗體分子"還涵蓋雙可變域免疫球蛋白分子，諸如DVD-IGTM(AbbottLaboratories)雙可變域免疫球蛋白分子(參見例如，PCT公開第WO2007/024715號)。如本文中所使用，"載體，，是指能夠充當用于外來多核苷酸在宿主細胞中遺傳轉(zhuǎn)移、表達或復制的載體的任何遺傳因子。例如，載體可為人工染色體或質(zhì)粒，且可能能夠穩(wěn)定整合到宿主細胞基因組中，或其可以獨立遺傳因子(例如離合染色小體(episome)、質(zhì)粒)形式存在。載體可以單一多核香酸或以兩種或兩種以上分離的多核苷酸形式存在。當存在在宿主細胞中時，載體可為單一拷貝載體或多拷貝載體。適用于本發(fā)明的優(yōu)選載體為表達載體分子，其中一個或多個功能基因可以適當定向插入載體分子中且接近駐留在表達載體分子中的表達控制元件，以便當載體分子駐留在適當(同源)宿主細胞中時，指導一種或多種蛋白的表達。表達載體可包括但不限于真核質(zhì)粒載體、真核病毒載體、原核質(zhì)粒、噬菌體載體、穿梭栽體(例如可在真核和原核細胞中復制的載體)、微型染色體和各種人工染色體(例如，細菌人工染色體(BAC)、酵母人工染色體(YAC))。優(yōu)選地，用于本發(fā)明中的表達載體為質(zhì)粒，更優(yōu)選為穩(wěn)定整合到宿主細胞基因組中的質(zhì)粒表達載體，且甚至更優(yōu)選為通過非同源重組穩(wěn)定整合到宿主細胞基因組中的質(zhì)粒表達載體。"穿梭載體"(或雙功能載體)是指可在生物體的超過一個物種中復制的任何載體。例如，可在大腸桿菌(^sc/^〃'c/z/aco")(Eco")和釀酒酵母(Sacc/zaramj/cescewv7'w'ae)(5".cerev/57'"e)中復制的穿梭載體可通過將來自大腸桿菌質(zhì)粒的序列與來自酵母2ILl質(zhì)粒的序列連接來建構。表達系統(tǒng)包含表達載體和將表達編碼在表達載體上的重組蛋白的適當(同源)宿主細胞。表達系統(tǒng)可為穩(wěn)定表達系統(tǒng)或瞬時表達系統(tǒng)。在穩(wěn)定表達系統(tǒng)中，表達載體穩(wěn)定整合到宿主細胞基因組中，或連續(xù)復18制且如實地傳代至兩個子代細胞中，以便宿主細胞能夠當在適當條件下培養(yǎng)時，繼續(xù)表達重組蛋白。在瞬時表達系統(tǒng)中，表達栽體分子不保留在兩個子細胞中且最后丟失，或在生長細胞培養(yǎng)物中減少，使得重組蛋白從培養(yǎng)物的表達將最后停止或太低以致不適用于大多數(shù)生產(chǎn)目的。下文用于實例中的表達載體為穿梭載體類型，當插入(例如通過轉(zhuǎn)型)至大腸桿菌細胞中時，其可復制成相對較高的拷貝數(shù)量，且其還可插入(例如通過轉(zhuǎn)染)至且穩(wěn)定維持在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中，以獲得所關注的其編碼基因產(chǎn)物的穩(wěn)定表達(Kaufman等人，Mo/ec.Ce〃.AW.，5:1750-1759(1980))或其可瞬時維持在HEK293細胞中(Durocher等人，A^c/ezc」c,A/^y.，30:E9)。因此，本文中所述的rEVE多核苷酸分子可用以增加所關注重組蛋白在穩(wěn)定和瞬時表達系統(tǒng)中的表達?？捎糜诒景l(fā)明中的示例性真核載體包括但不限于病毒和非病毒載體。病毒載體包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(包括慢病毒載體)；腺病毒載體，包括其具有復制能力的、復制缺陷和無活力形式；腺病毒相關性病毒(AAV)載體；猴病毒40(SV-40)載體；牛乳頭狀瘤病毒載體；埃-巴二氏病毒載體(Epstein-Barrvirusvector);皰滲病毒載體、牛痘病毒載體；莫洛尼鼠白血病病毒載體(Moloneymurineleukemiavirusvector);p合維鼠肉瘤病毒載體(Harveymurinesarcomavirusvector)、鼠類乳lU中瘤病毒載體和勞氏肉瘤病毒載體(Roussarcomavirusvectors)。才干訝犬病毒載體為熟知的且適于在昆蟲細胞中表達。適合于在真核或原核細胞中表達的多種載體在本領域中是熟知的且許多為市售的。商業(yè)來源包括但不限于Stratagene(LaJolla,California)、Invitrogen(Carlsbad，California)、Promega(Madison,Wisconsin)和Sigma-Aldrich(St.Louis,Missouri)。許多載體序列可經(jīng)由GenBank得到，且涉及載體的額外信息可經(jīng)由RikenBioSourceCenter在互聯(lián)網(wǎng)絡上得到。載體分子通常包含至少一個復制起源且還可包含用于"標記"或"選擇性標記，，的基因，當將載體插入宿主細胞中時，其可通過標記基因來鑒定或選擇。這樣的適用標記可(不限于)賦予對抗生素的抗性；提供給予選擇性生長優(yōu)點的功能，其優(yōu)于缺乏這樣的功能的細胞；或提供易鑒定擁有載體(例如染色遺傳(colorigenic)系統(tǒng))的細胞的方式。這樣的標記在本領域中是熟知的，且用于載體分子中的適當選擇性標記的選擇將視使用何種宿主細胞和含有載體的宿主細胞的何種性質(zhì)為需要的而定。術語"功能基因構建體"、"功能基因"和"基因"是指含有一種或多種蛋白的編碼序列的多核苷酸，該編碼序列可操作地連接于啟動子序列及其它可能的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列以指導編碼序列向信使RNA(mRNA)中的適當轉(zhuǎn)錄，且其還包含多種翻譯調(diào)節(jié)序列的任何序列，該序列對指導mRNA向所欲宿主細胞中的所要蛋白中的適當翻譯而言可為必需或所要的。在mRNA中通常需要翻譯起始密碼子(例如ATG)和核糖體結合位點，以使翻譯在原核和真核細胞中發(fā)生。視宿主細胞而定還可使用的其它翻譯調(diào)節(jié)序列包括但不限于RNA剪接位點和聚腺普酸化位點。本文中使用術語"重組體"來描述被改變或操縱的核酸、從天然存在的環(huán)境分離的核酸、被轉(zhuǎn)染或被操縱以含有外生核酸的宿主細胞、或經(jīng)由分離的DNA操縱和宿主細胞的轉(zhuǎn)型而非天然地表達的蛋白。"重組體"為特別涵蓋已使用遺傳工程技術活體外建構的DNA分子的術語，使用術語"重組"作為形容詞來描述分子、構建體、載體、細胞、蛋白、多肽或多核苷酸是特別排除天然存在的這樣的分子、構建體、載體、細胞、蛋白、多肽或多核苷酸。特別為本發(fā)明的目的，"重組蛋白，，為由一種在表達蛋白之前已通過并入至少一個非天然存在的遺傳因子所操縱的宿主細胞表達的蛋白。一種蛋白，其編碼序列已由人工并入宿主細胞(例如通過包括該蛋白的編碼序列的表達載體轉(zhuǎn)染)使的能夠表達該蛋白，一旦由該宿主細胞表達，即為"重組蛋白"。"宿主細胞"是指可插入載體分子的任何細胞，即任何真核或原核細胞。才艮據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選宿主細胞為真核或原核細胞，包括但不限于動物細力包(例如哺乳動物、鳥和魚類宿主細力包)、植物細胞(包括真核藻類細胞)，真菌細胞、細菌細月包和原生動物細胞。適用于本發(fā)明的宿主細胞可為任何遺傳構建體，但優(yōu)選為單倍體或二倍體細胞。適用于本發(fā)明的優(yōu)選哺乳動物宿主細胞包括但不限于中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、COS細胞、Vero細胞、SP2/0細胞、NS/0骨髓瘤細胞、人類胚腎(HEK293)細胞、幼倉鼠腎(BHK)細胞、Hela細胞、人類B細胞、CV-1/EBNA細胞、L細胞、3T3細胞、HEPG2細胞、PerC6細胞和MDCK細胞。優(yōu)選昆蟲細胞為Sf9。可在本發(fā)明中用作宿主細胞的真菌細胞包括但不限于子嚢菌細胞，諸如曲霉屬、鏈孢霉屬，和酵母細胞，尤其以下各屬的酵母酵母菌屬、畢赤酵母屬、漢森酵母屬、裂殖酵母屬、克魯維酵母屬、耶氏酵母屬和念珠菌屬?？捎米鞅磉_重組蛋白的宿主細胞的特別優(yōu)選酵母真菌物種為釀酒酵母、多形漢森酵母、乳酸克魯維酵母、曱醇酵母、粟酒裂殖酵母和耶羅維亞解脂酵母。可在本發(fā)明中用作宿主細胞的優(yōu)選原核細胞包括但不限于大腸桿菌、腸道沙門氏菌的血清型變體、志賀桿菌種、產(chǎn)琥珀酸沃廉菌、普通變形桿菌、雷特格氏變形桿菌、遲緩愛德華氏菌、弗氏檸檬酸桿菌、巴氏桿菌種、嗜血桿菌種、假單胞菌種、桿菌種、葡萄球菌種和鏈球菌種?？蔀楦鶕?jù)本發(fā)明用于表達重組蛋白的適用宿主細胞的其它細胞包括原生動物細胞，諸如錐蟲類宿主蜥蜴利什曼原蟲，和線蟲錐蟲秀麗引桿游^的細胞。各種表達載體可適用于上述細胞中。存在將載體分子插入細胞中的多種方式和方案，包括但不限于轉(zhuǎn)型，轉(zhuǎn)染，細胞或原生質(zhì)粒融合，使用化學處理(例如原生質(zhì)粒的聚乙二醇處理、釣處理、轉(zhuǎn)染劑，諸如可購自Invitrogen(Carlsbad，California)的LIPOFECTIN⑧和LIPOFECTAMINE⑧轉(zhuǎn)染試劑)，使用各種類型的脂質(zhì)粒，使用機械裝置(例如，用核酸涂布的微珠)，使用電荷(例如電穿孔)，及其組合。確定用以將本文中所述的特定載體分子插入所要宿主細胞中的特定方案和/或方式是在本領域技術人員的技術水平內(nèi)。從一個載體或其它核酸分子"轉(zhuǎn)移核酸序列信息"至另一個中的方法在本發(fā)明中非限制性的，且包括本領域中已知的多種遺傳工程化或重組核酸技術的任一個。特別優(yōu)選的轉(zhuǎn)移技術包括但不限于限制；肖化和連接技術、聚合酶鏈反應(PCR)方案(利用特定或隨機序列引物)、同源重組技術(利用具有同源性的多核苷酸區(qū))和非同源重組(例如隨機插入)技術。含有特測序列的核酸分子還可(例如)使用自動核酸合成器來合成，且將所得核酸產(chǎn)物隨后通過上述方法中的任一個并入另一核酸分子中。使用遺傳工程化技術必然需要在如通過本領域技術人員由所要細胞和特定細胞狀態(tài)的要求而確定的多種特定條件下，使重組宿主細胞(例如轉(zhuǎn)染子、轉(zhuǎn)型體)生長。例如，宿主細胞可擁有(如通過其遺傳排列所決定)某些管養(yǎng)需求或?qū)ξ锢?例如溫度)和/或化學(例如抗生素)條件的特定抗性或敏感性。另外，特定培養(yǎng)條件可為調(diào)節(jié)所要基因的表21達(例如使用可誘導啟動子)或引發(fā)特定細胞狀態(tài)(例如酵母細胞配合或孢子形成)所必需。這樣的變化條件和滿足這樣的條件的要求為本領域技術人員所理解和了解。在使用標準二氫葉酸還原酶(DHFR)-甲氨喋呤(MTX)擴增程序擴增(提高)重組蛋白在宿主細胞中的表達的情況下，術語"穩(wěn)定性"和"穩(wěn)定表達"是指當在不存在甲氨喋呤下生長時，即，不存在通過用于擴增程序的曱氨喋呤的存在所提供的用于提高表達的選擇壓力時，細胞培養(yǎng)物繼續(xù)以擴增(提高)水平來表達重組蛋白的能力。因此，一旦分離，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子宿主細胞即可在存在或缺少甲氨喋呤下表達所關注重組蛋白。在使用標準二氫葉酸還原酶(DHFR)-甲氨喋呤(MTX)擴增程序擴增重組蛋白在宿主細胞中的表達的情況下，對曱氨喋呤存在的"增強適應性"或"改善適應性"是指與在甲氨喋呤存在下攜帶缺乏rEVE的表達載體的宿主細胞培養(yǎng)物的存活性和/或生長速率相比，在甲氨喋呤存在下攜帶包含本文中所述的rEVE的表達載體的宿主細胞培養(yǎng)物存活性更高和/或生長速率更高。宿主細胞群體的"存活性"是指宿主細胞群體在選擇性壓力(例如甲氨喋呤)存在下生長和繁殖的能力。"序列同源性"為該領域中的本領域技術人員所熟悉的概念。為測定2個氨基酸序列或2個核酸的同源性百分比，將序列比對以達最優(yōu)選比較目的(例如，間隙可引入第一氨基酸的序列或核酸序列中以用于與第二比較氨基酸或核酸序列的最優(yōu)比對)。隨后比較相應氨基酸位置或核苷酸位置處的氨基酸殘基或核普酸。當?shù)谝恍蛄兄械奈恢糜膳c第二序列中的相應位置相同的氨基酸殘基或核苦酸占據(jù)時，則分子在該位置處為同源的(即，如本文中所使用，氨基酸或核酸"同源性"相當于氨基酸或核酸"同一性")。核酸序列同源性可以2個序列之間的一致性程度來判定。同源性可使用本領域中已知的計算機程序，諸如GCG程序包中提供的GAP軟件來測定。參見，Needleman和Wunsch,丄iUo/.5/o/.,4S:443-453(1970)。當"包含，，一個或多個指定要素或步驟時，本文中所述的組合物或方法是開放式的，其意謂指定要素或步驟為必要的，但在組合物或方法的范疇內(nèi)，還可添加其它要素或步驟。還應了解，為避免冗長，當"包含"一個或多個指定要素或步驟時，所述任何組合物或方法還22描述"基本上由相同指定要素或步驟組成"的相應的更限制性組合物或方法，其意謂組合物或方法包括指定的必需要素或步驟且還可包括不會本質(zhì)上影響組合物或方法的基本和新穎特征的額外要素或步驟。還應了解，當"包含"一個或多個指定要素或步驟或"基本上由一個或多個指定要素或步驟組成"時，本文中所述的任何組合物或方法還描述"由指定要素或步驟組成"以排除任何其它未指定要素或步驟的相應的更限制性和封端(close-ended)組合物或方法。在本文中所揭示的任何組合物或方法中,任何指定必需要素或步驟的已知或所揭示等價物可取代該元素或步驟。還應了解，"選自…"的要素或步驟是指緊接著的名單中的要素或步驟的一個或多個，包括所列要素或步驟的任何兩個或兩個以上的組合。，于、，一、、乂，、、、、口、'、、、、口、、、、與通過本領域技術人員所理解和使用的相同。本領域技術人員還應了解，如本文中所述的核酸序列(核苷酸堿基序歹'J)才是供DNA、RNA及其互補序列。本發(fā)明的重組表達載體元件(rEVE)首先從位于存在于轉(zhuǎn)染的DUXB11CHO細胞系的細胞中的表達載體的整合位點的任一側旁側的基因組DNA區(qū)分離，該細胞是從存在于表達載體上的基因表達格外高水平的抗IL-12抗體分子。DUXB11CHO基因組DNA的這樣的旁側區(qū)的克隆和測序揭示SEQIDNO:1和SEQIDNO:2的序列。SEQIDNO:1的2329堿基序列在本文中還稱為"ARM1"，且SEQIDNO:2的2422堿基序列稱為"ARM2"。旁側ARMlDNA序列經(jīng)顯示位于整合表達載體的重鏈基因的轉(zhuǎn)錄方向的上游，且旁側ARM2DNA序列經(jīng)顯示位于±4"八t，J"J0"'/Jr丄厶2A*世DTI丄厶_SL二人丄A-T",'A/右m一r>二Air^J-人^er5-^i^辟人r^w.vw^et^w、j，vj^y、口jw、jr///r(/鄉(xiāng)、夕ctr人^r^—i"j—-p勿J。將含ARM1和含ARM2的DNA分子單獨且以組合形式插入表達載體中，以測定其存在是否會影響各種重組蛋白于含有表達載體的宿主細胞中的表達水平。與不存在這樣的序列下獲得的制備水平相比，含ARM1和含ARM2的DNA提供重組蛋白在宿主細胞中的增加表達水平(參見下文實施例)。因此，含ARM1和含ARM2的核酸分子為重組表達載體元件的實例(rEVE)。通常，用ARM1多核苷酸獲得的增加制備水平比用ARM2多核苷酸或用ARM1和ARM2多核苦酸的組合獲得的那些稍微更低。在其中ARM1和ARM2的任一個或兩個已用于建構用于制備本發(fā)明所關注重組蛋白的表達載體的所有情況下，使用ARM1和/或ARM2表達增強子元件的蛋白表達水平更大。直接觀察到，超過不具有ARM增強子的對照表達系統(tǒng)的大于2倍、大于3倍、大于4倍、大于5倍、大于6倍、大于9倍、大于10倍、大于13倍、大于16倍和大于18倍的重組蛋白產(chǎn)物的增加的比較表達水平。(參見下文實施例)。此外，使用具有ARM1或ARM2或ARM1和ARM2兩者的表達載體獲得的高表達水平在轉(zhuǎn)染的宿主細胞中隨時間穩(wěn)定地維持。ARM1和ARM2序列擁有相對富集基質(zhì)/支架附著區(qū)的序列的區(qū)域(MAR/SAR;參見例如，Michalowski等人，5,oc/zew^^y,3S:12795-12804(1999);Tikhonov等人，77ze尸/"WCe〃，/2:2490曙264(2000)美國專利第7,129,062號；Bode等人,Wev.Q^o/.，/6Z4:389-454(1995);Bode等人,O//.We乂Ei^oTyo/Zc5"jc/^us^z'ow，<5:115-138(1996))。在ARM1的狀況下，MAR序列基序尤其集中在序列的3'末端區(qū)中，而在ARM2的狀況下，MAR基序的群集出現(xiàn)在序列的5'和3'末端區(qū)中，較少MAR基序位于序列的中間區(qū)中。缺失分析表明ARM2核酸的大致1260堿基對3'末端區(qū)含有對ARM2增加的蛋白表達活性而言關鍵的序列(參見下文實施例6)。本發(fā)明的rEVE分子包括那些核酸分子，其包含ARM1和ARM2序列的增加表達部分或片段。ARM1和ARM2序列的這樣的增加表達部分為那些當作為編碼所關注重組蛋白的基因存在于相同表達載體上時，與不存在ARM1或ARM2序列的這樣的部分或片段時獲得的表達水平相比，其增加重組蛋白在含有表達載體的宿主細胞中的表達水平。本文中所述的rEVE可單獨使用或與任何其它調(diào)節(jié)元件或表達增加系統(tǒng)組合使用，以用于增加所要重組蛋白在宿主細胞中的制備水平。這樣的其它序列和系統(tǒng)可包括但不限于使用調(diào)節(jié)啟動子以控制或最優(yōu)選化編碼所關注重組蛋白的基因的轉(zhuǎn)錄，使用指導重組蛋白從宿主細胞分泌的信號序列和使用基因擴增方法，諸如二氬葉酸還原酶(DHFR)-甲氨喋呤(MTX)擴增方案或谷氨酰胺合成酶方案。在DHFR-MTX擴增程序中，就對增加濃度的甲氨喋呤的抗性而言來選擇攜帶包含用于DHFR的基因的表達載體的宿主細胞(參見例如，Kaufman,R丄，/"GeneticEngineering:Principlesandmethods(編者丄K.Setlow),第9巻，第155頁(PlenumPublishing,NewYork,1987))。通常，當對甲氨喋呤的抗性水平增加時，存在重組基因的拷貝數(shù)量的伴隨擴增連同從該擴增基因的重組蛋白表達水平的相應擴增(升高)。SEQIDNO:1和SEQIDNO:2的核酸序列是從得自DUXB11CHO細胞系的DNA分子來鑒定。多種方法的任一個可用以制備包含SEQIDNO:1、SEQIDNO:2的核普酸序列或這樣的序列的任一個的部分的核酸分子。這樣的方法包括但不限于將一個或多個包含這樣的序列的rEVEDNA分子克隆出DUXB11CHO細胞的基因組DNA,產(chǎn)生包含這樣的序列的多核苷酸的固相核酸合成方案，重組核酸技術，聚合酶鏈反應(PCR)方案，自動核酸合成器，及其組合。本文中所述的rEVE多核普酸分子還可從用戶設計(customdesigned)的核酸分子的商品供貨商購買。制備或合成rEVE的方法非限制性的，且本領域技術人員可決定何種方法或方法的組合最適于制備本文中所述的特定rEVE。本文中所述的rEVE可插入表達載體中以增加多種蛋白(包括肽、多肽和寡聚蛋白)的任一個從宿主細胞中的表達載體的表達。倘若核苷酸編碼序列為已知的或可在核酸(DNA或RNA)分子上得到，則所關注的蛋白的編碼序列或整個功能基因可使用本領域中可用的多種方法中的任一個來插入表達載體中。編碼序列可操作地連接于啟動子，該啟動子將在需要其表達的宿主細胞類型中起作用。額外轉(zhuǎn)錄和翻譯序列還可被工程化到載體中，以用于所要蛋白在宿主細胞中的適當表達。廣大種類的蛋白(包括肽、多肽、寡聚蛋白)的任一個從適當宿主細胞中的表達載體的表達可通過一種或多種本文中所述的rEVE來增加，所述rEVE包括但不限于可溶性蛋白、膜蛋白、結構蛋白(即向細胞、組織或器官提供結構或支撐的蛋白)、核糖體蛋白、酶、酶原、各種抗體分子(包括但不限于TNF-a的抗體，諸如阿達木單抗；選擇蛋白的抗體；免疫調(diào)節(jié)蛋白的抗體，諸如IL-13的抗體；雙可變域免疫球蛋白分子，諸如DVD-IGTM雙可變域免疫球蛋白分子；細胞表面受體的抗體)、細胞表面受體蛋白、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白、翻譯調(diào)節(jié)蛋白、染色質(zhì)蛋白、激素、細胞周期調(diào)節(jié)蛋白、G蛋白、神經(jīng)活性肽、免疫調(diào)節(jié)蛋白(例如介白素、細胞因子、淋巴因子)、血液組分蛋白、離子門蛋白、熱休克蛋25白、二氫葉酸還原酶、抗生素抗性蛋白、任一前述蛋白的功能片段、任一前述蛋白的含表位片段及其組合。所關注重組蛋白可通過轉(zhuǎn)錄和翻譯編碼重組蛋白且存在于本文中所述的表達載體分子上的基因來制備。包括本文中所述的那些的表達載體上的基因的該轉(zhuǎn)錄和翻譯可使用無細胞的轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)或使用適l達載體分子上的基因產(chǎn)生所關注重組蛋白所必需的i當細胞轉(zhuǎn)錄和翻譯機構?；|(zhì)附著區(qū)(MAR)(還稱為支架附著區(qū)(SAR))最初是鑒定為染色體DNA的片段，其結合以制備似乎形成真核生物核中的支架或基質(zhì)的核蛋白。據(jù)信MAR駐留在染色質(zhì)環(huán)中，這樣的染色質(zhì)環(huán)連接于核基質(zhì)且界定或限定染色質(zhì)的個別結構單元。MAR已與一些增強子序列有關且/或與可在染色質(zhì)中發(fā)生的許多過程有關聯(lián)，這樣的過程包括轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)基因表達、轉(zhuǎn)基因重排、重組、復制和轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定化(參見例如，Michalowski等人，S,oc/zem&^y,3S:12795-12804(1999);Zhong等人，A^/.爿cm/.96f2/力11970-11975(1999);Tikhonov等人，77ze尸/朋fCe〃，"249-264(2000);Zhou等人，Ge"。277:139-144(2001);Sumer等人，Ge"匿toe置/z，":1737-1743(2003);美國專利第7,129,062號；Bode等人，MAev.C,/.，/6Z4:389-454(1995);Bode等人,O".五w^r""c￡"x/ms\s7'o/，6:115-138(1996))。ARMl(SEQIDNO:l)和ARM2(SEQIDNO:2)擁有多種MAR元件，其似乎主要以群集形式位于3'和/或5'末端區(qū)中。ARM1在3'末端區(qū)中含有一群MAR元件。在ARM2的狀況下，可發(fā)現(xiàn)MAR元件貫穿該rEVE序列的長度，MAR基序的群集位于5'和3'末端區(qū)中。顯然，攜帶ARM1和ARM2序列的載體及其它核酸分子為MAR元件和MAR元件的群集的適宜來源。因此，ARM1、ARM2及其含MAR的部分可用以使用本領域中可用于重組核酸序列信息或另外將核酸序列信息轉(zhuǎn)移至核酸分子中的各種方法的任一個，來增加MAR元件在所關注核酸分子中的數(shù)量。包含本文中所述的rEVE的序列或其部分的核酸分子還可用于本領域中已知的多種程序中，以在其它核酸分子中操縱、鑒定、制備或擴增rEVE序列。這樣的程序可包括但不限于使用rEVE或其部分作為本領域中已知的各種核酸雜交方法的任一個中的探針，或作為本領域中已知的各種聚合酶鏈反應(PCR)程序的任一個中的引物。本文中所述的rEVE多核普酸分子可用于制備所關注重組蛋白的方法中。優(yōu)選地，制備所關注重組蛋白的該方法包括如本文中所述的重組表達載體，其包含一個或多個編碼所關注重組蛋白的重組基因和至少一種本文中所述的rEVE多核苷酸分子，和將重組表達載體上存在的一個或多個重組基因轉(zhuǎn)錄和翻譯以產(chǎn)生所關注重組蛋白。一個或多個重組基因從表達載體的轉(zhuǎn)錄和翻譯優(yōu)選在包含表達載體的宿主細胞中進行，且在促進所關注重組蛋白的表達的條件下培養(yǎng)。rEVE多核普酸分子可用以增加一種或多種所關注重組蛋白從宿主細胞中的表達載體的表達水平，無"i侖通過瞬時表達(例如在經(jīng)轉(zhuǎn)染的COS或HEK293宿主細胞中)還是通過穩(wěn)定表達(例如在轉(zhuǎn)染的CHO宿主細胞中)。一個或多個重組基因從攜帶如本文中所述的rEVE的表達載體的轉(zhuǎn)錄和翻本文中所述的rEVE多核苷酸分子可用于制備宿主細胞，當表達水平已使用DHFR-甲氨喋呤擴增程序來擴增(提高)時，該宿主細胞穩(wěn)定(與瞬時對比)表達高水平的重組蛋白。這樣的宿主細胞為抗甲氨喋呤(抗MTX)細胞，其不僅當在甲氨喋呤存在下生長時，而且當在不存在曱氨喋呤時生長時，即，當不存在用于通過曱氨喋呤的存在所提供的增加表達的選擇壓力下生長時，繼續(xù)表達高水平的重組蛋白。在一個優(yōu)選實施方案中，產(chǎn)生曱氨喋呤抗性宿主細胞的該方法包括的步驟為將表達載體插入宿主細胞中，該表達載體包含編碼所關注重組蛋白的重組基因，rEVE或其增加表達部分，和二氬葉酸還原酶(DHFR)基因，在甲氨喋呤存在下使宿主細胞生長，以選擇表達所關注重組蛋白的曱氨喋呤抗性宿主細力包，和分離甲氨喋呤抗性宿主細胞；其中分離的甲氨喋呤抗性宿主細胞以比曱氨喋呤敏感性宿主細胞更高的水平表達所關注重組蛋白，且其中該甲氨喋呤抗性宿主細胞當在存在或不存在曱氨喋呤下生長時，穩(wěn)定表達高水平的重組蛋白。優(yōu)選地，rEVE包含SEQIDNO:1、SEQIDNO:2或其增加表達部分。更優(yōu)選地，rEVE包含SEQIDNO:2。本文中所述的rEVE多核苷酸分子還可用于改善表達重組蛋白的宿主細胞群體適應在甲氨喋呤存在下的生長能力的方法中。在一個優(yōu)選實施方案中，該方法包括將表達載體插入宿主細胞中，該表達載體包含.編碼所關注的蛋白的重組基因，.重組表達載體元件(rEVE)多核苦酸分子，其包含選自下列的序列SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:1的一部分、SEQIDNO:2的一部分及其組合，和.二氫葉酸還原酶(DHFR)基因，其中當在曱氨喋呤存在下生長時，與攜帶缺乏該rEVE多核苷酸分子的表達載體的宿主細胞群體相比，含有表達載體的宿主細胞群體具有更高存活性和/或更高生長速率。本文中所述的rEVE多核普酸分子還可用以使用DHFR-曱氨喋呤擴增程序來增加重組蛋白在宿主細胞中的表達擴增(升高)。在一個優(yōu)選實施方案中，該方法包括將表達載體插入宿主細胞中，該表達載體包含.編碼所關注重組蛋白的重組基因，.rEVE多核苷酸分子，其包含選自下列的序列SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:1的一部分、SEQIDNO:2的一部分及其組合，和.二氫葉酸還原酶(DHFR)基因，在甲氨喋呤存在下使宿主細胞生長，以選擇表達所關注重組蛋白的曱氨喋呤抗性宿主細胞，和分離甲氨喋呤抗性宿主細胞，其中分離的曱氨喋呤抗性宿主細胞在曱氨喋呤存在下，以比含有缺乏該rEVE多核苷酸分子的表達載體的甲氨喋呤抗性宿主細胞更高的水平表達所關注重組蛋白。在使用用于所要重組蛋白的擴增表達的曱氨喋呤選擇的本文中所述方法中，曱氨喋呤可在20nM至500nM的范圍內(nèi)使用。然而，有利地，本領域技術人員認識到，更低和更高的曱氨喋呤濃度(諸如5nM至10jiM)還可成功用于擴增表達的甲氨喋呤選擇中(參見例如，Kaufman,說明書第23/46頁R丄，MethodsinEnzymology,第185巻537-566(1990》。本發(fā)明還提供了減少、顯著抑制或基本上沉默重組蛋白從表達載體的表達的方法。該方法可使用包含本文中所述的rEVE序列的一個或多個片段的表達載體，這樣的片段提供比使用全長rEVE序列所提供的更低水平的特定重組基因產(chǎn)物的表達。該減少表達或抑制表達的rEVE衍生序列包括ARM2的序列的截短變體，其具有SEQIDNO:2的堿基1-1086或SEQIDNO:2的堿基1-461的堿基序列。顯然，從這樣的2種變體缺失的3'末端序列區(qū)的存在對重組蛋白的rEVE介導的增加表達而言是極其需要的。具有SEQIDNO:2的堿基1-461的ARM2截短序列的核酸分子尤其適用于抑制或基本上沉默重組蛋白從宿主細胞中的表達載體的表達。這樣的方法可在許多情況下得以使用，這樣的情況包括但不限于，當存在重組蛋白的表達可對宿主細胞有毒性的擔心時，或當某表達水平可存在所要蛋白的純化或分離的問題時，諸如存在蛋白凝集。因此，SEQIDNO:2的堿基462-2422的序列和SEQIDNO:2的堿基1087-2422的序列對最大ARM2rEVE介導的重組蛋白表達增加而言為最優(yōu)選的。因此，尤其適用于增加重組蛋白的表達的rEVE多核苦酸包含SEQIDNO:2的堿基462-2422的序列和/或SEQIDNO:2的堿基1087-2422的序列。本發(fā)明的額外實施方案和特征將由以下非限制性實施例而顯而易見。實施例實施例1.ARM1和ARM2重組表達載體元件(rEVE)的克隆和序列分析研究攜帶穩(wěn)定整合的表達載體的DUXB11CHO細胞系的產(chǎn)生，以確定在表達載體上編碼的重組抗IL-12抗體的格外高水平表達的可能基礎，宿主CHO細胞用該表達載體轉(zhuǎn)染。在該研究中，將旁側被整合的表達載體的基因組DNA區(qū)域克隆且測序。簡言之，用Xbal消化來從宿主細胞的基因組DNA，且使用基本上如通過Reynaud等人(丄Mo/./W:481-504(1980))所述的BioGelA-50管柱純化具有大致5千堿基(kb)的平均尺寸的片段。通過將片段克隆至人DASH⑧克隆載體(Stratagene，LaJolla,California)中來制備純化基因組片段的文庫。將文庫擴增且使用GIGAPACK⑧包裝萃取物(Stratagene)來包裝，且根據(jù)制備商方案轉(zhuǎn)導至XL1-BlueMRA或XL1-BlueMRA(P2)大腸桿菌細胞中。隨后，根據(jù)Stratagene方案，就抗IL-12抗體的重鏈可變區(qū)(Vh)的編碼序列而言，用探針來篩選文庫。XDASH克隆存21中的14.5kbXbal片段含有用于抗體表達載體的插入位點連同旁側基因組序列。這些旁側基因組區(qū)是指定為ARM1和ARM2。ARM1和ARM2區(qū)域的序列分別被測定為SEQIDNO:1和SEQIDNO:2的序列。關于CHO細胞基因組中的抗體表達載體的插入位點，ARMl位于插入位點的上游且為5'至抗體重鏈的載體基因的轉(zhuǎn)錄方向，ARM2位于插入位點的下游且為3'至抗體輕鏈的載體基因的轉(zhuǎn)錄方向。SEQIDNO:1和SEQIDNO:2相對CHO表達序列標記(EST)數(shù)據(jù)庫的BLAST分析未能揭示任何相關編碼序列，暗示ARMl和ARM2rEVE序列不含任何CHO編碼序列。rEVE序列的BLAST分析還相對小鼠基因組序列來進行。未鑒定到與ARMl序列同源的小鼠基因組序列。然而，ARM2序列似乎與不含有已知編碼序列的小鼠染色體14上的高度保守區(qū)域有關。使用載體NTI序列分析程序(Invitrogen),還就基質(zhì)附著區(qū)(MAR)元件的各種代表性(即并非全部)核苷酸序列基序的樣本的存在來篩選ARMl(SEQIDNO:l)和ARM2(SEQIDNO:2)的序列(參見例如，Michalowski等人，S,0c/^,'^7，12795-12804(1999))。通過計算機程序篩選的特定MARDNA序列基序顯示于表1中(互補鏈序列未列出)。表1.代表性基質(zhì)附著區(qū)(MAR)元件的核苷酸序列基序<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>配，但3'末端為G)或TAWAWWW(SEQIDNO:5的堿基l-7)(MRS的第一部分，無錯配)十AWWRTAA麗WWG(SEQIDNO:5的堿基10-21)(MRS的第二部分，允許l個錯配，但3'末端為G),其中第一和第二MRS部分經(jīng)計數(shù)具有至多4個間插堿基(N,-4)或至多3個重疊堿基<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>*互補鏈序列未列出；縮寫Y二T或C;W=A或T;N=A、T、G或C;R=G或A如下文表2中所示，在ARM1DNA序列(SEQIDNO:l)或其互補鏈序列中鑒定至少41個MAR元件序列，且在ARM2DNA序列(SEQIDNO:2)或其互補鏈序列中鑒定至少U4個MAR元件序列。表2.ARM1和ARM2DNA序列中的MAR序列位置<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>*ARM1序列(SEQIDNO:l)或ARM2序列(SEQIDNO:2);"互補"=互補鏈序列；"群集"二特測序列中的指定MAR元件的超過一個拷貝表2中的ARM1和ARM2的MAR序列分析(包括互補鏈分析)的結果指示，各種MAR主要在ARMl(SEQIDNO:l)的3'末端部分中群集且在ARM2(SEQIDNO:2)的5'部分和3'部分中群集。ARM1具有比ARM2更少的這樣的MAR位點。此外，ARM1中的大多數(shù)MAR序列在序列的3'區(qū)中，而ARM2的5'和3'區(qū)是由MAR序列群集(populated)。實施例2.用于研究ARM1和ARM2rEVE對重組蛋白的表達水平的影響的通用方案用于表達試驗的細胞DUXB11CHO細胞系為二氫葉酸還原酶(DHFR，表達缺陷的CHO細胞系(參見，Urlaub,G.和Chasin，L.A.,尸rac.淑/."S.A，77:4216-4220(1980))。該細胞系的DHFR一表型允許使用標準二氬葉酸還原酶-甲氨喋呤系統(tǒng)(DHFR-MTX)方案以擴增已轉(zhuǎn)染至這樣的細胞中的表達載體的拷貝數(shù)量(參見例如，Kaufman，R丄，/"GeneticEngineering:PrinciplesandMethods(編者J.K.Setlow),第9巻，第155頁(PlenumPublishing,NewYork,1987))。含有ARM1和ARM2rEVE序列的表達載體圖1提供了質(zhì)粒表達載體pA205的示意圖。圖2提供質(zhì)粒表達載體pA205Genomic的示意圖，其中編碼阿達木單抗的重鏈和輕鏈的基因的旁側是ARM1和ARM2,以致ARM1序列位于阿達木單抗的重鏈基因的上游且ARM2序列位于阿達木單抗的輕鏈基因的下游。圖3提供質(zhì)粒表達載體pA205Al的示意圖，其中ARM1序列位于阿達木單抗的重鏈基因的上游。圖4提供質(zhì)粒表達載體pA205A2的示意圖，其中ARM2序列位于阿達木單抗的輕鏈基因的下游。圖5提供了質(zhì)粒表達載體pCHOEL246GGhum的示意圖，該質(zhì)粒表達載體含有人類抗-EL-選擇蛋白抗體的重鏈和輕鏈的基因。圖6提供質(zhì)粒表達載體pA-Gen-EL-選擇蛋白的示意圖，其中編碼抗-EL-選擇蛋白抗體的重鏈和輕鏈的基因的旁側是ARM1和ARM2序列，以致ARM1序列位于抗體重鏈基因的上游且ARM2序列位于抗體輕鏈基因的下游。圖7提供了質(zhì)粒表達載體pA205-eGFP的示意圖，該質(zhì)粒表達載體含有增強綠色熒光蛋白(eGFP)的基因。圖8提供質(zhì)粒表達載體pA205G-eGFP的示意圖，其中編碼增強綠色熒光蛋白的基因是的旁側是ARM1和ARM2序列，以致ARM1序列位于eGFP基因的上游且ARM2序列位于eGFP基因的下游。圖9提供了質(zhì)粒表達載體pA205A2-Spe-trunc的示意圖，該質(zhì)粒表達載體基本上與圖4中所示的表達載體pA205A2相同，除ARM2序列已經(jīng)截短的ARM2變體"A2(bp1-1086)"置換外，該截短的ARM2變體是由于ARM2DNA—皮限制性核酸內(nèi)切酶5^e/消化而具有SEQIDNO:2的堿基1-1086的核酸堿基序列。圖10提供質(zhì)粒表達載體pA205A2-Swa-trunc的示意圖，該質(zhì)粒表達載體基本上與圖4中所示的表達載體pA205A2相同，除ARM2序列已經(jīng)被截短的ARM2變體"A2(bpl-461)"置換外，該截短的ARM2變體是由于ARM2DNA被限制性核酸內(nèi)切酶Swa/消化而具有SEQIDNO:2的堿基1-461的核酸堿基序列。培養(yǎng)基aMEM為最低必需培養(yǎng)基，a培養(yǎng)基(GIBCO⑧，Invitrogen,Carlsbad,California)。細胞生長和轉(zhuǎn)染每次轉(zhuǎn)染，用各自在10ml補充有5%透析FBS和H/T(GIBCO)的aMEM中的lxl()6個B3.2親本DUXBllCHO細胞將3個10cm組織培養(yǎng)氺反4妾種。18小時(18h)后，根據(jù)CurrentProtocolsinMolecularBiology(A謂bel,F.V.,Brent,R.,Moore,D.M,Kingston,RE.,Seidman，J.G，Smith,J.A.和K.Struhl編)，(WileyInterscience，NewYork,1990))中所述的磷酸鈣轉(zhuǎn)染方案(具有下文所指示的若干修改)將這樣的細胞轉(zhuǎn)染。通過抽吸從培養(yǎng)板移除生長培養(yǎng)基，且將9ml的Ham氏F12培養(yǎng)基(Invitrogen)添加至各培養(yǎng)板中。在轉(zhuǎn)染之前，在37。C下，將培養(yǎng)板培養(yǎng)2小時。磷酸鉀轉(zhuǎn)染方案將75微克(75pg)DNA溶于50ml錐形管中的1.35ml水中。添加150微升(150pl)的2.5MCaCl2,且將該DNA-4丐混合物逐滴添加至50ml錐形管中的1.5ml的2xHeBES(HEPES緩沖鹽水)中。用微量吸管使HeBES鼓泡，同時用Pasteur微量吸管添加DNA-4丐混合物。通過渦旋5秒來混合混合物且在室溫下將其培養(yǎng)20分鐘。將1毫升(lml)DNA-鈣混合物均勻分布在具有粘著細胞的各培養(yǎng)皿上，使其生長且備用于在如上所述的F12培養(yǎng)基中的轉(zhuǎn)染，且隨后在37。C下將培養(yǎng)物培養(yǎng)4小時。培養(yǎng)后，抽吸培養(yǎng)板，且將2ml在F12培養(yǎng)基中的10%二甲亞砜(DMSO)添加至各培養(yǎng)板中(DMSO休克處理)。DMSO休克持續(xù)1分鐘，之后，通過將5mlPBS(磷酸鹽緩沖鹽水)添加至各培養(yǎng)板中來稀釋DMSO。抽吸培養(yǎng)板且在PBS中再洗滌2次。添加10ml的aMEM/50/。FBS/HT,且在37。C下將培養(yǎng)板培養(yǎng)過夜。轉(zhuǎn)染的細胞在96孔培養(yǎng)板中的接種與甲氨喋呤(MTX)擴增第二天，如下將細胞接種至96孔培養(yǎng)板中通過胰蛋白酶消化收獲來自全部10cm培養(yǎng)板的細胞，且在aMEM/5Q/0FBS中以2000個細胞/ml的密度再懸浮。以10ml/板來接種96孔培養(yǎng)板，100ilU/孔。l周后，2周后且再次在其后5天改變96孔培養(yǎng)板上的培養(yǎng)基。所用培養(yǎng)基aMEM/5。/。FBS對表達DHFR的細胞有選擇性。最后一次培養(yǎng)基改變后2天，1:40稀釋培養(yǎng)物上清液且使用對人類IgGy鏈有特異性的ELISA來測試，以偵測阿達木單抗或抗-EL-選擇蛋白抗體的表達。以2.0ml/孔的ocMEM/5o/()FBS,將得到最高ELISA信號的克隆從其96孔培養(yǎng)板轉(zhuǎn)移至12孔培養(yǎng)板中。當長滿(大致2-5天后)時，再次檢定這樣的物質(zhì)，且將克隆分離至相同培養(yǎng)基+20nMMTX中用于擴增。最初在于12孔組織培養(yǎng)板中的aMEM/50/。FBS和20nMMTX中選擇細胞。在該MTX水平下的初始選擇后，經(jīng)18天的平均時期，將這樣的細胞在含有20nMMTX的生長培養(yǎng)基中傳代最少2次以上。隨后，將細胞系擴增至100nMMTX。在該培養(yǎng)期期間，培養(yǎng)物的阿達木單抗(人類抗-TNF-a抗體)或抗-EL-選擇蛋白生產(chǎn)力增加。在100nMMTX水平下選擇之后，經(jīng)18天的平均時期，將細胞系在含有100nMMTX的生長培養(yǎng)基中傳代最少2次以上。當有指示時，將細胞系進一步擴增至500nMMTX。在500nMMTX水平下選擇之后，經(jīng)18天的平均時期，將細胞系在含有500nMMTX的生長培養(yǎng)基中傳代最少2次以上。攜帶包含ARM1核酸序列(SEQIDNO:1)、ARM2核酸序列(SEQIDNO:2)或ARM1和ARM2序列的組合的表達載體的轉(zhuǎn)染的CHO細胞的培養(yǎng)物在曱氨喋呤存在下，與缺乏這樣的rEVE序列的相同表達載體轉(zhuǎn)染的CHO細胞相比，適應更好，即，具有更高存活性和/或更高生長速率。實施例3.ARM1和ARM2序列對轉(zhuǎn)染的CHO細胞中的抗-TNF-a的表達水平的影響在該試驗中，檢查ARM1和ARM2序列對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細胞中的人類抗-TNF-a抗體(阿達木單抗)的表達的影響。在用表達載體pA205(無ARM序列)、pA205Genomic(含有ARM1和ARM2)、pA205Al(含有ARM1)或pA205A2(含有ARM2)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細胞中，比較阿達木單抗的表達水平。表3顯示，阿達木單抗在具有來自在指定擴增水平(甲氨喋呤"MTX"的濃度)下的各載體轉(zhuǎn)染之前3個產(chǎn)生克隆的粘著培養(yǎng)物中的平均產(chǎn)生水平。表3.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細胞中的阿達木單抗表達水平載體0nMMTX20nMMTX100nMMTXpA2051.57嗎/ml4.20|_ig/ml5.53昭/mlpA205Genomic4.60|xg/ml14.80嗎/ml21.03嗎/mlpA205Al3.13(ig/ml9.卯|xg/ml17.3嗎/mlpA205A24.53|xg/ml24.23ng/ml20.8ng/ml表3中的數(shù)據(jù)指示，與缺乏ARM序列的載體(pA205)轉(zhuǎn)染的細胞中所見相比，單獨或呈組合的ARM1和ARM2序列增加阿達木單抗的表達水平?？傊?，單獨的ARM2(p205A2)相對于所有其它轉(zhuǎn)染子而言提供最大水平的增加表達，而單獨的ARMl(p205Al)提供最少的表達增加水平。數(shù)據(jù)顯示，具有ARM1序列(SEQIDNO:1)或ARM2序列(SEQIDNO:2)的分離核酸分子為代表性重組表達載體元件(rEVE),其當插入表達載體中時可增加由表達載體編碼且從表達載體表達的重組蛋白36的表達。還在不存在曱氨喋呤擴增時，在懸浮液培養(yǎng)物中l(wèi)周和4周后，比較阿達木單抗通過上述載體轉(zhuǎn)染的個別克隆的表達水平。結果顯示于表4中。表4.在不存在甲氨喋呤時1周和4周后，在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細胞的個別克隆的懸浮液培養(yǎng)物中的阿達木單抗表達水平<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>表4中的數(shù)據(jù)顯示，將ARM2并入不具有ARM1(pA205A2)的pA205中增強所增加阿達木單抗表達水平隨時間的穩(wěn)定性。詳細來說，在ARM1和ARM2(pA205Genomic)兩者或ARMl(pA205Al)單獨存在時，最初在培養(yǎng)物中觀察到阿達木單抗的增加的表達水平，但該水平可經(jīng)大約數(shù)周快速下降至低得多的水平(參見表4)。相反，在ARM2單增加的表達水平在4種培°養(yǎng)物的3種中穩(wěn)定地;iM爭4周的時期。因此、,ARM2可穩(wěn)定地維持阿達木單抗在轉(zhuǎn)染的CHO細胞的懸浮液培養(yǎng)物中的表達水平的顯著升高。實施例4.ARM1和ARM2序列對轉(zhuǎn)染的CHO細胞中的抗-EL-選擇蛋白抗體的表達水平的影響在該試驗中，檢查ARM1和ARM2序列對人類抗-EL-選擇蛋白抗體(結合E-和L-選擇蛋白)在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細胞中的表達的影響。在用表達載體pCHOEL246GGhum(無ARM序列)或用表達載體pA-Gen-EL-選擇蛋白(含有ARM1和ARM2)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細胞中比較該抗選擇蛋白抗體的表達水平。表5顯示，抗選擇蛋白抗體于具有來自在指定擴增水平(甲氨喋呤"MTX"的濃度)下的各載體轉(zhuǎn)染之前3個產(chǎn)生克隆的粘著培養(yǎng)物中的平均產(chǎn)生水平。表5.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細胞中的抗-EL-選擇蛋白抗體的表達水平載體0nMMTX20nMMTX100nMMTX500nMMTXpCHOEL246GGhum7.93略/ml15.47ng/ml17.27昭/ml22.30嗎/mlpA-Gen-EL-選擇蛋白6.27.嗎/ml19.87嗎/ml26.63嗎/ml44.13|ag/ml表5中的數(shù)據(jù)顯示，ARM1和ARM2序列(pAGen-EL-選擇蛋白)在增加抗-EL-選擇蛋白抗體在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細胞的曱氨喋呤擴增培養(yǎng)物中的表達水平上是有效的。實施例5.ARM1和ARM2序列對增強綠色焚光蛋白(eGFP)在轉(zhuǎn)染的CHO細胞中的表達水平的影響如上所述，將含有編碼增強綠色焚光蛋白(eGFP)的基因構建體轉(zhuǎn)染至CHO細胞中，例外的為，細胞與pcDNA3.1-hygro共轉(zhuǎn)染以提供用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子的選擇性標記，即潮霉素抗性。表達載體peGFP提供eGFP在CMV啟動子的轉(zhuǎn)錄控制下的表達的陽性對照。質(zhì)粒pA205-eGFP含有不具有ARM1或ARM2序列的pA205表達載體上的eGFP基因(圖7)。質(zhì)粒pA205Gen-eGFP(圖8)含有在編碼eGFP的基因旁側的ARM1和ARM2。在這樣的質(zhì)粒的任一個中不存在DHFR選擇基因。因此，不采取DHFR-甲氨喋呤擴增步驟。用濃度為400pg/ml的潮霉素選擇轉(zhuǎn)染子歷時2周，必要時分離，且隨后通過FACS分選以測定表達水平。細胞最初分選成各類型載體的池，且使表達細胞再生長2周，且隨后再分選。38表6.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細胞中的eGFP的表達水平載體平均熒光單位peGFP(陽性對照)239.03pA205誦eGFP17.36pA205Gen畫EGFP104.86表6中的數(shù)據(jù)指示，與用相同但缺乏ARM序列的eGFP表達載體(pA205-eGFP)轉(zhuǎn)染的細胞中的表達水平相比，ARM1和ARM2序列在顯著增加eGFP在轉(zhuǎn)染的CHO細胞中的表達水平上是有效的。實施例6:ARM2的缺失突變體對阿達木單抗在轉(zhuǎn)染的CHO細胞中的表達水平的影響在pA205A2載體中，將ARM2序列(SEQIDNO:2)的3'末端區(qū)截斷成Spel分裂位點(在SEQIDNO:2的堿基1086處)或Swal分裂位點(在SEQIDNO:2的堿基461處)以分別產(chǎn)生pA205A2-Spe-trunc(含有SEQIDNO:2的堿基1-1086的序歹')和pA205A2-Swa-trunc(含有SEQIDNO:2的堿基1-461的序列)。將所得質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到如上所述的CHO細胞中且擴增至20nMMTX。表7顯示，在具有來自在各擴增水平下的各轉(zhuǎn)染之前3個產(chǎn)生克隆的粘著培養(yǎng)物中的平均表達水平。表7.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細胞中的阿達木單抗的表達水平載體0nMMTX20nMMTXpA2051.80pg/ml1.57ng/mlpA205A26.10嗎/ml15.73(xg/mlpA205A2-Spe-tr薦3.57|xg/ml3.00(ig/mlpA205A2-Swa-trunc0.83(ig/ml0.90嗎/ml表7中的數(shù)據(jù)顯示，與用pA205A2載體轉(zhuǎn)染的CHO細胞相比，用含有ARM2DNA的5'末端1086石咸基對的表達載體pA205A2-Spe-trunc轉(zhuǎn)染的CHO細胞以更低的增加表達水平來產(chǎn)生阿達木單抗。驚人地，用含有ARM2DNA的5'末端461堿基對的表達載體pA205A2-Swa-trunc轉(zhuǎn)染的細胞，以比用不含有ARM序列的pA205示，從ARM2DNA的3'末端缺失的區(qū)域?qū)χ亟M蛋白在宿主細胞中的增加表達尤其重要。另外，ARM2DNA的相對較小(即，461堿基對)5'末端片段的單獨存在，實際上似乎減少重組基因產(chǎn)物在轉(zhuǎn)染宿主細胞中的表達，且可尤其適用于大體上減少或沉默重組基因產(chǎn)物的表達。當(例如)在某些培養(yǎng)條件下，基因產(chǎn)物在宿主細胞中的表達將有毒性或另外非所要時，可需要該應用。實施例7.來自前述研究的個別轉(zhuǎn)染子的表達水平下文所示的表提供通過在前述研究中產(chǎn)生的個別轉(zhuǎn)染克隆來產(chǎn)生的重組蛋白的表達水平。表8.用pA205轉(zhuǎn)染的CHO細胞中的阿達木單抗的表達水平<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>680.01690.01700.01710.009720.007730.007740.007750.006760770780表9.用pA205Genomic轉(zhuǎn)染的CHO細胞中的阿達木單抗的表達水平pA205Genomic克隆#0nMMTX20nMMTX100nMMTX500nMMTX19.319.161.040.626.916.559.740.236.515.152.028.645.7013.636.023.955.613.225.964.60.720.774.310.319.684.19.817.694.109.716.3104.009.515.6113.98.911.4123.67.69.3133.56.98.1143.46.48153.365.9162.94.50.1172.93.10.04182.702.5192.602.4202.51.6212.41.4222.21.1232.20.05242.20252.20026227228l.卯42291.90301.8311.80321.7331.7341.6351.6361.6371.50381.4391.4401.40411.3421.3431.30441.30451.2461.1471.1481.1491501.00510.80520.7530.7540.7550.6560.60570.5580.5590.5600.5610.5620.5630.4640.4650.4660.3670.3680.3690.3700.2710.243<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>表10.用pA205Al轉(zhuǎn)染的CHO細胞中的阿達木單抗的表達水平<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>表11.用pA205A2轉(zhuǎn)染的CHO細胞中的阿達木單抗的表達水平<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>表12.用pA205A2-Spe-trunc轉(zhuǎn)染的CHO細胞中的阿達木單抗的表達水平pA205A2-Spe-trunc克隆#0nMMTX20nMMTX15.54.723.12.332.12.0422.01.31.961.21.871.1.481.11.2911.0100.90.8110.90.4120.90.2130.80140.7050.70160.7170.6180.5190.4200.4210.4220.4230.4240.3250.2260.246表13.用pA205A2-Swa-trunc轉(zhuǎn)染的CHO細胞中的阿達木單抗的表達水平<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>表14.用pCHOEL246GGhum轉(zhuǎn)染的CHO細胞中的抗-EL-選擇抗體的表達水平<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>表15.用pA-Gen-EL-選擇蛋白轉(zhuǎn)染的CHO細胞中的抗-EL-選擇蛋白抗體的表達水平—<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>-化-13抗體在培養(yǎng)物內(nèi)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的哺乳動物細胞中rEVE介導的表達增力口。使用標準方法，將編碼具有人類IgGyl同型的人源化抗-IL-13單抹抗體的重鏈和輕鏈的DNA分子(參見美國第11/899,819號，其以引用的方式并入本文)插入表達載體質(zhì)粒pBJ(—種DHFR-MTX可擴增表達質(zhì)粒)中，以產(chǎn)生表達質(zhì)粒pBJ-13C5.5(親本表達質(zhì)粒)。隨后將包含ARM2序列(SEQIDNO:2)的rEVE多核普酸插入質(zhì)粒pBJ-13C5.5中，以產(chǎn)生含rEVE的表達質(zhì)粒pA2-13C5.5(ARM2rEVE表達質(zhì)粒)。按照先前實施例中所述的通用轉(zhuǎn)染方案，用親本表達質(zhì)粒pBJ-13C5.5或含A固2的rEVE表達質(zhì)粒pA2-13C5.5轉(zhuǎn)染CHO細胞，以獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細胞。轉(zhuǎn)染后24小時，將來自各轉(zhuǎn)染的細胞接種至48個96孔培養(yǎng)板中(200個細胞/孔)。就人類IgG的表達而言，通過ELISA篩選個別孔的培養(yǎng)基。在用ARM2rEVE表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細胞的培養(yǎng)物(孔)中，光密度比用親本表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細胞稍微更高。與用親本質(zhì)粒pBJ-13C5.5轉(zhuǎn)染的細胞的每培養(yǎng)板平均68個集落相比，當細胞用ARM2rEVE質(zhì)粒pA2-13C5.5轉(zhuǎn)染時，每培養(yǎng)板平均74個集落(孔)在選擇過程中存活。隨后使來自各轉(zhuǎn)染的15個穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的克隆經(jīng)受DHFR-甲氨喋呤(MTX)擴增。擴增之前，乂人ARM2rEVE質(zhì)粒轉(zhuǎn)染克隆獲得的抗-IL-13抗體的平均表達水平比從親本質(zhì)粒轉(zhuǎn)染克隆的平均表達水平高兩倍。隨后，通過2種方案中的任一個擴增抗體表達。使用用于如上文實施例2中所述的DHFR-MTX擴增的基本方案，首先使克隆在20nMMTX的濃度下經(jīng)受選擇，接著進一步在100nMMTX下選擇。在另一擴增方案中，直接在100nMMTX下選擇克隆，而無中間MTX濃度下的介入選擇。下文表16顯示，在含有指定水平的擴增(甲氨喋呤"MTX"的濃度)的培養(yǎng)基中的2次繼代后，在具有來自各轉(zhuǎn)染之前3個產(chǎn)生的克隆的培養(yǎng)物中的抗-IL-13抗體的平均產(chǎn)生水平。表16.轉(zhuǎn)染的CHO細胞中的人源化抗-IL-13抗體水平表達載體0nMM丁X20nMMTX100nMMTXpBJ-13C5.52.63(ig/ml2.00^g/ml3.04^g/mlpBJ陽13C5.52.63|Lig/mlN.A.1.72pg/mlpA2-13C5.54.35pg/ml5.85^g/ml14.94(ig/mlpA2-13C5.54.35(ig/mlN.A.14.33^g/mlN.A-不適用，不為擴增方案的部分表16中的數(shù)據(jù)清楚顯示，與從攜帶缺乏ARM2rEVEDNA的親本表達質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染子獲得的表達水平相比，ARM2rEVE將人源化抗-IL-13抗體的表達水平增加大約3倍至5倍。另外，當在100nMMTX的擴增水平下生長時，ARM2rEVE表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染子的一個次純是以高達95pg/ml的水平和21.74pg/細胞/天的比生產(chǎn)率表達人源化抗-IL-13抗體。當在MTX選擇下生長時，通過用ARM2rEVE表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的克隆的抗-IL-13抗體的擴增的表達水平易于維持歷時至少3周。實施例9.ARM1和ARM2rEVE多核普酸分子對阿達木單抗在瞬時表達系統(tǒng)中的表達的影響該研究經(jīng)設計以確定rEVE多核苷酸分子是否將增加重組蛋白在瞬時表達系統(tǒng)中的表達水平。用表達質(zhì)粒載體pA205、pA205Genomic、pA205Al、pA205A2、pA205A2-Spec-trunc和pA205A2-Swa-trimc轉(zhuǎn)染HEK293細胞。根據(jù)公開條件(Durocher等人，iVwc/e,cJc,A尺m.,3(7:E9)用與聚乙烯亞胺復合的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染在Freestyle293表達培養(yǎng)基(GIBCO⑧，Invitrogen,Carlsbad,CA)中培養(yǎng)的HEK293細胞。不執(zhí)行用于載體整合的選擇。轉(zhuǎn)染后，將細胞培養(yǎng)7天，且如上所述測試培養(yǎng)物上清液的等分試樣的阿達木單抗?jié)舛取?次轉(zhuǎn)染的結果顯示于表17中。對第3次轉(zhuǎn)染而言，一式三份來測試表達水平。51表17.轉(zhuǎn)染的HEK293細月包中的阿達木單抗的表達水平*轉(zhuǎn)染pA205pA205GenomicpA205AlpA205A2pA205A2-Spe-truncpA205A2-Swa-trunc12.15.45.43.325.320.320.39.934.311.911.910.22.21.24.115.715.72.31.33.014.214.22.31.0*阿達木單抗的(ig/ml表17中的結果顯示，當ARM1和ARM2序列單獨地(pA205Al、pA205A2)或以組合形式(pA205Genomic)存在于表達質(zhì)粒載體上時，其可增加阿達木單抗在HEK293細胞中的表達水平。在該HEK293瞬時表達系統(tǒng)中，ARM1賦予比ARM2更大程度的阿達木單抗表達增加。相反，在CHO穩(wěn)定表達系統(tǒng)中(參見上文實施例3)，ARM2賦予比ARM1更大程度的阿達木單抗表達增加。如在CHO穩(wěn)定表達系統(tǒng)(上文實施例6)中所見，ARM2的增加效應還在用攜帶Spel-或Swal-截短ARM2序列的表達質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染的HEK293細胞中明顯降低，包括表達降低至在經(jīng)pA205對照(無ARM序列)質(zhì)粒表達載體轉(zhuǎn)染的細胞中所見以下的程度。上文引用的所有專利、申請和公開是以引用的方式并入本文。所明白:且本發(fā)明的所有這樣的變體和^代性實施例意欲i蓋于上述描述和下文的申請專利范圍中。5權利要求1.一種分離的重組表達載體元件(rEVE)多核苷酸分子，其包含選自下列的核苷酸堿基序列SEQIDNO1的核苷酸堿基序列、SEQIDNO2的核苷酸堿基序列、與任何前述序列互補的序列、任何前述序列的增加表達部分及其組合。2.根據(jù)權利要求1的分離的rEVE多核苷酸分子，其中所述rEVE多核苷酸分子包含選自下列的SEQIDNO:2序列的增加表達部分SEQIDNO:2的堿基462-2422的序列和SEQIDNO:2的堿基1087-2422的序列。3—種重組載體，其包含如權利要求1或2中所描述的rEVE多核苦酸分子。4.根據(jù)權利要求3的重組載體，其中所述重組載體為重組表達載體。5.根據(jù)權利要求4的重組表達載體，其選自重組質(zhì)粒表達載體、重組真核病毒表達載體、重組噬菌體表達載體、重組酵母微型染色體表達載體、重組細菌人工染色體表達載體和重組酵母表達質(zhì)粒載體。6.根據(jù)權利要求4的重組表達載體，其中所述重組表達載體包含一個或多個編碼一種或多種重組蛋白的功能重組基因。7.根據(jù)權利要求6的重組表達載體，其中所述一種或多種重組蛋白選自可溶性蛋白、膜蛋白、結構蛋白、核糖體蛋白、酶、酶原、抗體分子、細胞表面受體蛋白、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白、翻譯調(diào)節(jié)蛋白、染色質(zhì)蛋白、激素、細胞周期調(diào)節(jié)蛋白、G蛋白、神經(jīng)活性肽、免疫調(diào)節(jié)蛋白、血液組分蛋白、離子門蛋白、熱休克蛋白、二氫葉酸還原酶(DHFR)、抗生素抗性蛋白、任一前述蛋白的功能片段、任一前述蛋白的含表位片段及其組合。8.根據(jù)權利要求7的重組表達載體，其中所述抗體分子選自抗-TNF-a抗體、抗-EL-選擇蛋白抗體、抗-IL-13抗體以及雙可變域免疫球蛋白分子。9.根據(jù)權利要求8的重組表達載體，其中所述抗-TNF-a抗體為阿達木單抗。10.根據(jù)權利要求4-9中任一項的重組表達載體，其中所述重組表達載體包含編碼二氫葉酸還原酶的基因的至少一個拷貝。11.一種宿主細胞，其包含根據(jù)權利要求3-10中任一項的載體。12.根據(jù)權利要求11的宿主細胞，其中所述宿主細胞為真核宿主細月包或原核宿主細月包。13.根據(jù)權利要求12的宿主細胞，其中所述宿主細胞為選自下列的真核宿主細胞哺乳動物宿主細胞、昆蟲宿主細胞、植物宿主細胞、真菌宿主細胞、真核藻類宿主細胞、線蟲宿主細胞、原生動物宿主細胞和魚類宿主細胞。14.根據(jù)權利要求13的真核宿主細胞，其中所述真核宿主細胞為哺乳動物宿主細月包。15.根據(jù)權利要求14的哺乳動物宿主細胞，其中所述哺乳動物宿主細胞選自中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、COS細胞、Vero細胞、SP2/0細胞、NS/0骨髓瘤細胞、人類胚腎(HEK293)細胞、幼倉鼠腎(BHK)細胞、Hela細胞、人類B細胞、CV-1/EBNA細胞、L細胞、3T3纟田胞、HEPG2細胞、PerC6細胞和MDCK細胞。16.根據(jù)權利要求15的哺乳動物宿主細胞，其中所述哺乳動物宿主細月包為CHO細胞。17.根據(jù)權利要求13的真核宿主細胞，其中所述真核宿主細胞為真菌宿主細胞。18.根據(jù)權利要求17的真菌宿主細胞，其中所述真菌宿主細胞選自曲霉屬0^perg/〃w)、鏈孢霉屬(AAewm^ora)、酵母菌屬(Sacc/zaramycw)、畢赤酵母屬(尸/c/na)、漢森酵母屬(7/a朋e"w/a)、裂殖酵母屬(Sc/n'msacc/^謹少ce力、克魯維酵母屬(《/w"eram少ce力、耶氏酵母屬(KaTravWa)和念珠菌屬(Ca"t^'t/a)。19.根據(jù)權利要求18的酵母菌屬宿主細胞，其為釀酒酵母(S.cereWw'—宿主細月包。20.根據(jù)權利要求13的真核宿主細胞，其中所述真核宿主細胞為原生動物宿主細^<。21.根據(jù)權利要求20的原生動物宿主細胞，其中所述原生動物宿主細胞為蜥蜴利什曼原蟲(Le^/zmam'a^reWo/ae)宿主細月包。22.—種制備所關注重組蛋白的方法，所述方法包括轉(zhuǎn)錄和翻譯存在于根據(jù)權利要求4-10中任一項的重組表達載體上的一個或多個編碼所關注重組蛋白的基因。23.根據(jù)權利要求22的方法，其中所述轉(zhuǎn)錄和翻譯發(fā)生在無細胞的轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中或在宿主細胞中。24.根據(jù)權利要求23的方法，其中所述轉(zhuǎn)錄和翻譯發(fā)生在宿主細胞中。25.根據(jù)權利要求24的方法，其中所述宿主細胞為CHO宿主細胞。26.—種制備穩(wěn)定表達高水平所關注重組蛋白的宿主細胞的方法，所述方法包括將根據(jù)權利要求10的重組表達載體插入宿主細胞中，使所述宿主細胞在甲氨喋呤存在下生長，以選擇表達該所關注重組蛋白的甲氨喋呤抗性宿主細胞，和分離所述甲氨喋呤抗性宿主細胞，其中所述分離的曱氨喋呤抗性宿主細胞表達該所關注重組蛋白的水平高于甲氨喋呤敏感性宿主細胞，并且其中所述曱氨喋呤抗性宿主細胞在曱氨喋呤存在或不存在下生長時，穩(wěn)定表達高水平的所述重組蛋白。27.根據(jù)權利要求26的方法，其中所述曱氨喋呤是以5nM至10^M范圍內(nèi)的濃度存在。28.根據(jù)權利要求26的方法，其中所述宿主細胞為CHO宿主細胞。29.—種用于擴增重組表達載體上編碼的所關注重組蛋白在宿主細胞中表達的二氫葉酸還原酶(DHFR)-甲氨喋呤方法，其中所述重組表達載體包含編碼該所關注重組蛋白的基因和編碼DHFR的基因，其改善在于所述重組表達載體還包含#4居權利要求1或2的rEVE多核苷酸分子，其中含有所述表達載體的宿主細胞在甲氨喋呤存在下生長以選擇且產(chǎn)生甲氨喋呤抗性宿主細胞，所述甲氨噪呤抗性宿主細胞在甲氨喋呤存在或不存在下生長時，以擴增水平穩(wěn)定表達該所關注重組蛋白。30.根據(jù)權利要求29的方法，其中所述曱氨喋呤是以5nM至10范圍內(nèi)的濃度存在。31.根據(jù)權利要求29的方法，其中所述宿主細胞為CHO宿主細胞。32.—種改善或增強表達重組蛋白的宿主細胞群體適應在甲氨喋呤存在下生長的能力的方法，所述方法包括以下步驟將重組表達載體插入宿主細胞內(nèi)，所迷重組表達載體包含編碼所關注重組蛋白的重組基因，重組表達載體元件(rEVE)多核普酸分子，其包含選自下列的序列SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:1的一部分、SEQIDNO:2的一部分及其組合，和二氫葉酸還原酶(DHFR)基因；其中在曱氨喋呤存在下生長時，與攜帶缺乏所述rEVE多核苷酸分子的相同重組表達載體的宿主細胞群體相比，含有所述重組表達載體的宿主細胞群體具有更高存活性和/或更高生長速率。33.根據(jù)權利要求32的方法，其中所迷曱氨喋呤是以5nM至10范圍內(nèi)的濃度存在。34.根據(jù)權利要求32的方法，其中所述宿主細胞為CHO宿主細胞。35.—種制備表達高水平重組蛋白的甲氨喋呤抗性宿主細胞的方法，所述方法包括將重組表達載體插入宿主細胞內(nèi)，所述重組表達載體包含編碼所關注重組蛋白的重組基因，重組表達載體元件(rEVE)多核苦酸分子，其包含選自下列的序列SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:1的一部分、SEQIDNO:2的一部分及其組合，和二氫葉酸還原酶(DHFR)基因；使所述宿主細胞在甲氨喋呤存在下生長，以選擇表達該所關注重組蛋白的甲氨喋呤抗性宿主細胞；和分離所述甲氨喋呤抗性宿主細胞；其中所述分離的曱氨喋呤抗性宿主細胞在甲氨喋呤存在下表達該所關注重組蛋白的水平高于含有缺乏rEVE序列的表達載體的曱氨喋呤抗性宿主細月包。36.根據(jù)權利要求35的方法，其中所述甲氨喋呤是以5nM至10pM范圍內(nèi)的濃度存在。37.根據(jù)權利要求35的方法，其中所述宿主細胞為CHO宿主細胞。38.—種增加存在于笫一核酸分子中基質(zhì)附著區(qū)(MAR)序列的數(shù)量的方法，所述方法包括將第二核酸分子插入所述第一核酸分子中，所述第二核酸分子包含選自下列的核苦酸序列SEQIDNO:1、包含至少一個MAR序列的SEQIDNO:1的一部分、SEQIDNO:2、包含至少一個MAR序列的SEQIDNO:2的一部分及其組合。39.根據(jù)權利要求38的方法，其中所述笫一核酸分子選自載體分子、真核細胞染色體、真核病毒基因組、原核細胞染色體、原核病毒基因組、酵母人工染色體和細菌人工染色體。40.根據(jù)權利要求39的方法，其中所述第一核酸為載體分子。41.根據(jù)權利要求40的方法，其中所述載體分子為重組表達載體分子。42.根據(jù)權利要求41的方法，其中所述重組表達載體包含一個或多個功能基因。43.根據(jù)權利要求42的方法，其中所述一個或多個功能基因編碼一種或多種選自下列的蛋白可溶性蛋白、膜蛋白、結構蛋白、核糖體蛋白、酶、酶原、抗體分子、細胞表面受體蛋白、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白、翻譯調(diào)節(jié)蛋白、染色質(zhì)蛋白、激素、細胞周期調(diào)節(jié)蛋白、G蛋白、神經(jīng)活性肽、免疫調(diào)節(jié)蛋白、血液組分蛋白、離子門蛋白、熱休克蛋白、二氫葉酸還原酶(DHFR)、抗生素抗性蛋白、任一前述蛋白的功能片段、任一前述蛋白的含表位片段及其組合。44.根據(jù)權利要求43的方法，其中所述抗體分子選自抗-TNF-a抗體、抗-EL-選擇蛋白抗體、抗-IL-13抗體以及雙可變域免疫球蛋白分子。45.根據(jù)權利要求44的方法，其中所述抗-TNF-a抗體為阿達木單抗。46.—種減少、顯著抑制或基本上沉默重組蛋白從表達載體表達的方法，所述方法包括將核酸分子插入包含一個或多個編碼一種或多種重組蛋白的重組基因的表達載體中，所述核酸分子包含SEQIDNO:2的石咸基1-461的核苷酸堿基序列或SEQIDNO:2的堿基1-1086的核苷酸堿基序列。47.根據(jù)權利要求46的方法，所述方法還包括將所述表達載體插入宿主細胞內(nèi)。全文摘要本發(fā)明描述了包括用于增加重組蛋白表達水平的重組表達載體元件(rEVE)的組合物和方法。本發(fā)明還描述了用于減少、顯著抑制或基本上沉默重組蛋白表達的其它組合物和方法。文檔編號C07H21/04GK101652379SQ200880011023公開日2010年2月17日申請日期2008年3月28日優(yōu)先權日2007年3月30日發(fā)明者G·R·卡森,H·高,W·R·焦恩,Y·Z·庫尼斯申請人:艾博特公司