專利名稱：一株適冷宿主菌菌株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株適冷宿主菌菌株及其應(yīng)用，特別涉及一株適冷宿主菌菌株 (Pseudoalteromonas sp.) SM20429及其應(yīng)用，屬于海洋生物技術(shù)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
在生物技術(shù)與生物工程領(lǐng)域中，通過將外源基因克隆于表達載體上，轉(zhuǎn)入到一個 合適的宿主細胞中，來達到表達和制備重組蛋白的目的。將這種表達系統(tǒng)應(yīng)用到工業(yè)生產(chǎn) 中，可以用于大量制備重組蛋白，達到工業(yè)化水平。一個表達系統(tǒng)首先需要一個適于轉(zhuǎn)化外源基因的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，該轉(zhuǎn)化系統(tǒng)應(yīng)包括 1)合適的篩選標記；2)用于攜帶外源基因進入宿主菌的載體，該載體可在宿主菌中進行復(fù) 制；3) —種適合將外源基因引入宿主細胞的轉(zhuǎn)化方法；4)用于轉(zhuǎn)化的宿主菌。大腸桿菌表 達系統(tǒng)和酵母表達系統(tǒng)是目前最廣泛應(yīng)用的兩個表達系統(tǒng)。地球上的低溫生境非常廣泛，包括深度超過1000米的海洋、極地和許多季節(jié)性的 寒冷環(huán)境等等。這些低溫生境中存在大量的微生物，其中大部分為適冷微生物。由于長期生 活在低溫環(huán)境下，適冷微生物所產(chǎn)生的酶類等蛋白質(zhì)往往具有適冷特性，即在低溫下的高 催化效率和高溫下的低穩(wěn)定性。有研究表明，低溫環(huán)境有利于適冷蛋白的重組表達，可以更 有效地得到有活性的適冷蛋白。雖然大腸桿菌表達系統(tǒng)是目前最成熟和常用的表達系統(tǒng)， 但大腸桿菌為中溫菌，最適生長溫度為37°C。在這樣高的溫度下，適冷酶既不穩(wěn)定，也難以 進行活性表達。而降低大腸桿菌的培養(yǎng)溫度，會降低大腸桿菌的生長速率和表達效率。因 此，大腸桿菌表達系統(tǒng)并不是適冷酶和蛋白重組表達的最佳選擇。由于適冷細菌能在低溫 下快速生長，所以建立適冷細菌為宿主的表達系統(tǒng)可以對適冷酶和蛋白進行有效的活性重 組表達。近些年，國外雖已有開發(fā)出適冷細菌表達系統(tǒng)的報道，但目前可廣泛應(yīng)用的適冷表 達系統(tǒng)非常少。國內(nèi)尚未見有關(guān)適冷細菌表達系統(tǒng)的報道或?qū)＠?br>
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一株適冷宿主菌菌株及其應(yīng)用。名詞解釋纖維素酶酶活單位(U)定義為35°C下每分鐘釋放1 μ g葡萄糖所需酶量。一株適冷宿主菌菌株(Pseudoalteromonas sp. ) SM20429,該菌株 2010 年 9 月 19 日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國武漢武漢大學，其菌種保藏編號為CCTCC M2010239。上述適冷宿主菌菌株是適冷菌BSi20429菌株的質(zhì)粒缺失株SM20429。適冷菌 BSi20429菌株是從北極的海冰樣品中分離出來，經(jīng)鑒定為假交替單胞菌屬細菌。對該菌株 進行質(zhì)粒消除改造，成功獲得一株穩(wěn)定的質(zhì)粒缺失株SM20429，并將其作為轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的宿主 菌。用于上述適冷宿主菌菌株的自主復(fù)制型表達載體pWD，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。上述適冷宿主菌菌株的自主復(fù)制型表達載體PWD的構(gòu)建方法，步驟如下1、以質(zhì)粒pSM429為模板，質(zhì)粒pSM429的GenBank登錄號EU627679,利用引物 ZF :5’ -AACTGCAGCAAGACACTGTGAAGG-3，，ZR :5’ -CGGGATCCTGCCTTTAAGATTTGC-3，，PfuDNA Polymerase PCR擴增質(zhì)粒pSM429的DNA片段；其中引物的5，端分別加上BamHI和PstI 識別位點；PCR產(chǎn)物電泳檢測后，用限制性內(nèi)切酶BamHI和PstI雙酶切處理，30°C酶切過夜 后，純化回收DNA片段；2、利用限制性內(nèi)切酶BamHI和PstI處理質(zhì)粒pUC19，30°C酶切過夜后，瓊脂糖電泳 檢測，純化回收大小為2. 68kb的DNA片段；3、將步驟1制得的DNA片段混合液和步驟2制得的DNA片段混合液4 μ 1、5 μ 1連 接緩沖液、ι μ 1連接酶混合成 ο μ 1反應(yīng)體系，16°C連接過夜，得質(zhì)粒；4、以質(zhì)粒 pBT 為模板，利用引物 CmB :5，_CGGGATC CACGGCACCACCCCGTCAG-3，，CmP 5‘-CGGAATTCGAAGCACACGGTCACACTG-3‘, Pfu DNA Polymerase PCR 擴增 CAT 片段；其中引物 的5’端分別加上BamHI和EcoRI識別位點；PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測大小為1. 6kb，用限制性內(nèi) 切酶BamHI和EcoRI雙酶切處理，30°C酶切過夜后，純化回收，插入到同樣經(jīng)酶切處理的通 過步驟3構(gòu)建的質(zhì)粒中，構(gòu)建成一個自主復(fù)制型表達載體pWD。經(jīng)檢測，上述質(zhì)粒大小為7654bp (如SEQ ID NO. 1所示)，包含有大腸桿菌復(fù)制元 件復(fù)制起始位點來源于質(zhì)粒PUC19的復(fù)制起始位點，選擇標記為抗氨卞青霉素基因，來源 于質(zhì)粒PUC19 ；假交替單胞菌復(fù)制元件復(fù)制起始位點來源于質(zhì)粒PSM429的復(fù)制起始位點， pSM429 (GenBank 登錄號 EU627679)提取于菌株 Pseudoalteromonas sp. BSi20429,選擇標 記為抗氯霉素基因，來源于質(zhì)粒PBT，啟動子為Lac啟動子，來源于質(zhì)粒pUC19，多克隆位點 為 PstI、XhoI 和 Sail，見附圖 2。上述適冷宿主菌菌株的自主復(fù)制型表達載體pWD在表達適冷纖維素酶方面的應(yīng) 用，具體步驟如下(I)PCR擴增適冷纖維素酶基因cen以假交替單胞菌屬適冷菌株的適冷纖維素酶基因cen為模板(序列如SEQ ID NO. 10所示)，根據(jù)基因兩端序列設(shè)計引物(引物序列F 5‘-AACTGCAGTATGGATAACAGT-3‘, R :5，-CCGCTCGAGGCCACC CCAACCTTGAATG-3)，在引物兩端分別設(shè)計了 PstI 和 XhoI 識別位 點。利用PCR方法擴增適冷纖維素酶基因cen。(2) PCR產(chǎn)物酶切回收 PCR擴增的適冷纖維素酶基因cen經(jīng)電泳檢測后，用限制性內(nèi)切酶PstI和XhoI雙 酶切處理，用純化試劑盒按說明書純化回收。(3)質(zhì)粒pWD的酶切回收從適冷宿主菌SM20429中純化質(zhì)粒pWD，將質(zhì)粒pWD用限制性內(nèi)切酶PstI和XhoI 雙酶切處理，用純化試劑盒按說明書純化回收。(4)纖維素酶基因cen的表達載體pWD-cen的構(gòu)建用連接酶將(2)中制得的酶切后的酶基因連接到(3)中制得的酶切后的質(zhì)粒PWD 中，構(gòu)建纖維素酶基因cen的表達載體pWD-cen。上述適冷宿主菌菌株在表達適冷纖維素酶方面的應(yīng)用，具體步驟如下
1)取菌種保藏編號為CCTCC M 2010239的適冷宿主菌菌株，接種到2216E液體培 養(yǎng)基中，18 22°C振蕩培養(yǎng)過夜，得初級菌液；2)按體積百分比1 5%的接種量將步驟1)制得的初級菌液接種到2216E液體 培養(yǎng)基中，18 22°C培養(yǎng)到0D600為0. 8 1. 0，離心，收集菌體，棄去上清，冰浴，得菌體；3)用預(yù)冷的含有15 25mM葡萄糖的無菌水洗滌步驟2)制得的菌體，4°C，離心， 收集菌體，棄上清，并重復(fù)2 3次，將菌體懸浮于預(yù)冷含有15 25mM葡萄糖的無菌水中， 得菌液；4)取含有目的基因cen的自主復(fù)制型表達載體pWD-cen加入至1步驟3)制得的 菌液中，混勻后，轉(zhuǎn)移至電轉(zhuǎn)杯中，電擊；5)取預(yù)冷的海水LB培養(yǎng)基加入電轉(zhuǎn)杯中，重懸后，轉(zhuǎn)入離心管中，18 22°C，振蕩 培養(yǎng)3 4h ；6)將菌液離心后涂布含氯霉素抗性和氨芐青霉素的篩選平板，18 22°C靜置培 養(yǎng)20 28小時；7)從篩選平板上挑選陽性轉(zhuǎn)化子，驗證其帶有質(zhì)粒pWD-cen。8)將帶有質(zhì)粒pWD-cen的SM20429菌株擴大培養(yǎng)，檢測菌株細胞內(nèi)的纖維素酶活性。所述步驟1)中的2216E液體培養(yǎng)基每升組分如下胰蛋白胨5克，酵母提取物1 克，F(xiàn)eCl3O. 1克，人工海水1000毫升，ρΗ7· 0。所述步驟5)中的海水LB培養(yǎng)基每升組分如下蛋白胨10克，酵母粉5克，人工海水1000毫升，ρΗ8.0。本發(fā)明的有益效果如下本發(fā)明所述的適冷宿主菌菌株SM20429可用于各種適冷酶和蛋白的異源活性表 達。該菌株屬于假交替單胞菌屬，該屬細菌是一類好氧、異養(yǎng)型革蘭氏陰性細菌，廣泛分布 于海洋環(huán)境中。由于海洋環(huán)境中大部分為低溫環(huán)境，因此目前分離到的假交替單胞菌多數(shù) 具有適冷特征。假交替單胞菌屬BSi20429菌株分離自北極的海冰樣品，具有典型適冷特 征。菌株SM20429為BSi20429的質(zhì)粒消除菌株，仍具有典型適冷特征，在15°C低溫條件下 可以快速率生長。由此，該菌株具有被發(fā)展成為大量表達外源蛋白的適冷表達宿主的潛在 價值，從而達到在低溫條件下快速制備適冷蛋白的目的。


圖1.質(zhì)粒消除菌株SM20429的篩選。對進行了質(zhì)粒消除的BSi20429菌株提取質(zhì) 粒并電泳分析，電泳圖表明，得到一株質(zhì)粒消除的菌株(圖中箭頭所指)，命名為SM20429。圖2、構(gòu)建的自主復(fù)制型載體pWD的物理圖譜。圖3、紅霉素抗性基因在SM20429中的異源表達。(A)對帶有紅霉素抗性基因表 達載體pWD-ermC的SM20429菌株進行SDS-PAGE電泳分析，泳道1為陰性對照，即不帶有 pffD-ermC的SM20429菌株；泳道2為帶有pWD_ermC的SM20429菌株，，方框顯示菌株表達 的紅霉素抗性基因產(chǎn)物條帶。泳道3為陽性對照，即帶有pWD-ermC的E. coli菌株，箭頭所 指為菌株表達的紅霉素抗性基因產(chǎn)物條帶。(B)帶有紅霉素抗性基因表達載體pWD-ermC的 SM20429菌株對紅霉素的敏感性。圖中1，3為帶有pWD_ermC的SM20429菌株在含紅霉素培養(yǎng)基中的生長情況，表明表達了紅霉素抗性基因的SM20429菌株具有紅霉素抗性，能夠在 含紅霉素培養(yǎng)基中正常生長；2，4為對照菌株，即不帶有pWD-ermC的SM20429菌株，在含紅 霉素培養(yǎng)基中的生長情況，表明對照菌株沒有紅霉素抗性，不能在含紅霉素培養(yǎng)基中生長。圖4、適冷纖維素酶基因在SM20429中的異源表達。圖中(1)為空白對照；(2)帶 有適冷纖維素酶基因表達載體的SM20429菌株胞內(nèi)檢測到纖維素酶酶活，說明適冷纖維素 酶基因在SM20429中進行了異源表達；(3)對照菌株，即不帶有適冷纖維素酶基因表達載體 的SM20429菌株，胞內(nèi)檢測不到纖維素酶酶活。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步闡述，但本發(fā)明所保護范圍不限于此。質(zhì)粒pUC19購自Takara公司，質(zhì)粒pBT購自Stratagene公司，純化試劑盒購自 OMEGA公司，限制性內(nèi)切酶BamHI和PstI購自Takara公司，連接緩沖液、連接酶均購自 Promega 公司。實施例1 質(zhì)粒缺失株SM20429的制備方法利用SDS-高溫處理法對假交替單胞菌屬BSi20429菌株進行質(zhì)粒消除處理，得到 了該菌株的質(zhì)粒缺失株SM20429。該菌株的特點是完全丟失了質(zhì)粒，質(zhì)粒沒有整合到菌株基 因組中，具有遺傳穩(wěn)定性。與原始株相比，該菌株在性狀上沒有發(fā)生明顯變化。具體步驟如 下1)挑取平板上假交替單胞菌屬BSi20429菌株的單菌落，接種于5ml 2216E液體培 養(yǎng)基中，250C，160rpm振蕩培養(yǎng)至OD6tltl為1. 0，得初級菌液；2)取100 μ 1菌液轉(zhuǎn)接到新鮮的5ml 2216E液體培養(yǎng)基中，33°C，160rpm振蕩培養(yǎng) 至 OD6tltl 約為 1.0。3)取100 μ 1菌液轉(zhuǎn)接到加入了 25 μ 1 1% SDS的5ml 2216E液體培養(yǎng)基中(SDS 終濃度為0. 005% ), 250C 160rpm振蕩培養(yǎng)至OD600為1. O。4)重復(fù)步驟2)和3)。5)將菌液稀釋涂布在2216E培養(yǎng)基平板上，25°C倒置培養(yǎng)，至長出單菌落。6)挑取單菌落，接種于5ml 2216E液體培養(yǎng)基，25°C，160rpm振蕩培養(yǎng)，提取質(zhì)粒， 電泳檢測表明(附圖1)，得到一株質(zhì)粒消除的菌株(圖中箭頭所指)，命名為SM20429，該菌 株2010年9月19日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國武漢武漢大學，其菌種保 藏編號為 CCTCC M 2010239。見附圖1。實施例2 自主復(fù)制型表達載體pWD的構(gòu)建1.說明大小7654bp大腸桿菌復(fù)制元件復(fù)制起始位點來源于質(zhì)粒PUC19的復(fù)制起點，pUC19購自Takara公司。選擇標記抗氨卞青霉素基因，來源于質(zhì)粒PUC19 (購自Takara公司)。
假交替單胞菌復(fù)制元件 復(fù)制起始位點來源于質(zhì)粒pSM429的復(fù)制起始位點，pSM429 (GenBank登錄號EU627679)提取于菌株 Pseudoalteromonas sp.BSi20429。選擇標記抗氯霉素基因，克隆于質(zhì)粒pBT (購自Stratagene公司)啟動子Lac啟動子，來源于質(zhì)粒pUC19(購自Takara公司)。多克隆位點=PstiahoI和Sail。見附圖2。2.構(gòu)建方法(i)PCR擴增質(zhì)粒pSM429上大小為3. 87kb的DNA片段。以質(zhì)粒 pSM429 為模板，利用引物(ZF 5，-AACTGCAGCAAGACACTGTGAAGG-3，，ZR 5，-CGGGATCCTGCCTTTAAGATTTGC-3，)，Pfu DNA Polymerase PCR 擴增質(zhì)粒 pSM429 的 DNA 片 段。其中引物的5’端分別加上BamHI和PstI識別位點。PCR產(chǎn)物電泳檢測后，用限制性內(nèi) 切酶BamHI和PstI雙酶切處理，30°C酶切過夜后，用純化試劑盒(購自O(shè)MEGA公司)按說 明書純化回收。(ii)從質(zhì)粒pUC19切下一個包含氨芐青霉素抗性基因、復(fù)制起始位點和Lac啟動 子的大小為2. 68kb的DNA片段。利用限制性內(nèi)切酶BamHI和PstI處理質(zhì)粒pUC19，30 V酶切過夜后，瓊脂糖電泳檢 測，用膠回收試劑盒(購自O(shè)MEGA公司)按說明書純化回收大小為2.68kb的DNA片段。(iii)以上兩片段的連接、轉(zhuǎn)化和驗證將兩個片段混合液4μ 1和5μ 1連接緩沖液(Promega公司)、1μ 1連接酶 (Promega公司)混合成反應(yīng)體系，16°C連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli DH5 α菌株的感 受態(tài)細胞。將轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細胞涂布在氨芐青霉素LB平板。通過提取質(zhì)粒和瓊脂糖電泳 來檢驗轉(zhuǎn)化子中含有構(gòu)建的質(zhì)粒。(iv)氯霉素抗性基因CAT的擴增和插入以質(zhì)粒 pBT (購自 Stratagene 公司)為模板，利用引物(CmB 5’-CGGGATCCACGGCA CCACCCCGTCAG-3',CmP 5' -CGGAATTCGAAGCACACGGTCACACTG-3，), Pfu DNAPolymerase PCR 擴增CAT片段。其中引物的5’端分別加上BamHI和EcoRI識別位點。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測 大小為1. 6kb，用限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRI雙酶切處理，30°C酶切過夜后，用純化試劑盒 (購自O(shè)MEGA公司)按說明書純化回收，插入到經(jīng)同樣酶切處理的步驟(iii)中構(gòu)建的質(zhì) 粒中，構(gòu)建成一個自主復(fù)制型表達載體PWD，將pWD轉(zhuǎn)化E. coli DH5a菌株的感受態(tài)細胞。 將轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細胞涂布在氨芐青霉素LB平板。通過提取質(zhì)粒和瓊脂糖電泳來檢驗轉(zhuǎn)化 子中含有構(gòu)建的質(zhì)粒pWD。經(jīng)測序，上述自主復(fù)制型表達載體pWD的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。實施例3 適冷假交替單胞菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立本發(fā)明采用了電轉(zhuǎn)化的方法，以SM20429菌株為宿主，以自主復(fù)制型質(zhì)粒pWD為載 體，建立適冷假交替單胞菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，步驟如下1)取菌種保藏編號為CCTCC M 2010239的適冷宿主菌菌株，接種到2216E液體培 養(yǎng)基中，20°C振蕩培養(yǎng)過夜，得初級菌液；2)按體積百分比的接種量將步驟1)制得的初級菌液接種到2216E液體培養(yǎng) 基中，20°C培養(yǎng)到OD600為0. 8 1. 0,6000rpm離心5min,收集菌體，棄去上清，冰浴IOmin, 得菌體；3)用20ml預(yù)冷的含有20mM葡萄糖的無菌水洗滌步驟2)制得的菌體，4°C，6，OOOrpm離心5min收集菌體，棄上清，并重復(fù)2 3次，將菌體懸浮于Iml預(yù)冷含有20mM 葡萄糖的無菌水中，得菌液；4)取0. 5μ g自主復(fù)制型表達載體pWD加入至100 μ 1步驟3)制得的菌液中，混勻 后，轉(zhuǎn)移至2mm電轉(zhuǎn)杯中，2000ν，25 μ F，200 Ω電擊；5)取Iml預(yù)冷的海水LB培養(yǎng)基加入電轉(zhuǎn)杯中，重懸后，轉(zhuǎn)入離心管中，20°C， IOOrpm振蕩培養(yǎng)3 4h ；6)將菌液離心后涂布含氯霉素抗性和氨芐青霉素的篩選平板，20°C靜置培養(yǎng)。用此方法轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化率達到IO3CFU/μ g DNA。因此，我們構(gòu)建了一個適冷假交替 單胞菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。實施例4 利用構(gòu)建的適冷表達系統(tǒng)表達紅霉素抗性基因由于適冷宿主菌SM20429菌株對紅霉素敏感，紅霉素抗性基因在該菌株的表達便 于檢測，因此首先用紅霉素抗性基因檢測構(gòu)建的適冷假交替單胞菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)是否能進行外 源基因表達。將紅霉素抗性基因插入到載體PWD上的Lac啟動子下游，構(gòu)建了紅霉素抗性 基因的表達載體，并轉(zhuǎn)入到適冷宿主菌SM20429中，然后檢測紅霉素抗性基因在該適冷表 達系統(tǒng)中的表達情況。具體步驟如下(A)以質(zhì)粒pMG36e 為模板，利用引物(ErmCF 5，-AACTGCAGTATGAACGAGAAAAATATAA AAC-3，，ErmCR :5，-CCGCTCGAGTTAAGGGATGCAGTTTA TG-3’)和 Pfu DNA Polymerase PCR 擴 增紅霉素抗性基因ermC。其中引物的5’端分別加上PstI和XhoI識別位點。PCR產(chǎn)物電 泳檢測后，用限制性內(nèi)切酶PstI和XhoI雙酶切處理，37°C酶切過夜后，用純化試劑盒(購 自O(shè)MEGA公司)按說明書純化回收。(B)將經(jīng)過酶切純化的ermC基因片段克隆到經(jīng)相同酶切處理的質(zhì)粒pWD中，構(gòu)建 紅霉素抗性基因ermC的表達載體pWD_ermC。(C)利用電轉(zhuǎn)化的方法將質(zhì)粒pWD-erm轉(zhuǎn)入適冷宿主菌株SM20429。通過提取質(zhì) 粒和瓊脂糖電泳來檢驗轉(zhuǎn)化子中含有構(gòu)建的質(zhì)粒。(D)將帶有質(zhì)粒pWD-ermC的SM20429菌株擴大培養(yǎng)。提取菌株細胞總蛋白， SDS-PAGE檢測細胞總蛋白，表明菌株細胞中有表達的紅霉素抗性基因蛋白產(chǎn)物。(E)將帶有質(zhì)粒pWD-ermC的SM20429菌株在含紅霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，檢測該菌 株對紅霉素的敏感性。結(jié)果表明，帶有質(zhì)粒pWD-ermC的SM20429菌株能在含紅霉素的培養(yǎng) 基中正常生長，說明菌株因為異源表達了紅霉素抗性基因而具有了對紅霉素的抗性。作為 對照，不帶有質(zhì)粒PWD-ermC的SM20429菌株在含紅霉素的培養(yǎng)基中就沒有生長。見附圖3。實施例5 利用構(gòu)建的適冷表達系統(tǒng)表達適冷纖維素酶(1)以來源于假交替單胞菌屬適冷菌株的適冷纖維素酶基因cen為模板(序列如 SEQ IDN0. 10所示)，利用PCR方法在其兩端分別加上PstI和XhoI識別位點(引物序列=F 5，-AACTGCAGTATGGATAACAGT-3，，R :5，-CCGCTCGAGGCCACCCCAACCTTGAATG-3)。PCR 產(chǎn)物電 泳檢測后，用限制性內(nèi)切酶PstI和XhoI雙酶切處理，37°C酶切過夜后，用純化試劑盒(購 自O(shè)MEGA公司)按說明書純化回收。(2)將經(jīng)過酶切純化的纖維素酶基因cen片段克隆到經(jīng)相同酶切處理的質(zhì)粒pWD 中，構(gòu)建纖維素酶基因cen的表達載體pWD-cen。(3)利用電轉(zhuǎn)化的方法將質(zhì)粒pWD-cen轉(zhuǎn)入適冷宿主菌株SM20429。通過提取質(zhì)粒和瓊脂糖電泳來檢驗轉(zhuǎn)化子中含有構(gòu)建的質(zhì)粒。(4)將帶有質(zhì)粒pWD-cen的SM20429菌株擴大培養(yǎng)，檢測菌株細胞內(nèi)的纖維素酶活性。纖維素酶活性檢測方法a)菌體超聲破碎取5ml菌液離心收集菌體，用磷酸緩沖液(PBS)洗滌菌體兩次， 最后加入5ml PBS使菌體重懸，用超聲波破碎細菌，4°C離心lmin，取上清測酶活。b)取0. Iml細胞提取液，加入15ml比色管中，加入預(yù)熱的Iml 1 %的CMC-Na溶 液，35°C水浴反應(yīng)30min，立即加入1.5ml 3，5-二硝基水楊酸(DNS)終止反應(yīng)，再置沸水中 煮沸5min，流水冷卻，加蒸餾水至15ml搖勻。同時進行空白對照測定，于15ml比色管中加 入0. Iml酶液，1. 5mlDNS試劑，后加入Iml預(yù)熱的1 %的CMC-Na溶液，搖勻。置沸水中煮沸 5min，流水冷卻，加蒸餾水至15ml，搖勻。于550nm波長處測吸光值測還原糖的含量。見附 圖4。
權(quán)利要求
一株適冷宿主菌菌株(Pseudoalteromonas sp.)SM20429，該菌株2010年9月19日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國武漢武漢大學，其菌種保藏編號為CCTCC M2010239。
2.權(quán)利要求1所述的適冷宿主菌菌株(Pseudoalteromonassp.) SM204299的自主復(fù)制 型表達載體PWD，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
3.權(quán)利要求2所述的適冷宿主菌菌株的自主復(fù)制型表達載體pWD的構(gòu)建方法，步驟如下a、以質(zhì)粒pSM429為模板，質(zhì)粒pSM429的GenBank登錄號EU627679,利用引物ZF 5' -AACTGCAGCAAGACACTGTGAAGG-3‘, ZR 5' -CGGGATCCTGCCTTTAAGATTTGd, PfuDNA Polymerase PCR擴增質(zhì)粒pSM429的DNA片段；其中引物的5，端分別加上BamHI和PstI 識別位點；PCR產(chǎn)物電泳檢測后，用限制性內(nèi)切酶BamHI和PstI雙酶切處理，30°C酶切過夜 后，純化回收DNA片段；b、利用限制性內(nèi)切酶BamHI和PstI處理質(zhì)粒pUC19，30°C酶切過夜后，瓊脂糖電泳檢 測，純化回收大小為2. 68kb的DNA片段；C、將步驟a制得的DNA片段混合液和步驟b制得的DNA片段混合液4 μ 1、5 μ 1連接緩 沖液、1 μ 1連接酶混合成10 μ 1反應(yīng)體系，16°C連接過夜，得質(zhì)粒；d、以質(zhì)粒 pBT 為模板，利用引物 CmB :5，-CGGGATC CACGGCACCACCCCGTCAG-3，，CmP :5， -CGGAATTCGAAGCACACGGTCACACTG-3',Pfu DNA Polymerase PCR 擴增 CAT 片段；其中引物的 5’端分別加上BamHI和EcoRI識別位點；PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測大小為1. 6kb，用限制性內(nèi)切 酶BamHI和EcoRI雙酶切處理，30°C酶切過夜后，純化回收，插入到同樣經(jīng)酶切處理的通過 步驟c構(gòu)建的質(zhì)粒中，構(gòu)建成一個自主復(fù)制型表達載體pWD。
4.權(quán)利要求3所述的適冷宿主菌菌株的自主復(fù)制型表達載體pWD在表達適冷纖維素酶 方面的應(yīng)用，具體步驟如下(1)PCR擴增適冷纖維素酶基因cen以來源于假交替單胞菌屬適冷菌株的適冷纖維素酶基因cen為模板，根據(jù)基因兩端 序列設(shè)計引物(引物序列F :5，-AACTGCAGTATGGATAACAGT-3，，R :5，-CCGCTCGAGGCCACC CCAACCTTGAATG-3)，在引物兩端分別設(shè)計了 PstI和XhoI識別位點。利用PCR方法擴增適 冷纖維素酶基因cen ；(2)PCR產(chǎn)物酶切回收PCR擴增的適冷纖維素酶基因cen經(jīng)電泳檢測后，用限制性內(nèi)切酶PstI和XhoI雙酶切 處理，用純化試劑盒按說明書純化回收；(3)質(zhì)粒pWD的酶切回收從適冷宿主菌SM20429中純化質(zhì)粒pWD，將質(zhì)粒pWD用限制性內(nèi)切酶PstI和XhoI雙酶 切處理，用純化試劑盒按說明書純化回收；(4)纖維素酶基因cen的表達載體pWD-cen的構(gòu)建用連接酶將(2)中制得的酶切后的酶基因連接到(3)中制得的酶切后的質(zhì)粒pWD中， 構(gòu)建纖維素酶基因cen的表達載體pWD-cen。
5.權(quán)利要求1所述的適冷宿主菌菌株(Pseudoalteromonassp.) SM20429在表達適冷 纖維素酶方面的應(yīng)用，具體步驟如下1)取菌種保藏編號為CCTCCM 2010239的適冷宿主菌菌株，接種到2216E液體培養(yǎng)基 中，18 22°C振蕩培養(yǎng)過夜，得初級菌液；2)按體積百分比1 5%的接種量將步驟1)制得的初級菌液接種到2216E液體培養(yǎng) 基中，18 22°C培養(yǎng)到0D_為0. 8 1. 0，離心，收集菌體，棄去上清，冰浴，得菌體；3)用預(yù)冷的含有15 25mM葡萄糖的無菌水洗滌步驟2)制得的菌體，4°C，離心，收集 菌體，棄上清，并重復(fù)2 3次，將菌體懸浮于預(yù)冷含有15 25mM葡萄糖的無菌水中，得菌 液；4)取含有目的基因cen的自主復(fù)制型表達載體pWD-cen加入至1步驟3)制得的菌液 中，混勻后，轉(zhuǎn)移至電轉(zhuǎn)杯中，電擊；5)取預(yù)冷的海水LB培養(yǎng)基加入電轉(zhuǎn)杯中，重懸后，轉(zhuǎn)入離心管中，18 22°C，振蕩培養(yǎng) 3 4h ；6)將菌液離心后涂布含氯霉素抗性和氨芐青霉素的篩選平板，18 22°C靜置培養(yǎng) 20 28小時；7)從篩選平板上挑選陽性轉(zhuǎn)化子，驗證其帶有質(zhì)粒pWD-cen；8)將帶有質(zhì)粒pWD-cen的SM20429菌株擴大培養(yǎng)，檢測菌株細胞內(nèi)的纖維素酶活性。
6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟1)中的2216E液體培養(yǎng)基每升組 分如下胰蛋白胨5克，酵母提取物1克，F(xiàn)eCl3O. 1克，人工海水1000毫升，pH7. 0。
7.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟5)中的海水LB培養(yǎng)基每升組分如下蛋白胨10克，酵母粉5克，人工海水1000毫升，pH8.0。
全文摘要
本發(fā)明涉及一株適冷宿主菌菌株及其應(yīng)用，特別涉及一株適冷宿主菌菌株(Pseudoalteromonas sp.)SM20429及其應(yīng)用，屬于海洋生物技術(shù)技術(shù)領(lǐng)域。該菌株2010年9月19日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國武漢武漢大學，其菌種保藏編號為CCTCC M 2010239。以及用于上述適冷宿主菌菌株的自主復(fù)制型表達載體pWD，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。菌株SM20429具有典型適冷特征，在15℃低溫條件下可以快速率生長。由此，該菌株具有被發(fā)展成為大量表達外源蛋白的適冷表達宿主的潛在價值，從而達到在低溫條件下快速制備適冷蛋白的目的。
文檔編號C12N15/63GK101985607SQ20101050221
公開日2011年3月16日 申請日期2010年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月11日
發(fā)明者于子超, 何海倫, 周百成, 張玉忠, 解彬彬, 趙殿麗, 陳秀蘭 申請人:山東大學