拮抗內(nèi)生菌p5菌株在辣椒采后保鮮中的應(yīng)用
【專利摘要】一種拮抗內(nèi)生菌枯草芽孢桿菌(B.subtilis)P5菌株在辣椒采后保鮮中的應(yīng)用，該菌株的保藏編號為CCTCC NO：M2016131。以辣椒炭疽病作為指示菌，測得本發(fā)明菌株P(guān)5的發(fā)酵濾液的熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、紫外線穩(wěn)定性、耐貯藏性均良好；該發(fā)酵濾液處理過的辣椒保鮮效果明顯優(yōu)于無菌水對照組，能顯著降低辣椒失重率和腐爛率，并有效抑制果實中可滴定酸、Vc、總糖、葉綠素等含量的減少，對辣椒有顯著的防腐保鮮效果，其保鮮效果與保鮮劑接近。與其他貯藏保鮮方法相比，利用本發(fā)明菌株P(guān)5的發(fā)酵濾液對采后辣椒進(jìn)行保鮮處理具有無污染、成本低、操作處理方便、保鮮效果良好等優(yōu)點，為開發(fā)新型、安全、穩(wěn)定、環(huán)保的生物保鮮劑提供了理論依據(jù)。CCTCC NO：M201613120160318
【專利說明】
括手幾內(nèi)生囷P5囷株在辣椒米后保鮮中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種拮抗內(nèi)生菌在辣椒保鮮中的應(yīng)用，尤其涉及一種拮抗內(nèi)生菌枯草芽孢桿菌(B.subtilis)P5菌株在辣椒采后保鮮中的應(yīng)用?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]辣椒采后保鮮、貯藏過程中除了因失水、冷害等因素造成商品價值較大損失外，還有因病原真菌和細(xì)菌引起的貯藏病害造成的腐爛損失，這種損失約占辣椒總損耗的50%-90%，因此，辣椒的釆后病害是影響其保鮮和貯藏的主要因素。研究發(fā)現(xiàn)，北運辣椒采后真菌性病害主要有炭疽病、黑霉病、軟腐病、灰霉病和疫病。其中炭疽病的發(fā)病率最高，達(dá)到 40.0%。目前控制辣椒采后病害的主要措施仍是化學(xué)殺菌劑。長期使用化學(xué)殺菌劑導(dǎo)致病菌產(chǎn)生的抗藥性大大降低了其防病效果。同時生產(chǎn)上頻繁使用高濃度化學(xué)殺菌劑造成其在辣椒果肉中的殘留量增加而威脅人類健康，因此，尋求安全、有效的辣椒采后防病保鮮新技術(shù)已成為當(dāng)前的研究熱點。
[0003]生物防治具有不污染環(huán)境、無農(nóng)藥殘毒、不產(chǎn)生抗藥性、處理費用低廉等優(yōu)點。植物內(nèi)生菌寄生在植物組織內(nèi)，在長期進(jìn)化過程中與寄主形成了互利共生關(guān)系。植物內(nèi)生菌能通過產(chǎn)生大量具有生物活性的物質(zhì)來保護(hù)寄主植物免受病害的侵染。目前，植物內(nèi)生菌用于果蔬保鮮已有相關(guān)報道。例如，百部內(nèi)生菌EJS的發(fā)酵液對油桃采后青霉病具有顯著的抑制效果；內(nèi)生菌BS-2-gfp和TP2_gfp對采后荔枝具有良好的保鮮作用。[〇〇〇4]因此，從植物內(nèi)生菌群中篩選拮抗菌株，并利用其產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)制成新型生物保鮮劑，以此取代化學(xué)殺菌劑或降低化學(xué)殺菌劑的使用量具有巨大的應(yīng)用前景。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決技術(shù)問題是:針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種拮抗內(nèi)生菌P5 菌株在辣椒采后保鮮中的應(yīng)用，該菌株P(guān)5的發(fā)酵濾液處理辣椒后，能顯著降低了辣椒失重率和腐爛率，并有效抑制了果實中可滴定酸、Vc、總糖、葉綠素等含量的減少，對辣椒有顯著的保鮮效果。
[0006]上述提及的拮抗內(nèi)生菌P5菌株，其分類命名為枯草芽孢桿菌P5 (Bacillus subtilis)P5,已于2016年3月18日保藏于中國典型微生物保藏中心，保藏地址為中國武漢武漢大學(xué)，保藏編號為CCTCC N0:M2016131。
[0007]本發(fā)明菌株P(guān)5的形態(tài)特征:[〇〇〇8]本發(fā)明菌株P(guān)5在28 °C于NA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，在高倍顯微鏡下，菌體呈桿狀，革蘭氏染色為陽性(圖1)，28°C培養(yǎng)24h后，單個菌落呈圓形，乳白色，不透明，邊緣整齊，菌落大小約為2-8mm，見圖2。
[0009]本發(fā)明菌株P(guān)5的生理生化特性:好氧性+，V.P實驗+，接觸酶反應(yīng)+，淀粉水解實驗 +，硫化氫實驗+，葡萄糖氧化發(fā)酵+，明膠液化+，耐7 % NaC+，耐50 °C溫度+。其中，“+”表示陽性或者能生長和利用；表示陰性或者不能生長和利用。[0〇1〇] 采用CTAB法提取本發(fā)明菌株P(guān)5的總DNA，應(yīng)用通用引物16S-27F和16S-1492R進(jìn)行 16S rDNA的PCR擴(kuò)增，將測得的16S rDNA序列在NCBI上進(jìn)行BLAST同源性比對，發(fā)現(xiàn)該序列與枯草芽孢桿菌(B.subtilis)的30種菌株的16S rDNA的序列同源性達(dá)到98%，其中登陸號為KF527194.1的Bacillus subtilis菌株FHGXJ1的16S rDNA的序列與本發(fā)明菌株P(guān)5的序列大小基本相同，并且二者在進(jìn)化樹上處于同一分支，進(jìn)化距離最近。結(jié)合本發(fā)明菌株P(guān)5的形態(tài)特征及生理生化特征，進(jìn)一步表本發(fā)明菌株P(guān)5為枯草芽孢桿菌(B.subti 1 is)。[〇〇11]以辣椒炭疽病作為指示菌，測定本發(fā)明菌株P(guān)5的發(fā)酵濾液理化性質(zhì)；并利用該發(fā)酵濾液處理辣椒進(jìn)行采后保鮮研究，測定的品質(zhì)指標(biāo)為:質(zhì)量損失率、腐爛率、可滴定酸含量、Vc含量、總糖含量、葉綠素含量等品質(zhì)指標(biāo)。結(jié)果表明，發(fā)酵濾液的熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、紫外線穩(wěn)定性、耐貯藏性均良好。發(fā)酵濾液處理過的辣椒保鮮效果明顯優(yōu)于無菌水對照組，能顯著降低辣椒失重率和腐爛率，并有效抑制果實中可滴定酸、Vc、總糖、葉綠素等含量的減少，對辣椒有顯著的防腐保鮮效果，其保鮮效果與保鮮劑接近。與其他貯藏保鮮方法相比，利用本發(fā)明菌株P(guān)5的發(fā)酵濾液對采后辣椒進(jìn)行保鮮處理具有無污染、成本低、操作處理方便、保鮮效果良好等優(yōu)點，為開發(fā)新型、安全、穩(wěn)定、環(huán)保的生物保鮮劑提供了理論依據(jù)。【附圖說明】
[0012]圖1是本發(fā)明菌株P(guān)5革蘭氏染色(X 100)圖。[〇〇13]圖2是本發(fā)明菌株P(guān)5的單菌落形態(tài)圖。[〇〇14]圖3是本發(fā)明菌株P(guān)5的發(fā)酵濾液的熱穩(wěn)定性測定圖。
[0015]圖4是本發(fā)明菌株P(guān)5的發(fā)酵濾液的紫外光穩(wěn)定性測定圖。
[0016]圖5是本發(fā)明菌株P(guān)5的發(fā)酵濾液的酸堿穩(wěn)定性測定圖。
[0017]圖6是本發(fā)明菌株P(guān)5的發(fā)酵濾液的遺傳穩(wěn)定性測定圖。
[0018]圖7是不同處理組對貯藏期間辣椒腐爛率的影響圖。
[0019]圖8是不同處理組對貯藏期間辣椒質(zhì)量損失率的影響圖。
[0020]圖9是不同處理組對貯藏期間辣椒Vc含量的影響圖。
[0021]圖10是不同處理組對貯藏期間辣椒總糖含量的影響圖。
[0022]圖11是不同處理組對貯藏期間辣椒葉綠素含量的影響圖。
[0023]圖12是不同處理組對貯藏期間辣椒可滴定酸含量的影響圖?！揪唧w實施方式】 [〇〇24] 實施例1[〇〇25]從湖南省長沙市菜園采取新鮮辣椒，用自來水洗干凈，在75 %質(zhì)量濃度的乙醇中浸泡3min之后，用5 %質(zhì)量濃度的NaC1擦拭5min，無菌水反復(fù)沖洗6次，去皮后用無菌小刀切成小塊，置于無菌研缽中研磨成漿液。取5ml研磨液用無菌水稀釋10倍，分別取0.1ml稀釋液涂布在NA固體培養(yǎng)基上，28 °C黑暗培養(yǎng)72h，挑取單菌落在相應(yīng)的平板上劃線分離，重復(fù)此操作直至得到純化菌株，即得本發(fā)明菌株P(guān)5。[〇〇26]實施例2本發(fā)明菌株P(guān)5發(fā)酵濾液的制備[〇〇27]挑取一環(huán)活化好的本發(fā)明菌株P(guān)5接入NA液體培養(yǎng)基中，在初始pH7.0、裝液量110/ 250ml、接種量3 %、180r/min、28°C條件下培養(yǎng)48h得到發(fā)酵原液，搖勾，于10000r/min離心lOmin，取上清液于無菌條件下過0.22mi無菌濾膜得到發(fā)酵濾液。[〇〇28]實施例3本發(fā)明菌株P(guān)5的發(fā)酵濾液的理化性質(zhì)的測定
[0029]本實施例中抑制活性的測定方法:采用平板對峙法，在直徑為90mm的培養(yǎng)皿中倒入約5ml PDA培養(yǎng)基，凝固后加入2ml本發(fā)明菌株P(guān)5發(fā)酵濾液，搖勻后再加入15ml PDA培養(yǎng)基。對照組的培養(yǎng)基中加入2ml無菌水代替發(fā)酵濾液，然后在平板上接入直徑為3mm的致病菌(辣椒炭疽病)菌絲塊，28 °C黑暗培養(yǎng)72h，測量菌落直徑，計算抑制率。抑制率=(Dck — D^)/D〇(X 100%，其中1)??為實驗組菌塊直徑，Da為對照組菌塊直徑。
[0030]1 ?熱穩(wěn)定性
[0031]取8只離心管，每只離心管中添加lml發(fā)酵濾液(PH7.2)，分別于40、50、60、70、80、 90、100、12rc條件下靜置處理30min，室溫(25°C)作為對照組(CK)，處理完成后進(jìn)行活性測定，每組實驗重復(fù)3次。結(jié)果見圖3,顯示本發(fā)明菌株P(guān)5的發(fā)酵濾液具有很強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，經(jīng) 40-100°C不同溫度處理30min后，抑菌活性均維持室溫下對照組的97%以上；121°C處理 30min后抑菌活性有所降低，但仍然保持對照組的85%。[〇〇32]2.紫外光穩(wěn)定性[〇〇33]將發(fā)酵濾液置于無菌培養(yǎng)皿中，然后將盛滿發(fā)酵濾液的培養(yǎng)皿放在距20W紫外燈 l〇cm進(jìn)行處紫外光照射，在照射l、3、5、7、9、12h后，進(jìn)行活性測定。以未經(jīng)紫外光照射的發(fā)酵濾液為對照，每個處理重復(fù)3次。結(jié)果見圖4,顯示:發(fā)酵濾液在紫外光下照射不同時間后， 抑菌活性下降均不明顯，在紫外光下連續(xù)照射12h后，抑菌活性仍能達(dá)到對照組活性的 89.87%，表明發(fā)酵濾液具有良好的紫外穩(wěn)定性。[〇〇34]3 ?酸堿穩(wěn)定性[0〇35]將發(fā)酵濾液分裝11份，每份lml，分別置于11支離心管中，于其中加入6mol/L的鹽酸和1〇111〇1凡的似011于室溫下分別調(diào)。11值至2-12，靜置處理1211后全部調(diào)。11至7.2，用無菌水定容至2ml。再取本發(fā)明菌株P(guān)5的發(fā)酵濾液，用無菌水定容至2ml作為對照(pH7.2)。測定抑菌活性，每組實驗重復(fù)3次。結(jié)果見圖5,顯示，發(fā)酵慮液在室溫下經(jīng)不同pH處理12h后，抑菌活性與對照相比變化不明顯，表明室溫下在PH2-12的范圍內(nèi)，抗菌物質(zhì)表現(xiàn)出很高的穩(wěn)定性。[〇〇36]4 ?遺傳穩(wěn)定性
[0037]參照高芬(高芬、吳元華、穆凌霄等的一株拮抗鏈霉菌的室內(nèi)抑菌活性及發(fā)酵液理化性質(zhì)測定[J].中國植物病理學(xué)會2007年學(xué)術(shù)年會論文集，2007)的方法，將菌株原始純化菌作為F1代，繼代培養(yǎng)直至F5代。每代培養(yǎng)4d，將1-5代的菌株常規(guī)發(fā)酵，測定發(fā)酵液抑菌活性。結(jié)果見圖6,顯示:與出發(fā)菌株相比，菌株P(guān)5繼代培養(yǎng)的發(fā)酵濾液抑菌活性隨傳代次數(shù)的增加呈輕微的下降趨勢，繼代培養(yǎng)到第5代時，其發(fā)酵濾液的抑菌活性仍然為出發(fā)菌株的 93.39%，可見菌株P(guān)5具有較為穩(wěn)定的遺傳特性。[〇〇38]由上可知，本發(fā)明菌株P(guān)5的發(fā)酵濾液中抑菌物質(zhì)熱穩(wěn)定、紫外穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性、 耐貯藏性均良好。
[0039]實施例4本發(fā)明菌株P(guān)5的發(fā)酵濾液對辣椒采后的保鮮效果
[0040]實驗設(shè)本發(fā)明菌株P(guān)5發(fā)酵濾液組、NW20保鮮液(生化級保鮮液，購自諾福(中國)生態(tài)科技有限公司)組和無菌水對照組3個處理。NW20保鮮液稀釋成體積分?jǐn)?shù)為10%的藥液后再使用。將采后新鮮辣椒清洗晾干之后，分別在不同的處理液中浸泡5min，自然晾干后，裝入保鮮袋內(nèi)，封口，20°C、75%的濕度下恒溫培養(yǎng)，每隔3d檢測指標(biāo)。每個處理20個果實，3次重復(fù)。
[0041]1.腐爛率測定[〇〇42]腐爛率(％ )=腐爛果實的個數(shù)/處理的總個數(shù)X 100%。[〇〇43] 結(jié)果見圖7,顯示:對照組最早出現(xiàn)腐爛，發(fā)酵濾液組直到貯藏第9天后才出現(xiàn)腐爛，腐爛率為5% (此時對照組的腐爛率為20% )。在整個貯藏期間，對照組的腐爛率上升顯著。而保鮮液組和發(fā)酵濾液組上升幅度較緩，發(fā)酵濾液的保鮮效果略低于保鮮液，二者差異不顯著(P>0.05)。貯藏15d后，發(fā)酵濾液組的腐爛率為20%，低于保鮮液組的10%，二組相比對照組分別降低了 50%和75%，呈顯著性差異(P〈0.05)，表明發(fā)酵濾液的保鮮效果良好。
[0044]2.質(zhì)量損失率測定
[0045]質(zhì)量損失率的測定參照靳敏等(靳敏、夏玉宇的食品技術(shù)檢驗[M].北京化學(xué)工業(yè)出版社.2003)的方法，1(%) = [(111()-11111)/111()]\100%，其中1為處理11天后的質(zhì)量損失率，1110 為原質(zhì)量，mn為處理n天后的質(zhì)量。[〇〇46] 結(jié)果見圖8,顯示:貯藏過程中，三個處理組的失重率均在上升，但對照組失重率的上升速率顯著高于保鮮液和發(fā)酵濾液組(P〈〇.05)。貯藏15d，保鮮液組的失重率為4.25%， 稍低于發(fā)酵濾液組的6.25%，二者與對照組(13.28%)相比分別降低了68%和52.71%，呈顯著性差異(P〈〇.05)。這一結(jié)果表明，發(fā)酵濾液處理能夠有效地防止辣椒在貯藏過程的失重。
[0047] 3.Vc含量測定[〇〇48] 采用2,6_二氯靛酚法。結(jié)果見圖9,顯示:貯藏過程中，不同處理組的Vc含量均有所下降，但發(fā)酵濾液組和保鮮液組下降速度相比對照組較緩。貯藏15d，對照組的Vc含量為 18.92mg/100g，比初始時降低了80.78% ;發(fā)酵濾液組和保鮮液組的Vc含量分別比初始時降低了44.77 %和37.56 %，二者Vc含量分別高于對照組65.20%和69.22%，差異極顯著(P〈 0.01)。貯藏15d，發(fā)酵濾液組的Vc含量略低于保鮮液組，二者差異不顯著(P>0.05)。該結(jié)果表明，在貯藏過程中，發(fā)酵濾液能有效抑制Vc氧化降解酶類的活性，從而顯著降低果實中Vc 的氧化，較好的保持了果實的營養(yǎng)品質(zhì)。
[0049]4.總糖含量測定
[0050]采用蒽酮比色法。結(jié)果見圖10,顯示:貯藏期間三個處理組的辣椒的總糖含量均減少，對照組辣椒的總糖含量下降速度最快，發(fā)酵濾液組和保鮮液組的總糖含量下降速度顯著小于對照組(P〈〇.05)。貯藏15d時，對照組的總糖含量比初始降低了 41.54%。發(fā)酵濾液組和保鮮液組與初始相比分別降低了29.07%和18.53%，二者總糖含量高于對照組21.33% 和39.36%，差異顯著(P〈0.05)。5.葉綠素含量測定
[0051]參考趙奇(趙奇、楊玉珍、郭運宏等的油用牡丹丹皮提取液對青椒的保鮮效應(yīng)[J].食品工業(yè)科技，2015，36 (2): 339-342)的方法。[〇〇52] 結(jié)果見圖11，顯示:隨著貯藏時間的延長，葉綠素逐漸降解，含量降低。對照組下降速度最快，貯藏15d時，由初始的0.195mg/g下降為0.085mg/g，相比初始的葉綠素含量降低了 56.41 %。此時發(fā)酵濾液組和保鮮液組相比初始的葉綠素含量分別降低了 40.51 %和 29.74%，二者葉綠素含量高于對照組36.47%和61.18%，差異顯著(P〈0.05)。[〇〇53]6.可滴定酸含量測定
[0054]可滴定酸參照李合生(李合生的植物生理生化實驗原理和技術(shù)[M].北京高等教育出版社，2000)的酸堿滴定法。[〇〇55] 結(jié)果見圖12，顯示:整個貯藏過程中，對照組可滴定酸含量下降最快。貯藏15d時， 對照組可滴定酸含量比初始時下降了75.94%。發(fā)酵濾液組和保鮮液組可滴定酸含量也均有下降，分別相比初始時下降了49.20%和40.11%，二者可滴定酸含量下降幅度均明顯小于對照組，此時，發(fā)酵濾液組的可滴定酸含量略低于保鮮液組，但二者差異不顯著(P> 0.05)。因此，發(fā)酵濾液能夠有效抑制辣椒的呼吸作用，減少了有機(jī)酸向可溶性糖的轉(zhuǎn)化，從而較好的保持了辣椒的風(fēng)味。[〇〇56]由上可知，本發(fā)明菌株P(guān)5的發(fā)酵濾液對辣椒具有顯著的防腐保鮮效果，其保鮮效果與保鮮劑接近，能用以制備保鮮劑。
【主權(quán)項】
1.一種保藏號為CCTCC NO: M2016131的拮抗內(nèi)生菌枯草芽孢桿菌(Bacillus subtil is )P5菌株在辣椒采后保鮮中的應(yīng)用。2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中，該應(yīng)用是指所述P5菌株在降低辣椒失重率中的應(yīng)用。3.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中，該應(yīng)用是指所述P5菌株在降低辣椒腐爛率中的應(yīng)用。4.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中，該應(yīng)用是指所述P5菌株在抑制辣椒可滴定酸含量減 少中的應(yīng)用。5.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中，該應(yīng)用是指所述P5菌株在抑制辣椒Vc含量減少中的應(yīng)用。6.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中，該應(yīng)用是指所述P5菌株在抑制辣椒總糖含量減少中 的應(yīng)用。7.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中，該應(yīng)用是指所述P5菌株在抑制辣椒葉綠素含量減少 中的應(yīng)用。
【文檔編號】A23B7/155GK105994610SQ201610423257
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年6月15日
【發(fā)明人】易有金, 羅程印, 夏菠, 曹熙, 田鍵
【申請人】湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)