專利名稱：一種刺參拮抗菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于海洋微生物和生物防治技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種刺參拮抗菌及其應(yīng)用，即一株具有拮抗刺參皮膚潰爛、圍口部腫脹疾病活性的細(xì)菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
近年來，刺參消費需求迅速擴大，傳統(tǒng)的捕撈業(yè)已不能滿足人們的需求，刺參人工養(yǎng)殖已成為我國北方沿海地區(qū)重要的經(jīng)濟養(yǎng)殖品種，其養(yǎng)殖面積已達百萬畝，年產(chǎn)值超過 100億元。然而，養(yǎng)殖的過速發(fā)展和不規(guī)范操作、養(yǎng)殖技術(shù)水平的參差不齊等導(dǎo)致了病害問題的日趨突出。自2003年冬季起，山東和遼寧沿海的養(yǎng)殖刺參先后出現(xiàn)了爛皮、腫嘴的大面積流行病、引發(fā)了 30%以上的大量死亡，造成了慘重的經(jīng)濟損失，嚴(yán)重制約了該產(chǎn)業(yè)的持續(xù)發(fā)展。隨著刺參疾病的頻繁發(fā)生，國內(nèi)外研究者開始關(guān)注刺參養(yǎng)殖過程中導(dǎo)致皮膚潰爛、 腫嘴流行病的病原問題。研究表明假交替單胞菌O^eudoalteromonas sp)和河豚毒素假交替單胞菌(P tetraodonis)可引起刺參皮膚潰爛、圍口部腫脹等流行性病害的發(fā)生。目前，控制刺參皮膚潰爛、圍口部腫脹等流行性疾病的方法一般是使用化學(xué)藥物，雖然有一定效果，但是并不能從根本上控制該病，而且生物體極易產(chǎn)生耐藥性，造成體內(nèi)、環(huán)境的藥物殘留，破壞生態(tài)平衡，威脅人體的健康和安全，并造成環(huán)境污染。近年來我國水產(chǎn)品因違禁抗生素超量，不斷遭受美國、歐盟和日本等國家的進口限制，不僅造成了巨大的經(jīng)濟損失， 而且國際形象嚴(yán)重受損。因此，采取既能保障水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展又能消除海水養(yǎng)殖產(chǎn)品抗生素污染、增加水產(chǎn)品質(zhì)量的措施已成為目前海水養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)中迫切需要解決的重要科學(xué)問題。生物防治是近年來被證明很有成就的新途徑，它主要利用為生物之間的拮抗作用，選擇對養(yǎng)殖生物不造成危害的微生物來抑制海水養(yǎng)殖生物病原菌的生長。使用拮抗菌防治刺參皮膚潰爛、圍口部腫脹等流行性疾病，可以減少化學(xué)農(nóng)藥的用量和在水產(chǎn)品上的殘留，對保護人類健康和防治環(huán)境污染都十分重要。同時，可有利于我國水產(chǎn)品的出口創(chuàng)匯，經(jīng)濟效益和社會效益十分顯著。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供了一種刺參拮抗菌及其應(yīng)用，可有效防治刺參皮膚潰爛、圍口部腫脹病，為刺參皮膚潰爛、圍口部腫脹疾病的預(yù)防和治療提供了產(chǎn)品和使用方法。本發(fā)明所提供的生物拮抗菌，是奧氏弧菌(Vibrio ordalii)，該菌株已于2011年 3月15日保藏于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院中科院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCC No. 4668。本發(fā)明的奧氏弧菌4668的活菌用于制備菌液制劑，所制得的菌液制劑可以預(yù)防刺參皮膚潰爛、圍口部腫脹病的發(fā)生。菌液制劑中奧氏弧菌4668活菌的數(shù)量為IO7 101(lCFU/ml。本發(fā)明篩選到的奧氏弧菌4668用于提取胞外產(chǎn)物，預(yù)防刺參皮膚潰爛、圍口部腫脹病的發(fā)生。本發(fā)明篩選的具有拮抗刺參皮膚潰爛、圍口部腫脹疾病活性的細(xì)菌，拮抗活性強， 利用鹽析法制備的拮抗菌胞外產(chǎn)物的產(chǎn)量穩(wěn)定，成本低，可具有較高的拮抗活性。使用該拮抗菌或拮抗產(chǎn)物對刺參的免疫保護率達70-80%，該拮抗菌產(chǎn)物為純生物制劑，且具有安全、環(huán)保的特點，不會產(chǎn)生藥物殘留和環(huán)境造成污染，并可從根本上遏制刺參皮膚潰爛、圍口部腫脹疾病的發(fā)生和流行。
具體實施例方式下面對本發(fā)明進行詳細(xì)的描述。上述拮抗菌的篩選方法如下首先分離養(yǎng)殖刺參池水中菌，然后以刺參皮膚潰爛、圍口部腫脹病原菌假交替單胞菌(I^eudoalteromonas sp)作為指示菌，篩選其拮抗菌。提取拮抗菌的胞外產(chǎn)物，用于刺參皮膚潰爛、圍口部腫脹疾病的預(yù)防。具體技術(shù)方案如下(1)養(yǎng)殖刺參池水、底泥、以及養(yǎng)殖大菱鲆池水細(xì)菌分離取養(yǎng)殖海參池水、底泥和大菱鲆池水，用無菌海水稀釋不同的倍數(shù)、劃線接種于2216E平板上，27°C培養(yǎng)48小時。 挑取形態(tài)一致的優(yōu)勢菌落進行純化培養(yǎng)，直到獲得60株純培養(yǎng)的優(yōu)勢菌株，轉(zhuǎn)入斜面培養(yǎng)基中4°C保存。(2)拮抗菌的篩選將指示菌-刺參皮膚潰爛、圍口部腫脹病原菌假交替單胞菌 (Pseudoalteromonas sp)接種于含有3% NaCl的LB液體培養(yǎng)基中，震蕩培養(yǎng)12 16小時，取40 μ 1 50 μ 1指示菌均勻涂布于高鹽營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(蛋白胨10g/L，肉浸粉 10g/L,NaCL 30g/L，瓊脂20g/L，PH為7. 4)平板上，用接種環(huán)或滅菌牙簽挑取(1)中的單菌落于涂有指示菌的平板上，每個平板涂2 3個單菌落，或者將該平板貼上滅菌后的小圓形濾紙片(5mm直徑)，并用移液槍取50 μ 1(1)中分離純化的菌液涂于濾紙片上，每個平板上放兩片或三片藥敏片(藥敏片直徑為6mm)，并做三個平行平板，減少隨機誤差。將平板放在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，觀察是否出現(xiàn)抑菌圈，并測量抑菌圈的大小。根據(jù)抑菌圈的大小篩選得到一株分離自刺參養(yǎng)殖池水的強拮抗菌YASM12，抑菌圈直徑M 43mm。(3)牛灃杯法將篩選得到的強拮抗菌YASM12重新鑒定，方法如下將牛灃杯放入高鹽營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，在牛灃杯中放入50 μ 1(1)中分離純化的菌液，將平板放在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，觀察是否出現(xiàn)抑菌圈，結(jié)果檢測到抑菌圈直徑為25mm。(4)拮抗菌YASM12胞外產(chǎn)物的抗菌活性鑒定利用鹽析法制備上述( 、(3)篩選得到的拮抗菌的胞外產(chǎn)物，沉淀用PH7. 4、10mM的無菌PBS溶解，并用透析袋，4°C過夜透析后即得拮抗菌胞外產(chǎn)物，放入1. 5ml的滅菌EP管中。將制備得到的10 μ 1胞外產(chǎn)物涂在滅菌濾紙片上，并將濾紙片貼于涂布40 μ 1 50 μ 1指示菌的高鹽營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，觀察抑菌圈的大小。(5)拮抗菌YASM12的形態(tài)、生理生化和分子生物學(xué)鑒定將拮抗菌劃線接種于 2216E平板，光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)菌形態(tài)和生理生化鑒定菌落特征為菌落呈乳白色，羽毛狀， 有鞭毛，細(xì)胞革蘭氏染色陰性，發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，對弧菌抑制劑0/1 敏感，接觸酶陽性，氧化酶陽性，無鹽條件下不生長，和3% NaCl胨水刺激其生長，IBSrRNA進行的分子生物學(xué)鑒定為奧氏弧菌(Vibrio ordalii)。菌株在高鹽營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng) 24h后，菌落呈乳白色，羽毛狀，有鞭毛可運動，革蘭氏染色陰性。發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，對
4弧菌抑制劑0/1 敏感，接觸酶陽性，氧化酶陽性，無鹽條件下不生長，和3% NaCl胨水刺激其生長。奧氏弧菌的培養(yǎng)條件將該菌涂布于高鹽營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(蛋白胨10g/L，肉浸粉10g/L，NaCL30g/L，瓊脂20g/L, PH為7. 4)平板上，28°C培養(yǎng)16-18小時即長出單菌落。篩選的菌株的抗菌性檢測實施例1 從市場購買體形均一、健康刺參，飼養(yǎng)于10L海水的整理箱中，每組15頭， 實驗期間連續(xù)充氣，水溫14 °C，每天換水，不投餌。將刺參病原菌假交替單胞菌 (Pseudoalteromonas sp)和篩選分離到的奧氏弧菌(Vibrio ordalii)分別接種于含有 3 % Na C1的LB培養(yǎng)基中，觀°C培養(yǎng)2 4 h后，離心，用無菌海水分別重懸，得菌懸液，進行以下四組實驗處理(1)對照組，未加病原菌和拮抗菌；(2)水體中病原菌菌液終濃度為 3. 5X108CFU/ml ； (3)水體中拮抗菌和病原菌菌液終濃度均為3. 5X 108CFU/ml，拮抗菌比病原菌先1天加入；(4)水體中拮抗菌菌液終濃度為3. 5X108CFU/ml,以上四組處理每天換水補充菌液，定時觀察記錄各組發(fā)病和死亡情況。處理組⑵第3天刺參開始出現(xiàn)病癥，第4 天出現(xiàn)死亡，第6天發(fā)病率是100%，死亡率是66. 7% ；處理組(3)中的刺參第5天有1頭出現(xiàn)皮膚潰爛、圍口部腫脹，第7天，死亡2頭，死亡率為13.3%;處理組⑴和(4)則無一例死亡。 二、奧氏弧菌菌液制劑的制備將奧氏弧菌接種于添加了 3% NaCl的LB培養(yǎng)基中，條件下培養(yǎng)至0D600值達到0.6以上時終止培養(yǎng)，獲得奧氏弧菌的擴大培養(yǎng)液；使菌液中的奧氏弧菌的濃度為 107-101QCFU/ml，即制得奧氏弧菌菌液制劑。本發(fā)明制得的奧氏弧菌菌液制劑可以添加在刺參餌料中或養(yǎng)殖水體中。三、拮抗菌奧氏弧菌胞外產(chǎn)物的信息1、拮抗菌奧氏弧菌胞外產(chǎn)物的制備拮抗菌接種于250ml、3% NaCl的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12-1 后，4°C、8000g離心10-20分鐘，棄沉淀，取上清，攪拌條件下緩慢滴加飽和硫酸銨達50%的飽和度，于4°C沉淀30min以上或過夜，使蛋白充分沉淀，10000g/min，10min4°C離心，棄上清。沉淀用5ml、 pH7. 4、IOmM的無菌PBS溶解，并裝入處理好的透析袋(截留分子量為14000Da)中，在4°C 條件下，于PH7. 4、IOmM的無菌PBS中透析過夜后，期間換兩到三次PBS溶液，即得拮抗菌胞外產(chǎn)物，分裝、放入1. 5ml的滅菌EP管中，_80°C條件下保存?zhèn)溆谩?、拮抗菌奧氏弧菌胞外產(chǎn)物的抗菌效果檢測實施例1 將健康、體形均一的刺參70頭，飼養(yǎng)于IOL海水的整理箱中，隨機分組每組15頭， 實驗期間連續(xù)充氣，水溫14°C，每天換水，不投餌。使用制備的拮抗菌胞外產(chǎn)物進行注射拮抗效果試驗，方法如下，試驗分3個處理，第1組為對照組，第2組為終濃度為3. 5 X IO8CFU/ ml的刺參病原菌處理組，第3組為注射20 40 μ 1的奧氏弧菌胞外產(chǎn)物后1天后加入終濃度為3. 5X108CFU/ml的刺參病原菌處理。10天后，第1組刺參無死亡，第2組刺參死亡率為100%，第3組的死亡率為20%。
實施例2 將健康、體形均一的刺參70頭，飼養(yǎng)于IOL海水的整理箱中，隨機分組每組15頭， 實驗期間連續(xù)充氣，水溫14°C，每天換水，不投餌。使用制備的拮抗菌胞外產(chǎn)物進行注射拮抗效果試驗，方法如下，試驗分3個處理，第1組為對照組，第2組為終濃度為3. 5 X IO8CFU/ ml的刺參病原菌處理組，第3組為注射20 40 μ 1的奧氏弧菌胞外產(chǎn)物后3天后加入終濃度為3. 5X108CFU/ml的刺參病原菌處理。10天后，第1組刺參無死亡，第2組的刺參死亡率為100%，第3組的死亡率為30%。實施例3 將健康、體形均一的刺參200頭，飼養(yǎng)于IOL海水的整理箱中，隨機分組，每組50 頭，實驗期間連續(xù)充氣，水溫14°C，每天換水。將制備的拮抗菌胞外產(chǎn)物混合入刺參餌料中， 進行拮抗效果試驗，每天胞外產(chǎn)物的飼喂量為50 μ 1，連續(xù)飼喂6天后，再飼喂正常餌料， 進行病原菌感染試驗。10天后，未進行拮抗菌胞外產(chǎn)物餌料飼喂的對照組刺參死亡率為 89%，第2組飼喂拮抗菌胞外產(chǎn)物餌料的刺參死亡率為30%。上述的實驗結(jié)果表明，本發(fā)明篩選得到的刺參拮抗菌及其保外產(chǎn)物具有高效的拮抗效果，能夠有效的提高刺參的抗病力，具有良好的市場推廣前景。
權(quán)利要求
1.一種刺參拮抗菌，為奧氏弧菌，其保藏編號為CGMCC No. 4668。
2.一種菌液制劑，其特征在于包含有權(quán)利要求1所述的奧氏弧菌的活菌。
3.如權(quán)利要求2所述的菌液制劑，其特征在于上述的奧氏弧菌活菌的數(shù)量為IO7 10lclCFU/ml。
4.如權(quán)利要求2或3所述的菌液制劑，其特征在于上述的菌液的培養(yǎng)基為高鹽營養(yǎng)培養(yǎng)基。
5.如權(quán)利要求4所述的菌液制劑，其特征在于上述的高鹽營養(yǎng)培養(yǎng)基為添加有3%g/ ml NaCl的LB培養(yǎng)基。
6.一種細(xì)菌胞外產(chǎn)物，其特征在于是由權(quán)利要求1所述的奧氏弧菌發(fā)酵生產(chǎn)的。
7.權(quán)利要求6所述的胞外產(chǎn)物用作飼料添加劑或抗菌增效劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種刺參拮抗菌及其應(yīng)用，所述的刺參拮抗菌為奧氏弧菌，其保藏編號為CGMCC No.4668。本發(fā)明的拮抗菌用于制備菌液制劑和提取胞外產(chǎn)物。本發(fā)明篩選的具有拮抗刺參皮膚潰爛、圍口部腫脹疾病活性的細(xì)菌，拮抗活性強，利用鹽析法制備的拮抗菌胞外產(chǎn)物的產(chǎn)量穩(wěn)定，成本低，可具有較高的拮抗活性。使用該拮抗菌或拮抗產(chǎn)物對刺參的免疫保護率達70-80％，使用該拮抗菌產(chǎn)物為純生物制劑，且具有安全、環(huán)保的特點，不會產(chǎn)生藥物殘留和環(huán)境造成污染，并且該方法可從根本上遏制刺參皮膚潰爛、圍口部腫脹疾病的發(fā)生和流行。
文檔編號C12N1/20GK102206595SQ201110079359
公開日2011年10月5日 申請日期2011年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月31日
發(fā)明者劉均玲, 劉洪展, 吳艷君, 孫修勤, 曲凌云, 鄭風(fēng)榮 申請人:國家海洋局第一海洋研究所