本發(fā)明涉及一種分子生物工程技術領域，尤其是一種多糖蛋白類結(jié)合物的純化和分析方法。

背景技術：

肺炎球菌感染是在全球范圍內(nèi)引起死亡的重要原因之一，且是肺炎、腦膜炎、中耳炎的主要病因之一，是全球性感染性疾病，人群普遍易感，但2歲以下嬰幼兒和60歲以上老人是最主要的易感人群。美國有觀察資料顯示，估計每年有40-50萬人患肺炎球菌性肺炎，病死率在5%-10%。在用疫苗預防兒童死亡的疾病中，肺炎球菌引起的疾病排名第一。目前隨著抗生素的依賴性及濫用，耐藥菌株與日俱增，醫(yī)藥學界都積極關注并開啟了肺炎球菌疫苗的開發(fā)，同時研究有效疫苗也成為預防肺炎鏈球菌感染的最有效手段。

多糖蛋白結(jié)合疫苗是目前肺炎疫苗研究的主要方向，并且在預防肺炎球菌感染性疾病方面發(fā)揮了顯著作用。但是目前批準上市的7價肺炎球菌結(jié)合疫苗（PCV7）、10價肺炎球菌結(jié)合疫苗（PCV10）和13價肺炎球菌結(jié)合疫苗（PCV13）。Prevenar^?和Prevenar13^?結(jié)合疫苗使用的技術方法為胺還原法，均使用了無毒的白喉毒素突變體（CRM197）作為載體蛋白。而GSK公司的Synflorix^?結(jié)合疫苗使用了三種不同蛋白質(zhì)載體，包括不可分型流感嗜血桿菌蛋白D（PD）、破傷風毒素（TT）和白喉毒素（DT）。研究發(fā)現(xiàn)使用不同載體蛋白制備的結(jié)合疫苗能誘導更高的血清抗體水平，主要是因為不同載體能夠激活更多克隆數(shù)的輔助性T細胞。

目前市售的肺炎多糖蛋白結(jié)合疫苗主要依賴國外進口，進口疫苗接種費用高，達不到全民預防的作用，所以開發(fā)我國肺炎高發(fā)流行的血清型結(jié)合疫苗，形成和國外可以相競爭的產(chǎn)品解決接種肺炎疫苗費用高的問題，已經(jīng)迫在眉睫。相關參考文獻如下所示：

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技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種高效快速的多糖蛋白結(jié)合疫苗純化分析方法。

為解決上述技術問題，本發(fā)明所采取的技術方案如下。

一種高效快速的多糖蛋白結(jié)合疫苗純化分析方法，在疫苗生產(chǎn)過程中用于多糖蛋白結(jié)合物的純化制備，該方法首先利用超濾系統(tǒng)將多糖蛋白結(jié)合物中未結(jié)合的載體蛋白及其他小分子物質(zhì)去除，得到多糖蛋白結(jié)合物和未參與結(jié)合的游離多糖，然后使超濾液經(jīng)過陰離子交換樹脂，游離的多糖穿過凝膠柱而多糖蛋白結(jié)合物吸附在凝膠基質(zhì)上，洗脫并濃縮洗脫液即得純化后的多糖蛋白結(jié)合物。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術方案，該方法包括如下步驟：

A、利用Minimate TFF超濾系統(tǒng)去除未反應的載體蛋白及小分子物質(zhì)，所述Minimate TFF超濾系統(tǒng)的分子截留量設定為1000kDa；

B、利用DEAE離子交換柱層析去除游離未結(jié)合的多糖，層析柱采用0.5M的NaCl溶液進行洗脫，收集洗脫液，經(jīng)濃縮即得純化后的多糖蛋白結(jié)合物，用于后續(xù)檢測分析。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術方案，所述多糖蛋白結(jié)合物為肺炎莢膜多糖CPS9V與CRM₁₉₇載體蛋白的結(jié)合物。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術方案，步驟A所使用的多糖蛋白結(jié)合物反應液的制備方法為：稱量40mg 肺炎莢膜多糖CPS9V干粉溶解于8mL pH7.0的磷酸緩沖液中配置成濃度為5mg/mL的多糖溶液，多糖溶液中加入高碘酸鈉氧化，然后加入乙烯基乙二醇終止反應，將上述反應液轉(zhuǎn)移至透析袋中室溫透析，每次透析1小時共透析3次；在上述透析液中加入載體蛋白CRM₁₉₇，混勻后加入100mM的氰基硼氫化鈉室溫反應5天，反應結(jié)束后在加入100mM硼氫化鈉去除反應液中剩余的醛基，即得多糖蛋白結(jié)合物反應液，將反應液凍干儲存用于后續(xù)純化操作。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術方案，步驟A中，所述Minmate超濾系統(tǒng)的參數(shù)設置為：蠕動泵采用R300A，蠕動泵轉(zhuǎn)速設定為250rpm；膜包采用改性聚醚砜超濾膜，膜包總面積為200cm²；壓力表參數(shù)設定為為0.15MPa，最高不超過0.2MPa；超濾膜片之間連接方式為并聯(lián)；進樣初始總體積為500mL；超濾過程中磁力攪拌器設定轉(zhuǎn)速為800rpm。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術方案，步驟A中，所述Minmate超濾系統(tǒng)的操作流程包括：

超濾前準備，用0.15M PBS pH7.0緩沖液清洗整個管路，清洗終點為回流管內(nèi)液體經(jīng)過pH計檢測顯示為中性；

將需要超濾的樣品倒入超濾杯中進行上樣；

啟動蠕動泵開關，設定轉(zhuǎn)速250rpm,調(diào)節(jié)壓力為0.15MPa，調(diào)節(jié)磁力攪拌器設定轉(zhuǎn)速為800rpm；

同時開啟0.15M PBS pH7.0緩沖液蠕動泵，及時補充超濾杯中的溶液，保持其總體積不變；

超濾50倍體積緩沖液后，停止補給0.15M PBS pH7.0的緩沖液，繼續(xù)超濾至總體積為達到50mL；

轉(zhuǎn)移超濾液至50mL無菌的離心管中等待進一步純化；

使用超純水清洗Minmate系統(tǒng)管路及膜包；

使用0.1M NaOH溶液清洗Minmate系統(tǒng)管路及膜包，直至整個管路系統(tǒng)浸泡在堿性環(huán)境中。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術方案，步驟B中，DEAE陰離子交換柱層析參數(shù)設置為：基質(zhì)：選擇6%交聯(lián)瓊脂糖，基質(zhì)粒徑：45-165μm，耐壓度：0.3MPa，層析柱體積：10mL，層析柱清洗緩沖液：0.15M磷酸緩沖液溶液pH 7.0，層析柱平衡緩沖液：0.15M磷酸緩沖液溶液pH 7.0，層析柱多糖蛋白結(jié)合物洗脫液：0.5M氯化鈉溶液pH 7.0。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術方案，步驟B中，DEAE陰離子交換柱層析的操作步驟為：

裝柱：⑴讓所有的材料和試劑達到室溫，同時配制清洗緩沖液、平衡緩沖液和洗脫液；⑵根據(jù)柱子大小取所需量的凝膠，清洗掉20%乙醇，抽干，按凝膠:清洗緩沖液=3:1的體積比例配制勻漿，勻漿作脫氣處理；⑶將柱內(nèi)及柱子底端用純水或清洗緩沖液潤濕并保持一小段液位，使液面高于濾膜，確保底端無氣泡；⑷用玻璃棒引導勻漿沿著柱內(nèi)壁一次性倒入柱內(nèi)，確保勿產(chǎn)生氣泡，打開柱子出液口，使凝膠在柱內(nèi)自由沉降，連結(jié)好柱子頂端柱頭；⑸打開蠕動泵，讓清洗緩沖液以2mL/min的流速流過，穩(wěn)定柱床,用100mL的平衡緩沖液平衡柱子；

平衡：讓平衡緩沖液勻速流過柱子，直至流出液電導和pH不變；

上樣：品用平衡緩沖液配制，CPS9V-CRM₁₉₇樣品經(jīng)離心和0.22μm膜過濾后上樣；CPS9V-CRM₁₉₇產(chǎn)品結(jié)合在柱子上，用平衡緩沖液洗去雜質(zhì)；

洗脫：DEAE介質(zhì)用0.5M氯化鈉溶液洗脫，收集洗脫樣，收集純的CPS9V-CRM₁₉₇結(jié)合物。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術方案，對步驟B所得多糖蛋白結(jié)合物進行檢測分析以確認多糖蛋白結(jié)合物的純化效能，具體操作步驟包括：

C-1、 CPS9V-CRM₁₉₇多糖蛋白結(jié)合物的定量分析：使用苯酚-硫酸法測定莢膜多糖的含量，蛋白質(zhì)的含量通過BCA方法測定，結(jié)合物的純度通過CL-4B層析分離，在紫外光280nm和206nm雙波長檢測吸收峰值。

C-2、動態(tài)光散射分析：使用BI-200SM檢測儀測量CPS9V-CRM₁₉₇和CRM₁₉₇的分子半徑，進一步分析確認多糖蛋白質(zhì)的結(jié)合情況；

C-3、層析色譜測定分子量：CPS9V-CRM₁₉₇的分子量通過CL-4B色譜檢測，層析柱使用前用0.15M NaCl溶液室溫預處理，設定流速為0.5mL/mL。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術方案，對經(jīng)步驟C分析之后的多糖蛋白結(jié)合物進行進一步的試驗分析，具體操作步驟包括：

D、對多糖蛋白結(jié)合物進行蛋白酶酶裂解敏感性分析，CPS9V-CRM₁₉₇結(jié)合物和CRM₁₉₇使用胰酶消化，胰酶與CRM₁₉₇蛋白質(zhì)溶液的質(zhì)量比例按照1:40配置。

E、對所得多糖蛋白結(jié)合物進行免疫原性測定：

E-1、將體重為15-22g的5周齡BALB/c小鼠隨即平均分成4組，每組小鼠分別接受CPS9V、CPS9V-CRM₁₉₇、CRM₁₉₇、PBS皮下免疫，小鼠在第一次接受免疫后14天給予第二次免疫；血樣分別在第0、7、14、21天采集，血清被分離儲后存于-20℃冰箱中；

E-2、使用CPS9V的鹽溶液孵育96孔板過夜Corning，次日使用包含0.05%Tween-20的PBS溶液清洗96孔板，然后使用包含1%BSA的PBS溶液在25℃封閉處理90分鐘；再次使用PBS緩沖液清洗96孔板，分別加入CPS9V、CPS9V-CRM₁₉₇、CRM₁₉₇、PBS免疫的血清37℃孵育90分鐘；棄去板內(nèi)液體使用PBS溶液清洗3次，使用2000倍稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG抗體37℃孵育90分鐘；孵育結(jié)束后，棄去板內(nèi)液體用包含0.05%Tween-20的PBS溶液清洗3次；加入100微升包含0.015%TMB的底物溶液37℃孵育30分鐘，然后加入25微升2M的H₂SO₄終止反應，最終溶液用酶標儀測定于450nm處吸收值，CPS9V和CRM₁₉₇特異性抗原滴度數(shù)據(jù)使用GraphPadPrism軟件進行統(tǒng)計學分析，完成對經(jīng)純化的多糖蛋白結(jié)合物的效能確認。

采用上述技術方案所產(chǎn)生的有益效果在于：本發(fā)明的申請人針對現(xiàn)有肺炎多糖蛋白結(jié)合物的純化工藝復雜、收率低、無法高效快速大規(guī)模生產(chǎn)的問題，經(jīng)過反復探索試驗提出了2步法快速、高效的肺炎莢膜多糖蛋白結(jié)合物純化工藝。肺炎莢膜多糖兩步法組合純化工藝具有快速、高效、處理量大、設備要求簡單、操作簡便等諸多優(yōu)點，解決了目前肺炎多糖結(jié)合疫苗試驗室研究、中試開發(fā)及工業(yè)化生產(chǎn)中的純化時間長、效率低和人力物力成本高等諸多問題，試驗證實所開發(fā)的操作工藝切實有效，相比傳統(tǒng)制藥企業(yè)肺炎多糖蛋白純化工藝優(yōu)勢明顯。本發(fā)明的工藝中，第一步純化是將反應后混合物經(jīng)超濾系統(tǒng)純化去除未結(jié)合的載體蛋白CRM₁₉₇及其他小分子物質(zhì)，得到CPS9V-CRM₁₉₇結(jié)合物和未參與結(jié)合的游離CPS9V多糖；第二步純化是將超濾液經(jīng)過DEAE陰離子交換樹脂，CPS9V-CRM₁₉₇將會被吸附在凝膠基質(zhì)上，游離的CPS9V多糖不會被吸附而穿過凝膠柱，再將吸附于凝膠基質(zhì)上的結(jié)合物用0.5M的NaCl溶液洗脫并收集洗脫液，濃縮后用于進一步檢測分析。本文中試驗結(jié)果分析證實兩步法多糖蛋白純化工藝具有節(jié)約時、節(jié)約人力物力消耗等許多優(yōu)點，進一步提高了實際工業(yè)化生產(chǎn)中的生產(chǎn)效率。本文中所開發(fā)的CPS9V-CRM₁₉₇兩步法純化工藝也可以擴展用于其它多糖蛋白結(jié)合疫苗的研究開發(fā)。

附圖說明

圖1a 為實施例3的3.1中游離的CPS9V多糖用CL-4B柱分離后280nm和206nm雙波長檢測的結(jié)果；圖1b 為實施例3的3.1中CPS9V-CRM197反應后混合物用CL-4B柱分離后280nm和206nm雙波長檢測的結(jié)果。

圖2a為實施例3的3.3中CPS9V與CRM197結(jié)合物純化前經(jīng)過CL-4B柱分離并在280nm和206nm紫外波長檢測的結(jié)果；圖2b為實施例3的3.3中 CPS9V-CRM197反應結(jié)合物經(jīng)兩步法純化后經(jīng)CL-4B柱分離后280nm、206nm雙波長紫外檢測的結(jié)果。

圖3為實施例4中CPS9V-CRM197 和CRM197分別經(jīng)胰酶消化后完整蛋白的剩余量；按照胰酶與蛋白質(zhì)的質(zhì)量比1:25進行配置磷酸緩沖液，蛋白質(zhì)的完整性通過辣根過氧化物酶標記的IgG測定。

圖4為實施例5中 CPS9V 和 CPS9V-CRM197產(chǎn)生的特異性抗體，CPS9V特異性IgG和IgM用辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗體進行檢測。

具體實施方式

以下實施例詳細說明了本發(fā)明。本發(fā)明所使用的各種原料及各項設備均為常規(guī)市售產(chǎn)品，均能夠通過市場購買直接獲得。其中高碘酸鈉、氰基硼氫化鈉、硼氫化鈉、乙烯基乙二醇、氯化鈉購自Sigma公司，Minimate TFF系統(tǒng)購自PALL公司，HiTrap DEAE FF、CL-4B購自GE公司，辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG抗體、IgM抗體購自Sigma公司，肺炎莢膜多糖CPS9V、CRM197載體蛋白來源于北京華安生物科技有限公司。

實施例1、用胺還原方法制備CPS9V-CRM197多糖蛋白結(jié)合物

稱量40mg CPS9V干粉溶解于8mL磷酸緩沖液（pH7.0）中配置成濃度為5mg/mL的多糖溶液，多糖溶液中加入高碘酸鈉氧化，然后加入乙烯基乙二醇終止反應。將上述反應液轉(zhuǎn)移至透析袋中室溫透析，每次透析1小時共透析3次。

在上述透析液中加入載體蛋白CRM₁₉₇，混勻后加入100mM的氰基硼氫化鈉室溫反應5天。反應結(jié)束后在加入100mM硼氫化鈉去除反應液中剩余的醛基，然后將反應液凍干并儲存用于進一步純化。

實施例2、CPS9V-CRM₁₉₇多糖蛋白結(jié)合物的純化

本公司開發(fā)了一種兩步法組合純化工藝，第一步純化是用Minimate TFF超濾系統(tǒng)（分子截留量為1000kDa）去除未反應的載體蛋白及小分子物質(zhì)，第二步是用DEAE離子交換柱層析去除游離未結(jié)合的CPS9V多糖，層析柱經(jīng)過洗脫收集CPS9V-CRM₁₉₇結(jié)合物。

實施例3、CPS9V-CRM₁₉₇多糖蛋白結(jié)合物的分析

3.1 CPS9V-CRM₁₉₇多糖蛋白結(jié)合物的定量分析：使用苯酚-硫酸法測定莢膜多糖的含量，蛋白質(zhì)的含量通過BCA方法測定。結(jié)合物的純度通過CL-4B層析分離，在紫外光280nm和206nm雙波長檢測吸收峰值。

定量分析的結(jié)果顯示：CPS9V肺炎莢膜多糖與載體蛋白CRM₁₉₇結(jié)合，分別經(jīng)過CL-4B層析柱分離后于280nm和206nm雙波長檢測。游離的CPS9V和CPS9V-CRM₁₉₇結(jié)合物的洗脫體積分別為50.34mL和47.82mL。

具體結(jié)果數(shù)據(jù)參見附圖1a和1b，圖1a 為游離的CPS9V多糖用CL-4B柱分離后280nm和206nm雙波長檢測結(jié)果，圖1b 為CPS9V-CRM197反應后混合物用CL-4B柱分離后280nm和206nm雙波長檢測結(jié)果。多糖測定試驗結(jié)果證實經(jīng)過兩步法純化多糖的總回收率為95%。

3.2 動態(tài)光散射試驗：使用BI-200SM檢測儀測量CPS9V-CRM₁₉₇和CRM₁₉₇的分子半徑，進一步分析多糖蛋白質(zhì)的結(jié)合情況。經(jīng)動態(tài)光散射試驗測定CRM₁₉₇的分子半徑為2.5nm，CPS9V-CRM₁₉₇的分子半徑為8.4nm。

3.3 使用CL-4B層析色譜測定CPS9V-CRM₁₉₇的分子量：CPS9V-CRM₁₉₇的分子量通過CL-4B色譜檢測，層析柱使用前用0.15M NaCl溶液室溫預處理，設定流速為0.5mL/mL。

測定結(jié)果參見附圖2a、2b。游離的CPS9V與CPS9V-CRM₁₉₇分別經(jīng)CL-4B凝膠色譜柱分離后經(jīng)280nm、206nm雙波長檢測，結(jié)果證實游離CPS9V的洗脫峰體積為50.34mL，反應后混合物在47.85mL的位置出現(xiàn)了多糖、蛋白質(zhì)的雙吸收峰，如圖2a；但是經(jīng)過兩步法純化之后的CPS9V-CRM₁₉₇結(jié)合物洗脫體積為50.32mL，并沒有明顯的變化如圖2b。

實施例4、CPS9V-CRM₁₉₇結(jié)合物蛋白酶酶裂解敏感性試驗

CPS9V-CRM₁₉₇結(jié)合物和CRM₁₉₇使用胰酶消化，胰酶與CRM₁₉₇蛋白質(zhì)溶液的質(zhì)量比例按照1:40配置。

試驗結(jié)果參見附圖3，CPS9V-CRM197 和CRM197分別經(jīng)胰酶消化后完整蛋白的剩余量；按照胰酶與蛋白質(zhì)的質(zhì)量比1:25進行配置磷酸緩沖液，蛋白質(zhì)的完整性通過辣根過氧化物酶標記的IgG測定。CPS9V-CRM₁₉₇結(jié)合物和CRM₁₉₇載體蛋白酶解試驗證實，CPS9V-CRM₁₉₇結(jié)合物具有比CRM₁₉₇更高的酶解敏感性。

實施例5、 CPS9V-CRM₁₉₇結(jié)合物的免疫原性測定

將體重為15-22g的5周齡BALB/c小鼠隨即平均分成4組，每組小鼠分別接受CPS9V、CPS9V-CRM₁₉₇、CRM₁₉₇、PBS皮下免疫，小鼠在第一次接受免疫后14天給予第二次免疫。血樣分別在第0、7、14、21天采集，血清被分離儲后存于-20℃冰箱中。

使用CPS9V的鹽溶液孵育96孔板過夜（Corning），次日使用包含0.05%Tween-20的PBS溶液清洗96孔板，然后使用包含1%BSA的PBS溶液在25℃封閉處理90分鐘。再次使用PBS緩沖液清洗96孔板，分別加入CPS9V、CPS9V-CRM₁₉₇、CRM₁₉₇、PBS免疫的血清37℃孵育90分鐘。棄去板內(nèi)液體使用PBS溶液清洗3次，使用2000倍稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG抗體37℃孵育90分鐘。孵育結(jié)束后，棄去板內(nèi)液體用包含0.05%Tween-20的PBS溶液清洗3次。加入100微升包含0.015%TMB的底物溶液37℃孵育30分鐘，然后加入25微升2M的H₂SO₄終止反應，最終溶液用酶標儀測定于450nm處吸收值。CPS9V和CRM₁₉₇特異性抗原滴度數(shù)據(jù)使用GraphPadPrism軟件進行統(tǒng)計學分析。

試驗結(jié)果參見附圖4，CPS9V-CRM₁₉₇和CPS9V免疫的小鼠血清用于分析CPS9V特異性抗體。結(jié)果證實：CPS9V-CRM₁₉₇產(chǎn)生了比CPS9V更高的IgM滴度，CPS9V-CRM₁₉₇誘導產(chǎn)生的IgG水平是CPS9V的350倍。

上述描述僅作為本發(fā)明可實施的技術方案提出，不作為對其技術方案本身的單一限制條件。