iPS細胞及其制造方法
【專利摘要】本發(fā)明在于提供一種以使至少1種連接蛋白抑制因子和至少1種TGFβ信號轉導抑制因子作用于細胞為特征的制作iPS細胞的方法、含有至少1種連接蛋白抑制因子的iPS細胞、含有選自連接蛋白抑制因子和TGFβ信號轉導抑制因子中的至少1種抑制因子的iPS細胞誘導劑、含有選自連接蛋白抑制因子和TGFβ信號轉導抑制因子中的至少1種抑制因子的iPS細胞誘導用培養(yǎng)基、含有選自連接蛋白抑制因子和TGFβ信號轉導抑制因子中的至少1種抑制因子的iPS細胞誘導用試劑盒。
【專利說明】iPS細胞及其制造方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及iPS細胞(induced pluripotent stem cells,誘導性多功能干細胞)及其制造方法。另外，本發(fā)明涉及iPS細胞誘導劑、iPS細胞誘導用培養(yǎng)基和iPS細胞誘導用試劑盒。
【背景技術】
[0002]iPS細胞也被稱為人工多功能性干細胞或誘導多功能性干細胞，是能夠獲得與ES細胞同等分化多功能性的細胞。
[0003]ES細胞、iPS細胞等具有分化多功能性的細胞，由于保持向構成機體的全部臟器和組織分化的能力，在再生因任何疾病而受損的臟器、血液、骨髓、組織等上作為極其有效的手段備受期待。
[0004]但是，從ES細胞得到的血液、骨髓、組織、臟器等機體材料，在移植階段有引起排斥反應的擔心，必須克服這樣的免疫性問題，還在倫理上的問題受到指責。另一方面，由于iPS細胞能夠使用本人的體細胞來制作，沒有免疫排斥的問題，也沒有倫理上的問題。
[0005]山中伸彌教授等的團隊在小鼠的成纖維細胞中導入了作為Yamanaka factors的4種重編程因子(reprogramming factor),制作了 iPS細胞(非專利文獻1、2),但在應用于醫(yī)療時有以下的問題。
[0006]1.有細菌DNA等外源基因整合到宿主細胞基因組的擔心。
[0007]2.由常規(guī)方法得到的iPS細胞以一定的概率癌化，在安全性方面存在問題。
[0008]3.對外來基因過量表達 得到的iPS細胞，不能預計多功能性以外的影響。
[0009]現有技術文獻
[0010]非專利文獻
[0011]非專利文獻1:Takahashi 等，Cell2006,126:663-676
[0012]非專利文獻2:0kita 等，Nature2007，448:313-317

【發(fā)明內容】

[0013]發(fā)明所要解決的課題
[0014]本發(fā)明的目的在于提供無癌化擔心、安全的iPS細胞。
[0015]用于解決課題的方法
[0016]本發(fā)明人等鑒于上述課題進行了研究，驚人地發(fā)現，使連接蛋白(connexin)抑制因子和TGFii信號轉導抑制因子作用于細胞，能夠不進行基因導入地建立iPS細胞。
[0017]本發(fā)明是提供以下的iPS細胞及其制造方法、iPS細胞誘導劑、iPS細胞誘導用培養(yǎng)基、iPS細胞誘導用試劑盒的發(fā)明。
[0018]項1.一種制作iPS細胞的方法，其特征在于:使至少I種連接蛋白抑制因子和至少I種TGFP信號轉導抑制因子作用于細胞。
[0019]項2.如項I所述的方法，其中，連接蛋白抑制因子為連接蛋白43抑制因子。[0020]項3.如項I或2所述的方法，其中，上述連接蛋白抑制因子是對連接蛋白的siRNA、shRNA、miRNA、反義RNA、肽、抗體或核酶、或在細胞內能夠放出這些RNA分子的表達載體。
[0021]項4.如項I?3中任一項所述的方法，其中，上述TGFP信號轉導抑制因子為TGF-β受體I抑制劑。
[0022]項5.如項I?4中任一項所述的方法，其中，上述TGF-β受體抑制劑為SB-431542、A-83-01 或 ALK5 抑制劑。
[0023]項6.含有至少I種連接蛋白抑制因子的iPS細胞。
[0024]項7.如項6所述的iPS細胞，其中，連接蛋白抑制因子為連接蛋白43抑制因子。
[0025]項8.如項6或7所述的iPS細胞，其中，上述連接蛋白抑制因子是對連接蛋白的siRNA、shRNA、miRNA、反義RNA、肽、抗體或核酶、或在細胞內能夠放出這些RNA分子的表達載體。
[0026]項9.一種含有選自連接蛋白抑制因子和TGF0信號轉導抑制因子中的至少I種抑制因子的iPS細胞誘導劑。
[0027]項10.—種含有選自連接蛋白抑制因子和TGF β信號轉導抑制因子中的至少I種抑制因子的iPS細胞誘導用培養(yǎng)基。
[0028]項11.一種含有選自`連接蛋白抑制因子和TGF β信號轉導抑制因子中的至少I種抑制因子的iPS細胞誘導用試劑盒。
[0029]發(fā)明的效果
[0030]根據本發(fā)明的方法，不必導入外源基因(特別是原癌基因)，不使用病毒，因此，不改變iPS細胞以外的形質，癌化和感染的擔心極低、是安全的，能夠制作對人的實用化具有非常大的優(yōu)點的iPS細胞。
[0031]由本發(fā)明得到的iPS細胞，確認以下4點。
[0032]1.多功能性細胞標記因子的表達以基因水平、蛋白質水平保持。
[0033]2.通過向小鼠皮下移植，形成畸胎瘤，能夠分化誘導為腺管、軟骨、神經等三胚層的全部細胞。
[0034]3.形成類胚體，根據分化誘導條件，能夠分別分化為內皮細胞、神經細胞、心肌細胞，分化誘導得到的心肌細胞能夠發(fā)揮生理功能。
[0035]4.能夠制作嵌合小鼠。
[0036]另外,本發(fā)明的iPS細胞能夠制作生殖系(Germ line)。
[0037]因此，由本發(fā)明提供的iPS細胞用于制作在再生醫(yī)療等中使用的生物材料是非常優(yōu)異的細胞。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0038]圖1表示本發(fā)明的實施例中得到的細胞的結果。a.siPSCs的形態(tài)類似于小鼠ES。b.siPSCs的ALP活性得到了認可。c.通過各種抗多功能性標記抗體(Nanog、0ct4、Sox2、SSEA1)的免疫染色，能夠在蛋白質水平確認了表達。d.通過RT-PCR，各種抗多功能性標記基因的表達在基因水平得到了確認。e.通過在SCID小鼠的皮下進行移植，形成畸胎瘤，確認了腺體、軟骨.肌肉、神經.上皮。[0039]圖2表示來自EGFP小鼠心肌的siPSCs的形態(tài)。
[0040]圖3表示siPSCs細胞的嵌合小鼠制作。a.表示從siPSCs_#l得到的嵌合小鼠。b.表示從siPSCs-#2得到的嵌合小鼠。
[0041]圖4是表示TGF信號轉導的概略圖。
【具體實施方式】
[0042]在本說明書中，“iPS細胞”是指也稱為人工多功能性干細胞或誘導多功能性干細胞的獲得了分化多功能性的細胞。本發(fā)明中得到的iPS細胞，能夠分化為內胚層、外胚層、中胚層全部(參照圖1)，能夠制作嵌合小鼠(圖3)和生殖系。
[0043]“連接蛋白(Cx)”是參與間隙連接的蛋白質的總稱，根據分子量，命名為Cx43(43kDa)等。作為連接蛋白的具體例子,可以列舉Cx26、Cx30、Cx31、Cx32、Cx36、Cx37、Cx40、Cx43、Cx50等?，F在已知超過20種的連接蛋白，今后所發(fā)現的連接蛋白類也包括在本發(fā)明中抑制對象的連接蛋白中。關于連接蛋白的種類和表達，在總說(Oyamada等，BBA, 2005,1719:6-23)中有詳細敘述，該記載在本說明書中作為參考援引。在以下的表中總結連接蛋白的種類和表達部位。
[0044][表I ]
【權利要求】
1.一種制作iPS細胞的方法，其特征在于: 使至少I種連接蛋白抑制因子和至少I種TGFii信號轉導抑制因子作用于細胞。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于: 連接蛋白抑制因子為連接蛋白43抑制因子。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于: 所述連接蛋白抑制因子是對連接蛋白的siRNA、shRNA、miRNA、反義RNA、肽、抗體或核酶、或在細胞內能夠放出這些RNA分子的表達載體。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于: 所述TGFii信號轉導抑制因子為TGF-β受體I抑制劑。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于: 所述TGF-β受體抑制劑為SB-431542、A-83-01或ALK5抑制劑。
6.一種iPS細胞，其特征在于: 含有至少I種連接蛋白抑制因子。
7.如權利要求6所述的iPS細胞，其特征在于: 連接蛋白抑制因子為連接 蛋白43抑制因子。
8.如權利要求6所述的iPS細胞，其特征在于: 所述連接蛋白抑制因子是對連接蛋白的siRNA、shRNA、miRNA、反義RNA、肽、抗體或核酶、或在細胞內能夠放出這些RNA分子的表達載體。
9.一種iPS細胞誘導劑，其特征在于: 含有選自連接蛋白抑制因子和TGFii信號轉導抑制因子中的至少I種抑制因子。
10.一種iPS細胞誘導用培養(yǎng)基，其特征在于: 含有選自連接蛋白抑制因子和TGFii信號轉導抑制因子中的至少I種抑制因子。
11.一種iPS細胞誘導用試劑盒，其特征在于: 含有選自連接蛋白抑制因子和TGFii信號轉導抑制因子中的至少I種抑制因子。
【文檔編號】C12N5/00GK103429732SQ201180067989
【公開日】2013年12月4日 申請日期:2011年12月27日 優(yōu)先權日:2010年12月27日
【發(fā)明者】高松哲郎, 戴平 申請人:Lsip基金運營聯合公司