專利名稱：用于轉(zhuǎn)染細胞代謝性選擇的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的標記選擇載體以及使用這些載體在真核細胞內(nèi) 穩(wěn)定表達基因產(chǎn)物的方法。
背景技術(shù)：
哺乳細胞體外培養(yǎng)技術(shù)的M對生物研究有著革命性的意義。細 胞培養(yǎng)技術(shù)可以用來評價處于;^艮前期的藥物的毒性或者效應(yīng)，藥物 發(fā)展前期使用人體臨床試驗具有很高的風險。細胞培#^支術(shù)也可用來 產(chǎn)生治療用途的復雜人體蛋白例如單抗，也可用做細胞基礎(chǔ)上治療的 平臺。這些細胞培養(yǎng)4支術(shù)包括成人和胚胎干細胞的體外培養(yǎng)。另外， 在體外細胞培養(yǎng)系內(nèi)引入雜和性重組DNA是科學家探索動物系統(tǒng)試驗 的有力輔助工具。
最近，對于用來表達生物分子進而產(chǎn)生治療用藥物的細胞系可能 存在的污染問題的調(diào)控需求更加重要。整個生物技術(shù)業(yè)不再4吏用含有 胎牛血清的培養(yǎng)液，從而達到避免由未來生物手段引起的潛在動物病 原體或者可能治病的動物蛋白被引y^A體的可能性。無血清培養(yǎng)液日 益成為體外培養(yǎng)哺乳細胞的標準程序，特別是對那些用于基因表達和 蛋白質(zhì)純化的制備沐系。
NS-0小鼠骨髓瘤細胞系是一個常用的蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)，例如 Lonza's GS基因表達系統(tǒng)(Lonza Group, Basel, Switzerland),這 個系統(tǒng)利用了在細胞液中不添加谷氨酸的情況下NS-0細胞本身不能 產(chǎn)生存活所必需的谷氨酸這一特性，使用谷氨酸合成酶作為質(zhì)粒載體
細胞轉(zhuǎn)染的選擇標記。
NS-0細胞也能產(chǎn)生膽固醇營養(yǎng)缺陷，從而導致細胞培養(yǎng)液中必須 同時加入膽固醇和谷氨酸以支持本細胞系的生長。在細胞培養(yǎng)液內(nèi)加 入膽固醇是一個復雜的耗時巨大的過程，這是因為脂質(zhì)必須與糖分子 (例如環(huán)糊精)相互偶聯(lián)以增加其在水溶液中的溶解度。另外，偶聯(lián)過 程本質(zhì)上不穩(wěn)定，因此會導致添加膽固醇的生長液的半衰期十分短暫。 另外，當使用化學成分確定的無血清的細胞培養(yǎng)液而非含有胎牛血清 的培養(yǎng)液培養(yǎng)膽固醇營養(yǎng)缺乏型細胞系時，膽固醇沉淀的情況更易發(fā) 生。最終，膽固醇因為其內(nèi)在的多聚體親和性而不易濾過小孔無菌濾 膜例如PES,從而導致在最終濾過的培養(yǎng)中膽固醇含量顯著下降。這 一現(xiàn)象導致添加膽固醇細胞培養(yǎng)液制備批次間的不一致性。當在細胞 培養(yǎng)液內(nèi)直接加入膽固醇而不經(jīng)過過濾會產(chǎn)生引入污染的可能性例如 異源物質(zhì)或/及內(nèi)毒素。
NS-0細胞產(chǎn)生膽固醇營養(yǎng)缺乏的分子機制最近已經(jīng)被確證 (European Collection of Cell Cultures — ECACC， No. 85110503， Deposited by Dr J Jarvis， MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, 73B(3) Methods in Enzymology (1981)。 jt匕細胞系不能 表達膽固醇體內(nèi)生物合成通路中一個關(guān)鍵的蛋白酶。這個稱作3-酮固 醇還原酶(3-KSR)的蛋白酶屬于beta-羥基固醇脫氫酶家族的一個成 員，是由一個特定基因所編碼的。3-KSR能夠催化酵母甾酮轉(zhuǎn)變?yōu)榻?母甾醇的化學反應(yīng)，酵母甾醇^Ja固醇的前體Marijanovic等人，17(9) M0L. ENDOCRINOL. 1715-25 (2003)。
就NS-0細胞的膽固醇營養(yǎng)缺乏問題， 一系列不同的技術(shù)手段被 提議，以改善制備細胞培養(yǎng)程序的效率以及減弱膽固醇在水性培養(yǎng)液 中低溶解能力的局限性。其中的一個方法是使用植物來源或者合成的 脂質(zhì)代替動物來源的脂質(zhì)加入細胞培養(yǎng)液Gorfien等人，16(5) BI0TECHN0L. PROG. 682-7 (2000)。另外的一個方法是改造NS-O細胞 使之能夠過量表達3-KSR從而逆轉(zhuǎn)其在細胞內(nèi)的不足從而使得細胞在 未加入膽固醇的細胞培養(yǎng)液中正常生長Seth等人，121(2) J. BI0TECHN0L. 241-52 (2006)。最后，研究人員研究了 NS-O細胞內(nèi)3-KSR 活性缺乏的分子機制，試圖通過對關(guān)鍵上游調(diào)控區(qū)域去甲基化，消除
其對3-KSR基因的轉(zhuǎn)錄抑制能力從而使3-KSR的7jc平恢復正常Seth等 人，93(4) BI0TECHN0L. BIOENG. 820-27 (2006)。
但是，化學成分確定的無血清培養(yǎng)液中在生物技術(shù)公司使用表達 載體制備能夠表達雜和性分子的穩(wěn)定細胞系中仍然十分必要。另外， 能夠直接使用而無須加入外源性膽固醇的化學成分確定的無血清培養(yǎng) 液是非常理想的細胞培養(yǎng)液。本發(fā)明提供了 一個含有基因或者核苷酸 序列的表達載體，這個基因或者多核苷^列能夠編碼真核細胞固醇 或者膽固醇體內(nèi)合成通路的一個蛋白酶，從而使得細胞能夠在化學成 分確定或/及無血清細胞培養(yǎng)液內(nèi)生長和體外培養(yǎng)。如果本表達載體也 包含一個編碼雜和性蛋白，多肽或者單肽的基因或者多核苷酸序列，
被轉(zhuǎn)染細胞，從而在化學成分確定或/及無血清細胞培養(yǎng)液產(chǎn)生雜和性 蛋白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及新的標記選擇載體以及使用這些載體在真核細胞內(nèi) 穩(wěn)定表達基因產(chǎn)物的方法。
本發(fā)明包括一種載體，其包含編碼真核細胞甾醇生物合成途徑酶 的多核苷酸，其生物學活性片段或其生物學上活性變體和編碼異源多 肽的多核苷酸。本發(fā)明進一步包括使用該載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
本發(fā)明還包括一種試劑盒(kit)，其包含 一種載體，其包含 含有編碼真核細胞類固醇生物合成途徑酶的多核苷酸，其生物學活性 片段或其生物活性變體和編碼異源多肽的多核苷酸的載體；任意一種 或多種膽固醇缺陷型的大量宿主細胞；化學限定且無血清的培養(yǎng)液； 幫助在低播種和克隆密度的大量宿主細胞的生長；和至少一種應(yīng)用試 劑盒的協(xié)iJC (protocol)。
本發(fā)明另外包括可以使選擇細胞在無膽固醇培養(yǎng)液中存活的方 法，包括轉(zhuǎn)染真核細胞，即包含在多核苷酸的膽固醇缺陷型載體編碼 真核細胞類固醇生物合成途徑酶，其生物學活性片段或其生物學上活 性變體，以及任意至少一種編碼異源蛋白的多核苦酸；在缺乏膽固醇
培養(yǎng)液中存活的選擇細胞。
本發(fā)明進一步包含一種獲得在缺乏膽固醇培養(yǎng)液中存活并生產(chǎn)
異源蛋白細胞的方法轉(zhuǎn)染真核細胞，即如這里描述的膽固醇缺陷型 載體包含一種酶，例如3-KSR，以及任意至少一種編碼異源蛋白的多 核普酸；在缺乏膽固醇培養(yǎng)液中存活的選擇細胞。
附圖簡述


圖1A-1J顯示了真核和特異性的生物合成途徑，通過3-KSR基因 的產(chǎn)物部分調(diào)節(jié)哺乳動物類固醇的生物合成。
圖2描述了 p3-KSR表達栽體的質(zhì)粒圖鐠。
圖3p3-KSR: mAbVL: mAbVH表達栽體先后進行完整人抗體輕和重鏈 基因克隆的質(zhì)粒圖語。
圖4描述了 p3-KRS: rec-gene的質(zhì)粒圖i普，其是重組細胞基因構(gòu) 件(rec-gene)克隆為p3-KSR的例子。
圖5描述了 pBFKSR. 1HUMAB，其提供了在p3-KSR表達載體的多個 克隆區(qū)域中6個可能的抗體基因盒表達方向。
詳細描述
容易理解本發(fā)明不局限于這里描述的可能改變的具體方法和組 分。同時容易理解這里使用術(shù)語僅僅用于描述的具體實施方案的目的， 將不限定于本發(fā)明的范圍。必須注意到除非上下文清楚定義之外，如 這里使用和在附加權(quán)利要求中單數(shù)的形式"a"、 "an，，和"the，，包括兩個 以上的含義。因此，例如"一個多核苷酸，，的含義是本領(lǐng)域技術(shù)人員等 公知的一種或多種多核苷酸和包括其同等物的含義。術(shù)語"載體"是DNA 分子自我復制和含義，同時這里涉及作為一種"質(zhì)粒"或"質(zhì)?？寺≥d 體"，其是一種用于重組DNA實驗的質(zhì)粒，如一種外來的或異源的DNA 的受體。異源蛋白、多肽或肽意指包括用于治療癥狀或疾病或作為試 劑的任意蛋白質(zhì)。
除非另有定義，這里使用的所有技術(shù)性和科學性術(shù)語與本領(lǐng)域普
通技術(shù)人員對本發(fā)明內(nèi)容的 一般理解具有相同的意思。盡管與這里那 些描述的任意方法和原料相似或相同，所描述的具體的方法、裝置和 原料可用于本發(fā)明的實驗或測試。
本發(fā)明提供了用于轉(zhuǎn)染細胞代謝性選擇的組合物和方法，即通過 利用 一種哺乳動物類固醇生物合成途徑的酶作為酶中缺乏真核細胞的 一種代謝性選#^基因。具有這些特性的真核細胞用于產(chǎn)生異源分子如 肽、多肽、蛋白或細胞不正常產(chǎn)生的其它分子。具體地，本發(fā)明利用
3-甾酮還原酶(3-KSR)作為一種代謝性選^^基因用于缺乏3-KSR真核 細胞系的產(chǎn)生，其用于在缺乏外原性的膽固醇或真核膽固醇生物合成 途徑中3-KSR下游的任意膽固醇前體的培養(yǎng)液中產(chǎn)生異源的分子如 肽、多肽或蛋白。參見圖1,其提供了通過3-KSR部分調(diào)節(jié)的哺乳動 物類固醇生物合成的生物化學途徑。
更具體地說，本發(fā)明提供了如圖l提供的編碼在哺乳動物類固醇 生物合成途徑酶的多核普酸和多肽，例如這里該酶是3-KSR，表達該 酶的栽體如3-KSR,缺乏該酶的細胞系如3-KSR，用于轉(zhuǎn)染步驟的細胞 培養(yǎng)液和生長因子，以及用于本發(fā)明商業(yè)性開發(fā)的試劑盒。
本發(fā)明包括一種載體，其包含編碼真核細胞類固醇生物合成途徑 酶的多核苷酸，其生物學活性片段或其生物學上活性變體，以及一種 編碼異源蛋白的多核苷酸。更具體地說在該栽體中的酶包含3-甾酮還 原酶(3-KSR)，更具體地說是小鼠的3-KSR。編碼3-KSR的具體有代表 性的多核苷酸包含SEQ ID NO : 1——其編碼由SEQ ID NO: 3代表的 氨基酸順序；并且包含SEQ ID NO : 2——其編碼由SEQ ID NO: 4代 表的"H&酸順序。
如上所述的載體優(yōu)選重組DM表達載體，其進一步任意包含至少 用于產(chǎn)物基因的第一轉(zhuǎn)錄單元，其轉(zhuǎn)錄單元由人細胞巨化病毒啟動子 控制。表達載體中其它單元與元件的具體情況在這里詳細描寫。
本發(fā)明進一步包括用如上所述的載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。宿主細胞 是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的一種真核細胞，其包括原生生物、真菌、動
物和植物。因此，真菌、植物和哺乳動物細胞指的是本發(fā)明包括的如 適當?shù)乃拗骷毎?。宿主細胞?yōu)選膽固醇缺陷型細胞。本發(fā)明使用的具
體宿主細胞是NS-O、 NS-1和CH0-215細胞等，更具體地是NS-0小鼠 骨髓瘤細胞。
本發(fā)明同時包括一種試劑盒，其包含 一種載體，其包含含有編 碼真核細胞類固醇生物合成途徑酶的多核苷酸，其生物學活性片段或 其生物學上活性變體和編碼異源多肽的多核苷酸的載體；任意一種或 多種膽固醇缺陷型的大量宿主細胞；化學成分確定的無血清培養(yǎng)液； 幫助在低播種和克隆密度的大量宿主細胞的生長；和至少一種應(yīng)用試 劑盒的協(xié)議。如上所述，酶優(yōu)選為3-KSR，更優(yōu)選具有包含載體的小 鼠3-KSR，例如，編碼酶的有用的多核苷酸包含SEQ ID N0 : 1和SEQ ID NO : 2。編碼酶氨基酸序列的多核苷酸分別包含SEQ ID NO : 3 和SEQ ID NO : 4。試劑盒中的載體優(yōu)選重組DNA表達載體，其進一 步任意包含至少用于產(chǎn)物基因的第一轉(zhuǎn)錄單元，其轉(zhuǎn)錄單元由人細胞 巨化病毒啟動子控制。
試劑盒中的宿主細胞優(yōu)選NS-O、 NS-1和CH0-215細胞等，更優(yōu) 選NS-0小鼠骨髓瘤細胞，它們適合于在化學上定義的無血清培養(yǎng)液和 /或化學上定義的培養(yǎng)液中培養(yǎng)。
試劑盒進一步可任意包含生長因子，其包含無脂肪酸的牛血清白 蛋白、重組細胞人白細胞間介素-t(rhlL-6)、重組細^v胰島素、亞 硒酸鈉、丙酮酸鈉和乙醇胺中的至少一種。生長因子更優(yōu)選包含最終 濃度為約0. 1%到約5%的無脂肪酸牛血清白蛋白、約1 ng/mL到約9 ng/mL的rhIL-6、約5 mg/mL到約15 mg/L重組細j!feA胰島素、約5 H /L到約8 jli /L亞硒酸鈉、約0. 01 g/L到約0. 3 g/L丙酮酸鈉和約 0.5 mg/L到約3.5 mg/L乙醇胺的選擇培養(yǎng)液。生長因子更優(yōu)選包含 最終濃度為約1%的無脂肪酸牛血清白蛋白、約5ng/mL的rhlL-6、約 10mg /L重組細lfeA胰島素、約6. 7 jli /L亞硒酸鈉、約0.11 g/L丙酮 酸鈉和約約2. 0 mg/L乙醇胺的選擇培養(yǎng)液。
本發(fā)明進一步包括細胞培養(yǎng)因子的組合物，包含最終濃度為約 0.1%到約5%的無脂肪酸牛血清白蛋白、約1 ng/mL到約9 ng/mL的 rhlL-6、約5 mg/mL到約15 mg/L重組細^/v胰島素、約5p/L到約 8 n /L亞硒酸鈉、約0. 01 g/L到約0. 3 g/L丙酮酸鈉和約0. 5 mg/L
到約3.5mg/L乙醇胺的選擇培養(yǎng)液。另外，本發(fā)明也包括細胞培養(yǎng)因 子組合物，包含最終濃度為約1%的無脂肪酸牛血清白蛋白、約5 ng/mL 的rhIL-6、約10mg /L重組細胞人胰島素、約6. 7 n /L亞硒酸鈉、約 0. 11 g/L丙酮酸鈉和約約2. 0 mg/L乙醇胺的選擇培養(yǎng)液。
此外，本發(fā)明選擇細胞在無膽固醇培養(yǎng)液中存活的方法，包括 轉(zhuǎn)染真核細胞，即包含在多核苷酸的膽固醇缺陷型載體編碼真核細胞 甾醇生物合成途徑酶，其生物學活性片段或其生物學上活性變體，以 及任意至少 一種編碼異源蛋白的多核苷酸；在缺乏膽固醇培養(yǎng)液中存 活的選擇細胞。更優(yōu)選的宿主細胞為NS-0、 NS-l和CHO-215細胞等， 優(yōu)選的細胞為NS-0小鼠骨髓瘤細胞，培養(yǎng)液和無血清培養(yǎng)液是化學確 定成分的。在該方法中有用的酶包含3-KSR。
本發(fā)明進一步包括為了獲得能夠在無膽固醇培養(yǎng)液中存活并產(chǎn) 生異源蛋白的細胞的方法，包括轉(zhuǎn)染真核細胞，即包含在多核苷酸的 膽固醇缺陷型栽體編碼真核細胞甾醇生物合成途徑酶，和至少一種編 碼異源蛋白的多核苷酸；以及在缺乏膽固醇培養(yǎng)液中存活的選擇細胞。 如以上所述，該細胞為膽固醇缺陷型細胞，優(yōu)選為NS-0、 NS-1和 CH0-215細胞，更優(yōu)選為NS-O小鼠骨髓瘤細胞，它們可以在化學上定 義的無血清培養(yǎng)液和/或化學上定義的培養(yǎng)液中培養(yǎng)。
本發(fā)明進一步包括一種本文描述的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中生產(chǎn)異源蛋 白細胞的方法，包含轉(zhuǎn)染真核細胞，即包含在多核苷酸的膽固醇缺 陷型載體編碼真核細胞笛醇生物合成途徑酶，其生物學活性片段或其 生物學上活性變體，以及任意至少一種編碼異源蛋白的多核苷酸；在 產(chǎn)生異源蛋白的條件下培養(yǎng)細胞。該方法進一步包含使用本領(lǐng)域技術(shù) 人員^^p的離析、分離或純化技術(shù)來獲得異源蛋白。該細胞為膽固醇 缺陷型細胞，優(yōu)選NS-0、 NS-1和CHO-215細胞，更優(yōu)選為NS-O小鼠 骨髓瘤細胞，它們可以在化學上定義的無血清培養(yǎng)液和/或化學上定義 的培養(yǎng)液中培養(yǎng)。
本發(fā)明進一步包括，更具體地說一種表達異源蛋白的方法，其包 含培養(yǎng)一種具有包含編碼3-甾酮還原酶和至少 一種異源蛋白載體的轉(zhuǎn) 染細胞，其在缺乏膽固醇條件下產(chǎn)生異源蛋白，其中優(yōu)選上述的細胞
和培養(yǎng)液。
I. 3-齒酮還原酶
本發(fā)明利用任意真核生物的3-KSR作為代謝性選#^基因用于產(chǎn)生 異源蛋白。在一個實施方案中，可以使用小鼠的3-KSR，具體地是3卩-膽固醇NADP+3-氧化還原酶，也稱作HSD3p 5 (NCBI核香酸登記號 L41519)，其具有的核苷酸序列如下(SEQ ID N0:1):
ATGCCTGGATGGAGCTGCCTGGTGACAGGAGCAGGAGGGTTTCTTGGCCA
GAGGATTGTCCGAATGTTGGTGCAGGAGGAAGAGTTGCAGGAGATCAGAG
CCCTGTTCAGGACCTTCGGTCGAAAACATGAAGAGGAATTGTCCAAGCTG
CAGACAAAGGCCAAGGTGAGAGTACTGAAGGGAGACATTCTGGATGCCCA
ATGCCTGAAGAGAGCCTGCCAGGGCATGTCTGCTGTCATCCACACCGCTG
CTGCTATTGACCCCCGTGGTGCCGCTTCCAGACAGACCATCCTAGATGTC
AATCTGAAAGGTACTCAGCTCCTACTGGATGCTTGTGTGGAAGCCAGTGT
GCCAACATTCATCTACAGCAGCTCAGTGCTTGTGGCTGGACCAAATTCCT
ACAAGGAGATCATCCTGAATGCCCATGAGGAAGAGCATCATGAAAGCACA
TGGCCTAACCCATACCCATACAGCAAAAGGATGGCTGAGAAGGCAGTGCT
GGCAACAAATGGGAGACTCCTGAAAAATGGTGGCACTTTGCATACTTGTG
CCTTAAGACTCCCTTTCATCTATGGGGAAGAATGCCAAGTCACTTCAACC
ACTGTGAAAACAGCACTGAAGAACAACAGCATAATTAAGAAAAATGCCAC
ATTCTCCATCGCCAACCCAGTGTATGTGGGCAATGCAGCCTGGGCTCACA
TTCTGGCTGCCAGGAGCCTACAGGACCCCA AGAAGTCCCC AAGCATCCAAGGACAGTTCTATTACATCTCTGATAACACCCCTCACCAAAGCTATGATGA
TTTAAATTACACCCTGAGCAAGGAGTGGGG CCTCTGCCTT GATTCTGGCTGGAGGCTTCCTCTGTCCCTGCTTTACTGGC TTGCCTTCCT GCTGGAAACTGTGAGCTTCCTGCTACGTCCAGTTTACAACTATAGGCCACCCTTTACCCG
CCTCTTGATCACAGTGCTAAATAGCGTGTTTACCATTTCCTATAAGAAAG
CTCAGCGCGATCTAGGCTATCAGCCACTTGTCAGCTGGGAGGAAGCCAAG
CAAAAAACCTCAGAGTGGATTGGAACACTAGTGAAGCAGCACAGGGAGAC
ACTACACAAA AAGTCACAGT GA
SEQ ID NO: 1編碼一種具有如下M酸序列的特異3-KSR:
小鼠HSD3b5 ^J^紗列(SEQ ID NO: 3)
GDILDA-(
TFIYSSSVLVAGPNSYKEIILNAHEEEHHESTWPNPYPYSKRMAEKAVIiATNGRLLKNG GTLHTCALRLPFIYGEECQPVYVGNAAWAHIIJ-ARSLQDPKKSPSIQGQFYYISDNTPH
KSQ*
另夕卜，使用基因編碼其它功能的酶包括但不限于17 p-羥甾醇脫氫 酶類型7(Hsdl7b7)、 3(5-羥基-delta(5)-類固醇脫氫酶(Hsd3b5)、大 鼠3(5-HsdlJI、小鼠3卩-HsaIV、小鼠3(3HsdV和倉鼠3卩-Hsdlll，其/> 知的功能是唯一作為3-酮類固醇還原酶。具體地， 一種多核苷酸包含 SEQIDNO: 2，也稱為膽固醇(17p)脫氫酶7 (核苷酸登記號NCBI: BC01 1464),包含以下小鼠HSD17b7核苷酸序列，其如下
ATGCGGAAGG CCTTTGCGGT CGTGTAGGAA TCTCACCCCT GCAGTCGGTG TAGACTACTT CTCAAGGCAT CACCACAGCG GGTTGCAGGA CGGGAACTGG CTGGACGTCC TCCAGCACTC
CACCGGGGCG CAGAAGACGA GCAAGAGCTG CAGCATCGTG CAGAGGAAGT
ATATCTGAAT GCTGGAATCC TGCCTAATCC ACAATTCAAC TTTTCTGCGG CATCTTTTCA AGAAATGTGA TTCATATGTT
TGGTTTTGAT CGACTGCTGG CCTGAGCAAA CCGCCGAAGT GTCCGGGGTG
AGCAGTGGCA TGACCTCCAC TTCGAGATAC CAGATGGATG
TTGGGCTAGC CTGTGTTTGG CCTGCTGGCC TCAGCAGCCT TTTCAAAGAT
GAAGGAATTT GGTGTTTGAA AACCACTTCT TCTCGCAATG CAAAGGCCCG
TGACCCAGAA ACCAATCTCT CTGCCATGCG CAAAGAAGGC GAACCCTACA
TGACTCGGTC TTGGCCACTT GACAACCCCT TAACTTCAGC GCTCTTCCAA
ACTGCCGACG TATTCTGATT CTCAGCTCAT CTGGAGGACA ATATGCTACC
GACCTCCTGA TTCCAGTGTG TTTTGCCTCC CGCTTTTTTG CCTGGTGTGG AATACGCGAG AAGATGGACA GGAGCTGGAA GCTGA
ATGTGGCTTT ATGTGCCCAG CTTTATCTGG TAAATGCGCT CTCTTCCACC CGCCACCTCG TAGATGAAGA AAGCGTGTCA
GAACAGGAAT GCGTCGTGAT ACGTTGCTCC CACTGTGACA AAAAACCGGA GGATTTGGGA CACTGCTGAA GGACCACCGT
TTCAACCAGA GACCAATATG TACCCATAAT CCGTACAACG GTCTCTTAAT CTAATTACGT AAATTCTATG TCAGAAATCG
AGGGTCTGTA ACGTATGGAA GTGGCTCCTT GAGCAGAGGC CCTCTGACCA CACGGGCCAA AGGTCTTACT GATCACCCGA
SEQ ID NO: 2編碼具有如下氨基酸序列的特異3-KSR:小鼠 HSD17b7 a. a.序列(SEQ ID NO: 4):
MRKVVLITGASSGIGI1ALCGRLI1AEDDDLHLCLACRNLSKARAVRDTLLASHPSAEVS
QKMDIDEDTAEKFYEVLLELEKRVRTTVQKSDHPS *
在另一個實施方案中，任意酶，例如可以使用如3-KSR促進圖1 描述的在溫血動物齒醇生物合成的第 一和第二周期中下列前體酶轉(zhuǎn) 化
4-甲基-5a-膽甾-3，8，24-三烯-3p-醇-〉3-KSR-〉 3-氧-4a-甲基 -5a-膽甾-8，24-二烯-> 3-KSR-〉 3j5-羥基-4a-曱基-5a-膽甾-8， 24-二 烯(lst周期)
5a-膽甾-3，8，24-三烯-3p-醇-〉3-KSR-〉 3-氧-5a-膽甾-8， 24-二烯-〉3-KSR-〉delta-8， 24-膽甾二烯-3|5-醇(3p-羥基-5a-膽甾-8， 24-二烯；酵母甾醇)(2nd周期)
其它可以用于本發(fā)明的3-KSRs具體實施例包括其它小鼠(登記號
麗-00295、 NM010476和BC-012715)、牛(登記號XM-591611)、人(登 記號NMJH6371) 3-KSRs。
A. 3-KSR多核苷酸、其片段和變體
本發(fā)明涉及編碼任意3-KSR的多核苷酸。本發(fā)明關(guān)于編碼3-KSR 多核苦酸的范圍包括但不局限于這里提供的任意一個多核苷酸序列中 公布的序列；通過在嚴格條件(高度嚴格的特別條件)雜交獲得從這里 描述的生物材料或其它生物來源(例如，小鼠或人來源)的多核苷酸； 與提供的多核苷酸相對應(yīng)的基因；多核苷酸和它們對應(yīng)基因提供的可 變體，特別是保持編碼基因產(chǎn)物生物活性的可變體(例如，歸于基因產(chǎn) 物的生物活性相當于提供的多核苷酸，作為結(jié)果基因產(chǎn)物分配到一種 蛋白家族和/或蛋白家族群和/或存在于基因產(chǎn)物的識別功能域)。當本 發(fā)明提供其它預(yù)期的3-KSR多核苷酸組合物時，在本發(fā)明范圍附近和 范圍內(nèi)對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說的顯而易見的。如這里4吏用的， 除非明確地說明，術(shù)語"多核苦酸"和"核酸"將不限定多核苷酸的長度 或結(jié)構(gòu)。
3-KSR多核苷酸可以包含這里提供的任意一個多核苷酸序列中公 布的序列。本發(fā)明的3-KSR多核苷酸同時包括與天然3-KSR DM相比 序列相似或序列同一的多核苷酸。這包括相關(guān)聯(lián)的5'和3'未轉(zhuǎn)譯的序 列、啟動子和增強子的序列。在低嚴^件如在50X:和10XSSC(0.9M 鹽水/0. 09M檸檬酸鈉)和在55TC、 1XSSC下洗滌，可通過雜交測定具 有序列相似性的3-KSR多核苷酸。在嚴格^Hf下通過雜交可以測定序 列同源性，例如在50"C或更高的溫度和0. IXSSC(O. 9M鹽水/O. 09M檸 檬酸鈉)的條件下。當然，雜交方法和條件為本領(lǐng)域所熟知，所有可選 擇的方法和條件可用來識別附加的3-KSR多核普酸。
本發(fā)明的3-KSR多核苷酸也包括天然存在的變體3-KSR核苷^f 列(例如，退化變體、等位變體等)。通過這里公開的核香酸序列雜交 公認的變體識別本發(fā)明的3-KSR多核苷酸變體，優(yōu)選在嚴^件下的 雜交。例如通過4吏用適當?shù)南礈鞐l件，可以識別這里描述的3-KSR多 核苷酸變體，這里等位變體顯示至多約25-30l5^對(bp)錯配，可以 包含同樣少甚至5-15%或2-5%或1-2% bp錯配，以及單個bp錯配。
本發(fā)明同時包括相當于這里提供的3-KSR多核苷酸序列的同源染 色體，這里同源基因的來源可以是任意哺乳動物種屬，例如靈長類動 物種屬，特別是人；嚙齒類，例如鼠類；犬類、貓類、牛類、羊類、 馬類、酵母、線蟲等。在哺乳動物種屬之間，例如人和小鼠，同源染 色體通常對基因或其部分來說具有相當大的序列相似性，例如至少75% 序列，通常至少90%，更通常至少95%、 96%、 97%、 98%或99°/。在核苷 酸序列之間同源。根據(jù)參比序列可以計算序列相似性，其可以是大的 3-KSR序列的亞群，例如，作為一種保守基序、部分編碼區(qū)、旁側(cè)區(qū) 等。參比序列通常至少為約18(鄰接)nt長度，更通常至少為約30nt 長度，可提供完整3-KSR序列用于對照。序列分析的算法為本領(lǐng)域已 知，例如Altschul等A^ 25 NUCLEIC ACIDS RES. 3389-3402 (1997) 中描述的ga卯ed BLAST。
通常，〗吏用常用方法如Smith-Waterman同源性檢索算法作為在 MPSRCH程序(Accelrys >&司，San Diego, CA)的工具，這里描述的3-KSR 多核苷酸變體具有大于至少約65%、至少約75%、至少約85%和可以大 于至少約90%、 95%、 96%、 98%、 99%或更多的序列同源。例如，全球 DM序列同源性大概大于65%是由the Smith-Waterman同源性檢索算 法使用仿射的空位檢索(af f ine gap search)測定，使用以下檢索>|*: 空位打開罰分，12;以及空位擴充罰分，1。
本發(fā)明的3-KSR可以是cDNA或基因組DNA，以及其截斷的形式 (versions)或片段，特別是編碼生物學上活性的或可救援在真核細 胞中具有功能性的3-KSR基因產(chǎn)物的片段，其中片段被轉(zhuǎn)染，允許細 胞在無膽固醇培養(yǎng)液中生長。cDNA包括所有的核酸，其共用在自然成 熟mRNA種屬的序列因子的排列，這里序列因子是外顯子和3'和5'非 編碼區(qū)域。通常，mRNA種屬具有插入內(nèi)含子的鄰接外顯子，當通過核 內(nèi)RNA拼接的可移動的，產(chǎn)生了連續(xù)的可譯框架編碼多肽。mRNA種屬 還可以以外顯子和內(nèi)含子存在，這里通過選擇性拼接可除去內(nèi)含子。
3-KSR基因組序列可以包含在起始密碼子和終止密碼子之間出現(xiàn) 的核酸，如列出序列所定義，包括通常存在于天然染色體中的所有內(nèi) 含子。它可以進一步包含在成熟mRM中發(fā)現(xiàn)的5'和3'非轉(zhuǎn)譯區(qū)?；?因組序列可以進一步包含特異的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)序列，例如啟動子、
增強子等，包括約lkb，但可能更多DNA在或者5'和3'轉(zhuǎn)錄區(qū)域末端 的側(cè)面基因組。
B. 3-KSR多肽、片段和其變體
本發(fā)明包括那些通過公開的3-KSR多核苷酸、片段和其變體編碼 的3-KSR多肽，例如，由于遺傳密碼的蛻化，核酸與公開的3-KSR多 核苷^列是不相同的。
3-KSR多肽意指通過所述多核苷酸編碼的全長的多肽和通過所述 多核苷^示的基因以及其部分或片段編碼的多肽。3-KSR多肽也包 含自然存在于蛋白質(zhì)的變體，這里這些變體與天然存在的3-KSR蛋白 質(zhì)同源或大體上類似，可以是天然存在的3-KSR蛋白質(zhì)(例如，人、鼠 或其它種屬自然表達的所述多肽，通常是哺乳動物種屬)中相同或不同 種屬的起源。通常，3-KSR多肽變體具有至少約80%,通常至少約90% 等，通常至少為約95%序列同源性或更高的序列，例如這里描述的 3-KSR多肽，具有96°/" 97%、 98%或99°/。序列同源性，例如通過BLAST 2. 0 使用如上所述參數(shù)。3-KSR多肽變體可以自然或非自然地進行翻譯后 修飾，例如多肽具有翻譯后修飾圖案，與翻譯后修飾任意預(yù)知或?qū)嶒?表征的自然存在3-KSR蛋白不同。
本發(fā)明同時包括3-KSR多肽(或其片段)的同源染色體，這里同源 染色體與任意種屬通常從哺乳動物種屬如嚙齒類如小鼠、老鼠；家畜 如馬、奶牛、狗、貓；和人分離。同源染色體可具有至少約35%，通 常至少40%等，通常至少約60%的#^酸序列與這里描述的特異3-KSR 蛋白同源，例如這里通過BLAST 2. 0算法使用如上所述參數(shù)測定序列 同源性。
本發(fā)明范圍內(nèi)的多肽變體也包含突變體、片段和融合體。突變體 可以包含^&酸取4戈、加入或刪除。M酸取代可以是保守M酸取 代或取代以消除不需要的氛基酸，這樣改變了糖基化位點、磷酸化位 點或乙?；稽c，或通過取代或刪除沒有所需功能的一種或多種半胱 氨酸殘基使錯折疊最小化。保守的絲酸取代是那些絲了一般充電、 疏水性/親7jC性、和/或Jl^酸取代的立體?？梢栽O(shè)計變體使得保持或 具有提高蛋白的具體區(qū)域的生物活性(例如，功能區(qū)域和/或與交感序
列有關(guān)的區(qū)域，這里多肽是蛋白家族的一個成員)。為了生產(chǎn)3-KSR變 體,可基于可達性(內(nèi)部對比外部)的氨基酸(參見，例如Go等人，15 INT. J. PEPTIDE PROTEIN RES. 211 (1980))、變體多肽的熱穩(wěn)定性(參見， 例如，Querol等人，9 PROT. ENG. 265 (1996))、想得到的糖基化位 點(參見，例如Olsen和Thomsen， 137 J. GEN. MICROBIOL. 579 (1991))、想得到的二硫鍵(參見，例如Clarke等人，32 BIOCHEM. 4322 (1993)和Wakarchuk等人，7 PROTEIN ENG. 1379 (1994))、想 得到的金屬結(jié)合基點(參見例如Toma等人，30 BIOCHEM. 97 (1991)和 Haezerbrouck等人，6 PROTEIN ENG. 643 (1993))和脯氨酸環(huán)內(nèi)想得 到的取代(參見例如Masui等人，60 APPL. ENV. MICROBIOL. 3579 (1994))選擇改變氨基酸。美國專利號4, 959， 314/>開了可以生產(chǎn) 半胱氨酸衰竭突變蛋白。
3-KSR變體同時包含這里公開的多肽片段，特別是生物學上活性 片段和/或相當于功能性區(qū)域片段。感興趣的片段一般為最小約10氨 基酸(aa)到至少約15 aa長度，通常至少為約50 aa長度，可以只要 300 aa長度或更長的但通常不超過約531 aa長度，其中片段具有一 個M酸威基，即與通過多核苷酸編碼的3-KSR多Abf目同，多核苷酸 具有這里提供了多核苷酸序列任意一種序列或其同源染色體。遺傳密 碼可用于選擇適當?shù)拿艽a子構(gòu)建對應(yīng)的變體。特別地，片段包括那些 包含3-KSR蛋白的特異性領(lǐng)域或抗原決定基。
通過將適當?shù)暮塑账嵝蛄胁迦牒怂峄蛲ㄟ^肽合成制備3-KSR的氨 基^列變體。這樣的修飾包括，例如從3-KSR的JL^^列中殘基 的缺失和/或插入和/或取代。假如最終的構(gòu)造具有想得到的特征，任 意缺失、插入和取代的結(jié)合可用于達到外形的3-KSR構(gòu)造。氛基酸變 化同時可改變3-KSR的翻譯后步驟，例如改變糖基化位點的數(shù)目或位 置或改變其它翻譯后修飾包括乙酰化和磷酸化。
一種有用的方法用于識別3-KSR的某些瓶基或區(qū)域，優(yōu)選用于誘 變定位的方法稱為"丙氨酸掃描誘變"，如Cunningham和We 11 s描述， 244 SCIENCE 1081-85 (1989)。這里，通過中性的或帶負電的M酸(最 優(yōu)選丙氨酸或聚氨基丙酌識別和替代一個殘基或目標殘基組(例如， 帶電殘基例如精氨酸、天冬氨酸、組氨酸、賴氨酸和谷氨酌，使用抗
原影響氛基酸的相互作用。那些氛基酸定位顯示了對取代功能性的靈 敏度，然后通過進一步引入或其它變體在或為取代的位點提純。因此， 當用于引入Jl&酸序列變異的位點預(yù)先決定時，自然突變本身不必預(yù) 先決定。例如，為了研究在已給定位點的一個突變的特性，在目標密
碼子或區(qū)域進行丙氨酸掃描或隨機誘變，篩查想得到活性的表達3-KSR 變體。
M酸序列插入包括JL^-和/或g-末端熔融范圍長度從一個 殘基到多肽包含一百個或更多殘基，以及氨基酸殘基單一或多倍的序
列內(nèi)插入。末端插入的例子包括用N-末端蛋氨酰殘基插入3-KSR。
另外的變體類型是JL^酸取代變體。這些變體具有在3-KSR蛋白 內(nèi)至少 一個被不同殘基取代的M酸殘基。
在3-KSR蛋白的生物學特性中實際的修飾伴隨有選擇取代，其在 它們的影響維持(i)取代區(qū)域內(nèi)多肽支架的構(gòu)造，例如作為一種片狀或 螺旋構(gòu)造，(i i)在目標位點分子的電荷或疏水性，或(i i i)大部分側(cè)鏈。 基于常見的側(cè)-鏈特性將自然存在的殘基分成組
(1) 疏水的正亮氨酸、蛋氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、 異亮氨酸；
(2) 中性疏水的半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸；
(3) 酸性的天冬氨酸、谷氨酸；
(4) 堿性的天冬酰胺、谷氨酰胺、組氨酸、賴氨酸、精氨酸；
(5) 影響鏈取向的殘基甘氨酸、脯氨酸；和
(6) 芳香性的色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸。
非保守取代將需要將這些種類的一種交換為另一種種類。保守取 代包括在相同的種類中交換氨基酸。
II.編石馬3-KSR的載體
本發(fā)明進一步提供了在用于哺乳動物甾醇生物的合成生物化學
途徑中表達任意酶的載體，例如膽固醇缺陷細胞中的酶、3-KSR。通常， 任意原核的克隆載體可用于載體的構(gòu)建。載體可包含一個細菌復制起 點，其用于載體大腸桿菌的宿主細胞眛中載體的繁殖，載體DNA在哺 乳動物細胞轉(zhuǎn)染之前將從宿主細胞抹中分離。細菌復制起點的例子包 括但不局限于，Col El、 pUC、 pBR322或從大腸桿菌的非病原細胞林 得到的其它來源。栽體可以進一 步包含用于大腸桿菌中質(zhì)粒的高復制 數(shù)擴展的一個選擇標記。作為舉例的選擇標記包括使抗生素如氨爺青 霉素、羧芐青霉素、四環(huán)素、氯霉素、卡那霉素、慶大霉素、 sulphaethoazole、甲氧千氨嘧啶等具有耐藥性的基因。可用于本發(fā)明 載體的其它選擇標記包括提供基于熱休克、金屬解毒和其它代謝過程 選擇的基因。
載體可進一步包含真核啟動子，其驅(qū)動3-KSR基因的表達。其可 以是一個極小的啟動子，例如哺乳動物的胸苷激酶(TK)基因啟動子， 或更強的轉(zhuǎn)錄盒,例如猿猴病毒40 (SV40)復制起點和早期啟動子區(qū)域。 很強的啟動子，例如巨細胞病毒(CMV)主要即刻早期(MIE)啟動子區(qū)域， 有或者沒有內(nèi)含子A和/或B序列，或人延伸因子-a(EFa)，也可以用 于驅(qū)動3-KSR基因的表達。真核轉(zhuǎn)錄終止序列或聚腺苷酰作用位點同 時可以出現(xiàn)在中止3-KSR基因轉(zhuǎn)錄和信號腺苷酰作用上。理論上聚腺 苷酰作用位點可以源自于任意真核類基因，但是一般使用強的聚腺苷 酰作用序列，包括SV40 late poly-A和牛生長素(BGH) poly-A。
如圖2描述，載體(在這種情況下稱為p3-KSR)的一個實施方案可 包含pUC衍生細菌復制起點(ori)和p-內(nèi)自酶基因(bla),其在對這 些抗生素敏感的大腸桿菌細胞林給予氨節(jié)青霉素或羧千青霉素耐藥 性。載體可以同時包含巨細胞病毒(CMV)主要即刻早期(MIE)啟動子和 增強子以用于驅(qū)動異源重組序列克隆為多種限制酶切點的表達。猿猴 病毒40(SV40)聚腺普酰作用序列(SV40 pA)可以定位于異源重組序列 和3-KSR基因的下游區(qū)以有效地l^苷酖化各個基因的新生mRM。 SV40啟動子和復制起點(SV40 ori)可以立即定位于3-KSR基因的上游 區(qū)以驅(qū)動選擇標記的表達。
在一個具體的實施方案中，通過從小鼠腎cDNA庫中克隆增強的 小鼠3-KSR cDM可將3-KSR基因插入載體，小鼠腎cDNA庫可以包含
如PmlI末端，其與存在于pUC-衍生載體、p3-KSR的PmlI位點一致， 其位點存在于在SV40 ori和SV40 poly -A之間區(qū)域。因此，用Pmll 限制的3-KSR cDNA可用來克隆該基因i^ p3-KSR主鏈的Pmll位點。 在載體基因的取向可以用限制性核酸內(nèi)切酶分析(REN)和雙脫氧-終止 DNA序列測定。
編碼至少感興趣異源多肽的一種多核苷酸或基因或基因盒然后 在例如圖3、 4或5所示的多克隆位點或位點插入到包含3-KSR基因的 載體中。插入的多核苷酸或基因盒在控制中或可操控的連接啟動子， 這將允許在真核的或優(yōu)選溫血動物宿主細胞中表達。
III.具有載體編碼的3-KSR細胞的轉(zhuǎn)染
將感興趣的多核苷酸載體編碼異源蛋白(和3-KSR作為一種選擇 標記)引入宿主細胞，可以使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)包括但不限于電穿孔 法、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法、磷酸鉤沉淀法、聚乙二醇沉淀法、超聲處理、轉(zhuǎn)染、 轉(zhuǎn)導、轉(zhuǎn)化和病毒感染來完成。參見SAMBR00K等人，《分子克隆實 驗室操作指南》(第三版，2001)。
優(yōu)選溫血動物可以用于轉(zhuǎn)染的任意真核細胞，其膽固醇缺陷型可 歸因于酶活性如3-KSR活性，例舉的細胞系可包括但不局限于 NS-0(ECACC 號 85110503) 、 NS-1 (ECACC 號 85011427)和 CH0-215(Plemenitas 等人 ， 265 (28) J. Biol. Chem. 17012-17 (1990))。
本發(fā)明同時包括真核細胞和特定的哺乳動物細胞，其不是初始膽 固醇缺陷型細胞，但通過使用放射劑、誘變劑或重組修復基因敲除技 術(shù)制備得到失去活性的內(nèi)源性基因，編碼3-KSR活性包括但不限于 17p-羥甾醇脫氫酶類型7(Hsdl7b7)和3B-羥基-delta(5)-類固醇脫氫 酶(Hsd3b5)。在又一個實施方案中，靶敲除基因可以包括但不局限于 大鼠3(5-Hsdin、小鼠3p-HsdlV、小鼠3p-HsdV和倉鼠3p-HsdIII， 其爿i^P的功能僅^f5l作為3-甾酮還原酶。
使用包含3-KSR選擇標記(和多核苷酸編碼感興趣的異源蛋白)表 達載體轉(zhuǎn)染的NS-0、 NS-I、 CHO-215和其它膽固醇缺陷型細胞系應(yīng)該
在缺乏膽固醇培養(yǎng)液中生長。在某些其它實施方案中，宿主細胞可以 在任意無血清和無膽固醇培養(yǎng)液中生長，其包含以下非詳盡的清單齒
醇前體4-甲基-5a-膽甾-3，8，24-三烯-3p-醇、3-氧-4ot-甲基-5a-膽 甾-8，24-二烯、5a-膽甾-3，8，24-三烯-3(5-醇和/或3-氧-5a-膽甾 -8，24-二烯。這些前體在膽固醇的生物化學途徑中的3-KSR上游區(qū)作 用。
就調(diào)節(jié)所關(guān)心的問題，宿主細胞(轉(zhuǎn)染之前或以后)可以在任意合 適培養(yǎng)液包括但不限于無血清培養(yǎng)液、無蛋白培養(yǎng)液、化學確定成分 培養(yǎng)液或其任意結(jié)合包括化學上確定成分/無血清培養(yǎng)液中生長。本發(fā) 明的特定的方面所關(guān)心的動物衍生蛋白質(zhì)和/或未明起源的蛋白質(zhì)可 以給予不合適人治療的或診斷利用的重組蛋白質(zhì)產(chǎn)物。合適生長培養(yǎng) 液的一個具體的實施方案是CD雜交瘤培養(yǎng)液(Invitrogen⑧公司， Carlsbad, CA)、化學確定成分、無血清培養(yǎng)液，其不包含動物、植物 或合成來源的蛋白質(zhì)和已證實沒有未定義的溶菌產(chǎn)物或水解產(chǎn)物。
本發(fā)明的宿主細胞可以作為已經(jīng)適應(yīng)于合適的生長培養(yǎng)液如CD -SFM提供。在轉(zhuǎn)染之前，細胞常常適合于這樣的培養(yǎng)液。在那種情 況下，細胞可以適合于HyQ CDM4NS-0(Hyclone⑧，Logan， UT),其 為另一個缺乏動物衍生組分的化學確定成分、無血清培養(yǎng)液。后者市 售培養(yǎng)液包括足夠數(shù)量的膽固醇支持膽固醇缺陷型細胞系的生長。轉(zhuǎn) 染后，細胞在沒有膽固醇的合適選擇培養(yǎng)液中生長。另外地，在無膽 固醇培養(yǎng)液中培養(yǎng)的轉(zhuǎn)染子使用標準的補充有血清的培養(yǎng)液已脫脂， 廣泛使用已知技術(shù)并發(fā)現(xiàn)不支持雙親細胞的生長。
在轉(zhuǎn)染后，細胞一般低密度播種以選作穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化林。在這方面， 可以使用任意合適的選擇介質(zhì)。在一個實施方案中，選擇培養(yǎng)液可以 包含補充有2mM L-谷氨酰胺或Glutamax和IX NEAA (不需要氨基 酌(Invitrogen⑧公司，Carlsbad， CA)的CD雜交瘤。
在某些實施方案中，轉(zhuǎn)染后可以將一種雞尾酒生長因子加到選擇 培養(yǎng)液中以最佳化生長條件。轉(zhuǎn)染后可將生長因子加入任意合適的細 胞系包括但不限于NS-0、 NS-1、 CH0-215細胞。在一個具體的實施方 案中，雞尾酒生長因子可用來最優(yōu)化NS-O細胞轉(zhuǎn)染后生長條件。在一
個實施方案中，生長因子可以包括但不限于血清清蛋白、白細胞間介
素-6、胰島素、亞硒酸鈉、丙酮酸鈉和乙醇胺。
任意合適的市售型血清清蛋白可以使用包括但不限于牛血清清 蛋白(BSA)、牛血清清蛋白(fraction v)和全部人血清白蛋白。在某些 實施方案中，可以是代替未改變的無脂肪酸血清清蛋白，為了除去可 能的膽固醇-血清清蛋白絡(luò)合物可以提供脂類到生長細胞。無脂肪酸 BSA從眾多包括如Research Organics公司、Cleveland, 0H購得。在 選擇培養(yǎng)液中的組分最后濃度可以包括但不局限于從約0. 1%至約5% 的范圍，更具體地說，約O. 2%、約O. 5%、約l. 0%、約1.5%、約2. 0% 或更多達到約5.0%。在一種具體的實施方案中，在選擇培養(yǎng)液中血清 清蛋白的最后濃度可以為約1%。
可用來最優(yōu)化生長條件的另 一種生長因子包括白細胞間介素-6。 在一個實施方案中，可以4吏用重組人IL-6(Promega/^司，Madison， WI)。 IL-6的最后濃度可以包括但不局限于，在選擇培養(yǎng)液中為從約l ng/mL至約9 ng/mL的范圍，更具體地說為約2 ng/mL、約3 ng/mL、 約4 ng/mL、約5 ng/mL、約6 ng/mL或更多，達到約9 ng/mL。在一 個具體的實施方案中，在選擇培養(yǎng)液中IL-6的最后濃度可以為約5 ng/mL。 IL-6如rhIL-6的濃度，根據(jù)需要可以成批調(diào)整至目標廠商報 告的細胞活素的EC50。
雞尾酒生長因子可以進一步包括胰島素，具體地是重組人胰島素 (RayBiotech公司，Norcross, GA)。該組分在選擇培養(yǎng)液中的最后濃 度可以包括但不局限于從約5 mg/L至約15 mg/L的范圍，更具體地說 為約6 mg/L、約7 mg/L、約8 mg/L、約9 mg/L、約10 mg/L、約11 mg/L 或更多，達到約15 mg/L。在一個具體的實施方案中，在選擇培養(yǎng)液 中胰島素的最后濃度可以為約10 mg/L。
亞硒酸鈉同時可以用來最優(yōu)化生長條件 (J. T. Baker， Phillipsburg， NJ)。該添加劑的最后濃度可以包括但不局 限于，在選^^培養(yǎng)液中為從約5. 0 jig/L至約8. Ong/L的范圍，更具 體地說為約5.5jig/L、約6. Ojig/L、約6.5jig/L、約7.0ng/L或更多， 達到約8. (Vg/L。在一個具體的實施方案中，在選擇培養(yǎng)液中亞硒酸
鈉最后濃度可以為約6. 7ng/L。
在其它實施方案中，丙酮酸鈉可以用作生長因子(SAFC Biosciences,公司,Lenexa， KA)。丙酮酸鈉在選擇培養(yǎng)液中的最后 濃度可以包括但不局限于從約0. 01g/L到約0. 3 g/L的范圍，更具體 地說為約O. 05g/L、約O. lg/L、約O. 15g/L或更多，達到約0. 3g/L。 在一個具體的實施方案中，在選擇培養(yǎng)液中丙酮酸鈉最后濃度可以為 約0. 11g/L。
雞尾酒生長因子可以進一步包括乙醇胺(S igma-A 1 dr i ch⑧公司， St. Louis, M0)。該添加劑在選擇培養(yǎng)液中的最后濃度可以包括但不 局限于從約0. 5 mg/L至約3. 5 mg/L的范圍，更具體地說為約1. Omg/L、 約1. 5 mg/L、約2. 0 mg/L、約2. 5 mg/L或更多,達到約3. 5 mg/L。 在一個具體的實施方案中，在選擇培養(yǎng)液中乙醇胺最后濃度可以為約 2. 0 mg/L。
在一個具體的實施方案中，雞尾酒生長因子可以包含無脂肪酸 BSA(0.1%-5%)、 rhIL-6(1 ng/mL-9 ng/mL)、重組人胰島素(5 mg/L-15 mg/L)、亞硒酸鈉(5ng/L-8ng/L)、丙酮酸鈉(O. 01 g/L-0. 3 g/L)和乙 醇胺(0. 5 mg/L-3. 5 mg/L)(在選擇培養(yǎng)液中的最后濃t 。在另 一個具 體的實施方案中，雞尾酒生長因子可以包含無脂肪酸BSA(l%-5%)、 rhlL-6 (0. 5ng/mL)、重組人胰島素(IO mg/L)、亞硒酸鈉(6. 7pg/L)、 丙酮酸鈉(O. 11 g/L)和乙醇胺(2mg/L)(在選擇培養(yǎng)液中的最后濃度)。 在又一個實施方案中，雞尾酒生長因子可以包含無脂肪酸BSA(1%)、 rhlL-6 (0. 5ng/mL)、重組人胰島素(10mg/L)、亞硒酸鈉(6. 7pg/L)、 丙酮酸鈉(0.11 g/L)和乙醇胺(2mg/L)(在選擇培養(yǎng)液中的最后濃度)。
在另一個實施方案中，生長因子可以包含無脂肪酸BSA、 rhlL-6、 重組人胰島素、亞硒酸鈉、丙酮酸鈉、乙醇胺和沒有其它生長因子。 在進一步的實施方案中，生長因子可以包含無脂肪酸BSA、 rhlL-6、 重組人胰島素、亞硒酸鈉、丙酮酸鈉、乙醇胺和沒有一般包括或用于 培養(yǎng)細胞生長中的其它物質(zhì)。在一個選擇性的實施方案中，生長因子 可以包含無脂肪酸BSA、 rhIL-6、重組人胰島素、亞硒酸鈉、丙酮酸 鈉、乙醇胺和沒有在血清一M現(xiàn)的其它物質(zhì)。在又一個實施方案中，
生長因子可以包含無脂肪酸BSA、 rhlL-6、重組人胰島素、亞竭酸鈉、 丙酮酸鈉、乙醇胺、通常用于重新組成任意所述生長因子包括水的任 意物質(zhì)和沒有其它任意物質(zhì)。
IV.用于產(chǎn)生異源蛋白的試劑盒
本發(fā)明進一步提供了工業(yè)上銷售的試劑盒。在某些實施方案中， 試劑盒可以包含載體、多個細胞和生長因子。載體可以包含用于哺乳 動物甾醇生物合成的生物化學途徑中編碼一種酶的序列，例如3-KSR, 可用于使用載體進行轉(zhuǎn)染細胞的選擇。試劑盒的用戶可以使用合適的 限切酶克隆一個耙基因為載體。在某些實施方案中，細胞為膽固醇缺 陷型細胞。在一個實施方案中，試劑盒提供的細胞已可以適合于化學 確定成分培養(yǎng)液中生長。在另一個實施方案中，試劑盒提供的細胞已 可以適合于化學確定成分、無血清的培養(yǎng)液中生長。根據(jù)調(diào)整的要求， 這些細胞來自工作細胞庫，其將無需外源因子就可以決定。
在另一個實施方案中，試劑盒可以包含這里描述的生長因子，其 支持細胞包括但不限于NS-0、 NS-1和CH0 215的生長和細胞。在某些 實施方案中，試劑盒可以包含生長因子，其支持細胞在無血清培養(yǎng)液、 無蛋白培養(yǎng)液、化學確定成分培養(yǎng)液或其任意結(jié)合包括化學上確定成 分/無血清培養(yǎng)液中生長。在一個具體的實施方案中，試劑盒可以包含 這里描述的生長因子，其支持CD-SFM NS -0細胞在低播種密度下生長， 例如在轉(zhuǎn)染后和有限稀釋細胞克隆(LDCC)階段期間。
此夕卜，本發(fā)明的試劑盒可用來表達任意感興趣的異源蛋白。當然， 不限定在本發(fā)明的細胞、細胞系和細胞培養(yǎng)中表達異源蛋白的本質(zhì)和 來源。例如，可以改造質(zhì)粒p3-KSR用于表達單個或至少兩個基因。前 者適用于獨立蛋白如單個鏈激素，后者意指雙重鏈狀分子鏈狀分子如 一種抗體的表達。
在本發(fā)明一個具體的實施方案中，可以使用包含必要基因的載體 表達重組抗體分子。參見實施例，圖3?？贵w由多重組分構(gòu)成蛋白質(zhì)， 特別地為兩個重鏈和兩個輕鏈。在一個實施方案中，可以改造p3-KSR 載體，包括完全的重和輕鏈的基因，用于人免疫球蛋白G(IgG)先后克 隆。從重組構(gòu)造表達的蛋白導致單克隆抗體的分泌，隨后可以從細胞培養(yǎng)在分離和純化用于工業(yè)應(yīng)用。因為它們?yōu)榫唧w的到單個抗原，可 用于目標具體的病原體、臟器或腫瘤，所以人單克隆抗體可很好適于
人體治療。
沒有進一步詳細說明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以相信使用優(yōu)先的描 述，可以以最充分的程度利用了本發(fā)明。下面的實施例僅僅是說明性 的，而不限定以任何方式>^開的剩余部分。
實施例
實施例1:闡述小鼠骨髓瘤細胞系NS-0在化學成分確定或/及無血清 細胞培養(yǎng)液中的膽固醇篩選
小鼠骨髓瘤細胞系NS-0在兩種化學成分確定無血清細胞培養(yǎng)液 中進行適應(yīng)培養(yǎng)以測試3-KSR在此細胞背景下或者SFM條件下作為選 擇標記的適宜性。使用CD-雜交瘤(Invitrogen )和CDM-4-NS-0 (HyClone⑧)對NS-0細胞進行適應(yīng)培養(yǎng)。從每個在CD-SFM適應(yīng)培養(yǎng)的 NS-0細胞系被用來建立Acession細胞庫。建立一個方法可以用于測 定CD-SFM-NS-0細胞系對細胞培養(yǎng)液膽固醇的依賴性。這些試驗結(jié)果 表明CD-SFM-NS-0細胞在無膽固醇培養(yǎng)液中培養(yǎng)72小時后，少于10% 的細胞可以存活。在CD-SFM內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)5天后，使用臺盼藍染色法沒 有檢測到活細胞。另外，在無膽固醇的條件下，沒有檢測到細胞的間 歇生長期，表明細胞對培養(yǎng)液中的脂質(zhì)缺乏靈敏度。
實施例2:小鼠3-酮固醇還原酶(3-KSR)的PCR反應(yīng)和構(gòu)建3-KSR表達 載體
使用從成年雄性BALB/c小鼠腎臟分離的cDNA進行3-酮固醇還原 酶(3-KSR)基因的PCR擴增反應(yīng)，本基因編碼小鼠muscuhis 3B-羥基 -delta(5)-類固醇脫氫酶(&i/J6力。使參考文獻報道中的小鼠3-KSR 化^mf序列，4吏用其特異寡核苷酸序列進行PCR擴增反應(yīng)，在瓊脂糖 凝膠電泳中可以檢測到一條1. lkb大小的帶。分離此帶并將其克隆至 pCR-Blunt II-T0P0載體(Invitrogen 中，然后重新克隆至pBV必尸r. 1 質(zhì)粒背景下，新的構(gòu)件載體稱作pBFhr.l。
在pBF^yr. 1中編碼3-ksr的1. lkb區(qū)域通過DNA測序得以確i人， 其開放閱讀框(orf)與發(fā)表的序列進行比較，測序的結(jié)果與已報道的小 鼠3-酮固醇還原酶(NCBI登記號A49573)完全一致。
實施例3: NS-0細胞在化學成分確定的無脂肪酸選擇培養(yǎng)液中的轉(zhuǎn)染 和選擇
一個含有正確3-KSR開放閱讀框的pBF/csr. 1被轉(zhuǎn)染進入NS-0 細胞并于化學成分確定的無脂肪酸選擇培養(yǎng)液中進行選擇。細胞選擇 培養(yǎng)液包括下列成分CD-雜交瘤(Invitrogen ) 、 Glutamax(2mM， Invitrogen⑧)、NEAA(非必需^J^酌(Ix， Invitrogen )、無脂肪酸 的BSA (1%, Calbiochem)、重組人IL-6 (5 ng/ml， Promega), ITS液 體培養(yǎng)液添加物(Ix， Sigma-Aldrich)。最初的轉(zhuǎn)染和選擇可以在T-75 細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)進行。在轉(zhuǎn)染當天，使用臺盼藍染色法對NS-0細胞進行 記數(shù)以區(qū)分活細胞或者死細胞。至少90%的細胞存活。每次轉(zhuǎn)染需要 大約lx107。除了質(zhì)粒轉(zhuǎn)染外，還需要進行一個陰性對照轉(zhuǎn)染(不含有 DNA)。離心細胞，將其混懸于20ml的無血清轉(zhuǎn)染液中進4亍洗滌并再次 離心。對于每次轉(zhuǎn)染，將lxl07個細胞混懸于70(^L的無血清轉(zhuǎn)染液。 制備DNA溶液，制備途徑如下將40pg純化的線性質(zhì)粒DNA置于lOO^L 的無菌蒸餾水中。線性DNA可以通過使用DNA限制性內(nèi)切酶進行制備， 通常不局限于Pvul (Proteus vulgaris restriction endonuclease 1)，其能夠在beta-內(nèi)酰胺酶開放閱讀框內(nèi)對pBF/csr. 1進行一次限 制性內(nèi)切。將整個DNA溶'^a入電轉(zhuǎn)染杯內(nèi)，將700pL的細胞混懸液 加入^^有DNA溶液的電轉(zhuǎn)染杯內(nèi)，小心吹打混合均勻，同時避免氣泡 的產(chǎn)生。將電轉(zhuǎn)染杯加蓋，置于電轉(zhuǎn)染儀器內(nèi)進行轉(zhuǎn)染(Gene Pulser II (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA)或等同物)。轉(zhuǎn)染^ff 為250v的單一脈沖，400pFd加之于電轉(zhuǎn)染杯上(電場強度為625V/cm)。 適宜的轉(zhuǎn)染條件下的時間常lt值應(yīng)該不大于8微秒。電轉(zhuǎn)染后將細胞 加至含有12mL的化學成分確定的無脂肪酸的選擇培養(yǎng)液的T-75細胞 培養(yǎng)瓶內(nèi)，于37匸下孵育過夜，孵育條件為5%0)2、 90%的相對濕度。
在體外培養(yǎng)三個星期后，被pBF/csr. 1轉(zhuǎn)染和篩選后的細胞在化
學成分確定的無脂肪酸的選擇培養(yǎng)液的存活率比對照組顯著提高。在 體外培養(yǎng)三個星期后，被陰性對照轉(zhuǎn)染和篩選后的細胞在同樣條件下
的存活率與對照組相比沒有顯著提高。
實施例4:在化學成分確定的無脂肪酸的選^^培養(yǎng)液NS-0細胞的轉(zhuǎn)染， 篩選以及單抗的表達
構(gòu)建哺乳動物表達載體pBF必/V. 1,其可以作為哺乳動物基因克 隆的骨架，這些基因包括人抗體重鏈和輕鏈編碼區(qū)域，這個載體也可 以在二氫葉酸脫氫酶(dhfr)突變的parental母系細胞系(CH0-DG44) 內(nèi)進行表達。在使用這個載體時，人IgGI的重鏈恒定區(qū)可以被克隆在 多克隆位點內(nèi)(mcs)，作為人抗體重鏈可變區(qū)的受方。這個栽體^皮^^名 為pBF必/V. 1: H。
首先將相應(yīng)的輕鏈可變區(qū)序列克隆至含有人輕鏈恒定區(qū)基因片 斷的桿狀病毒表達載體pIEI-light內(nèi)。然后將整個輕鏈編碼序列克隆 至pBF必/Y. 1。為了構(gòu)建雙重表達載體，與pCMV-MIE 5，端和在互補 鏈上的BGH-pA相匹配的引物可以被用來擴增含有pCMV-MIE-輕鏈 -BGHpA的輕鏈序列，此序列在兩端都含有BgIII限制性酶切位點。然 后將本片段克隆至每個相應(yīng)的pdhfr:Heavy-Chain栽體的單一 BglII 限制性酶切位點上。由此構(gòu)建的載體pBV必/Y. 1: humAb含有完整的人 抗體重鏈和輕n因。
分離小鼠3-酮類固醇還原酶基因，將其克隆至pCR-Blunt II一TOPO zaiti (Invitrogen )內(nèi)，然后再次克隆至于 pBV必尸r. 1: humAb載體內(nèi)。這個含有正確3-KSR開放閱讀框的新栽體 pBFhr. 1 : HUMAB可以被轉(zhuǎn)染至NS-0細胞內(nèi)并使用化學成分確定的無 脂肪酸的選擇培養(yǎng)液進行篩選。最初的轉(zhuǎn)染和篩選可以在T-75細胞培 養(yǎng)瓶內(nèi)進行。在轉(zhuǎn)染后，細胞可直接培養(yǎng)于篩選培養(yǎng)液內(nèi)。在體外培 養(yǎng)三個星期后，被pBFhr. 1 :HUMAB轉(zhuǎn)染和篩選后的細胞在化學成分 確定的無脂肪酸的選擇培養(yǎng)液的存活率比對照組顯著提高。在體外培 養(yǎng)三個星期后，被陰性對照轉(zhuǎn)染和篩選后的細胞在同樣條件下的存活 率與對照組相比沒有顯著提高。
被轉(zhuǎn)染細胞進行篩選和體外培養(yǎng)，可以使用酶聯(lián)免疫法測定細胞 上清液內(nèi)的重組mAb。簡而言之，收集,皮轉(zhuǎn)染pBFhr. 1 : HUMAB細胞 的上清液，離心以去除任何細胞或碎片。使用羊抗人Fab lambda特異
性抗體溶液(Sigma-Aldrich⑧Co. ， St. Louis, M0)對96孔板ii行包 被，抗體溶液制備如下將9nL抗體加至6. 3mL的磷酸緩沖液(PBS) 中。將96孑L板于4X:孵育至少24小時，至多兩個星期。在測定當天， 使用PBS/tween(0.1% tween)緩沖液漂洗96孑L板，漂洗次數(shù)為三次。 將人IgGl單抗標準品(Sigma )以PBS/tween稀釋至5pg/mL，然后再 以1: 2的比率依次稀釋，從而得到標準濃度梯度。將每個標準溶^> 至96孔板中，每孔100pL。未知抗體濃度的樣品以1: 2000的比率進 行稀釋，加至96孑L板中，每孔100nL。將96孑L板于室溫下孵育1小 時。孵育后使用PBS/tween緩沖液漂洗96孔板，漂洗次數(shù)為三次。將 過氧化物酶標記的羊抗人IgGFc抗體(KPL， Inc., Gaithersburg， MD) 以1: 2000的比率進行稀釋，加至96孑L板中，每孔100pL。將96孔 板于室溫下孵育1小時。孵育后使用PBS/tween緩沖液漂洗96孑L板， 漂洗次數(shù)為三次。將3， 3:5，5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物(Sigma⑧)加 至96孔板中，每孔100pL。 一分鐘后，加入100pL的0. 5M硫酸溶液 (Acros 0rganics， Geel， Belgium)以停止反應(yīng)的進行。在450nm波長 下進行讀色，使用儀器為ThermoMax96孔板讀數(shù)器或者類似儀器。 ELISA試驗結(jié)果可以測定重組單抗產(chǎn)物的存在。
權(quán)利要求
1.一種載體，其包含編碼真核細胞甾醇生物合成途徑中的酶的多核苷酸、其生物學活性片段或其生物活性變體以及編碼異源多肽的多核苷酸。
2. 如權(quán)利要求l所述的載體，其中所述酶包含3-甾酮還原酶。
3. 如權(quán)利要求2所述的載體，其中所述3-甾酮還原酶包含鼠3-甾酮還原酶。
4. 如權(quán)利要求l所述的載體，其中編碼所述酶的所述多核苷酸包 含SEQ ID NO : 1。
5. 如權(quán)利要求l所述的載體，其中編碼所述酶的所述多核苷酸包 含SEQ ID NO : 2。
6. 如權(quán)利要求l所述的栽體，其中所述多核苷酸對包含SEQ ID NO: 3的所述酶的^J^酸序列進行編碼。
7. 如權(quán)利要求l所述的栽體，其中所述多核苷酸編碼對包含SEQ ID NO: 4的所述酶的M酸序列進行編碼。
8. 如權(quán)利要求1-7中任一項所述的栽體，其中所述載體是重組 ■表達載體。
9. 如權(quán)利要求8所述的栽體，其中重組DNA表達載體進一步包含 至少一個用于產(chǎn)物基因的第一轉(zhuǎn)錄單元，轉(zhuǎn)錄單元由人細胞巨化病毒 啟動子控制。
10. —種以如權(quán)利要求9所述的載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
11. 如權(quán)利要求10所述的宿主細胞，其中所述宿主細胞是真核細胞。
12. 如權(quán)利要求10所述的宿主細胞，其中所述宿主細胞是膽固醇 缺陷型細胞。
13. 如權(quán)利要求10所述的宿主細胞，其中所述宿主細胞選自由 NS-0、 NS-1和CH0-215組成的組。
14. 如權(quán)利要求10所述的宿主細胞，其中所述宿主細胞是NS-O 小鼠骨髄瘤細胞。
15. —種試劑盒，包含 一種載體，其包含含有編碼真核細胞甾 醇生物合成途徑中的酶的多核苷酸，其生物學活性片段或其生物活性 變體和編碼異源多肽的多核苷酸的載體；和任意一種或多種膽固醇缺陷型的大量宿主細胞；化學限定且無血清的培養(yǎng)基；用于支持低播種 和克隆密度下所述大量宿主細胞生長的生長補充物；和至少一種應(yīng)用 試劑盒的協(xié)議。
16. 如權(quán)利要求15所述的試劑盒，其中所述酶包括3-甾酮還原酵。
17. 如權(quán)利要求16所述的試劑盒，其中所述3-齒酮還原酶包含 鼠3-甾酮還原酶。
18. 如權(quán)利要求15所述試劑盒，其中編碼所述酶的所述多核苷酸 包含SEQ ID NO : 1。
19. 如權(quán)利要求15的試劑盒，其中編碼所述酶的所述多核苷酸包 含SEQ ID NO : 2。
20. 如權(quán)利要求15所述的試劑盒，其中所述多核苷酸對包含SEQ ID NO: 3的所述酶的M酸序列進行編碼。
21. 如權(quán)利要求15所述的試劑盒，其中所述多核苷酸對包含SEQ ID NO: 4的所述酶的^酸序列進行編碼。
22. 如權(quán)利要求15-21中任一項所述的試劑盒，其中所述載體是 一種重組DNA表達載體。
23. 如權(quán)利要求22所述的試劑盒，其中重組DNA表達載體進一步 包含至少一個用于產(chǎn)物基因的第一轉(zhuǎn)錄單元，轉(zhuǎn)錄單元由人細胞巨化 病毒啟動子控制。
24. 如權(quán)利要求15所述的試劑盒，其中所述宿主細胞選自由 NS-0、 NS-1和CH0-215組成的組。
25. 如權(quán)利要求15所述的試劑盒，其中所述宿主細胞是NS-O小 鼠骨髓瘤細胞。
26. 如權(quán)利要求15所述的試劑盒，其中所述宿主細胞適合于化學 確定成分的無血清培養(yǎng)液。
27. 如權(quán)利要求15所述的試劑盒，其中所述宿主細胞適合于化學 確定成分的培養(yǎng)液。
28. 如權(quán)利要求15所述的試劑盒，其中所述生長添加劑包含無脂 肪酸BSA、 rhlL-6、重組人胰島素、亞硒酸鈉、丙酮酸鈉和乙醇胺中 至少一種。
29. 如權(quán)利要求15所述的試劑盒，其中所述生長添加劑包含在選 擇培養(yǎng)液中的最后濃度為約0.1%-5%的無脂肪酸BSA、約1 ng/mL-9 ng/mL的rhIL-6、約5 mg/mL-15 mg/L的重組人胰島素、約5 p g/L-8 H g/L的亞硒酸鈉、約0. 01 g/L-0. 3 g/L的丙酮酸鈉和約0. 5 mg/L-3. 5 mg/L的乙醇胺。
30. 如權(quán)利要求15所述的試劑盒，其中所述生長添加劑包含在選 擇培養(yǎng)液中的^濃度為約1 S的無脂肪酸BSA、約5ng/mL的rhlL-6、 約10 mg/L的重^A胰島素、約6. 7 p g/L的亞硒酸鈉、約0.11 g/L 的丙酮酸鈉和約2.0 mg/L的乙醇胺。
31. —種細胞培養(yǎng)添加劑的組合物，其包含在選擇培養(yǎng)液中的最 后濃度為約0.1%-5X的無脂肪酸BSA、約1 ng/mL-9 ng/mL的rhlL-6、 約5 mg/mL-15 mg/L的重組人胰島素、約5 ji g/L-8 ji g/L的亞硒酸鈉、 約0. 01 g/L-0. 3 g/L的丙酮酸鈉和約0. 5 mg/L-3. 5 mg/L的乙醇胺。
32. —種細胞培養(yǎng)添加劑的組合物，其包含在選擇培養(yǎng)液中的最 后濃度為約1W的無脂肪酸BSA、約5ng/mL的rhIL-6、約10 mg/L的 重組人胰島素、約6. 7ng/L的亞硒酸鈉、約O.ll g/L的丙酮酸鈉和 約2. 0 mg/L的乙醇胺。
33. —種選擇能夠在無膽固醇培養(yǎng)液中存活的細胞的方法，包括以載體轉(zhuǎn)染膽固醇缺陷型的真核細胞，所述載體包括對真核細 胞甾醇生物合成途徑酶、其生物學活性片段或其生物學上活性變體進 行編碼的多核苷酸，以及任意地至少一種對異源蛋白進行編碼的多核 苷酸；以及選捧具有在缺乏膽固醇培養(yǎng)液中存活的能力的細胞。
34. 如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述細胞選自由NS-0、 NS-1 和CHO-215組成的組。
35. 如權(quán)利要求34所述的方法，其中所述細胞是NS-O小鼠骨髓 瘤細胞。
36. 如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述培養(yǎng)液為化學確定成分 和無血清或化學確定成分。
37. 如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述酶包含3-甾酮還原酶。
38. —種獲得具有在缺乏膽固醇培養(yǎng)液中存活的能力并生產(chǎn)異源 蛋白的細胞的方法，包括用權(quán)利要求1-9中任一項所述的載體和至 少一種對異源蛋白質(zhì)進行編碼的多核苷酸轉(zhuǎn)染膽固醇缺陷型真核細胞；以及選擇具有在缺乏膽固醇培養(yǎng)液中存活能力的細胞。
39. 如權(quán)利要求38所述的方法，其中所述細胞為膽固醇缺陷型細胞。
40. 如權(quán)利要求38所述的方法，其中所述細胞選自由NS-O、 NS-1 和CHO-215組成的組。
41. 如權(quán)利要求40所述的方法，其中所述細胞是NS-0小鼠骨髓 瘤細胞。
42. 如權(quán)利要求38所述的方法，其中所述培養(yǎng)液為化學確定成分 和無血清或化學確定成分。
43. —種產(chǎn)生異源蛋白質(zhì)的方法，包含用權(quán)利要求l-9中任一 項所述的載體和至少一種對異源蛋白質(zhì)進行編碼的多核苷酸轉(zhuǎn)染膽固醇缺陷型真核細胞；以及在產(chǎn)生異源蛋白的條件下培養(yǎng)細胞。
44. 如權(quán)利要求43所述的方法，其中所述細胞為膽固醇缺陷型細胞。
45. 如權(quán)利要求43所述的方法，其中所述細胞選自由NS-0、 NS-1 和CH0-215組成的組。
46. 如權(quán)利要求45所述的方法，其中所述細胞是NS-O小鼠骨髓 瘤細胞。
47. 如權(quán)利要求43所述的方法，其中所述培養(yǎng)液為化學確定成分 和無血清或化學確定成分。
48. 如權(quán)利要求43所述的方法，進一步包含從細胞培養(yǎng)得到異源 蛋白。
49. 一種表達異源蛋白的方法，其包含培養(yǎng)一種具有包含編碼3-甾酮還原酶和至少一種異源蛋白載體的轉(zhuǎn)染細胞，其在缺乏膽固醇條 件下產(chǎn)生異源蛋白。
50. 如權(quán)利要求49所述的方法，其中所述細胞是膽固醇缺陷型細胞。
51. 如權(quán)利要求49所述的方法，其中所述細胞選自由NS-O、 NS-1 和CHO-215組成的組。
52. 如權(quán)利要求51所述的方法，其中所述細胞是NS-O小鼠骨髓 瘤細胞。
53. 如權(quán)利要求49所述的方法，其中所述培養(yǎng)液為化學確定成分 和無血清或化學確定成分。
全文摘要
本發(fā)明涉及新的標記選擇載體以及使用這些載體在真核細胞內(nèi)穩(wěn)定表達基因產(chǎn)物的方法。更具體地說，本發(fā)明提供了組合物和利用任意酶在真核甾醇/膽固醇生物合成途徑中有用的方法，例如3-甾酮還原酶作為一種選擇轉(zhuǎn)染細胞的代謝選擇標記。在一個實施方案中，該方法包括轉(zhuǎn)染細胞，其為具有載體編碼3-甾酮還原酶和至少一種異源蛋白的膽固醇缺陷型細胞，并選擇缺乏膽固醇培養(yǎng)液中能夠存活的選擇細胞和/或在化學確定成分和/或無血清培養(yǎng)液中這些細胞內(nèi)產(chǎn)生異源蛋白。
文檔編號C08B1/02GK101193918SQ200680017290
公開日2008年6月4日 申請日期2006年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月18日
發(fā)明者路易斯·布蘭科, 達里爾·B·桑佩 申請人:拜奧法克圖拉公司