專利名稱：含有cd34標(biāo)志基因用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞分選的載體的構(gòu)建及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體的說是一種含有CD34細(xì)胞表面標(biāo)志基因用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞分選的載體的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在基因工程中，將外源基因通過載體攜帶入宿主細(xì)胞，并在宿主細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增使外源基因得以高效表達(dá)的技術(shù)有著十分廣泛的應(yīng)用。但是在將載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，如何從數(shù)量巨大的細(xì)胞群中檢測并分選出為數(shù)極少的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，就成為建立真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的一個(gè)關(guān)鍵。
目前所用的方法通常為利用載體中攜帶的標(biāo)記基因，通過在培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的抗性藥物或通過其他方式來進(jìn)行篩選，最常用的為G418(geneticin)篩選。G418對真核細(xì)胞具有毒性，但當(dāng)載體中攜帶的新霉素抗性基因(neo)在真核細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，可產(chǎn)生一種磷酸轉(zhuǎn)移酶，使得G418失活，從而轉(zhuǎn)染進(jìn)載體并表達(dá)了新霉素抗性基因的細(xì)胞即可避免被殺死。此外還有胸苷激酶基因(tk)選擇系統(tǒng)、二氫葉酸還原酶基因(dhfr)選擇系統(tǒng)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(cat)檢測系統(tǒng)等方法，但是由于轉(zhuǎn)染細(xì)胞中標(biāo)志基因與目的基因并不一定同時(shí)表達(dá)，因此通過這類方法對轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行篩選時(shí)，既耗時(shí)效率又低，要分選出表達(dá)了目的基因的細(xì)胞株通常需耗費(fèi)一個(gè)甚至幾個(gè)月的時(shí)間。
有些情況下還可以利用轉(zhuǎn)染細(xì)胞所獲得的某些特性通過流式細(xì)胞儀來進(jìn)行分選，但是流式分選所需費(fèi)用較高，使其推廣應(yīng)用受到限制。
近年來，通過免疫學(xué)的方法，即利用細(xì)胞表面的某些標(biāo)志分子通過抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)分選某種類型的細(xì)胞的方法在生物醫(yī)學(xué)科研及臨床研究中有著廣泛的應(yīng)用，例如利用免疫磁珠法(MACS)分離CD34+造血干/祖細(xì)胞等等。我們將免疫學(xué)的細(xì)胞分選方法與多基因共表達(dá)載體的構(gòu)建策略相結(jié)合并應(yīng)用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞的分選，不僅簡化了傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)染細(xì)胞分選煩瑣又耗時(shí)的過程，而且提高了轉(zhuǎn)染細(xì)胞的分選效率。
在細(xì)胞表面標(biāo)志基因的選擇中，CD34基因因其顯著的優(yōu)點(diǎn)而受到了我們的關(guān)注。目前，對于CD34+細(xì)胞的分選已有十分成熟的方法，而且有許多商品化的試劑及設(shè)備，可以方便、高效地分選CD34+細(xì)胞。我們通過在轉(zhuǎn)入目的基因的時(shí)，將標(biāo)志基因CD34一起轉(zhuǎn)入細(xì)胞，使轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)目的基因的同時(shí)亦獲得CD34表面標(biāo)志，從而利用CD34表面標(biāo)志，方便的分選轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞分選的載體。其特征在于，載體中包含編碼細(xì)胞表面分子CD34的核苷酸序列，將目的核苷酸序列插入該載體多克隆位點(diǎn)后經(jīng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，兩者可以實(shí)現(xiàn)共同表達(dá)，通過轉(zhuǎn)染細(xì)胞所新獲得的CD34表面標(biāo)志分子利用免疫結(jié)合的原理實(shí)現(xiàn)分選陽性細(xì)胞的目的。
采用多基因共表達(dá)載體的構(gòu)建方式，實(shí)現(xiàn)CD34基因和目的核苷酸序列兩者的共同表達(dá)。凡是可以實(shí)現(xiàn)兩個(gè)或者多個(gè)不同基因共同表達(dá)的載體構(gòu)建策略均可以應(yīng)用于此，目前較常用的為構(gòu)建雙順反子載體，兩個(gè)基因之間以一定的核苷酸序列進(jìn)行連接，實(shí)現(xiàn)其共同表達(dá)，例如以IRES(internal ribosome entry site)、2A等序列將兩個(gè)基因進(jìn)行連接的構(gòu)建方法。我們利用IRES序列，來構(gòu)建雙順反子載體。
經(jīng)本發(fā)明中所述的載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，在表達(dá)目的基因的同時(shí)，轉(zhuǎn)染細(xì)胞可獲得一種新的細(xì)胞表面標(biāo)志CD34。利用此種細(xì)胞表面標(biāo)志，采用免疫學(xué)的方法，將一定的標(biāo)志物(例如免疫磁珠)結(jié)合于細(xì)胞表面上，然后即可通過相應(yīng)的細(xì)胞分選技術(shù)(例如免疫磁性分選)來實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的分選。
我們構(gòu)建的這一載體提供了一種新的分選轉(zhuǎn)染細(xì)胞的思路和方法，簡化了以往煩瑣的轉(zhuǎn)染細(xì)胞分選過程，提高了轉(zhuǎn)染細(xì)胞的分選效率，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有極佳的應(yīng)用前景。
下面以質(zhì)粒載體pcDNA3.1(+)-IRES-CD34的構(gòu)建為例，并結(jié)合附圖對本發(fā)明做一詳細(xì)說明。


圖1是質(zhì)粒載體pcDNA3.1(+)-IRES-CD34的構(gòu)建流程圖。
圖2是質(zhì)粒載體pcDNA3.1(+)-IRES-CD34的PCR鑒定。
MDL2000分子量標(biāo)志物；1pcDNA3.1(+)-IRES-CD34經(jīng)PCR擴(kuò)增IRES的部分序列；2pcDNA3.1(+)-IRES-CD34經(jīng)PCR擴(kuò)增CD34序列；圖3是質(zhì)粒載體pcDNA3.1(+)-IRES-CD34的酶切鑒定。
M1DL2000分子量標(biāo)志物；M2DL15000分子量標(biāo)志物；1pcDNA3.1(+)-IRES-CD34經(jīng)HindIII單酶消化。
2pcDNA3.1(+)-IRES-CD34經(jīng)EcoRI、XbaI雙酶消化。
圖4是質(zhì)粒載體pcDNA3.1(+)-IRES-CD34的圖譜。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、pcDNA3.1(+)-IRES-CD34載體的構(gòu)建一、CD34-cDNA插入T-easy載體。CD34基因分離自CD34+細(xì)胞，根據(jù)CD34-cDNA編碼區(qū)的序列并分別引入NcoI和XbaI、SphI酶切位點(diǎn)合成引物，引物序列及其多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的條件如下P15′-CGCCCATGGTGCTGGTCCGCAGGGGC-3′P25′-CGCGCATGCTCTAGATTAGCGGCGATTCATCAGGAA-3′50μl反應(yīng)體系包括2ul cDNA，primer1和2各2μl(10μM)，4μl dNTP(2.5mM)，0.5μl高保真Taq DNA聚合酶(BioDev公司)，5μl 10×PCR Buffer，34.5μl滅菌水。反應(yīng)條件為94℃變性5min；94℃ 30sec，50℃ 30sec，72℃ 80sec，33個(gè)循環(huán)；72℃ 10min。反應(yīng)產(chǎn)物克隆至pGEM-T easy載體(Promega公司，美國)，獲得克隆質(zhì)粒T-CD34。
二、IRES(EMCV)插入T-CD34。質(zhì)粒pIRES2-EGFP用限制性內(nèi)切酶NcoI、SalI消化，回收目的片段IRES插入到T-CD34載體的NcoI、SalI位點(diǎn)上，獲得攜帶IRES和標(biāo)志基因CD34的載體T-IRES-CD34，經(jīng)SalI、XbaI雙酶消化后，TAE瓊脂糖凝膠電泳得到1.6kb的條帶，與預(yù)期結(jié)果符合。
三、pcDNA3.1(+)-IRES-CD34載體的構(gòu)建。用SalI、XbaI雙限制酶消化T-IRES-CD34載體，獲得IRES-CD34片段，插入經(jīng)XhoI、XbaI雙限制酶消化的pcDNA3.1(+)載體的多克隆位點(diǎn)。經(jīng)EcoRI、XbaI雙酶消化后，獲得1.6kb條帶，與預(yù)期結(jié)果符合；經(jīng)HindIII單酶消化后，獲得300bp條帶，與預(yù)期結(jié)果符合。經(jīng)PCR鑒定，CD34為陽性。設(shè)計(jì)引物鑒定IRES如下P15′-CGGTGGGAGGTCTATATAAGC-3′P25′-TTATTCCAAGCGGCTTCG-3′。
20μl反應(yīng)體系包括1μl質(zhì)粒，primer1和2各1μl(10μM)，2μl dNTP(2.5mM)，0.2μl rTaq酶(TakaRa公司)，2μl 10×PCR Buffer，12.8μl滅菌水。反應(yīng)條件為94℃變性5min；94℃ 30s，48℃ 30s，72℃ 30s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 7min。IRES鑒定結(jié)果為陽性。對其進(jìn)行測序及分析表明，載體pcDNA3.1(+)-IRES-CD34構(gòu)建成功。
本實(shí)施例是構(gòu)建了含有細(xì)胞表面標(biāo)志基因CD34的雙順反子載體，采用腦心肌炎病毒EMCV的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(internal ribosome entry site，IRES)序列進(jìn)行連接，以實(shí)現(xiàn)目的基因和細(xì)胞表面標(biāo)志基因的共同表達(dá)。
實(shí)施例2、重組載體pcDNA3.1(+)-IRES-CD34-luc的構(gòu)建設(shè)計(jì)引物從載體pAP1-luc上擴(kuò)增luc基因，并引入NheI、EcoRI酶切位點(diǎn)，引物序列及其多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)如下P15′-GCTAGCATGGAAGACGCCAAAAACA-3′P25′-GAATTCAATTACACGGCGATCTTTCC-3′。
50μl反應(yīng)體系包括2μl質(zhì)粒，primer1和2各2μl(10μM)，4μl dNTP(2.5mM)，0.3μl Pyrobest Taq酶(TakaRa公司)，5μl 10×pyrobest Buffer，34.7μl滅菌水。反應(yīng)條件為94℃變性5min；94℃ 30s，53℃ 30s，72℃ 90s，33個(gè)循環(huán)；72℃ 10min。反應(yīng)產(chǎn)物克隆至pGEM-T easy載體(Promega公司，美國)，獲得克隆質(zhì)粒T-luc。
用NheI、EcoRI雙限制酶消化質(zhì)粒T-luc，得到的目的基因luc片段(約1650bp)插入經(jīng)NheI、EcoRI雙限制酶消化的3.1-IRES-CD34載體的多克隆位點(diǎn)。經(jīng)PCR鑒定、酶切鑒定正確后，對其進(jìn)行序列測定。得到重組載體pcDNA3.1(+)-IRES-CD34-luc。
實(shí)施例3、重組載體pcDNA3.1(+)-IRES-CD34-luc轉(zhuǎn)染細(xì)胞生長狀態(tài)良好的CHO細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)至50％～75％匯合，用胰酶消化收集細(xì)胞，用預(yù)冷的電穿孔緩沖液沖洗兩次，然后將細(xì)胞重新懸浮在該緩沖液中，使細(xì)胞的終濃度為(0.5-1.0)×107個(gè)細(xì)胞/ml。取0.8ml細(xì)胞懸液放入電轉(zhuǎn)杯中，加入適量的重組載體pcDNA3.1(+)-IRES-CD34-luc并充分混合，冰浴中放置10min，電擊一次。電擊后將電轉(zhuǎn)杯放入冰浴中10min。用適當(dāng)?shù)耐耆囵B(yǎng)基稀釋細(xì)胞，置于37℃，5％CO2孵箱中培養(yǎng)。
實(shí)施例4、運(yùn)用MACS系統(tǒng)分選轉(zhuǎn)染細(xì)胞轉(zhuǎn)化后細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)24～48小時(shí)，使轉(zhuǎn)化的外源基因得以表達(dá)。棄去舊培養(yǎng)基，加入胰酶消化液消化，輕輕吸出消化液，加入10ml PBS(含2mM EDTA)輕輕吹吸，轉(zhuǎn)移入離心管中離心(800g，10min)收集細(xì)胞，用10mlPBS(含2mM EDTA)洗一次，之后采用Direct CD34 Progenitor Cell Isolation Kit(Miltenyi Biotec)利用免疫磁珠分選(MACS)的方法對其進(jìn)行分選。分選得到的細(xì)胞可直接進(jìn)行下一步的分析或者加入培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)。
采用本發(fā)明中的載體與常規(guī)載體相比，可以大大提高轉(zhuǎn)染細(xì)胞分選效率，縮短轉(zhuǎn)染細(xì)胞分選的周期。
權(quán)利要求
1.一種含有CD34標(biāo)志基因用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞分選的新載體，其特征在于載體中包含一段編碼細(xì)胞表面分子CD34的核苷酸序列，將目的核苷酸序列插入該載體的多克隆位點(diǎn)后經(jīng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，可以實(shí)現(xiàn)目的核苷酸序列和CD34基因的共同表達(dá)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的載體的構(gòu)建方法，其特征在于采用多基因共表達(dá)載體的構(gòu)建方式來實(shí)現(xiàn)目的核苷酸序列和CD34基因兩者的共同表達(dá)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于可采用雙順反子載體的構(gòu)建方法構(gòu)建。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于可采用多啟動子載體的構(gòu)建方法構(gòu)建。
5.權(quán)利要求1所述的載體在轉(zhuǎn)染細(xì)胞分選中的應(yīng)用，即利用轉(zhuǎn)染細(xì)胞在表達(dá)目的核苷酸的同時(shí)所新獲得的CD34細(xì)胞表面標(biāo)志而對目的細(xì)胞進(jìn)行分選。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)染細(xì)胞的分選方法，其特征在于利用免疫結(jié)合的原理而進(jìn)行的分選，可采用的方法包括免疫磁珠分離、免疫吸附法分離等。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體的說是一種含有CD34標(biāo)志基因用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞分選的載體的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。本發(fā)明構(gòu)建了包含有編碼細(xì)胞表面分子CD34的核苷酸序列的載體，采用了多基因共表達(dá)載體的構(gòu)建方式，將目的核苷酸序列插入該載體多克隆位點(diǎn)后轉(zhuǎn)染細(xì)胞，載體中CD34基因和目的核苷酸序列可實(shí)現(xiàn)共同表達(dá)。利用轉(zhuǎn)染細(xì)胞獲得的新的細(xì)胞表面標(biāo)志，采用免疫結(jié)合的原理來實(shí)現(xiàn)分選陽性細(xì)胞的目的。本發(fā)明提供了一種新的分選轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法，不僅簡化了傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)染細(xì)胞分選煩瑣又耗時(shí)的過程，而且提高了轉(zhuǎn)染細(xì)胞的分選效率，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有極佳的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N15/65GK1712535SQ200410049999
公開日2005年12月28日 申請日期2004年6月25日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月25日
發(fā)明者裴雪濤, 岳 文, 曲笑霞, 秦立篷, 高艷紅, 閆舫 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所