專利名稱：人紅血球生成素基因在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的高水平表達(dá)的制作方法
本申請是申請?zhí)枮?8115963.X，申請日為87年6月26日，發(fā)明名稱為“制備相當(dāng)于人紅血球生成素基因片段的核苷酸序列的方法”的發(fā)明專利申請的分案申請。
本發(fā)明一般地涉及基因工程領(lǐng)域，具體說與重組基因的糖蛋白產(chǎn)物表達(dá)有關(guān)，更具體地說與從穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中高水平地表達(dá)有生物活力的人紅血球生成素有關(guān)。
紅血球生成素這一激素在調(diào)節(jié)紅血球生成、紅血細(xì)胞的形成以及由貧血導(dǎo)致的紅血球生成素缺乏中起著重要作用。由于缺少純的材料，對這個(gè)激素做詳細(xì)研究以及試圖用它進(jìn)行替補(bǔ)治療一直都很困難。
人紅血細(xì)胞的產(chǎn)生，需要腎臟分泌成熟糖蛋白形式的紅血球生成素。在恒態(tài)時(shí)，這個(gè)激素在循環(huán)血液中濃度為每毫升10至18毫單位(128-230微微克)，在嚴(yán)重的組織供氧不足(缺氧)刺激下，它的水平可以增加一千倍。提高激素水平可觸發(fā)骨髓中感受干細(xì)胞群的增生和分化，激活成熟紅細(xì)胞中血紅蛋白的合成，加速紅細(xì)胞從骨髓釋放進(jìn)入循環(huán)，從而增加紅細(xì)胞量，改善供氧不足的局面。缺乏紅血球生成素的病人如慢性腎臟病人，常患有嚴(yán)重的貧血癥。
紅血球生成素是一個(gè)34-38千道爾頓的糖蛋白，分子量的約40％是糖類提供的。至少一個(gè)二硫橋是活力所需的，對此激素的結(jié)構(gòu)所知甚少，其合成的詳情也未全清楚。最近分離到的CDNA和基因組克隆，提供了分析紅血球生成素產(chǎn)生的調(diào)節(jié)控制的機(jī)會(huì)，但是，還沒有表達(dá)足夠數(shù)量的有生物活力的人紅血球生成素以用于替補(bǔ)治療。
按照本發(fā)明公開的內(nèi)容，有生物活力的人紅血球生成素可以由穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系進(jìn)行高水平表達(dá)(每升上清液超過二百萬名義滴度單位)，這就為臨床應(yīng)用純的人紅血球生成素提供了巨大的來源。紅血球生成素的這一驚人的高水平表達(dá)，是通過用人紅血球生成素基因的Apa I限制片段轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞系實(shí)現(xiàn)的。Apa I限制片段的意義鏈有

圖1所示的核苷酸序列。
圖1表示含有人紅血球生成素基因序列的2426個(gè)堿基對的Apa I限制片段；圖2繪出了含有2426個(gè)堿基對的Apa I限制片段的有代表性的質(zhì)粒表達(dá)載體(pD11-Ep)；圖3描繪的是另一個(gè)帶有Apa I限制片段的表達(dá)載體(pBD-Ep)。
在較好的實(shí)施方案中，如圖1所示的通過基因工程構(gòu)建的Apa I限制片段被插入如圖2和圖3所示的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體中，然后將表達(dá)載體引入哺乳動(dòng)物細(xì)胞系以發(fā)展穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，產(chǎn)生大量有生物活力的人紅血球生成素。所選擇的人紅血球生成素基因的Apa I限制片段要能最高效率地轉(zhuǎn)錄紅血球生成素信使RNA，有效地轉(zhuǎn)譯RNA和進(jìn)行轉(zhuǎn)譯后的修飾，以生成具有生物活力的成熟紅血球生成素糖蛋白。具體地說，重要的是將紅血球生成素基因5′端干擾序列除去，而保留增強(qiáng)子序列。為了保存有潛在價(jià)值的增強(qiáng)子序列，Apa I限制片段中的內(nèi)含子也被保留。在基因的3′端某些3′非轉(zhuǎn)譯序列也被保留，使推測的調(diào)控序列最適化。由Apa I片段提供的增強(qiáng)表達(dá)為以下實(shí)例所證實(shí)，在下述實(shí)例中，該片段與兩個(gè)啟動(dòng)子和兩個(gè)細(xì)胞系合用均得到穩(wěn)定的高水平表達(dá)的紅血球生成素。
提出下列實(shí)例是用以闡述發(fā)明的優(yōu)越性，并幫助普通的專門技術(shù)人員掌握和應(yīng)用本發(fā)明。這些實(shí)例無論如何都不是企圖限制本發(fā)明公開的范圍，或本專利證書所提供的保護(hù)。
實(shí)例1.基因克隆的提取在入噬菌體中構(gòu)建的人基因組文庫(Cell，151157-1174，1978)用低嚴(yán)緊度雜交條件及在Cell，38287-297，1984(特此引證)中所述的寡核苷酸探針混合物進(jìn)行篩選寡核苷酸混合物系用Applied Biosystems合成儀制備，用32P-ATP及T4多核苷酸激酶作末端標(biāo)記。設(shè)計(jì)的合成寡核苷酸相應(yīng)于氨基末端部分的氨基酸序列H2N-Ala-Pro-？-Arg-Leu-Ile-Leu-Asp-Ser-Arg-Val-Leu-Glu-Arg-Tyr-Leu-Leu-Glu-Ala-Lys-Glu-Ala-Glu-？-Ile-Thr-Asp-Gly-Gly-Ala24此序列得自Yanagawa等人(J.Biol.Chem.2592707-2710，1984)從再生障礙貧血病人尿中純化的人蛋白質(zhì)。為了減少這段氨基酸序列密碼子的簡并程度，采用了Grantham等(Nu-cleic Acids Research，843-59，1981)和Jaye等(Nucleic Acids Research，112325-2335，1983)的密碼子使用規(guī)律。這些規(guī)律考慮到了脊椎動(dòng)物DNA中二核苷酸CpG相對地稀少，和適當(dāng)?shù)乇苊釧:G潛在錯(cuò)配。第24位氨基酸最可能是門冬酰胺(J.Biol.Chem 2592707-2710，1984)。對于氨基酸序列谷-丙-賴-谷-丙-谷-門冬酰胺，2組各72種相應(yīng)于預(yù)期的密碼子序列被合成，第一組是20核苷酸探針，為TT(c/t)TC(a/g/t)GC(c/t)TC(c/t)TT(a/g/t)-GCTTC，第二組在第18位將T換為C。對于氨基酸序列谷-門冬酰胺-異亮-蘇-門冬-甘，構(gòu)建一組序列為AGC TCC TCC ATC AGT ATT ATT T(c/t)的23核苷酸探針。
用寡核苷酸探針雜交到的噬菌斑，于低密度下重篩選直到純化。在起始的陽性噬菌體克隆通過噬菌斑純化后，Jacobs等發(fā)表了紅血球生成素基因的進(jìn)一步的序列資料(Nature，313806-810，1985)。根據(jù)這一資料構(gòu)建了寡核苷酸，并用于驗(yàn)證陽性克隆，用EcoRI限制性酶酶解陽性克隆，用凝膠電泳純化其插入片段DNA，再用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)連結(jié)入預(yù)先用EcoRI限制性酶解的pUC13質(zhì)粒中。借助雙脫氧核苷酸鏈終止法測定DNA序列(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，745463-5467，1977)，此測定使用dATP(α-35S)和通用的17核苷酸引物，或在選定的區(qū)域使用特殊的寡核苷酸引物進(jìn)行。32P-ATP從ICN獲得，酶從New EnglandBiolabs或Bethesda Research Laboratories獲得。
大約4.8×106個(gè)噬菌體被雙份硝酸纖維素濾膜雜交法篩選。三個(gè)不同的克隆在噬菌斑純化過程中保持陽性，其DNA插入片段作限制圖譜和部分雙脫氧序列測定。三個(gè)克隆中有兩個(gè)顯然含有紅血球生成素基因的全部信息。這些克隆的限制圖譜及其2426個(gè)堿基對的Apa I片段的序列(見圖1)與最近Jacobs等發(fā)表的人紅血球生成素基因序列(Nature，313806-810，1985)基本相同。在這個(gè)增殖的文庫中提出的含有紅血球生成素基因的噬菌體頻度之低-約2×106個(gè)噬菌體中有1個(gè)-與紅血球生成素基因在人染色體基因組中以單拷貝存在的說法相符。用紅血球生成素基因的Apa I片段或其它限制片段與總?cè)巳旧wDNA作Southern吸印雜交，只顯現(xiàn)單一雜交區(qū)帶，沒有其它高度同源的DNA區(qū)域。
實(shí)例2.ApaI限制片段的選擇為構(gòu)建表達(dá)載體，紅血球生成素基因的Apa I限制片段按Proc.Natl.Acad.Sci.USA 745463-5467，1977所述的技術(shù)(特此引證)制備得到。簡言之，提取的噬菌體DNA用限制酶Apa I(Bethesda Research Laboratories)酶解，然后在1％瓊脂糖凝膠上分離，電泳洗脫，酚抽提和乙醇沉淀。此片段通過如實(shí)例1中的部分測序法驗(yàn)證。
參照圖1，插入的Apa I限制片段含有58個(gè)堿基對的5′非翻譯序列(0001-0058核苷酸)，后面是推測的27個(gè)氨基酸的信號肽編碼序列、成熟蛋白、四個(gè)推測的插入序列和222個(gè)堿基對的3′非編碼DNA序列。在基因的5′端，Apa I位點(diǎn)是在蛋白序列的起始密碼子ATG(0058)上游58個(gè)堿基對處。選擇這個(gè)5′端位點(diǎn)(0001)是為了避免緊靠Apa I限制位點(diǎn)上游的一個(gè)假起始點(diǎn)，同時(shí)又保存了被認(rèn)為是對核糖體有效地結(jié)合和加工很重要的調(diào)控序列。選擇3′端的Apa I位點(diǎn)(2426)，以在大多數(shù)3′非翻譯區(qū)保留推測的加工信號，并除去更下游的序列。使用完整的紅血球生成素基因，包括其內(nèi)含子序列，是為了保留在內(nèi)含子中潛在的調(diào)節(jié)和增強(qiáng)子序列，它們可能在紅血球生成素基因的表達(dá)或蛋白質(zhì)的修飾和分泌方面發(fā)揮作用。
實(shí)例3.帶有Apa I限制片段的表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建包含完整的人紅血球生成素基因的2426堿基對的Apa I限制片段被插入兩個(gè)表達(dá)載體pD11和pBD，二者分別基于不同的哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子。
質(zhì)粒表達(dá)載體pD11是從前述的質(zhì)粒衍生的(Nucleic AcidsResearch，13841-857，1985，此處特予引證)，含有猴腎病毒40(SV 40)的增強(qiáng)子序列和復(fù)制起始區(qū)，以及腺病毒2的主要晚期啟動(dòng)子和三重引導(dǎo)序列。人紅血球生成素基因組序列的Apa I片段(圖1)為凝膠純化，單鏈末端用T4 DNA聚合酶補(bǔ)齊，用Bam HI連接子連接二個(gè)平末端，將組建物插入pD11的單一Bam HI限制位點(diǎn)，以從一個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子直接轉(zhuǎn)錄紅血球生成素的基因。
組建的帶有Apa I片段(Ep)的表達(dá)質(zhì)粒pD11-Ep的結(jié)構(gòu)繪如圖2。質(zhì)粒pD11是由PML的EcoRI(RI)位點(diǎn)插入以下成分所構(gòu)成，即含有350堿基對的腺病毒左側(cè)末端(0-1)，SV-40復(fù)制起始區(qū)和增強(qiáng)子序列(E)，腺病毒的主要晚期啟動(dòng)子(MLP)，腺病毒2的三重引導(dǎo)序列(L1-3)，第三個(gè)引導(dǎo)序列的5′拼接位點(diǎn)(5′SS)，免疫球蛋白的3′拼接位點(diǎn)(3′SS)，以及SV-40晚期多聚腺苷酸信號(pA)。重組的質(zhì)粒在E.Coli HB101中克隆，氯化銫等密度離心純化，表達(dá)質(zhì)粒pD11-Ep大約為6500堿基對，構(gòu)建產(chǎn)物為限制圖譜及部分雙脫氧測序法驗(yàn)證。
pBD含有金屬硫蛋白I啟動(dòng)子序列(MT-1，Glanville，Durham and Palmiter，Nature，292267-269，1981特此引證)和帶有二氫葉酸還原酶(DHFR)選擇標(biāo)記序列的pUC質(zhì)粒。參照圖3，此2426堿基對的Apa I限制片段(Ep)插入pBD的唯一SmaI限制位點(diǎn)，形成表達(dá)質(zhì)粒pBD-Ep。pBD-EP的DHFR序列與SV-40的復(fù)制起始序列和增強(qiáng)子序列以及肝炎病毒B表面抗原聚腺苷酸序列相連。pBD-Ep的構(gòu)建基本如上述的pD11-Ep。
雖然在這些確證實(shí)驗(yàn)中使用質(zhì)粒載體，但也設(shè)想了改用病毒或逆病毒表達(dá)載體，以相似的方式將Apa I紅血球生成素基因片段引入寄主細(xì)胞系。適合此目的的DNA病毒包括腺病毒或BPV(牛乳頭狀瘤病毒)，而合適的逆病毒也是已知的和現(xiàn)成的。很清楚這樣的逆病毒(RNA)載體將攜帶Apa I限制片段的反義鏈，即相應(yīng)于圖1的意義鏈的RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物序列，或其等價(jià)物。逆病毒載體亦將包括將病毒基因組反轉(zhuǎn)錄及將病毒DNA整合入寄主基因組所需的跨染色體作用因子的序列。
實(shí)例4.哺乳動(dòng)物細(xì)胞的轉(zhuǎn)染二種哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，各用pD11-Ep和pBD-Ep轉(zhuǎn)染。哺乳動(dòng)物細(xì)胞系COS-7(猴腎)和BHK(幼大鼠腎)保存在含10％胎牛血清的改良Dul becco基本培養(yǎng)基中。細(xì)胞傳代至50-70％融合時(shí)，用磷酸鈣法轉(zhuǎn)染(Virology，52456-467，1973)。BHK系從腎上皮細(xì)胞而來，一般認(rèn)為它們是最可能在哺乳動(dòng)物貧血或缺氧時(shí)產(chǎn)生出天然狀態(tài)紅血球生成素的，因此，這些細(xì)胞有可能識別紅血球生成素Apa I片段上關(guān)鍵性的調(diào)控序列，有效地加工和產(chǎn)生出紅血球生成素糖蛋白。
為做細(xì)胞的臨時(shí)表達(dá)，在100毫米培養(yǎng)皿中加入20微克總DNA，其中10微克帶有紅血球生成素基因的pD11-Ep質(zhì)粒，及10微克載體鮭魚精子DNA，48小時(shí)后，收集上清液，400g離心10分鐘，除去細(xì)胞及顆粒，于-20℃冰凍，細(xì)胞亦分別收集，單獨(dú)用pD11-EP轉(zhuǎn)染臨時(shí)表達(dá)結(jié)果見表1，數(shù)據(jù)是每型細(xì)胞各三次實(shí)驗(yàn)而來。
表1
觀察到的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系COS-7或BHK分泌到上清液中的紅血球生成素，比以前報(bào)導(dǎo)的編碼紅血球生成素cDNA或用整個(gè)紅血球生成素基因作的臨時(shí)表達(dá)都要高約80倍。
為建立產(chǎn)生高水平紅血球生成素的穩(wěn)定細(xì)胞系，COS-7或BHK細(xì)胞用pD11-EP和pDHFR-1a質(zhì)粒同時(shí)轉(zhuǎn)染(后者為包含二氫葉酸還原酶cDNA的相似的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體)。轉(zhuǎn)染步驟改為用5微克pD11-EP質(zhì)粒，5微克pDHFR-1a質(zhì)粒和10微克載體DNA做共同轉(zhuǎn)染，繼續(xù)保溫18-24小時(shí)，然后將不同濃度的氨甲蝶呤(10毫微摩爾/升至1毫摩爾/升)加入培養(yǎng)基。摻入DHFR基因的細(xì)胞在此選擇培養(yǎng)基上成活。當(dāng)保溫?cái)?shù)天后，分離出抗氨甲蝶呤的集落，傳代及篩選上清液中紅血球生成素活力，被檢測的抗氨甲蝶呤的集落中，大約一半分泌有可測得的紅血球生成素活力。
為用表達(dá)載體pBD-EP建立穩(wěn)定的細(xì)胞系，用磷酸鈣法轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞，18-24小時(shí)后，培養(yǎng)基中加入1微摩爾/升至1毫摩爾/升的氨甲蝶呤，培養(yǎng)數(shù)天后，分離出在較高氨甲蝶呤中存活的集落，傳代和篩選，在這一系列中，所有被檢測的抗氨甲蝶呤的集落都分泌有可測得的紅血球生成素的活力。
為了使含有紅血球生成素基因和DHFR基因的轉(zhuǎn)錄單位表達(dá)最適化，將含有pBD-Ep或pD11-EP的分泌高水平紅血球生成素的各BHK細(xì)胞系在濃度遞增的氨甲蝶呤中傳代數(shù)次(Nature，316271-273，1985)。然而，不是通過氨甲蝶呤濃度的小間隔逐步增加對細(xì)胞系施加選擇壓力，而是使這些細(xì)胞立即受到濃度非常高的氨甲蝶呤(即1毫摩爾/升)的挑戰(zhàn)。僅僅極少數(shù)細(xì)胞存活下來，但這些細(xì)胞中質(zhì)粒組建物摻入到DNA中特別有利于表達(dá)的部位(所謂熱點(diǎn))和/或擁有許多組建的轉(zhuǎn)錄單位的復(fù)本。因此，一步就可以選擇到最高產(chǎn)的細(xì)胞系，假若在缺少氨甲蝶呤選擇壓力下傳15代以上，仍保持紅血球生成素的高產(chǎn)，這些細(xì)胞系(包括在表2所列的F7.2和S5.2)可以看做是穩(wěn)定的了。
不能在細(xì)胞顆粒中定量紅血球生成素的活力，因?yàn)榧?xì)胞抽提物中有許多抑制檢測的因子。所以表2所列的結(jié)果只是細(xì)胞系產(chǎn)生和分泌到上清液中的紅血球生成素蛋白，沒有分析胞內(nèi)的紅血球生成素的水平。
表2從穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的BHK細(xì)胞系中表達(dá)的重組紅血球生成素
表2(續(xù))
觀察到的紅血球生成素分泌相當(dāng)于高達(dá)每升七百萬單位的名義產(chǎn)率。這一名義產(chǎn)率是將觀察到的每毫升產(chǎn)量乘一千倍得到的，以給出預(yù)期的大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)每升的產(chǎn)量。
使用Apa I片段所觀察到的紅血球生成素產(chǎn)量，比早先報(bào)道的使用不同的人紅血球生成素基因片段穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的CHO細(xì)胞系得到的產(chǎn)量(Lin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，827580-7584，Nov.1985)高三百倍以上。
這些轉(zhuǎn)染物測定中的對照實(shí)驗(yàn)，包括非轉(zhuǎn)染細(xì)胞的上清液，和用編碼其它蛋白質(zhì)—包括細(xì)菌的氯霉素轉(zhuǎn)乙酰酶和人凝血因子IX-的DNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞平行培養(yǎng)物的上清液，這些對照培養(yǎng)物，模擬的轉(zhuǎn)染或用其它基因轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)細(xì)胞，均無可測得的紅血球生成素活力。也須指出，上述各紅血球生成素基因的實(shí)驗(yàn)中，從選擇出的細(xì)胞系獲得的表達(dá)水平，與伴隨紅血球生成素基因的選擇性標(biāo)記是與之共同感染，還是在感染前先插入含Apa I片段的質(zhì)粒，并無關(guān)系。
適于實(shí)用于此發(fā)明的其它有代表性的感染方法，包括DEAE-葡聚糖中介的轉(zhuǎn)染技術(shù)，溶菌酶融合法或紅細(xì)胞融合法，刮削法，直接攝入法，滲透休克或葡糖休克法，直接微注射或間接微注射法，諸如紅細(xì)胞中介的技術(shù)和/或把宿主細(xì)胞置于電流中等方法。轉(zhuǎn)染是指將遺傳信息，具體地說是將人紅血球生成素基因Apa I限制片段的編碼信息，利用提取的DNA、RNA或合成的核苷酸多聚物轉(zhuǎn)移入細(xì)胞內(nèi)，上面所列的轉(zhuǎn)染技術(shù)并不能算已經(jīng)完善，因?yàn)榘堰z傳信息導(dǎo)入細(xì)胞的其它手段無疑將會(huì)發(fā)展出來。在進(jìn)行轉(zhuǎn)染之前，典型地說，Apa I限制片段通常可以接于(連接到)其它的核酸的序列，諸如啟動(dòng)子，增強(qiáng)子和聚腺苷酸序列。雖然敘述了哺乳動(dòng)物來源的各宿主細(xì)胞系，并特別提到了腎臟上皮細(xì)胞，但也考慮到了本發(fā)明可以使用其它的真核和原核(細(xì)菌或酵母)宿主細(xì)胞系。最近將哺乳動(dòng)物基因引入植物細(xì)胞的成功，提供了利用植物和藻類細(xì)胞的潛在可能性。
實(shí)例5.從轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系表達(dá)紅血球生成素分泌到轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系上清液中的紅血球生成素是有生物活力的，分泌出大量的激素高達(dá)每毫升七千單位。
紅血球生成素活力的體外測定是根據(jù)小鼠骨髓細(xì)胞在血漿凝塊培養(yǎng)基上紅色集落的形成(CFU-E，紅色集落形成細(xì)胞)(BloodCells，489-103，1978)這個(gè)測定的靈敏度約為5毫單位/毫升。作為測定標(biāo)準(zhǔn)的紅血球生成素是由貧血綿羊血漿部分純化得到的制劑(Connaught，第三步的EP，批號3026)，用于測定的是在不含氨甲蝶呤的新鮮培養(yǎng)基上生長24小時(shí)的傳代細(xì)胞系的上清液，每毫升含2×105個(gè)骨髓細(xì)胞、10％加檸檬酸鹽處理的牛血清、20％胎牛血清、1％牛血清白蛋白和1.6％胎牛提取物(Gibco)的測定培養(yǎng)基中，加入1至10微升用培養(yǎng)基按1∶200稀釋的上清液，培養(yǎng)36至48小時(shí)后，血漿凝塊在載玻片上固定，用聯(lián)苯胺做血紅蛋白染色，數(shù)紅細(xì)胞集落的數(shù)目。當(dāng)不加紅血球生成素時(shí)，測不到由CFU-E產(chǎn)生的集落。通常，每毫升培養(yǎng)物用50毫單位的紅血球生成素(0.64毫微克)能夠觀察到最合適的集落生長(每2×104個(gè)骨髓細(xì)胞可測得100-150個(gè)CFU-E)。如表1和表2所示，大量的紅血球生成素激素分泌到轉(zhuǎn)染細(xì)胞系上清液中，高達(dá)每毫升7000單位，假設(shè)重組的紅血球生成素的比活力與天然紅血球生成素等價(jià)(每毫克蛋白質(zhì)78000單位)，此生物測定結(jié)果即相當(dāng)于每毫升大約80微克的紅血球生成素蛋白質(zhì)。
此外，使用多價(jià)的抗人紅血球生成素兔抗血清(J.Cell.physiol.11887-96，1984)做競爭性放射免疫測定，以檢測選擇出的細(xì)胞系上清液中有免疫反應(yīng)活力的紅血球生成素。用放射免疫測定檢測到的蛋白量，與生物檢測估計(jì)的蛋白水平相等。這些數(shù)據(jù)說明轉(zhuǎn)染細(xì)胞系表達(dá)和分泌的紅血球生成素蛋白約98％以上是有活力的。
對轉(zhuǎn)染的細(xì)胞產(chǎn)生的重組紅血球生成素做進(jìn)一步的檢查，以證實(shí)這些細(xì)胞分泌的確是天然的激素，選擇出的細(xì)胞系被用在重度缺氧引起紅細(xì)胞增生的小鼠中做紅血球生成素的體內(nèi)檢測(Nature，1911069-1087，1961)。細(xì)胞系分泌的上清液用重度缺氧引起紅細(xì)胞增生的小鼠檢測，有著強(qiáng)烈的體內(nèi)生物活力。在應(yīng)用部分純化的天然紅血球生成素做的實(shí)驗(yàn)中，早就注意到，當(dāng)在整體動(dòng)物中檢測時(shí)，唾液酸酶的處理可以完全消除紅血球生成素的活力(J.Biol.Chem.2475159-5160，1958)。此活力的喪失推測是由于肝臟對去唾液酸激素的清除增強(qiáng)的結(jié)果，因?yàn)橥僖核崦柑幚淼募t血球生成素在體外檢測可保有其全部活力。所觀察到的體內(nèi)的強(qiáng)烈的生物活力，說明了轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系在轉(zhuǎn)譯后修飾階段，在紅血球生成素蛋白上添加上了適當(dāng)?shù)奶呛湍┒送僖核帷?br> 在分開的實(shí)驗(yàn)中，體外生物檢測到的紅血球生成素的活力，亦為加到培養(yǎng)基中的抗人紅血球生成素抗體所中和。
那些有代表性的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系分泌到上清液中的紅血球生成素，也檢測了它們對其它骨髓祖代細(xì)胞的增生效應(yīng)。檢測重組的紅血球生成素對人和小鼠骨髓來源的各種祖代細(xì)胞的效應(yīng)，包括紅色群落生成細(xì)胞(CFU-E)、紅色突發(fā)形成細(xì)胞(erythroid burst-forvming cells，EFU-E)、粒細(xì)胞—巨噬細(xì)胞前體(CFU-GM)以及混合細(xì)胞群落生成細(xì)胞(CFU-Mix)(J.Cell.Physiol.Suppl.179-85，I982；J.Cell.Phy-siol.11887-96，1984)。紅色干細(xì)胞對重組紅血球生成素顯示的增生效應(yīng)，與對天然紅血球生成素顯示的效應(yīng)有平行的劑量關(guān)系。由對于CFU-GM和CFU-MiX，重組紅血球生成素的濃度增加到每毫升檢測細(xì)胞培養(yǎng)物10個(gè)單位，都不顯示任何增生效應(yīng)。
在還原的或非還原條件下做SDS-PAGE分析時(shí)，純化的重組紅血球生成素與再生障礙貧血病人尿中純化的紅血球生成素電泳情形相同。這些蛋白顯示出同樣的微觀不均一性，其主要成分都在分子量34千道爾頓處。
盡管本發(fā)明與提出的實(shí)施例一起敘述，普通專門技術(shù)人員在閱讀了上述實(shí)例后將能夠做出各種修改，使用等價(jià)物取代，或?qū)ι厦嫣岬降慕M分和方法做其它的更改。因此，我們打算把這一專利證書的保護(hù)范圍僅僅由所附的權(quán)利要求及其等價(jià)部分所定義的內(nèi)容加以限制。
權(quán)利要求
1.基本上由人基因組紅細(xì)胞生成素基因Apa I 2.4kb限制片段組成的重組DNA。
2.權(quán)利要求1的重組DNA，具有圖1A和1B所示的核苷酸序列。
3.含有基本上由人基因組紅細(xì)胞生成素基因Apa I 2.4kb限制片段組成的插入片段的重組DNA構(gòu)建體。
4.由權(quán)利要求3的重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的真核宿主細(xì)胞。
5.權(quán)利要求4的真核宿主細(xì)胞，其為哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
6.權(quán)利要求5的真核宿主細(xì)胞，其為幼倉鼠腎細(xì)胞。
7.基本上由相應(yīng)于人紅細(xì)胞生成素基因Apa I限制片段的核苷酸序列組成的基本上純化的DNA或RNA。
8.權(quán)利要求7的DNA或RNA，其中Apa I限制片段基本上由圖1所示核苷酸序列的有義鏈或其互補(bǔ)RNA序列組成。
9.與能夠?qū)崿F(xiàn)其表達(dá)的第二核酸序列有效連接的權(quán)利要求7的DNA或RNA序列。
10.權(quán)利要求9的DNA或RNA，其中第二核酸序列選自以下一個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子序列、增強(qiáng)子序列、聚腺苷?；蛄?、可選擇標(biāo)記序列、質(zhì)粒、病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體和逆轉(zhuǎn)錄病毒反式作用因子。
11.含有權(quán)利要求9的DNA或RNA的細(xì)胞。
12.權(quán)利要求11的細(xì)胞，其中細(xì)胞用所述DNA或RNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。
13.權(quán)利要求12的細(xì)胞，其中細(xì)胞選自真核細(xì)胞和細(xì)菌。
14.權(quán)利要求13的細(xì)胞，其中真核細(xì)胞是酵母細(xì)胞。
15.權(quán)利要求13的細(xì)胞，其中真核細(xì)胞是腎來源的。
16.權(quán)利要求15的細(xì)胞，其中腎細(xì)胞是上皮細(xì)胞。
17.由權(quán)利要求1的方法制備的、具有紅細(xì)胞生成調(diào)節(jié)活性的糖蛋白。
全文摘要
一種表達(dá)重組人紅血球生成素的方法，包括用主要含有人紅血球生成素基因的2.4kb Apa I限制片段的DNA、RNA或核苷酸序列轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，使轉(zhuǎn)染細(xì)胞與培養(yǎng)基相接觸，表達(dá)并回收紅血球生成素。以及一種通過與保溫的培養(yǎng)基接觸的細(xì)胞系表達(dá)重組人紅血球生成素的方法，包括在所說的方法中加入能在保溫培養(yǎng)基中產(chǎn)生紅血球生成素的細(xì)胞系，所說的細(xì)胞系通過用主要含有人紅血球生成素基因的2.4kb Apa I限制片段的DNA、RNA或核苷酸序列轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞系產(chǎn)生。
文檔編號C12N15/27GK101041819SQ20061010068
公開日2007年9月26日 申請日期1987年6月26日 優(yōu)先權(quán)日1986年6月27日
發(fā)明者杰里·S·鮑威爾 申請人:華盛頓大學(xué)評議會(huì)