專利名稱：適用于哺乳動(dòng)物表達(dá)的人源化mfat1基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種人源化的mfatl基因。
背景技術(shù)：
Omega-3 多不飽 和脂肪酸(omega_3polyunsaturated fatty acids, n_3PUFAs ;又稱n_3, ω-3),是人體生長(zhǎng)和健康所必需的物質(zhì),屬于18-24碳脂肪酸家族,其碳鏈上具有3個(gè)以上的雙鍵，依照第一個(gè)雙鍵距離甲基端碳原子不同分為η-3系、η-6系、η-7系、η_9系(即η編號(hào)系統(tǒng)，也叫ω編號(hào)系統(tǒng))，n-3PUFAs是指從脂肪酸碳鏈甲基端算起，第一個(gè)雙鍵位于第3位碳原子上的多不飽和脂肪酸，屬于亞麻酸類。由于哺乳類細(xì)胞不具有能增加雙鍵到第9位原子后的酶，因此，n-3PUFAs是人體必需氨基酸，是細(xì)胞膜磷脂的主要成分，在體內(nèi)不能合成，必須從食物中提供。n_3PUFAs 主要包括 α -亞麻酸(a-1inolenic acid, ALA, 18:3η_3), 二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid, EPA, 20: 5n_3), 二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA，22:6n-3)。ALA多來(lái)自植物油，如亞麻籽、核桃仁及其他種子油，EPA和DHA主要來(lái)自魚(yú)油，這些成分由于體內(nèi)不能合成，只能從食物中攝取，因此，被稱為“必需”脂肪酸(essential fatty acid, EFA)。其中α -亞麻酸作為n_3多不飽和脂肪酸的前體,在體內(nèi)經(jīng)去飽和與延長(zhǎng)反應(yīng)，生成EPA或DHA等η-3多不飽和脂肪酸，人體內(nèi)無(wú)催化n_6PUFAs向n-3PUFAs轉(zhuǎn)化的n_3多不飽和脂肪酸脫氫酶。目前n_3PUFAs主要從魚(yú)油中獲取，但提煉工藝復(fù)雜且產(chǎn)率低。來(lái)源于秀_線蟲(chóng)(Caenorhabditis elegans)的n_3多不飽和脂肪酸脫氫酶基因(fat-Ι)，其編碼產(chǎn)物是η-3多不飽和脂肪酸脫氫酶，可以n-6PUFAs為優(yōu)先底物，使其脫氫轉(zhuǎn)化為n-3PUFAs。目前，η-3多不飽和脂肪酸(n_3PUFA)主要成果在心血管方面的研究。它具有降低血脂，改變血液流變學(xué)，抑制血小板聚集和血栓形成，抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成等作用(Kobayashi M, Sasaki S，Hamada GS.et al.Serum n_3fatty acids, fishconsumption and cancer mortality in six Japanese populations in Japan andBrazil.J Cancer Res.1999;90(9):914-21.Saadatian-Elahi M, Toniolo P, Ferrari P.etal.Serum fatty acids and risk of breast cancer in a nested case—control studyof the New York University Women's Health Study.Cancer Epidemiol BiomarkersPrev.2002;11 (11):1353-60)隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)n-3PUFA還具有抗腫瘤功能，并且越來(lái)越重視其抗腫瘤作用(Barber MD, Ross JA, Preston T, et al.Fish oil-enriched nutritionalsupplement attenuates progression of the acute—phase response in weight-losingpatients with advanced pancreatic cancer.J Nutr.1999; 129(6): 1120-5)。人體血液中的脂肪酸含量測(cè)定研究顯示，血液中n-3PUFAs水平和前列腺癌發(fā)病率成反比關(guān)系(PrattVC, Watanabe S，Bruera E, et al.Plasma and neutrophil fatty acid compositionin advanced cancer patients and response to fish oil supplementation.Br JCancer.2002，87 (12): 1370-1378)。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，n_3PUFAs可以通過(guò)多種途徑抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡(Stoll BA.N-3fatty acids and lipid peroxidation inbreast cancer inhibition.Br J Nutr.2002, 87(3):193-198.Palakurthi SS, FluckigerR, Aktas H, et al.1nhibition of translation initiation mediates the anticancereffect of the n-3polyunsaturated fatty acid eicosapentaenoic acid.CancerRes.2000,60(11): 2919-2925)?；谶@些數(shù)據(jù)，我們對(duì)fat I基因進(jìn)行了改造，得到mfatl基因，以使該基因能夠在哺乳動(dòng)物中高效表達(dá)。我們預(yù)期在哺乳動(dòng)物中表達(dá)人源化的mfatl基因，可有效提聞各種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的品質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種人源化的可以在哺乳動(dòng)物中高效表達(dá)的mfatl基因。本發(fā)明序列如SEQ ID No:1所示。上述適用于哺乳動(dòng)物表達(dá)的人源化mfatl基因在提高轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物品質(zhì)中的應(yīng)用。其中，所述的哺乳動(dòng)物為小鼠。其中，所述的提聞轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物品質(zhì)，為人源化mfatl基因在哺乳動(dòng)物體內(nèi)完成轉(zhuǎn)化為Omega-3多不飽和脂肪酸的功能；在胰島組織中提高胰島細(xì)胞分泌胰島素的水平；提高胰島細(xì)胞抵抗細(xì)胞因子誘導(dǎo)的凋亡能力。有益效果:本發(fā)明的人源化mfatl基因可以用于在哺乳動(dòng)物中表達(dá)，同時(shí)在體內(nèi)完成轉(zhuǎn)化為Omega-3多不飽和脂肪酸的`功能，在胰島組織中可以有效提高胰島細(xì)胞分泌胰島素的水平，另外，可以提高胰島細(xì)胞抵抗細(xì)胞因子誘導(dǎo)的凋亡能力。


圖1是本發(fā)明實(shí)施例中構(gòu)建的pST181轉(zhuǎn)基因載體的示意圖。圖2是mfatl轉(zhuǎn)基因和野生型對(duì)照小鼠分別分離胰島組織后，用不同濃度的葡萄糖和lOnmol/Ι的胰高血糖素樣肽_1共同處理30分鐘，測(cè)量胰島素分泌水平。結(jié)果顯示在葡萄糖和胰高血糖素樣肽-1刺激下，mfatl轉(zhuǎn)基因小鼠的胰島有更高水平的胰島素分泌。圖3是mfatl轉(zhuǎn)基因和野生型對(duì)照小鼠分別分離胰島組織，然后用1.lmmol/1的葡萄糖以及10mmol/l亮氨酸和10mmol/l谷氨酸鹽處理60分鐘,對(duì)照是僅用1.lmmol/1的葡萄糖處理，測(cè)定胰島素分泌水平。結(jié)果顯示在葡萄糖，亮氨酸和谷氨酸鹽刺激下，mfatl轉(zhuǎn)基因小鼠的胰島有更高水平的胰島素分泌。圖4是mfatl轉(zhuǎn)基因和野生型對(duì)照小鼠分別分離胰島組織，用10 μ mol/1前列腺素E2 (PGE2)預(yù)處理，之后分別用50ng/ml百日咳毒素(PTX)處理，沒(méi)有百日咳毒素處理的作為對(duì)照，然后研究葡萄糖刺激的胰島素分泌水平。結(jié)果顯示mfatl轉(zhuǎn)基因小鼠的胰島組織分泌更多的胰島素。圖5是細(xì)胞因子誘導(dǎo)的凋亡測(cè)試。從mfatl轉(zhuǎn)基因小鼠和對(duì)照野生型小鼠分離的胰島用細(xì)胞因子處理48小時(shí)，然后用熒光共聚焦顯微鏡分析。結(jié)果顯示mfatl轉(zhuǎn)基因小鼠可以明顯抑制細(xì)胞因子誘導(dǎo)的凋亡。
圖6是細(xì)胞因子誘導(dǎo)的凋亡測(cè)試的定量統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果顯示mfatl轉(zhuǎn)基因小鼠可以明顯抑制細(xì)胞因子誘導(dǎo)的凋亡。
具體實(shí)施例方式根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的內(nèi)容僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。實(shí)施例1:pST181質(zhì)粒的構(gòu)建。首先根據(jù)線蟲(chóng)fatl基因的cDNA序列，根據(jù)哺乳動(dòng)物核苷酸使用頻率進(jìn)行優(yōu)化，合成了在哺乳動(dòng)物中高效表達(dá)fatl的cDNA序列(由Geneart合成)，命名為mfatl,這種能廣泛在小鼠中表達(dá)fatl的轉(zhuǎn)基因片段包含有1.7kb的CMV聯(lián)合雞β-肌動(dòng)蛋白(CMV-chicken- β -actin promoter)基因的啟動(dòng)子、肌肉肌酸激酶增強(qiáng)子muscle creatinekinase (MCK) enhancer,小鼠fatl基因的cDNA(哺乳動(dòng)物mfat-lcDNA,其編碼區(qū)經(jīng)優(yōu)化以后在哺乳動(dòng)物細(xì)胞體系中具有有效的翻譯)和牛生長(zhǎng)激素基因(bGH)的3’端不翻譯區(qū)，且?guī)в胁溉閯?dòng)物細(xì)胞中篩選用 的抗性基因新霉素(Neomycin)基因和原核細(xì)胞中篩選用的抗性基因一氨芐青霉素(ampicillin)基因(見(jiàn)圖1)。這種能廣泛性表達(dá)的β-骨骼肌肌動(dòng)蛋白(CMV-chicken-β -actin promoter)基因的啟動(dòng)子可保證下游基因廣泛性表達(dá)。本發(fā)明構(gòu)建的全身性表達(dá)mfatl的轉(zhuǎn)基因載體的全序列如SEQ ID No:1所示，其中586-2285堿基為基因的啟動(dòng)子區(qū)，第317-533堿基為MCK enhancer，第2286-3516堿基為mfatl基因的編碼區(qū)，第3572-3796堿基為bGH3’端不翻譯區(qū)，第4275-5778堿基為新霉素(Neomycin)抗性基因，第6972-7971堿基為氨芐青霉素(Ampicillin)抗性基因。實(shí)施例2:利用原核注射的方法構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠并進(jìn)行鑒定。將構(gòu)建好的pST181轉(zhuǎn)基因載體，用Bgl II和Rsr II限制性內(nèi)切酶酶切，回收所需片斷，通過(guò)原核注射的方法直接注入受精卵，使外源基因整合到DNA中，然后將受精卵植入4-5周齡的代孕C57BL/6母鼠體內(nèi)。提取mfat-1轉(zhuǎn)基因小鼠尾部的基因組，利用PCR引物進(jìn)行擴(kuò)增，進(jìn)行基因型鑒定。正向引物為:5’ -GGACCTTGGTGAAGAGCATCCG-3，，反向引物為:5’ -GCGTCGCAGAAGCCAAAC-3 ’。得到的438bp的片段為陽(yáng)性片斷。實(shí)施例3:mfat-l轉(zhuǎn)基因小鼠的表型功能分析。1.小鼠體內(nèi)組織的脂肪酸測(cè)定，mfatl轉(zhuǎn)入小鼠體內(nèi)，可以有效地將小鼠體內(nèi)0mega-6多不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化為Omega-3多不飽和脂肪酸。提取小鼠鼠尾和胰島組織的脂肪酸，通過(guò)氣象色譜的方法測(cè)定小鼠鼠尾和胰島組織中不飽和脂肪酸含量，發(fā)現(xiàn)實(shí)施例2制得的轉(zhuǎn)基因小鼠的鼠尾和胰島組織較野生型對(duì)照小鼠相比，含有更高水平的Omega-3多不飽和脂肪酸，和較低水平的Omega-6多不飽和脂肪酸。如表I所示。表I是本發(fā)明實(shí)施例3中，轉(zhuǎn)基因小鼠和對(duì)照野生型小鼠鼠尾和胰島組織的脂肪酸測(cè)定結(jié)果，mfatl轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型對(duì)照組小鼠分別取用50mg的尾巴組織和200個(gè)胰島。結(jié)果說(shuō)明將mfatl轉(zhuǎn)入小鼠體內(nèi)，可以有效地將小鼠體內(nèi)的0mega-6多不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化為Omega-3多不飽和脂肪酸。
表權(quán)利要求
1.適用于哺乳動(dòng)物表達(dá)的人源化mfatl基因，其全序列如SEQID No:l所示。
2.權(quán)利要求1所述的適用于哺乳動(dòng)物表達(dá)的人源化mfatl基因在提高轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物品質(zhì)中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的哺乳動(dòng)物為小鼠。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的提高轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物品質(zhì)，為人源化mfatl基因在哺乳動(dòng)物體內(nèi)完成轉(zhuǎn)化為Omega-3多不飽和脂肪酸的功能；在胰島組織中提高胰島細(xì)胞分泌胰島素 的水平；提高胰島細(xì)胞抵抗細(xì)胞因子誘導(dǎo)的凋亡能力。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種適用于哺乳動(dòng)物表達(dá)的人源化mfat1基因，其全序列如SEQ ID No1所示。本發(fā)明還公開(kāi)了上述人源化mfat1基因在提高轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物品質(zhì)中的應(yīng)用。本發(fā)明的人源化mfat1基因可以在哺乳動(dòng)物中高效表達(dá)，從而可以有效改善轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的品質(zhì)。
文檔編號(hào)C12N15/12GK103074347SQ20131002591
公開(kāi)日2013年5月1日 申請(qǐng)日期2013年1月23日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月23日
發(fā)明者戴一凡 申請(qǐng)人:南京華貞生物醫(yī)藥科技有限公司