穩(wěn)定高表達(dá)os-9的細(xì)胞株的構(gòu)建方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種穩(wěn)定高表達(dá)OS-9的細(xì)胞株的 構(gòu)建方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 腸粘膜屏障是機(jī)體防御的重要屏障，可防止腸腔內(nèi)致病性抗原（細(xì)菌、有毒物質(zhì)、 食物抗原物質(zhì)、致癌物質(zhì)等）侵入，使機(jī)體內(nèi)環(huán)境保持相對(duì)穩(wěn)定，維持機(jī)體的正常生命活 動(dòng)。
[0003] 腸上皮細(xì)胞間的緊密連接蛋白是構(gòu)成腸粘膜屏障的重要組成部分。一旦緊密連接 蛋白受到破壞，腸上皮細(xì)胞間通透性便增加，細(xì)菌、內(nèi)毒素和大分子物質(zhì)就可通過(guò)緊密連 接蛋白進(jìn)入體循環(huán)，參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展。
[0004] 大量研宄表明在燒傷、創(chuàng)傷、大型手術(shù)等外科應(yīng)激條件下，會(huì)引起腸道的急性缺 氧，從而導(dǎo)致腸粘膜屏障功能障礙，造成腸源性感染，進(jìn)一步加重原發(fā)疾病，誘發(fā)全身炎癥 反應(yīng)綜合征，導(dǎo)致多臟器功能衰竭，甚至危及生命。
[0005] 骨肉瘤蛋白（os-9)是在人體組織廣泛表達(dá)的一種蛋白，但其功能尚不完全明確。 目前對(duì)os-9的研宄主要集中于它從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)一些膜蛋白，以及在缺氧條件 下調(diào)節(jié)缺氧誘導(dǎo)因子。然而〇s-9在表達(dá)的過(guò)程中，其可能會(huì)伴隨著一系列的刺激和誘導(dǎo)作 用，并促使一些未知蛋白（包括一些對(duì)機(jī)體防御功能有利的蛋白）表達(dá)量提高；因此通過(guò)研 宄〇s-9的表達(dá)狀態(tài)，進(jìn)一步地探宄其對(duì)其他對(duì)機(jī)體防御功能具有幫助的功能性蛋白的表 達(dá)情況為人們對(duì)疾病治療和防御開(kāi)辟了新的路徑。
[0006] 然而，目前還未見(jiàn)有通過(guò)os-9過(guò)表達(dá)探宄腸粘膜屏障保護(hù)作用的相關(guān)報(bào)道，因此 提供一種穩(wěn)定高表達(dá)OS-9的細(xì)胞株的構(gòu)建方法并進(jìn)行應(yīng)用是人們亟需解決的一個(gè)技術(shù)問(wèn) 題。
[0007] 有鑒于此，特提出本發(fā)明。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的第一目的在于提供一種穩(wěn)定高表達(dá)OS-9的細(xì)胞株的構(gòu)建方法，該方法 實(shí)現(xiàn)了高表達(dá)OS-9的細(xì)胞株的構(gòu)建，為通過(guò)研宄OS-9高表達(dá)探宄對(duì)機(jī)體防御功能具有幫 助的功能性蛋白的表達(dá)情況提供了實(shí)驗(yàn)材料。
[0009] 本發(fā)明的第二目的在于提供上述的表達(dá)OS-9的細(xì)胞株的構(gòu)建方法構(gòu)建成的細(xì)胞 株的用途。
[0010] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：
[0011] 一種穩(wěn)定高表達(dá)os-9的細(xì)胞株的構(gòu)建方法，包括將plenti6. 3載體和OS-9基因 連接，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌；將轉(zhuǎn)后的大腸桿菌進(jìn)行質(zhì)粒提取，獲得Plenti6. 3-OS-9質(zhì) 粒；以所述plenti6. 3-OS-9質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，收獲病毒液，并以所述病毒液感染Caco-2 細(xì)胞后篩選出陽(yáng)性克隆，培養(yǎng)10-15天后，獲得穩(wěn)定高表達(dá)OS-9的細(xì)胞株。
[0012] 該方法構(gòu)建的細(xì)胞株，其能夠?qū)崿F(xiàn)OS-9的過(guò)表達(dá)，進(jìn)而為在研宄OS-9過(guò)表達(dá)過(guò)程 中，其他功能蛋白表達(dá)狀態(tài)提供了良好的實(shí)驗(yàn)材料，而且該細(xì)胞株表達(dá)OS-9穩(wěn)定，可很好 地用于定量和定性檢測(cè)OS-9高表達(dá)狀態(tài)下相關(guān)蛋白的表達(dá)狀態(tài)；此外，該構(gòu)建方法由于載 體、供體細(xì)胞以及宿主細(xì)胞等選擇合理，進(jìn)而使得穩(wěn)定高表達(dá)OS-9的細(xì)胞株易于獲得，且 獲得的細(xì)胞株性能穩(wěn)定，易于貯存。
[0013] 可選的，該構(gòu)建方法具體包括以下步驟：
[0014] 1)、提取傳代培養(yǎng)后Caco-2細(xì)胞的mRNA，并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到CDNA;
[0015] 2)、以所述cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增、電泳以及切膠回收，得到全長(zhǎng)OS-9基因；
[0016] 3)、將所述全長(zhǎng)OS-9基因酶切后與plenti6. 3載體進(jìn)行連接，并導(dǎo)入DH5a感受 態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到轉(zhuǎn)化后DH5a;
[0017] 4)、對(duì)轉(zhuǎn)化后DH5a進(jìn)行質(zhì)粒提取，獲得Plenti6. 3-OS-9質(zhì)粒；
[0018] 5)、以所述plenti6. 3-OS-9質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，收獲病毒液，并以所述病毒液感 染Caco-2細(xì)胞后篩選出陽(yáng)性克隆，培養(yǎng)10-15天后，獲得穩(wěn)定高表達(dá)OS-9的細(xì)胞株。
[0019] 可選的，在步驟2)中，所述PCR擴(kuò)增的過(guò)程中，所用的引物包括上游擴(kuò)增引物、下 游擴(kuò)增引物以及中間缺失拼接引物；
[0020] 其中，所述上游引物的序列如SEQIDNO: 1-SEQIDNO:2所示；所述下游擴(kuò)增引 物如SEQIDNO:3-SEQIDNO:4所示；所述中間缺失拼接引物的序列如SEQIDNO:5-SEQ IDNO:12 所示。
[0021] 通過(guò)特定序列的引物，以實(shí)現(xiàn)不同位置OS-9基因片段的擴(kuò)增，上述所舉幾種引 物，由于酶切位點(diǎn)設(shè)置合理，同時(shí)序列選擇得當(dāng)，非常便于全長(zhǎng)0S-9序列的擴(kuò)增以及后續(xù) 連接反應(yīng)的順利進(jìn)行。
[0022] 可選的，在步驟2)中，所述PCR擴(kuò)增具體包括如下步驟：
[0023] 以所述cDNA為模板，分別以上游引物、下游引物和中間缺失拼接引物進(jìn)行擴(kuò)增， 獲得3個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0024] 以3個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，以如SEQIDNO:1和如SEQIDNO:4所示序列為引物，進(jìn) 行擴(kuò)增。
[0025] 以不同的引物，通過(guò)擴(kuò)增獲得不同的目的片段，具體的，引物SEQIDN0:1和SEQ IDNO:2擴(kuò)增上游1. 6kb目的片段（退火溫度選擇60°C);引物SEQIDNO:3和SEQID NO:4擴(kuò)增下游260bp片段（退火溫度選擇50°C);引物SEQIDNO:5-SEQIDNO:12基因 拼接中間缺失的165bp片段（退火溫度55°C)。
[0026] 然后以上面三個(gè)PCR產(chǎn)物做模板，用引物SEQIDNO: 1和如SEQIDNO:4,擴(kuò)增全 長(zhǎng)0S-9,目的片段2k。該方式可快速有效地獲得全長(zhǎng)0S-9基因。
[0027] 可選的，在步驟3)中，所述酶切反應(yīng)的體系為：PacI0. 8-1. 2y1，Pmel 0? 8-1. 2y1，lOXbuffer1. 8-2. 2y1，0S-9 基因 1. 8-2. 2yg，ddH20 補(bǔ)至 20y1〇
[0028] 在上述的酶切反應(yīng)體系中，由于反應(yīng)體系設(shè)置合理，因此可以實(shí)現(xiàn)順利酶切效果， 從而便于后續(xù)與plenti6. 3載體順利連接。
[0029] 可選的，在步驟3)中，所述連接的過(guò)程中采用T4DNA連接酶，且反應(yīng)溫度為 15-17。。。
[0030] 在該溫度下，T4DNA連接酶具有較好的連接效果，可以實(shí)現(xiàn)大量的0S-9基因與 plenti6. 3載體連接。
[0031] 可選的，在步驟5)中，具體包括：
[0032] a)、將plenti6. 3-OS-9質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒等量混合，得到稀釋后plenti6. 3-OS-9質(zhì) 粒；
[0033]b)、將所述稀釋后plenti6. 3-OS-9質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑Lipo2000混合后孵育15-25 分鐘，得到DNA與轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物；
[0034]c)、將所述DNA與轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物滴加到293T細(xì)胞培養(yǎng)液中，于36-38°C、4-6%的 C02的條件下分段培養(yǎng)90-100小時(shí)后，咼心，過(guò)濾，得到病毒液；
[0035]d)、將所述病毒液接種于含有Caco-2細(xì)胞的培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，并在培養(yǎng)液中加 入殺稻瘟菌素，每隔兩天換液一次，并加入新的殺稻瘟菌素，持續(xù)培養(yǎng)10-15天獲得穩(wěn)定高 表達(dá)OS-9的細(xì)胞株。
[0036] 可選的，在步驟c)中，所述離心的轉(zhuǎn)速為2800-3200轉(zhuǎn)/分鐘，時(shí)間為10-20分鐘； 所述過(guò)濾的過(guò)程中，濾徑為0. 4-0. 5微米。
[0037] 所述的構(gòu)建方法在制備降低對(duì)腸粘膜通透性破壞或提高腸上皮細(xì)胞中的緊密連 接蛋白表達(dá)量的藥物中的應(yīng)用。
[0038] 所述的構(gòu)建方法通過(guò)提高claudin-1和occludin表達(dá)量，增強(qiáng)腸粘膜屏障功能中 的應(yīng)用。
[0039] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：
[0040] (1)、通過(guò)本發(fā)明的構(gòu)建方法構(gòu)建的高表達(dá)0S-9的細(xì)胞株，其生化性能穩(wěn)定，能夠 實(shí)現(xiàn)0S-9過(guò)表達(dá)，極大的方便了在研宄0S-9過(guò)表達(dá)的狀態(tài)下，其他功能性蛋白的表達(dá)情 況，為0S-9過(guò)表達(dá)與其他功能性蛋白表達(dá)的關(guān)系的相關(guān)研宄提供了理想的實(shí)驗(yàn)材料。
[0041](2)、該高表達(dá)0S-9的細(xì)胞株，可通過(guò)westernblot、免疫焚光等操作進(jìn)行相關(guān)蛋 白的定量和定性。
[0042](3)、該構(gòu)建方法在獲取全長(zhǎng)0S-9基因的過(guò)程中，對(duì)于引物進(jìn)行特定的選擇，而且 在PCR的過(guò)程中，用不同的引物擴(kuò)增，獲取不同目的片段，然后再以所獲的目的片段為模板 再次擴(kuò)增，非常利于全長(zhǎng)0S-9基因的獲取。
[0043] (4)、該細(xì)胞株在高表達(dá)0S-9的過(guò)程中，其可明顯提高緊密連接蛋白（claudin-1 和occludin)的表達(dá)量，而且還可降低對(duì)腸粘膜通透性的破壞，因此用于制備降低對(duì)腸粘 膜通透性破壞或提高腸上皮細(xì)胞中的緊密連接蛋白表達(dá)量的藥物中，以預(yù)防和治療腸粘膜 疾病。
【附圖說(shuō)明】
[0044] 為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，以下將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹。
[0045] 圖1為本發(fā)明應(yīng)用例1中0S-9過(guò)表達(dá)細(xì)胞株在正常條件和缺氧條件對(duì)緊密連接 蛋白claudin-1和occludin的蛋白表達(dá)圖。
[0046] 其中，A為western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果，B圖為western blot結(jié)果的定量統(tǒng)計(jì)分析；
[0047] 圖2為本發(fā)明應(yīng)用例2中，免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示0S-9過(guò)表達(dá)對(duì)緊密連接蛋白的 上調(diào)的結(jié)果圖；
[0048] 圖3為本發(fā)明提供的高表達(dá)OS-9的細(xì)胞株與腸上皮細(xì)胞跨上皮電阻檢測(cè)腸粘膜 屏障通透性關(guān)系檢測(cè)結(jié)果圖；
[0049] 圖4為本發(fā)明實(shí)施例5提供的高表達(dá)OS-9的細(xì)胞株的倒置熒光顯微鏡觀測(cè)以及 os-9表達(dá)結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0050] 下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì) 理解，下列實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體 條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為 可以通過(guò)市售購(gòu)買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0051] 本發(fā)明提供了一種穩(wěn)定高表達(dá)OS-9的細(xì)胞株的構(gòu)建方法，包括：將plenti6. 3 載體和OS-9基因連接，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌；將轉(zhuǎn)后的大腸桿菌進(jìn)行質(zhì)粒提取，獲得 plenti6. 3-OS-9質(zhì)粒；以所述plenti6. 3-OS-9質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，收獲病毒液，并以所述 病毒液感染Caco-2細(xì)胞后篩選出陽(yáng)性克隆，培養(yǎng)10-15天后，獲得穩(wěn)定高表達(dá)OS-9的細(xì)胞 株。
[0052] 該方法構(gòu)建的細(xì)胞株，其能夠?qū)崿F(xiàn)OS-9的過(guò)表達(dá)，進(jìn)而為在研宄OS-9過(guò)表達(dá)過(guò)程 中，其他功能蛋白表達(dá)狀態(tài)提供了良好的實(shí)驗(yàn)材料，而且該細(xì)胞株表達(dá)OS-9穩(wěn)定，可很好 地用于定量和定性檢測(cè)OS-9高表達(dá)狀態(tài)下相關(guān)蛋白的表達(dá)狀態(tài)；此外，該構(gòu)建方法由于載 體、供體細(xì)胞以及宿主細(xì)胞等選擇合理，進(jìn)而使得獲得穩(wěn)定高表達(dá)OS-9的細(xì)胞株的過(guò)程易 于實(shí)現(xiàn)，而且獲得的細(xì)胞株性能穩(wěn)定，易于貯存。
[0053] 接下來(lái)，結(jié)合以上的內(nèi)容，對(duì)本發(fā)明的穩(wěn)定高表達(dá)OS-9的細(xì)胞株構(gòu)建方法舉出以 下具體的實(shí)施例。
[0054] 實(shí)施例1
[0055] SI1 :提取傳代培養(yǎng)后Caco-2細(xì)胞的mRNA，并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到cDNA;
[0056] S12 :以所述cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增、電泳以及切膠回收，得到全長(zhǎng)OS-9基因；
[0057] PCR擴(kuò)增的過(guò)程中，所用的引物包括上游擴(kuò)增引物、下游擴(kuò)增引物以及中間缺失拼 接引物；
[0058] 其中，所述上游引物的序列如SEQIDNO: 1-SEQIDNO:2所示；所述下游擴(kuò)增引 物SEQIDN0:3-SEQIDN0:4所述；所述中間缺失拼接引物的序列如SEQIDN0:5-SEQID NO: 12所示。
[0059] 另外，在擴(kuò)增的過(guò)程中，以所述cDNA為模板，分別以上游引物、下游引物和中間缺 失拼接引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得3個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0060] 以3個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，以如SEQIDNO:1和如SEQIDNO:4所示序列為引物，進(jìn) 行擴(kuò)增。
[0061] S13 :將所述全長(zhǎng)0S-9基因酶切后與plenti6. 3載體進(jìn)行連接，并導(dǎo)入DH5a感受 態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到轉(zhuǎn)化后DH