一種三陰性乳腺癌順鉑耐藥細(xì)胞株及其制備方法和用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種乳腺癌耐藥細(xì)胞株，尤其涉及一種 三陰性乳腺癌順鉑耐藥細(xì)胞株及其制備方法和用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，據(jù)統(tǒng)計，全球每年乳腺癌的發(fā)病人數(shù)約有 120萬人，約50萬人死于乳腺癌。隨著對乳腺癌的研宄不斷深入，目前認(rèn)為乳腺癌是一種 高度異質(zhì)性腫瘤，不同的病理特點和分子特征導(dǎo)致其對治療的反應(yīng)和預(yù)后明顯不同。臨床 上根據(jù)免疫組化檢測的雌激素受體（estrogenreceptor，ER)、孕激素受體（progesterone receptor，PR)、人表皮生長因子受體 2(humanepidermalgrowthfactorreceptor-2， HER-2)、Ki67等的結(jié)果將乳腺癌分為不同的分子亞型，其中ER、PR、HER-2表達(dá)均陰性者被 稱為三陰性乳腺癌（triplenegativebreastcancer，TNBC)。該類乳腺癌患者無法從常 規(guī)內(nèi)分泌治療和針對HER-2陽性的靶向治療中獲益，化療成為其主要的全身治療手段。但 是該型乳腺癌對化療藥物雖然敏感卻容易產(chǎn)生耐藥，化療耐藥的出現(xiàn)對TNBC患者的預(yù)后 影響重大。近年來，腫瘤耐藥細(xì)胞株已成為重要的研宄工具，許多研宄者利用它來揭示腫瘤 細(xì)胞的耐藥機(jī)制、研宄腫瘤細(xì)胞的耐藥性逆轉(zhuǎn)、開發(fā)及評價新的抗癌方法等，建立腫瘤耐藥 細(xì)胞株具有重要應(yīng)用價值。
[0003] 雖然目前TNBC的輔助化療仍采用以紫衫類、蒽環(huán)類以及環(huán)磷酰胺為基礎(chǔ)的化療 方案，但自2006年Garber在SABCS會議上首次發(fā)表了使用單藥順鉑治療TNBC可達(dá)到50 % 的客觀緩解率（objectiveresponserate，0RR)和 22% 的病理完全緩解（pathological completeresponse，pCR)起，鉬類藥物用于TNBC的越來越成為研宄熱點。目前研宄認(rèn)為 鉑類藥物作用于TNBC的機(jī)制在于：三陰性乳腺癌存在一定的DNA損傷修復(fù)障礙，而鉑類藥 物可以與雙鏈DNA交聯(lián)，阻滯DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡，因此三陰性乳腺癌對鉑 類藥物敏感性較高。臨床研宄也證明接受含鉑方案新輔助及輔助化療的乳腺癌患者的pCR 和cDR在TNBC患者均顯著高于非TNBC者。此外，由于含蒽環(huán)和紫杉類藥物的方案在新輔 助治療或術(shù)后輔助治療中的應(yīng)用，使得患者在疾病復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移時常常對其已經(jīng)耐藥，因此鉑 類藥物也是三陰性乳腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移治療的有效選擇。
[0004]MDA-MB-231細(xì)胞是乳腺癌細(xì)胞株，是從一名51歲的白人女性乳腺癌患者的胸水 中分離建立的。經(jīng)免疫組化鑒定該細(xì)胞株ER、PR、Her-2均為陰性，屬于三陰性乳腺癌細(xì) 胞株。該細(xì)胞株是目前研宄乳腺癌，特別是三陰性乳腺癌十分常用的一種細(xì)胞株。國內(nèi)外 建立乳腺癌對阿霉素的耐藥細(xì)胞株已經(jīng)很常用，而針對三陰性乳腺癌的耐藥細(xì)胞株仍較少 見，特別是由DDP(順鉑）誘導(dǎo)的三陰性乳腺癌耐藥細(xì)胞株未見報道。本發(fā)明是首次建立 MDA-MB-231細(xì)胞對DDP的耐藥細(xì)胞株，建立該細(xì)胞株能夠為腫瘤耐藥相關(guān)研宄提供必要的 研宄模型，具有實用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之一是提供一種三陰性乳腺癌順鉑耐藥細(xì)胞株 MDA-MB-231/DDP，為以下相關(guān)研宄提供耐藥腫瘤細(xì)胞模型：研宄耐藥腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)及生 物學(xué)特點、研宄腫瘤耐藥機(jī)制、分析化療藥物敏感性及篩選化療藥物、開發(fā)腫瘤耐藥逆轉(zhuǎn)藥 物、研發(fā)更有效的腫瘤治療方法等。目前國內(nèi)外尚無MDA-MB-231細(xì)胞對DDP的耐藥株，我 們的發(fā)明為三陰性乳腺癌的研宄提供了一種重要的基礎(chǔ)研宄模型。
[0006] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之二是提供該三陰性乳腺癌順鉑耐藥細(xì)胞株的制備方 法。
[0007] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之三是提供該三陰性乳腺癌順鉑耐藥細(xì)胞株的用途。
[0008] 本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：
[0009] 在本發(fā)明的一方面，提供一種三陰性乳腺癌順鉑耐藥細(xì)胞株，該細(xì)胞株命名為人 三陰性乳腺癌耐藥細(xì)胞株MDA-MB-231/DDP，已于2015年3月12日保藏在中國微生物菌種 保藏管理委員會普通微生物中心（簡稱為CGMCC)，保藏編號為CGMCCNo. 10406,保藏地點： 中國，北京。
[0010] 本發(fā)明通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、生長曲線、細(xì)胞耐藥指數(shù)測定、基因芯片檢測、耐藥 相關(guān)基因檢測，評價三陰性乳腺癌順鉑耐藥細(xì)胞株MDA-MB-231/DDP的生物學(xué)特性，結(jié)果成 功建立了MDA-MB-231/DDP耐藥株，耐藥指數(shù)為11倍。
[0011] 在本發(fā)明的另一方面，提供該三陰性乳腺癌順鉑耐藥細(xì)胞株的制備方法，本發(fā)明 采用人三陰性乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231為誘導(dǎo)對象，采用逐步遞增DDP濃度，持續(xù)作用的 體外誘導(dǎo)法建立了人三陰性乳腺癌耐藥細(xì)胞株MDA-MB-231/DDP。
[0012] 具體地，本發(fā)明涉及的人三陰性乳腺癌順鉑耐藥細(xì)胞株MDA-MB-231/DDP是按照 如下方法建立獲得：
[0013] (1)人三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞株，復(fù)蘇后用L15培養(yǎng)液（含10%胎牛血清、 青霉素100U/ml、鏈霉素100yg/ml)(優(yōu)選于37°C、5%C02、95%濕度條件下）培養(yǎng)；
[0014] (2)取對數(shù)生長期MDA-MB-231細(xì)胞，換新鮮培養(yǎng)液，加入DDP，使其作用濃度為 100ng/ml，（優(yōu)選在37°C、5%C02、95%濕度條件下）繼續(xù)培養(yǎng)，適時換液，維持100ng/ml藥 物濃度直至存活細(xì)胞能在此濃度穩(wěn)定生長、傳代；
[0015] (3)適當(dāng)增加DDP的作用濃度，（優(yōu)選在37°C、5%C02、95%濕度條件下）繼續(xù)培 養(yǎng)，適時換液，維持藥物濃度直至存活細(xì)胞能在此濃度穩(wěn)定生長、傳代；
[0016] (4)重復(fù)步驟（3)直到獲得能在4μg/mlDDP中穩(wěn)定生長、傳代及復(fù)蘇的 MDA-MB-231/DDP細(xì)胞株。
[0017] 在誘導(dǎo)過程中，掌握適當(dāng)?shù)腄DP增加濃度非常重要，理想狀況是既通過增加藥 物濃度篩選出少數(shù)耐藥細(xì)胞又不致于使全部細(xì)胞死亡，從而不斷獲得有更高耐藥性的 MDA-MB-231細(xì)胞。經(jīng)過探索，在我們的發(fā)明中優(yōu)選采用每階段增加200-500ng/mlDDP的方 法取得了較好效果，歷時7個月建立了MDA-MB-231/DDP耐藥細(xì)胞株。
[0018] 此外，在本發(fā)明的另一方面，還提供該三陰性乳腺癌順鉑耐藥細(xì)胞株在制備乳腺 癌耐藥逆轉(zhuǎn)藥物中的應(yīng)用。
[0019] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明可用于分析三陰性乳腺癌細(xì)胞 DDP耐藥后的形態(tài)學(xué)及生物學(xué)表型的變化；研宄腫瘤對DDP耐藥的分子機(jī)制和逆轉(zhuǎn)腫瘤耐 藥的方法及篩選其他抗腫瘤藥物；發(fā)現(xiàn)腫瘤耐藥標(biāo)志物以及篩選和評估新型抗腫瘤藥物 等，具有較高的科研和生產(chǎn)應(yīng)用價值。經(jīng)實驗驗證，本發(fā)明三陰性乳腺癌順鉑耐藥細(xì)胞株MDA-MB-231/DDP的耐藥指數(shù)為11，具有較高的耐藥性，可用于制備乳腺癌耐藥逆轉(zhuǎn)藥物。
【附圖說明】
[0020] 圖1是本發(fā)明實施例2中倒置顯微鏡下MDA-MB-231細(xì)胞觀察圖（X200);
[0021] 圖2是本發(fā)明實施例2中倒置顯微鏡下MDA-MB-231/DDP細(xì)胞觀察圖（X200);
[0022] 圖3是本發(fā)明實施例2中MDA-MB-231和MDA-MB-231/DDP細(xì)胞內(nèi)順鉑濃度檢測 圖；
[0023] 圖4是本發(fā)明實施例2中MTT法檢測順鉑作用MDA-MB-231細(xì)胞及MDA-MB-231/ DDP細(xì)胞72h的增殖抑制率示意圖；
[0024] 圖5是本發(fā)明實施例2中MDA-MB-231細(xì)胞和MDA-MB-231/DDP細(xì)胞中耐藥基因含 量圖（**P〈0. 01);
[0025] 圖6是本發(fā)明實施例2中MDA-MB-231細(xì)胞和MDA-MB-231/DDP細(xì)胞差異基因聚類 分析圖；
[0026] 圖7是本發(fā)明實施例2中MDA-MB-231/DDP細(xì)胞差異基因所調(diào)節(jié)的部分GOs;
[0027] 圖8是本發(fā)明實施例2中MDA-MB-231/DDP細(xì)胞差異基因所調(diào)節(jié)的信號通路 (P<0. 05)；
[0028] 圖9是本發(fā)明實施例2中MDA-MB-231/DDP細(xì)胞差異基因間相互作用網(wǎng)絡(luò)；
[0029] 代號為MDA-MB-231/DDP的人三陰性乳腺癌耐藥細(xì)胞株，已于2015年3月12日保 藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（簡稱為CGMCC)，保藏編號為CGMCC No. 10406,保藏地點：中國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研宄所。
【具體實施方式】
[0030] 下面的實施例可以使本領(lǐng)域技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制 本發(fā)明。
[0031] 以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下