述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為常 規(guī)生化試劑商店購買得到的。
[0032] 實施例1人三陰性乳腺癌耐藥細胞株MDA-MB-231/DDP的誘導建立
[0033] 本發(fā)明采用逐步遞增DDP(順鉑）濃度，持續(xù)作用的體外誘導法建立人三陰性乳腺 癌耐藥細胞株MDA-MB-231/DDP。具體步驟如下：
[0034] 1.人三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞株（購自中國科學院上海細胞庫，由本實驗 室凍存），復蘇后用L15培養(yǎng)液（含10%胎牛血清、青霉素100U/ml、鏈霉素100yg/ml)于 37°C、5%C02、95%濕度條件下培養(yǎng)；
[0035] 2.取對數生長期MDA-MB-231細胞，換新鮮培養(yǎng)液，加入DDP(注射用順鉑凍干粉購 自齊魯制藥有限公司，批號：ZWA2A1305034A)，使其作用濃度為100ng/ml，在37°C、5%C02、 95%濕度條件下繼續(xù)培養(yǎng)，適時換液，維持100ng/ml藥物濃度直至存活細胞能在此濃度穩(wěn) 定生長、傳代；
[0036] 3.適當增加DDP的作用濃度，在37°C、5%C02、95%濕度條件下繼續(xù)培養(yǎng)，適時換 液，維持藥物濃度直至存活細胞能在此濃度穩(wěn)定生長、傳代；
[0037] 4.重復步驟（3)直到獲得能在4μg/mlDDP中穩(wěn)定生長、傳代及復蘇的 MDA-MB-231/DDP細胞株。
[0038] 在誘導過程中，掌握適當的DDP增加濃度非常重要，理想狀況是既通過增加藥 物濃度篩選出少數耐藥細胞又不致于使全部細胞死亡，從而不斷獲得有更高耐藥性的 MDA-MB-231細胞。經過探索，在本發(fā)明中采用每階段增加200-500ng/mlDDP的方法取得了 較好效果，歷時7個月建立了MDA-MB-231/DDP耐藥細胞株。
[0039]當細胞依次對 100ng/ml、300ng/ml、500ng/ml、1yg/ml、1. 5yg/ml、2yg/ml、 2. 5yg/ml、3yg/ml、3. 5yg/ml、4yg/mlDDP穩(wěn)定耐藥后，及時凍存該濃度耐藥細胞于液 氮中。凍存液由15%胎牛血清、5%DMS0、80%L15培養(yǎng)液組成，凍存過程逐步降溫，采取 4°C30分鐘一20°C1小時一_80°C過夜一液氮的順序進行。凍存細胞的復蘇按以下程序進 行：在一個25cm2的細胞培養(yǎng)瓶中加入至少10ml含10%胎牛血清的培養(yǎng)液；從液氮中取出 裝有細胞的凍存管，立即放入37°C水浴輕輕搖動使凍存物在1分鐘內解凍，用酒精棉球擦 拭凍存管外壁后拿入超凈臺；將解凍后的細胞懸液移入已加了培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，稍加搖 動混勻，擰松瓶蓋，平放入二氧化碳培養(yǎng)箱中，在37°C、5%C02、95%濕度條件下培養(yǎng)，約24 小時細胞貼壁后換新鮮培養(yǎng)液3-5ml繼續(xù)培養(yǎng)。
[0040] 實施例2對應用本發(fā)明的方法建立的MDA-MB-231/DDP細胞株進行形態(tài)學觀察及 生物學特性鑒定：
[0041] 1.倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)
[0042] 取對數生長期MDA-MB-231細胞和MDA-MB-231/DDP細胞各一瓶，換液后在倒置相 差顯微鏡下觀察活細胞形態(tài)并照像?？梢奙DA-MB-231細胞呈多角形，形態(tài)較一致，細胞內 結構均勻（如圖1所示）；MDA-MB-231/DDP細胞大小、形態(tài)均發(fā)生變化，細胞更細長，細胞內 尤其是近胞膜處有較多深色物質聚集（如圖2所示）。
[0043] 2. HPLC(高效液相色譜）法檢測細胞內DDP濃度
[0044] 分別取對數生長期MDA-MB-231細胞和MDA-MB-231/DDP細胞，以DDP濃度為6yg/ ml的含藥培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后，倒掉培養(yǎng)液，PBS緩沖液洗，消化收集各組細胞并計數，并經 PBS沖洗3次后，加入50%乙醇溶液lml，然后于液氮快速冷凍，并與37°C下迅速解凍后超 聲5min(70W)，反復凍融超聲3次，置顯微鏡下觀察無完整細胞，14 000r/min離心lOmin， 取上清400y1，加入內標液（37. 5yg/ml氯化鎳）和二乙基二硫代氨基甲酸鈉（DDTC)溶 液（0. 25mol/L)各50y1，搖勻，37°C孵育30min，放至室溫后，加入500y1氯仿，渦旋震蕩 lmin進行抽提，14 000r/min離心5min，吸取下層溶液5y1進樣。
[0045] 實驗所用的高效液相色譜儀為Agilengl260型；色譜柱為DiamonsilC18 (2) 5u 150X4.6mm，柱溫25°C;檢測波長為254nm;流動相比例為水：甲醇：乙腈=25 :40 :35,流速 lml/min〇
[0046] 分析表明，用HPLC法測定MDA-MB-231細胞及MDA-MB-231/DDP細胞內DDP的 濃度，2種細胞分別與6yg/ml的DDP接觸24h后，MDA-MB-231細胞內DDP的濃度為 47. 10±2. 37ng/5X104cells，而MDA-MB-231/DDP細胞則為 6. 30±1. 64ng/5X104cells，兩 者具有顯著性差異（P〈〇. 01)，如圖3所示。
[0047] 3.MTT法（又稱MTT比色法，是一種檢測細胞存活和生長的方法）測定細胞耐藥指 數
[0048] 分別取對數生長期MDA-MB-231細胞和MDA-MB-231/DDP細胞，細胞消化、計數、調 整細胞密度為3X104個/mL，接種于96孔培養(yǎng)板中，100y1/孔。置37°C、C0 2體積分數 為5%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24h后，用完全培養(yǎng)基稀釋藥物至所需濃度，每孔加入 100yL相應的含藥培養(yǎng)基。每組都設6個復孔，并設置調零孔（只含相應培養(yǎng)液，無細胞） 和對照孔（只含細胞、培養(yǎng)液）。96孔細胞培養(yǎng)板置于37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時 后，每孔加入MTT(5mg/mL) 15y1/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4h，小心吸棄培養(yǎng)液和MTT(3- (4, 5-二甲基 噻唑-2)-2, 5-二苯基四氮唑溴鹽）溶液，加入DMS0 (二甲基亞砜）150y1/孔，振蕩10分 鐘使充分溶解顯色。用全波長酶標儀測定吸光度值（A490)，實驗重復3次，取平均值。按下 式計算細胞生長抑制率。
[0049]
【主權項】
1. 一種三陰性乳腺癌順鉑耐藥細胞株，其特征在于，該細胞株命名為人三陰性乳腺癌 耐藥細胞株MDA-MB-231/DDP，其保藏編號為CGMCC No. 10406。
2. 根據權利要求1所述的一種三陰性乳腺癌順鉑耐藥細胞株，其特征在于該細胞株對 DDP的耐藥指數為11。
3. 根據權利要求1所述的一種三陰性乳腺癌順鉑耐藥細胞株的制備方法，其特征在 于，包括以下步驟： (1) 人三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞株，復蘇后用L15培養(yǎng)液培養(yǎng)；所述L15培養(yǎng)液 含10%胎牛血清、青霉素 l〇〇U/ml、鏈霉素100 μ g/ml ; (2) 取對數生長期MDA-MB-231細胞，換新鮮培養(yǎng)液，加入DDP，使其作用濃度為IOOng/ ml，繼續(xù)培養(yǎng)，適時換液，維持100ng/ml藥物濃度直至存活細胞能在此濃度穩(wěn)定生長、傳 代； (3) 適當增加 DDP的作用濃度，繼續(xù)培養(yǎng)，適時換液，維持藥物濃度直至存活細胞能在 此濃度穩(wěn)定生長、傳代； (4) 重復步驟（3)直到獲得能在4 μ g/ml DDP中穩(wěn)定生長、傳代及復蘇的MDA-MB-231/ DDP細胞株。
4. 根據權利要求3所述的一種三陰性乳腺癌順鉑耐藥細胞株的制備方法，其特征在 于，步驟（1)、（2)、（3)的培養(yǎng)條件為：37°C、5% C02、95%濕度條件下培養(yǎng)。
5. 根據權利要求3所述的一種三陰性乳腺癌順鉑耐藥細胞株的制備方法，其特征在 于，步驟（3)中，每次增加的DDP濃度為200-500ng/ml。
6. 根據權利要求1或2所述的一種三陰性乳腺癌順鉑耐藥細胞株在制備乳腺癌耐藥逆 轉藥物中的應用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種三陰性乳腺癌順鉑耐藥細胞株，該細胞株命名為人三陰性乳腺癌耐藥細胞株MDA-MB-231/DDP，其保藏編號為CGMCC No.10406。此外，本發(fā)明還公開了該耐藥細胞株的制備方法及其在制備乳腺癌耐藥逆轉藥物中的應用。本發(fā)明可用于分析三陰性乳腺癌細胞DDP耐藥后的形態(tài)學及生物學表型的變化；研究腫瘤對DDP耐藥的分子機制和逆轉腫瘤耐藥的方法及篩選其他抗腫瘤藥物；發(fā)現腫瘤耐藥標志物以及篩選和評估新型抗腫瘤藥物等，具有較高的科研和生產應用價值。經實驗驗證，本發(fā)明三陰性乳腺癌順鉑耐藥細胞株MDA-MB-231/DDP的耐藥指數為11，具有較高的耐藥性，可用于制備乳腺癌耐藥逆轉藥物。CGMCC No.1040620150312
【IPC分類】C12N5-09, C12Q1-02
【公開號】CN104830775
【申請?zhí)枴緾N201510174185
【發(fā)明人】陳紅風, 盛佳鈺, 葉媚娜
【申請人】上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院
【公開日】2015年8月12日
【申請日】2015年4月14日