專利名稱：依托泊苷誘導建立的宮頸癌多藥耐藥細胞株的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬腫瘤生物學領域，涉及一種人宮頸癌耐藥細胞株。具體涉及以人宮
頸癌SiHa為親代細胞，通過逐步增加化療藥物依托泊苷(VP16)作用濃度，建
立了宮頸癌多藥耐藥細胞株SiHa/VP16。
背景技術：
宮頸癌嚴重危害著女性健康，其發(fā)病率居女性惡性腫瘤第二位。全世界每年 的宮頸癌新發(fā)病例約50萬，而我國每年新發(fā)病人數(shù)約占世界總發(fā)病人數(shù)的1/3。 化療是治療宮頸癌的重要手段，但化療中常見且難以解決的問題是多藥耐藥性 的產(chǎn)生，即腫瘤同時對多種結構和作用機制不同的化療藥物產(chǎn)生交叉耐藥的現(xiàn) 象，它是化療失敗的主要原因。因此研究腫瘤多藥耐藥機制以及防止或逆轉腫 瘤多藥耐藥的發(fā)生對于提高化療效果十分重要。近年來，腫瘤耐藥細胞株已成 為重要的工具，大量研究利用它來揭示腫瘤細胞的耐藥機制、研究腫瘤細胞的 耐藥性逆轉、開發(fā)及評價新的抗癌方法等。建立腫瘤耐藥細胞株具有重要應用 價值。植物堿類化療藥物依托泊苷是腫瘤化療的常用藥物，作為二線藥物也被 用于宮頸癌的化療，建立宮頸癌對依托泊苷耐藥細胞株能夠為腫瘤耐藥相關研 究提供必要的研究模型。SiHa宮頸鱗癌細胞株，由日本YIto建立，是腫瘤研究 的常用工具。目前國內(nèi)尚無SiHa細胞對VP16的耐藥株，國外有過相關研究， 但其耐藥株的建立方式、耐藥能力與我們的發(fā)明均有所不同。
腫瘤耐藥細胞株的建立通常有兩種方法， 一是逐步增加藥物濃度、持續(xù)誘導 法，二是大劑量沖擊間斷給藥法。國內(nèi)外均有研究對這兩種方法進行了比較， 認為不同誘導方式可能獲得不同耐藥機理的耐藥細胞株，同時也可能影響腫瘤 細胞耐藥程度，持續(xù)誘導比沖擊誘導更易產(chǎn)生耐藥性。持續(xù)誘導法以腫瘤細胞 最終能在特定濃度化療藥物中穩(wěn)定生長作為誘導成功的判定標準，細胞耐藥性 穩(wěn)定、直觀，因此本發(fā)明主要采用該法來誘導耐藥細胞的產(chǎn)生。
腫瘤細胞耐藥程度的判定常用耐藥指數(shù)(resistant index, RI)來表示， RI是耐藥細胞半數(shù)抑制濃度(50% inhibitory concentration, IC50)與親代 細胞半數(shù)抑制濃度的比值。Snow等按耐藥指數(shù)的高低將耐藥性分為低度(〈5)、 中度(5-15)、高度(M5)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是建立宮頸癌耐藥細胞株SiHa/VP16，為以下相關研究提供耐 藥腫瘤細胞模型研究耐藥腫瘤細胞形態(tài)學及生物學特點、研究腫瘤多藥耐藥
機制、分析化療藥物敏感性及篩選化療藥物、開發(fā)腫瘤耐藥逆轉藥物、研發(fā)更 有效的腫瘤治療方法等。
本發(fā)明的耐藥細胞株建立步驟如下(1)人宮頸癌SiHa細胞株，復蘇后用 DMEM培養(yǎng)液(含10%小牛血清、青霉素100U/ml、鏈霉素100ug/ml)于37。C、 5%C02、 95%濕度條件下培養(yǎng)；(2)取對數(shù)生長期SiHa細胞，換新鮮培養(yǎng)液，加 入VP16，使其作用濃度為0. lug/ml，在37。C、 5%C02、 95%濕度條件下繼續(xù)培 養(yǎng)，適時換液，維持0. lyg/ml藥物濃度直至存活細胞能在此濃度穩(wěn)定生長、 傳代；(3)適當增加VP16的作用濃度，在37。C、 5%C02、 95%濕度條件下繼續(xù)培 養(yǎng)，適時換液，維持藥物濃度直至存活細胞能在此濃度穩(wěn)定生長、傳代；(4) 重復步驟(3)直到獲得能在4n g/mlVP16中穩(wěn)定生長、傳代及復蘇的SiHa/VP16 細胞株。在誘導過程中，掌握適當?shù)腣P16增加濃度非常重要，理想狀況是既通 過增加藥物濃度篩選出少數(shù)耐藥細胞又不致于使全部細胞死亡，從而不斷獲得 有更高耐藥性的SiHa細胞。經(jīng)過探索，在我們的發(fā)明中采用每階段增加0.5 2u g/mlVP16的方法，初始誘導階段細胞對藥物較敏感，每次增加的藥物量宜低，當細胞有一定 耐藥能力后可適當加大增藥濃度。歷時9個月建立了SiHa/VP16耐藥細胞株。用光學顯貨A 鏡觀察細胞形態(tài)、MTT法繪制細胞生長曲線、檢測細胞耐藥指數(shù)。我們發(fā)現(xiàn)， SiHa/VP16細胞立體感增強，有時呈現(xiàn)短且胖的梭形，但總地說來與SiHa細胞 差別不大；生長速度明顯減慢；對VP16明顯耐藥，耐藥指數(shù)(RI)為24.019， 除對VP16耐藥外，對MTX中度耐藥，對cDDP、 VCR、 5-Fu、 DOX呈低度耐藥。


圖1是倒置相差顯微鏡下SiHa活細胞觀察圖；圖2是倒置相差顯微鏡下
SiHa/VP16活細胞觀察圖；圖3是光學顯微鏡下SiHa細胞爬片HE染色觀察圖4是光學顯微鏡下SiHa/VP16細胞爬片HE染色觀察圖；圖5是SiHa及
SiHa/VP16細胞生長曲線。
具體實施例方式
實施例1
SiHa/VP16多藥耐藥細胞株按以下步驟建立(1)人宮頸癌SiHa細胞株，復蘇后用DMEM培養(yǎng)液(含10%小牛血清、青霉素100U/ml、鏈霉素100ug/ml) 于37X:、 5%C02、 95%濕度條件下培養(yǎng)；(2)取對數(shù)生長期SiHa細胞，換新鮮培 養(yǎng)液，加入VP16，使其作用濃度為0. lug/ml，在37。C、 5%C02、 95%濕度條件 下繼續(xù)培養(yǎng)，適時換液，維持O. lug/ml藥物濃度直至存活細胞能在此濃度穩(wěn) 定生長、傳代；(3)適當增加VP16的作用濃度，在37t、 5%C02、 95%濕度條件 下繼續(xù)培養(yǎng)，適時換液，維持藥物濃度直至存活細胞能在此濃度穩(wěn)定生長、傳 代；(4)重復步驟(3)直到獲得能在2iig/mlVP16中穩(wěn)定生長、傳代及復蘇的 SiHa/VP16細胞株。每階段增加VP16量為0. 5 2ug/ml。歷時9個月建立 SiHa/VP16細胞株。
當細胞依次對0. 1 ti g/ml、 0.5tig/ml、 lpg/ml、 2ug/ml、 4ug/ml VP16 穩(wěn)定耐藥后，及時凍存該濃度耐藥細胞于液氮中。凍存液由20%小牛血清、 5%DMS0、 75% DMEM培養(yǎng)液組成，凍存過程應逐步降溫，采取4°C30分鐘一-20 °C1小時一""7(TC過夜一液氮的順序進行。凍存細胞的復蘇按以下程序進行在 一個25cm2的細胞培養(yǎng)瓶中加入至少10ml含10%小牛血清的培養(yǎng)液；從液氮中取 出裝有細胞的凍存管，立即放入37t:水浴輕輕搖動使凍存物在1分鐘內(nèi)解凍， 用酒精棉球擦拭凍存管外壁后拿入超凈臺；將解凍后的細胞懸液移入已加了培 養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，稍加搖動混勻，擰松瓶蓋，平放入二氧化碳培養(yǎng)箱中，在37°C、 5%C02、 95%濕度條件下培養(yǎng)，約24小時細胞貼壁后換新鮮培養(yǎng)液3 5ml繼續(xù)培 養(yǎng)。
實施例2
對本方法建立的SiHa/VP16細胞株進行形態(tài)學觀察及生物學特性鑒定 l.形態(tài)學觀察
(1) 倒置相差顯微鏡觀察活細胞形態(tài)
取對數(shù)生長期SiHa、 SiHa/VP16細胞各一瓶，換液后在倒置相差顯微鏡下 觀察活細胞形態(tài)并照像?？梢奡iHa/VP16細胞立體感增強，有時呈現(xiàn)短且胖的 梭形，但總地說來與SiHa細胞差別不大。(如圖l、 2所示)
(2) HE染色觀察細胞形態(tài)
取對數(shù)生長期SiHa、 SiHa/VP16細胞，用0. 25%胰酶消化制成單細胞懸液， 調(diào)整密度約1X107ml，接種于鋪蓋玻片的培養(yǎng)皿，放C02培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)，待 細胞基本長成單層，取出蓋玻片，棄培養(yǎng)液，0.01M PBS浸洗3次，常規(guī)HE染
5色，于光學顯微鏡下觀察?？梢奡iHa/VP16與SiHa細胞無明顯差別。(如圖3、 4所示)。
2. 測定細胞生長曲線和群體倍增時間(MTT法)
取對數(shù)生長期SiHa、 SiHa/VP16細胞，用胰酶消化制單細胞懸液，調(diào)整細 胞密度。每種細胞均以2000/孔種于96孔板，設5個復孔。同時接種8塊96孔 板。于實驗的1 8天每天取出一塊板，用MTT法檢測595nm波長處0D值，通 過OD值一細胞數(shù)直線回歸方程將OD值換算成細胞數(shù)。將8次的實驗數(shù)據(jù)進行 分析，繪制生長曲線(如圖5所示)。按Patterson公式Td = A T X lg2/lg(Nt/No) 計算細胞倍增時間，Td為倍增時間，Nt為終末細胞數(shù)，No為初始細胞數(shù)(此 處用0D值代替)，A T為Nt No的時間，算得SiHa和SiHa/VP16細胞群體倍增 時間分別為38.04土2. 39h、 43.30士1.41h，耐藥細胞生長速度減慢(P<0.001)
3. 耐藥譜分析(MTT法)
取對數(shù)生長期的SiHa、 SiHa/VP16細胞，用0. 25%胰酶消化，制單細胞 懸液，以4X107ml的密度接種于96孔板，每孔180 u 1 (7200個細胞/孔)。 常規(guī)培養(yǎng)24h。每孔加20ixl用培養(yǎng)液配制的化療藥物，使八種藥物(依托泊 苷、順鉑、紫杉醇、長春新堿、5-氟尿嘧啶、氨甲喋呤、多柔比星、絲裂霉素 C)分別以7 8個梯度濃度作用于細胞(梯度濃度根據(jù)預實驗所得，務必使半 數(shù)抑制濃度在此梯度范圍中間位置)。每一濃度設3復孔，同時設僅接種細胞的 無藥對照孔和僅加培養(yǎng)液的調(diào)零孔。于37°C、 5%C02、 95%濕度培養(yǎng)72h。每孔 加5mg/mlMTT液20iU，繼續(xù)培養(yǎng)4h。吸棄上清液，每孔加DMS0150 u 1，震蕩 儀震蕩10min，用酶標儀檢測595nm波長0D值，每三個復孔取其平均值。根據(jù) 0D值計算細胞抑制率，計算公式細胞抑制率=(1-實驗組0D值/對照組0D值) X100%。根據(jù)每種藥物不同濃度抑制率，利用SPSS15.0軟件Regression中的 Probit過程計算該藥半數(shù)抑制濃度(IC50)，從而計算每種藥物的耐藥指數(shù)RI， RP耐藥細胞IC50/親代細胞IC50，比較耐藥細胞和親代細胞的差異。分析表明， SiHa/VP16細胞對VP16的耐藥指數(shù)(RI)為24.019，屬高度耐藥，除對VP16耐 藥外，對MTX中度耐藥，對DDP、 VCR、 5-Fu、 D0X呈低度耐藥，對TAX、醒C無 耐藥性。詳細數(shù)據(jù)如表1所示?；熕幬颕C50(SiHa) (li g/ml)IC50(SiHa/VP16) (w g/ml)RI
依托泊苷(VP16)6. 358152.71224.019
順鉬(cDDP)1. 8925.4322.871
紫杉醇(TAX)0.0110.0111.000
長春新堿(VCR)0. 0230.0672. 913
5-氟尿嘧啶(5-Fu)1. 7168. 1234. 734
氨甲喋呤(MTX)0. 4943. 5957. 277
多柔比星(D0X)0.0670. 3234. 821
絲裂霉素c(羅c)0. 0890. 0830.933
表l
保藏該生物材料樣品的單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心 地址湖北省武漢市武昌珞珈山
培養(yǎng)物名稱人宮頸癌多藥耐藥細胞株SiHa/VP16 保藏日期2009年1月20日 保藏編號CCTCC一C200904
權利要求
1. 一種宮頸癌多藥耐藥細胞株，其特征在于細胞株命名為SiHa/VP16，系利用化療藥物依托泊苷(VP16)誘導人宮頸癌SiHa細胞株建立，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC—C200904。
2. 根據(jù)權利要求1所述的一種宮頸癌多藥耐藥細胞株，其特征在于宮頸癌多藥 耐藥細胞株按以下步驟建立(1)人宮頸癌SiHa細胞株，復蘇后用畫EM培養(yǎng) 液(含10%小牛血清、青霉素100U/ml、鏈霉素100ug/ml)于37。C、 50線、95% 濕度條件下培養(yǎng)；(2)取對數(shù)生長期SiHa細胞，換新鮮培養(yǎng)液，加入VP16，使 其作用濃度為0. 1 u g/ml，在37°C、 5%C02、 95%濕度條件下繼續(xù)培養(yǎng)，適時換液， 維持O.lUg/ml藥物濃度直至存活細胞能在此濃度穩(wěn)定生長、傳代；(3)適當 增加VP16的作用濃度，在37'C、 5%C02、 95%濕度條件下繼續(xù)培養(yǎng)，適時換液， 維持藥物濃度直至存活細胞能在此濃度穩(wěn)定生長、傳代；(4)重復步驟(3)直 到獲得能在4 " g/mlVP16中穩(wěn)定生長、傳代及復蘇的SiHa/VP16細胞株。
3. 根據(jù)權利要求1和2所述的一種宮頸癌多藥耐藥細胞株，其特征在于步驟(3) 每次增加的VP16濃度為0. 5 2 u g/ml。
4. 根據(jù)權利要求1和2所述的一種宮頸癌多藥耐藥細胞株，其特征在于該細胞 株對VP16的耐藥指數(shù)(RI)為24. 019，除對VP16耐藥外，對MTX、 cDDP、 VCR、 5-Fu、 DOX有交叉耐藥。
5. 權利要求1、 2、 3和4所述的一種宮頸癌多藥耐藥細胞株SiHa/VP16在腫瘤 研究中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種宮頸癌多藥耐藥細胞株，特征是選擇人宮頸癌SiHa細胞株作為親代細胞，從0.1μg/ml逐步增加化療藥物依托泊苷(VP16)的作用濃度至4μg/ml，建立SiHa/VP16耐藥細胞株。SiHa/VP16細胞能在4μg/mlVP16中穩(wěn)定生長、傳代及復蘇，對VP16的耐藥指數(shù)(RI)為24.019，除對VP16耐藥外，對MTX、cDDP、VCR、5-Fu、DOX有交叉耐藥。本發(fā)明目的是為腫瘤相關研究提供耐藥腫瘤細胞模型。
文檔編號C12N5/08GK101503673SQ20091005826
公開日2009年8月12日 申請日期2009年2月2日 優(yōu)先權日2009年2月2日
發(fā)明者劉珊玲, 和 王, 陳新蓮 申請人:四川大學華西第二醫(yī)院