5a;
[0062] 所述酶切反應(yīng)的體系為：PacI0? 8-1. 2y1，Pmel0? 8-1. 2y1，lOXbuffer 1.8-2. 2yl，OS-9基因1.8-2. 2yg，ddH20補(bǔ)至20yl;另外，在連接的過程中采用T4DNA 連接酶，且反應(yīng)溫度為15-17°C。
[0063]S14:對轉(zhuǎn)化后DH5a進(jìn)行質(zhì)粒提取，獲得plenti6. 3-OS-9質(zhì)粒；
[0064] S15 :以所述plenti6. 3-OS-9質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，收獲病毒液，并以所述病毒液感 染Caco-2細(xì)胞后篩選出陽性克隆，培養(yǎng)10-15天后，獲得穩(wěn)定高表達(dá)OS-9的細(xì)胞株。
[0065] 具體的，該步驟包括以下操作：
[0066]a)、將plenti6. 3-OS-9質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒等量混合，得到稀釋后plenti6. 3-OS-9質(zhì) 粒；
[0067]b)、將所述稀釋后plenti6. 3-OS-9質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑Lipo2000混合后孵育15-25 分鐘，得到DNA與轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物；
[0068]c)、將所述DNA與轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物滴加到293T細(xì)胞培養(yǎng)液中，于36-38°C、4-6%的 C02的條件下分段培養(yǎng)90-100小時后，咼心，過濾，得到病毒液；
[0069] 所述離心的轉(zhuǎn)速為2800-3200轉(zhuǎn)/分鐘，時間為10-20分鐘；過濾的過程中，濾徑 為0.4-0. 5微米。
[0070] d)、將所述病毒液接種于含有Caco-2細(xì)胞的培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，并在培養(yǎng)液中加 入殺稻瘟菌素，每隔兩天換液一次，并加入新的殺稻瘟菌素，持續(xù)培養(yǎng)10-15天獲得穩(wěn)定高 表達(dá)OS-9的細(xì)胞株。
[0071] 實(shí)施例2
[0072]S21:提取傳代培養(yǎng)后Caco-2細(xì)胞的mRNA，并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到cDNA;
[0073] 在該步驟中，對于Caco-2細(xì)胞的傳代培養(yǎng)具體包括：
[0074] 人結(jié)腸癌上皮Caco-2細(xì)胞株購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫；Caco-2細(xì)胞完全培養(yǎng)基配 制：20%胎牛血清，1 %非必需氨基酸，1 %雙抗，MEM培養(yǎng)基為母液；Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)條件： 37°C，5 %C02，飽和濕度，培養(yǎng)4-6天；待細(xì)胞融合約80%時，將細(xì)胞用無菌PBS洗滌3次， 加入含0. 25%EDTA的胰酶進(jìn)行消化，顯微鏡下觀察，待細(xì)胞變圓，部分脫落時，立即加入含 有血清的培養(yǎng)基終止消化；用滴管反復(fù)吹打細(xì)胞懸液幾次，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至無菌離心管， 放入離心機(jī)，1000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘；離心完畢，倒去上清液，加入無菌的Hanks緩沖液， 用滴管再次吹打均勻，然后1000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘；離心完畢，倒去上清液，加入完全培 養(yǎng)基吹打均勻，按1:3傳代分瓶，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
[0075] 對于Caco-2細(xì)胞mRNA的提取操作包括：
[0076] 倒去細(xì)胞培養(yǎng)基，用PBS洗滌兩次。按每10cm2生長細(xì)胞加入1mlTrizol裂解液， 用移液槍吹打細(xì)胞使其脫落。將裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，室溫靜置5分鐘。加入l/5Trizol 量的氯仿，振蕩混勻。室溫靜置5分鐘。12000g，4°C，離心15分鐘。將上清液小心轉(zhuǎn)入一 新的去酶離心管中，加入與上清液等體積的異丙醇。室溫靜置10分鐘。12000g，4°C，離心 10分鐘。小心倒去上清，向沉淀中緩慢加入lml75%的乙醇。12000g，4°C，離心5分鐘。倒 去上清，保留沉淀，室溫晾干2-5分鐘。加入30-100y1適量DEPC水溶解沉淀，測定濃度， 置于冰上，備用。
[0077] 逆轉(zhuǎn)錄的操作具體包括：
[0078] 使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara)將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。按以下成分于冰上配制反應(yīng) 混合液：
[0079]5XgDNA Eraser Buffer2til? gDNA Eraser lul? Total RNA 2ul? RNase Free ddH20 5 u 1〇
[0080] 將混合液簡短離心后，42°C，反應(yīng)2分鐘；再按以下成分繼續(xù)于冰上配制反應(yīng)混合 液。
[0081]上述反應(yīng)混合液10 y 1，PrimeScript RT Enzyme Mix I 1 y 1，RT Primer Mix*4 1 y 1,5XPrimeScript Buffer 2 4yl,RNase Free ddH20 4 yl〇
[0082] 將混合液簡短離心后，37°C，15分鐘，然后迅速于85°C反應(yīng)5秒，再置于冰上。將 獲得的Caco-2細(xì)胞cDNA作為模板，繼續(xù)以下步驟。
[0083] S22 :以所述cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增、電泳以及切膠回收，得到全長OS-9基因；
[0084] 在該步驟中，在PCR擴(kuò)增的過程中，對于引物的設(shè)計(jì)和選擇按以下操作進(jìn)行：
[0085] 從GenBank資料庫中獲得人OS-9的mRNA序列（NM_001017956)，設(shè)計(jì)帶有酶切位 點(diǎn)PacI和Pmel的基因引物：
[0086] PacI-0S9-upF:agtcTTAATTAAACCATGGCGGCGGAAACGCTGCTG；
[0087] Br-0S9-upR:ATCCTCCTCTGTAGGTTGGGGTGATGGGGGAGG；
[0088] Os9-Fl:ccatcaccccaacctacagaggaggatcctgagcacagag ；
[0089] Os9-Rl:GCTTGGTGACCCGGACCCGGACTCTGTGCTCAGGATCCTC ；
[0090] Os9~F2:gggtccgggtcaccaagctccgtctcggaggccctaatca ；
[0091] Os9-R2:ATCTCGAGGACAGTCAGATCCTGATTAGGGCCTCCGAGAC ；
[0092] Os9_F3:gatctgactgtcctcgagatgaaacgggaaaacccacagctgaaacaaatcgaggg ;
[0093] Os9-R3:CCAGCAGCTCCTTCACCAGCCCCTCGATTTGTTTCAGCTG ；
[0094] 0s9~F4:ctggtgaaggagctgctggagagggagggactcacagctg ；
[0095] 0s9-R4:ATTTTGATCTCAATTTTCCCTGCAGCTGTGAGTCCCTCCC ；
[0096] Br-0S9-downF:acagctgcagGGAAAATTGAGATCAAAATTGTCC ；
[0097] PmeI-0S9-downR:gtcaGTTTAAACTCAGAAGTCAAATTCGTCCAGG〇
[0098]引物設(shè)計(jì)和合成由上海天晶生物技術(shù)有限公司協(xié)助完成。
[0099]使用PCR試劑盒（Takara)按以下成分于冰上配制反應(yīng)體系：
[0100] PremiX Taq 10 yl, cDNAO. 5yl, Forward Primer 0. 5yl, Reverse Primer 0. 5 y 1，RNase Free ddH20 8. 5 y 1。
[0101] 將上述反應(yīng)液簡短離心后，按以下表1所示條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增：
[0102] 表1 PCR擴(kuò)增過程中反應(yīng)條件
[0103]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種穩(wěn)定高表達(dá)os-9的細(xì)胞株的構(gòu)建方法，其特征在于，包括：將plenti6. 3載 體和0S-9基因連接，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌；將轉(zhuǎn)后的大腸桿菌進(jìn)行質(zhì)粒提取，獲得 plenti6. 3-0S-9質(zhì)粒；以所述plenti6. 3-0S-9質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，收獲病毒液，并以所述 病毒液感染Caco-2細(xì)胞后篩選出陽性克隆，培養(yǎng)10-15天后，獲得穩(wěn)定高表達(dá)0S-9的細(xì)胞 株。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，具體包括以下步驟： 1) 、提取傳代培養(yǎng)后Caco-2細(xì)胞的mRNA，并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到cDNA ; 2) 、以所述cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增、電泳以及切膠回收，得到全長OS-9基因； 3) 、將所述全長OS-9基因酶切后與plenti6. 3載體進(jìn)行連接，并導(dǎo)入DH5 α感受態(tài)細(xì) 胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到轉(zhuǎn)化后DH5 α ; 4) 、對轉(zhuǎn)化后DH5 α進(jìn)行質(zhì)粒提取，獲得Plenti6. 3-OS-9質(zhì)粒； 5) 、以所述plenti6. 3-OS-9質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，收獲病毒液，并以所述病毒液感染 Caco-2細(xì)胞后篩選出陽性克隆，培養(yǎng)10-15天后，獲得穩(wěn)定高表達(dá)OS-9的細(xì)胞株。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于，在步驟2)中，所述PCR擴(kuò)增的過程 中，所用的引物包括上游擴(kuò)增引物、下游擴(kuò)增引物以及中間缺失拼接引物； 其中，所述上游引物的序列如SEQ ID NOd-SEQ ID NO :2所示；所述下游擴(kuò)增引物如 SEQ ID N0:3-SEQ ID N0:4所示；所述中間缺失拼接引物的序列如SEQ ID N0:5-SEQ ID NO :12所示。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的構(gòu)建方法，其特征在于，在步驟2)中，所述PCR擴(kuò)增具體包括 如下步驟： 以所述cDNA為模板，分別以上游引物、下游引物和中間缺失拼接引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得3 個擴(kuò)增產(chǎn)物； 以3個擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，以如SEQ ID NO: 1和如SEQ ID NO :4所示序列為引物，進(jìn)行擴(kuò) 增。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的構(gòu)建方法，其特征在于，在步驟3)中，所述酶切反應(yīng)的體系 為：PacI 0.8-1. 2 μ 1，PmeI 0.8-1. 2 μ 1，10Xbuffer 1.8-2. 2 μ l，0S-9 基因 1.8-2. 2 μ g， ddH20 補(bǔ)至 20 μ 1。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的構(gòu)建方法，其特征在于，在步驟3)中，所述連接的過程中采用 T4DNA連接酶，且反應(yīng)溫度為15-17°C。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2-6任一項(xiàng)所述的構(gòu)建方法，其特征在于，在步驟5)中，具體包括： a) 、將plenti6. 3-0S-9質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒等量混合，得到稀釋后plenti6. 3-0S-9質(zhì)粒； b) 、將所述稀釋后plenti6. 3-0S-9質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑Lipo2000混合后孵育15-25分鐘， 得到DNA與轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物； c) 、將所述DNA與轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物滴加到293T細(xì)胞培養(yǎng)液中，于36-38°C、4-6%的CO2的條件下分段培養(yǎng)90-100小時后，尚心，過濾，得到病毒液； d) 、將所述病毒液接種于含有Caco-2細(xì)胞的培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，并在培養(yǎng)液中加入殺 稻瘟菌素，每隔兩天換液一次，并加入新的殺稻瘟菌素，持續(xù)培養(yǎng)10-15天獲得穩(wěn)定高表達(dá) 0S-9的細(xì)胞株。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的構(gòu)建方法，其特征在于，在步驟c)中，所述離心的轉(zhuǎn)速為 2800-3200轉(zhuǎn)/分鐘，時間為10-20分鐘；所述過濾的過程中，濾徑為0. 4-0. 5微米。
9. 權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的構(gòu)建方法獲得的細(xì)胞株在制備降低對腸粘膜通透性破 壞或提高腸上皮細(xì)胞中的緊密連接蛋白表達(dá)量的藥物中的應(yīng)用。
10. 權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的構(gòu)建方法獲得的細(xì)胞株在通過提高claudin-1和 occludin表達(dá)量，增強(qiáng)腸粘膜屏障功能中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種穩(wěn)定高表達(dá)OS-9的細(xì)胞株的構(gòu)建方法，屬于分子生物技術(shù)領(lǐng)域。該方法包括將plenti6.3載體和OS-9基因連接，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌；將轉(zhuǎn)后的大腸桿菌進(jìn)行質(zhì)粒提取，獲得plenti6.3-OS-9質(zhì)粒；以所述plenti6.3-OS-9質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，收獲病毒液，并以所述病毒液感染Caco-2細(xì)胞后篩選出陽性克隆，培養(yǎng)10-15天后，獲得穩(wěn)定高表達(dá)OS-9的細(xì)胞株。該細(xì)胞株，方便了在研究OS-9過表達(dá)的狀態(tài)下，其他功能性蛋白的表達(dá)情況，為OS-9過表達(dá)與其他功能性蛋白表達(dá)關(guān)系的研究提供了材料?？赏ㄟ^western blot、免疫熒光等操作進(jìn)行相關(guān)蛋白的定量和定性。
【IPC分類】C12N15-85, C12N5-10
【公開號】CN104830778
【申請?zhí)枴緾N201510205030
【發(fā)明人】孫力華, 楊樺, 肖衛(wèi)東, 王文生
【申請人】孫力華
【公開日】2015年8月12日
【申請日】2015年4月27日