干轉(zhuǎn)染組合物及其制備和使用方法
【專利說明】干轉(zhuǎn)染組合物及其制備和使用方法
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 根據(jù)35U.S.C.§119(e)，本申請要求2013年11月5日提交的美國臨時專利申請序列 No.61/900,232的申請日期的優(yōu)先權(quán)，所述申請的公開內(nèi)容通過引用并入本文。
[0003] 引言
[0004] 能夠有效引入外源分子，諸如DNA、SiRNA、蛋白質(zhì)等至生物細胞中在生物學(xué)和生物 工程中是非常重要的。轉(zhuǎn)染是指轉(zhuǎn)移核酸至細胞中。用核酸分子有效轉(zhuǎn)染生物細胞是闡明 基因功能如何在復(fù)雜的細胞環(huán)境中起作用和可如何調(diào)控其活性以用于治療干預(yù)的必要前 提。細胞轉(zhuǎn)染通常用于基礎(chǔ)生物學(xué)研究和藥學(xué)開發(fā)中。
[0005] 可將核酸通過將核酸與帶電脂質(zhì)、類脂質(zhì)、肽、聚合物或其混合物預(yù)先復(fù)合而體外 和體內(nèi)遞送至細胞。此類轉(zhuǎn)染試劑可商購獲得并且廣泛用于遞送核酸至培養(yǎng)中的細胞。暴 露于轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物的細胞可通過內(nèi)吞或其它方式內(nèi)化這些復(fù)合物。
[0006] 概述
[0007] 提供干聚合轉(zhuǎn)染劑組合物，如凍干聚合轉(zhuǎn)染劑組合物。所述干組合物包含聚合轉(zhuǎn) 染劑和緩沖液。在一些情況下，所述組合物還包含一種或多種核酸。還提供了制備和使用所 述組合物的方法，以及包括所述組合物的試劑盒。
[0008] 附圖簡述
[0009] 圖1描繪了為了測定轉(zhuǎn)染效率而在轉(zhuǎn)染后72小時轉(zhuǎn)染細胞的熒光激活細胞分選 (FACS)分析的結(jié)果。陽性細胞％表示為條形圖（左Y-軸)并且平均熒光強度(MFI)表示為線 圖（右Y-軸）。
[0010] 圖2描繪了為了測定產(chǎn)生的慢病毒量而由凍干包裝組分產(chǎn)生的慢病毒儲液的定量 RT-PCR (qRT-PCR)的結(jié)果。
[0011] 圖3描繪了為了測定產(chǎn)生的慢病毒滴度而用凍干包裝組分產(chǎn)生的慢病毒儲液的每 ml測定感染單位(IFU/ml)的結(jié)果。
[0012] 圖4描繪了當用另外的樣品再測試一次時(N = 8液體;N=13干燥），測定由凍干包 裝組分產(chǎn)生的慢病毒儲液的轉(zhuǎn)染效率(上圖：陽性細胞％和1?1)和拷貝/ml的病毒（下圖： qRT-PCR)的結(jié)果。
[0013]圖5提供了根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案的多孔基質(zhì)的圖。
[0014] 詳述
[0015] 提供了干聚合轉(zhuǎn)染劑組合物，如凍干聚合轉(zhuǎn)染劑組合物。所述干組合物包含聚合 轉(zhuǎn)染劑和緩沖液。在一些情況下，所述組合物還包含一種或多種核酸。還提供了制備和使用 所述組合物的方法，以及包括所述組合物的試劑盒。
[0016] 在詳細描述本公開的方法之前，應(yīng)理解所述方法不限于所述的特定實施方案，因 此當然可以發(fā)生變化。還應(yīng)當理解，本文所用的術(shù)語只是為了描述特定實施方案，并非旨在 進行限制，因為本發(fā)明的范圍將只由所附權(quán)利要求書限定。
[0017] 當提供數(shù)值范圍時，應(yīng)理解該范圍的上限和下限之間的每個居間數(shù)值(至下限單 位的十分之一，除非本文另外清楚地規(guī)定）以及所述范圍內(nèi)的任意其它所述或居間的數(shù)值 都涵蓋在本方法中。這些較小范圍的上限和下限可獨立地包括在該較小的范圍內(nèi)，并且也 涵蓋在本方法中，服從于所述范圍內(nèi)的任何特別排除的限值。當所述范圍包括上下限值之 一或兩者時，排除那些所包括的界限之一或兩者的范圍也包括在本方法中。
[0018] 本文中提供了某些在數(shù)值之前加有術(shù)語"約"的范圍。術(shù)語"約"在本文中用于為其 之后的確切數(shù)字以及與所述術(shù)語之后的數(shù)字接近或近似的數(shù)字提供文字支持。在確定數(shù)字 是否與明確引用的數(shù)字接近或近似中，接近或近似的未引用的數(shù)字可以是在其出現(xiàn)的上下 文中提供明確引用的數(shù)字的基本等同物的數(shù)字。
[0019] 除非另有定義，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本方法所屬領(lǐng)域中普通 技術(shù)人員通常所理解的相同含義。雖然類似于或等同于本文所述的那些方法和材料的任何 方法和材料也可用于實踐或檢驗本發(fā)明，但現(xiàn)在描述代表性說明方法和材料。
[0020] 本說明書中引用的所有公布和專利通過引用并入本文，就如同特定地及個別地表 明各個公布或?qū)＠ㄟ^引用并入，并且通過引用并入本文以公開和描述與公布一起被引用 的方法和/或材料。任何公布的引用是針對其提交日期之前的公開內(nèi)容，并且不應(yīng)當解釋為 本發(fā)明無權(quán)先于因先前發(fā)明所作的此類披露。此外，提供的公布的日期可與可能需要獨立 確認的實際公布日期不同。
[0021] 應(yīng)指出的是，如本文和所附權(quán)利要求中所使用的，除非上下文明確地另有說明，否 則單數(shù)形式"一種/個(a)"、"一種/個(an)"和"該(the)"包括復(fù)數(shù)指示物。還應(yīng)指出，可撰寫 權(quán)利要求來排除任何可選元素。這樣，該陳述意圖用作與權(quán)利要求要素的引用聯(lián)合使用此 類排他性術(shù)語"單獨地"、"僅僅"等或使用"否定(negative)"限制的在先基礎(chǔ)。
[0022]應(yīng)理解，也可在單個實施方案中組合地提供本發(fā)明的某些特征，所述特征為清楚 起見描述于分開的實施方案的上下文中。反之，為簡明起見而在單個實施方案的語境中描 述的本方法的多個特征也可以分開或以任何合適的子組合提供。所述實施方案的所有組合 明確地包括在本發(fā)明中并且公開于本文中，就如同各個和每一個組合被個別地且明確地公 開一樣，至此類包括可操作的工藝和/或裝置/系統(tǒng)/試劑盒的程度。此外，描述此類變量的 實施方案中所列的所有子組合還明確地包括在本方法中并且公開于本文中，就如同各個和 每一個子組合被個別地且明確地公開于本文中一樣。
[0023]如在閱讀本公開內(nèi)容后對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是很顯然的，本文中描述的和例舉的 單個實施方案的每一個具有可容易地與其它幾個實施方案的任一個的特征分開或組合的 獨立的組分和特征而不背離本發(fā)明的范圍或精神。可以以所引用事件的順序或以邏輯上可 能的任何其它順序進行任何引用的方法。
[0024]干轉(zhuǎn)染劑組合物
[0025] 如上所概述，本發(fā)明的各方面包括干聚合轉(zhuǎn)染劑組合物。由于所述組合物被干燥， 所以它們基本上(如果不完全)不含未結(jié)合的水?；旧喜缓唇Y(jié)合的水意指所述組合物包 含0.1重量％或更少，諸如0.01重量％或更少，包括0.001重量％或更少的未結(jié)合的水，包括 在一些情況下無未結(jié)合的水。干組合物可為顆粒組合物。顆粒組合物是由顆粒組成的組合 物，其中所述顆粒的尺寸可變化，在一些情況下范圍為5至lOOOnm、諸如10至500nm并包括50 至400nm。
[0026] 在一些情況下，干聚合轉(zhuǎn)染劑是凍干組合物。凍干意指所述組合物已經(jīng)經(jīng)受冷凍 干燥條件，使得所述組合物可被描述為冷凍-干組合物。適合的冷凍干燥條件的實例在下文 提供。
[0027] 本文所述的干組合物包含聚合轉(zhuǎn)染劑。聚合轉(zhuǎn)染劑意指一種或多種具有轉(zhuǎn)染活性 的聚合物，即當與核酸合并和與細胞接觸時，它們增強運輸核酸至細胞中。增強的幅度可變 化，其中在一些情況下如與不存在轉(zhuǎn)染劑的適合對照相比，增強的幅度為2倍或更大、諸如3 或5倍或更大、包括10-倍或更大。
[0028] 由于轉(zhuǎn)染劑是聚合的，它們是由較小單元即單體殘基的多個重復(fù)組成的大分子。 在一些情況下，聚合轉(zhuǎn)染劑是雜聚物，并且在一些情況下是聚(β氨基酯）及其鹽和衍生物。 目標聚合轉(zhuǎn)染劑是可生物降解和生物相容的。在一些情況下，聚合轉(zhuǎn)染劑的聚合物在聚合 物的主鏈中具有一個或多個叔胺，諸如每重復(fù)主鏈單元一個或兩個叔胺。所述聚合物還可 為共聚物，其中組分之一是聚(β_氨基酯）。本發(fā)明的聚合物由下式的任一種表示：
[0029
[0030] 其中A和B是可為任何取代或未取代、支化或未支化碳原子或雜原子鏈的連接子。 所述聚合物的分子量的范圍可為l〇〇〇g/mol至20，000g/mol、諸如5000g/mol至15 ,OOOg/ mol。在某些實施方案中，B是一至十二個碳原子的烷基鏈。在其它實施方案中，B是含有總共 一至十二個碳原子和雜原子的雜脂族鏈。基團RjPR 2可為各種各樣取代基的任一種。在某些 實施方案中，RdPR2可含伯胺、仲胺、叔胺、羥基和烷氧基。在某些實施方案中，所述聚合物是 胺-封端的;并且在其它實施方案中，所述聚合物是丙烯酸酯化封端的。在一些情況下，基團 心和/或1? 2與連接子A形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。含有此類環(huán)狀部分的聚合物具有在較低pH下更可溶的 性質(zhì)。目標聚合物是那些不溶于處于生理pH(pH 7.2-7.4)的水溶液中并且可溶于處于低于 生理pH(pH〈7.2)的水溶液中的聚合物。其它目標聚合物是那些可溶于處于生理pH(pH 7.2-7.4)和低于其的水溶液中的聚合物。在一些情況下，聚合轉(zhuǎn)染劑是美國專利No. 6，998，115 和7,427,394中描述的聚合物;其公開內(nèi)容通過引用并入本文。這些專利中描述的一種特異 性目標轉(zhuǎn)染劑是XFECT?轉(zhuǎn)染劑（Clontech ,Mountain View CA) 〇
[0031] 干組合物中的聚合轉(zhuǎn)染劑的量可變化。盡管所述組合物中的聚合轉(zhuǎn)染劑的量可變 化(并且可基于多種因素諸如但不限于轉(zhuǎn)染劑的特定類型、核酸類型、靶細胞類型、組合物 中的其它組分等），但在一些情況下干組合物中存在的聚合轉(zhuǎn)染劑的量的范圍為5至75重 量％，諸如5至50重量％并且包括10至30重量％，如25至27.5重量％。
[0032] 除了聚合轉(zhuǎn)染劑之外，本文所述的干組合物還包含緩沖液組分。所述緩沖液組分 可變化，其中目標緩沖液包括但不限于:磷酸鉀如磷酸鈉或鉀，檸檬酸鹽如檸檬酸鈉或鉀， 馬來酸，乙酸鹽如乙酸鈉、鉀或銨，三_(羥甲基)_氨基甲烷(tris)，三(羥甲基）甲基甘氨酸 (Tri cine )，HEPES，MOPS等。干組合物中存在的緩沖劑的量可變化。在一些情況下，選擇該量 使得當將Iyg干組合物與Ι0μ1水合并時，緩沖液在所得水性組合物中的濃度范圍為50至 500mM、諸如約75至350mM并包括約225至275mM，如250mM。干組合物中緩沖組分的量可變化， 其范圍在一些情況下為10至95重量％、諸如25至90重量％且包括50至80重量％，如72.5% 重量％。在某些實施方案中，所述緩沖劑將以足以提供在與水合并后從干組合物制備的所 得水性組合物中范圍為約5.0至10.0、諸如6.0至9.5的pH的量存在。
[0033] 在一些情況下，干組合物包含冷凍保護劑。冷凍保護劑意指用于在干燥期間如冷 凍-干燥過程中保護所述組合物組分的物質(zhì)。在一些情況下，冷凍保護劑是也不用作緩沖劑 的化合物。適合的冷凍保護劑包括但不限于:二醇，諸如乙二醇、丙二醇和甘油，一種或多種 糖(如一種或多種二糖，諸如海藻糖、松三糖(melizitose)、棉子糖），其中所述糖可與一種 或多種多元醇(如甘露醇、山梨糖醇)等混合。在那些包括冷凍保護劑的實施方案中，冷凍保 護劑可以各種量存在，其范圍在一些情況下為0.01至90重量％，諸如0.05至50重量％并包 括0.1至10重量％。在一些情況下，所述組合物不含冷凍保護劑，其中它們不包含至少不是 用作所述組合物組分所用的冷凍保護劑的量的冷凍保護劑。在此類情況下，所述組合物中 冷凍保護劑的量如果存在為1.0重量％或更少、諸如0.5重量％或更少、包括0.1重量％或更 少。
[0034] 除了聚合轉(zhuǎn)染劑和緩沖液之外，干組合物還可包含多種不同的組分，諸如但不限 于:粘合劑、填充劑、增量劑、張度劑、穩(wěn)定劑、表面活性劑、增溶劑、抗氧化劑、螯合劑、防腐 劑等。當存在時，這些組分可構(gòu)成組合物的0.1至99重量％、諸如1至50重量％、包括2至10重 量％。在一些情況下，干組合物僅由轉(zhuǎn)染劑組分和緩沖液組分構(gòu)成。
[0035] 在一些情況下，干組合物包含一種或多種核酸。目標核酸包括由脫氧核糖核苷酸、 核糖核苷酸或其組合組成的任何長度的聚合物，其中核酸長度可變化，如10個堿基或更長、 20個堿基或更長、50個堿基或更長、100個堿基或更長、500個堿基或更