一種原代成纖維細(xì)胞siRNA的轉(zhuǎn)染方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及細(xì)胞轉(zhuǎn)染領(lǐng)域，特別是涉及一種原代成纖維細(xì)胞SiRNA的轉(zhuǎn)染方法。
【背景技術(shù)】
[0002]siRNA是一種小RNA分子(21-25 bp)，它是siRISC中的主要成員，可激發(fā)與之互補(bǔ)的目標(biāo)mRNA的沉默，從而調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)、影響細(xì)胞的生物功能。由于其功能的獨(dú)特性，借助基因轉(zhuǎn)染，siRNA已被廣泛應(yīng)用于研究特定基因?qū)ζ鞴偕L、發(fā)育和分化的影響，也被作為一種基因藥物試用于預(yù)防和治療多種疾病如病毒感染、腫瘤、遺傳性和代謝性疾病以及神經(jīng)系統(tǒng)疾病?；蜣D(zhuǎn)染方法的選擇和這些方法轉(zhuǎn)染效率的高低，直接影響了 siRNA在這些領(lǐng)域的應(yīng)用和發(fā)展。
[0003]基因轉(zhuǎn)染是將具有生物功能的核酸轉(zhuǎn)移或運(yùn)送到細(xì)胞內(nèi)并使核酸在細(xì)胞內(nèi)維持其生物功能的過程。根據(jù)轉(zhuǎn)染機(jī)制和基因運(yùn)載系統(tǒng)的不同，基因轉(zhuǎn)染可分為物理性、化學(xué)性和病毒性三種，其中脂質(zhì)體和脂質(zhì)體復(fù)合物轉(zhuǎn)染是最常用的化學(xué)轉(zhuǎn)染。與其它基因一樣，siRNA轉(zhuǎn)染入細(xì)胞也需要借助于病毒載體或脂質(zhì)體載體。這些載體雖然作用機(jī)理不同，對細(xì)胞的毒副作用有輕有重，但大都可以有效地將基因轉(zhuǎn)入已成細(xì)胞系的細(xì)胞，并已在細(xì)胞系細(xì)胞的功能和生物性狀的研究中發(fā)揮過重要作用。然而研究中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞系細(xì)胞往往失去了部分源組織細(xì)胞的生物性狀，它的研究結(jié)果并不能完全反應(yīng)源組織細(xì)胞在體內(nèi)的生物過程，因此越來越多的研究直接使用原代培養(yǎng)的細(xì)胞，即原代細(xì)胞。病毒載體對原代細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率較高，但操作過程復(fù)雜、存在著可整合改變宿主細(xì)胞基因的隱患。脂質(zhì)體復(fù)合物載體操作簡單，不直接影響宿主基因，但對原代細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率不高，因此，完善轉(zhuǎn)染方法，提高轉(zhuǎn)染效率，將使脂質(zhì)體復(fù)合物轉(zhuǎn)染成為簡單、安全并高效的體外原代細(xì)胞的轉(zhuǎn)染方法，也將更有利于研究各種目的基因?qū)?xì)胞生物功能的影響。
[0004]成纖維細(xì)胞是結(jié)締組織的主要細(xì)胞成分，由胚胎時(shí)期的間充質(zhì)細(xì)胞分化而來，在組織損傷和修復(fù)中發(fā)揮重要作用。最新研究表明，成纖維細(xì)胞還可通過自身增殖和分泌功能的調(diào)節(jié)而推動(dòng)腫瘤的發(fā)展。因此，建立有效的原代成纖維細(xì)胞siRNA轉(zhuǎn)染方法將不僅有利于成纖維細(xì)胞基因調(diào)控的研究，也將有利于開發(fā)出一些藥物靶點(diǎn)來調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞的活性從而最終達(dá)到控制炎癥和腫瘤發(fā)展的目的。
[0005]常用的脂質(zhì)體或脂質(zhì)體復(fù)合物轉(zhuǎn)染試劑有Invitrogen公司的Lipofectamine、Qiagen 公司的 Hiferfect、Thermo Fisher Scientific 的 Darmafect。LipofectamineRNAiMAX是一種陽離子脂質(zhì)體試劑，其說明書中雖然說明僅用InM siRNA即可獲得較好的靶基因干擾效果，但在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用于原代成纖維細(xì)胞siRNA轉(zhuǎn)染時(shí)，轉(zhuǎn)染效率并不高，而提高siRNA濃度和轉(zhuǎn)染試劑的含量，其毒副作用也隨之提高。Darmafect也存在著類似的問題。
[0006]Hiperfect轉(zhuǎn)染試劑是一種陽離子和中性脂類的復(fù)合物，能實(shí)現(xiàn)高效的siRNA吸收和細(xì)胞內(nèi)siRNA的高效釋放，而且在使用高濃度siRNA時(shí)，細(xì)胞毒副作用低。但在觀察轉(zhuǎn)染效率時(shí)卻發(fā)現(xiàn)，按照常規(guī)的貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法或說明書中推薦的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，此轉(zhuǎn)染試劑的轉(zhuǎn)染效率依然很低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明主要解決的技術(shù)問題是提供一種原代成纖維細(xì)胞siRNA的轉(zhuǎn)染方法，改進(jìn)現(xiàn)存在的轉(zhuǎn)染方法，提高siRNA在原代成纖維細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率。
[0008]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的一個(gè)技術(shù)方案是:提供一種原代成纖維細(xì)胞siRNA的轉(zhuǎn)染方法，包括步驟為:將成纖維細(xì)胞接種于孔板上，在接種后的一定時(shí)間內(nèi)加入siRNA和轉(zhuǎn)染試劑的混合物溶液進(jìn)行轉(zhuǎn)染，所述一定時(shí)間為30-180 min。
[0009]在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述一定時(shí)間為30 min-60 min。
[0010]在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，轉(zhuǎn)染時(shí)所述成纖維細(xì)胞的接種濃度為2-6 X 14至24孔板或1.5-2.0X 15至6孔板。
[0011]在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，轉(zhuǎn)染時(shí)所述成纖維細(xì)胞的接種濃度為4 X 14至24孔板或1.5 X 15至6孔板。
[0012]在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述siRNA在與所述轉(zhuǎn)染試劑混合后的濃度為50-200 nMo
[0013]在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述siRNA在與所述轉(zhuǎn)染試劑混合后的濃度為100
nMo
[0014]在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述siRNA和轉(zhuǎn)染試劑的混合物是siRNA與轉(zhuǎn)染試劑按體積比為1:1_1:3進(jìn)行混合的。
[0015]在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述siRNA和轉(zhuǎn)染試劑的混合物是siRNA與轉(zhuǎn)染試劑按體積比為1:1進(jìn)行混合的。
[0016]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明的原代成纖維細(xì)胞siRNA的轉(zhuǎn)染方法，采用此轉(zhuǎn)染方法對原代成纖維細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染效率明顯增加，轉(zhuǎn)染效果穩(wěn)定，重復(fù)性好，避免了按照常規(guī)轉(zhuǎn)染方法或按照Hiperfect說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)所出現(xiàn)的問題。
【附圖說明】
[0017]為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案，下面將對實(shí)施例描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其它的附圖，其中:
圖1是本發(fā)明中成纖維細(xì)胞傳代后不同時(shí)間時(shí)加入轉(zhuǎn)染試劑和siRNA，目的基因被其siRNA knock down的程度，圖中所示是代表性目的基因透明質(zhì)酸合成酶2基因的siRNA對其表達(dá)的抑制程度。
[0018]圖2是本發(fā)明中加入轉(zhuǎn)染試劑后成纖維細(xì)胞的密度，A為轉(zhuǎn)染后24 h鏡下觀察結(jié)果，B為轉(zhuǎn)染后48 h鏡下觀察結(jié)果，C為轉(zhuǎn)染后72 h鏡下觀察結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)重復(fù)了 3次，圖中所示是一代表性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，放大倍數(shù)100X。
[0019]圖3是本發(fā)明中不同濃度的siRNA對目的基因knock down的效果，圖中所示是不同濃度代表性目的基因HAS2 siRNA對HAS2基因表達(dá)的影響。
[0020]圖4是本發(fā)明中不同濃度的siRNA對目的基因knock down的效果，圖中所示是不同濃度代表性目的基因HAS2 siRNA knock down HAS2基因后，成纖維細(xì)胞合成HA能力的變化。
[0021]圖5是本發(fā)明中采用的細(xì)胞接種數(shù)、接種時(shí)間和siRNA濃度(如文中所述)，在轉(zhuǎn)染后24 h、48 h和72 h時(shí)對目的基因knock down的效果，圖中所示是代表性目的基因HAS2siRNA 的 knock down 效果。
[0022]圖6是本發(fā)明中采用的細(xì)胞接種數(shù)、接種時(shí)間和siRNA濃度(如文中所述)，在轉(zhuǎn)