一種人原代成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為表皮細(xì)胞的方法【專利摘要】本發(fā)明涉及組織工程領(lǐng)域，具體是一種人原代成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為表皮細(xì)胞的方法，包括以下步驟：將人原代成纖維細(xì)胞培養(yǎng)于含10％胎牛血清的DMEM中，37℃、5％CO2培養(yǎng)，每3?5天換液，根據(jù)細(xì)胞的生長速度和細(xì)胞培養(yǎng)皿中成纖維細(xì)胞密度進(jìn)行1:3傳代，培養(yǎng)120天以上。本發(fā)明人原代成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為表皮細(xì)胞的過程中沒有利用到細(xì)胞重編程技術(shù)，沒有外源性的干擾細(xì)胞的基因組成，保證了轉(zhuǎn)化所得細(xì)胞的功能性和安全性。本發(fā)明將人原代成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為表皮細(xì)胞有望成為臨床工作中創(chuàng)面修復(fù)的一種新手段?！緦＠f明】一種人原代成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為表皮細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
[0001]本發(fā)明涉及組織工程領(lǐng)域，具體地說，是醫(yī)學(xué)創(chuàng)面修復(fù)
技術(shù)領(lǐng)域：
的一種人原代成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為表皮細(xì)胞的方法。【
背景技術(shù)：
】[0002]表皮細(xì)胞是皮膚組織工程的“種子細(xì)胞”，可以加速皮膚上皮化，促進(jìn)創(chuàng)面愈合。自體表皮細(xì)胞體外擴增和移植技術(shù)與傳統(tǒng)植皮手術(shù)相比具有損傷小、修復(fù)面積大、對患者全身情況影響小等優(yōu)點。但表皮細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和體外擴增難度很大，細(xì)胞培養(yǎng)過程中需要表皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基，費用昂貴，細(xì)胞生長速度緩慢。[0003]成纖維細(xì)胞是機體疏松結(jié)締組織的主要細(xì)胞成分，在人體中來源廣泛，其分離、培養(yǎng)和體外擴增技術(shù)已經(jīng)日臻完善。SebeA等已成功將成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)成為神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞及多能干細(xì)胞。(SebeA1IvicsZ.ReprogrammingofHumanFibroblaststoInducedPluripotentStemCellswithSleepingBeautyTransposon-BasedStableGeneDelivery.MethodsMolB1l.2016;1400:419-27)[0004]分離患者的成纖維細(xì)胞進(jìn)行大量快速的體外擴增，而后將成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)成為表皮細(xì)胞回植于患者自體創(chuàng)面，可以有效縮短創(chuàng)面上皮化時間，起到加速創(chuàng)面愈合的作用。2014年ChenY等將p63和Klf4兩種基因?qū)氤衫w維細(xì)胞，成功誘導(dǎo)出類表皮細(xì)胞，但該研究中發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)所得細(xì)胞與表皮細(xì)胞相比在功能方面存在明顯差距，并且誘導(dǎo)所得的類表皮細(xì)胞存在癌變可能(ChenY1MistryDS,SenGL.Highlyrapidandefficientconvers1nofhumanfibroblaststokeratinocyte-likecells.JInvestDermatol.2014Feb；134(2):335-44.)。到目前為止，未曾有將人原代成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為表皮細(xì)胞后成功應(yīng)用于創(chuàng)面修復(fù)，且無致癌作用的研究報道?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種將人原代成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為表皮細(xì)胞的方法。[0006]本發(fā)明通過獲取臨床上包皮環(huán)切患者術(shù)后的多余包皮，利用酶分離法分離所取組織的表皮和真皮層，并獲取單個成纖維細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。本發(fā)明成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為表皮細(xì)胞過程不包含細(xì)胞重編程、慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染等改變細(xì)胞基因組成的操作。所得表皮細(xì)胞不僅保留了表皮細(xì)胞促進(jìn)創(chuàng)面愈合，改善創(chuàng)面修復(fù)質(zhì)量的特性，而且該細(xì)胞不具有致癌性。同時，本發(fā)明研究過程中發(fā)現(xiàn)同樣條件下培養(yǎng)120天人脂肪成纖維細(xì)胞、瘢痕成纖維細(xì)胞和腫瘤成纖維細(xì)胞均不能轉(zhuǎn)化為表皮細(xì)胞。[0007]本發(fā)明的第一方面，提供一種人原代成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為表皮細(xì)胞的方法，包括以下步驟:將人原代成纖維細(xì)胞培養(yǎng)于含體積百分比10%的胎牛血清Fatalbovineserum(FBS)的Dulbecco，smodificat1nofEagle’smediumDulbecco(DMEM)中，37°C、5%C〇2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3-5天換液，根據(jù)細(xì)胞的生長速度和細(xì)胞培養(yǎng)皿中成纖維細(xì)胞密度進(jìn)行1:3傳代，培養(yǎng)120天以上。[0008]本發(fā)明的鑒定試驗證明，采用上述方法，在第100天，部分成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為表皮細(xì)胞，在第120天，90%以上成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化表皮細(xì)胞。[0009]優(yōu)選的，所述的人原代成纖維細(xì)胞是皮膚來源的人原代成纖維細(xì)胞。更優(yōu)選采用人包皮組織獲取的人原代成纖維細(xì)胞。[0010]所述的人原代成纖維細(xì)胞的制備方法，包括以下步驟:將皮膚組織利用洗必泰清洗，再用phosphatebufferedsaline(PBS)清洗，無菌條件下修剪，去除皮下組織，將修剪好的皮片浸入體積百分比0.25%的DispaseII酶，4°C消化16h。在無菌條件下鈍性分離皮片表皮和真皮層，將真皮加入體積百分比0.2%膠原酶I37°C水浴消化lh，以體積百分比10%的FBS培養(yǎng)基終止消化后將真皮組織過200目濾器研磨過濾，得到人原代成纖維細(xì)胞。[0011]本發(fā)明的第二方面，提供一種誘導(dǎo)得到的表皮細(xì)胞，采用上述任一所述的人原代成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為表皮細(xì)胞的方法制備得到。[0012]所述的誘導(dǎo)得到的表皮細(xì)胞的培養(yǎng)和凍存方法:配制含體積百分比10%的二甲基亞砜(DMSO)和體積百分比90%的FBS的凍存培養(yǎng)液，取對數(shù)生長期的細(xì)胞，用胰蛋白酶把單層生長的細(xì)胞消化下來移至15ml離心管中，離心100rpm，5min，去除胰蛋白酶加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液，調(diào)節(jié)細(xì)胞的密度為IX107/ml，利用程序降溫冰盒冷凍細(xì)胞，而后移入液氮凍存?zhèn)溆?。[0013]本發(fā)明的第三方面，提供上述誘導(dǎo)得到的表皮細(xì)胞的應(yīng)用，用于制備促進(jìn)創(chuàng)面愈合或改善創(chuàng)面修復(fù)質(zhì)量的藥物或制劑。[0014]本發(fā)明優(yōu)點在于:[0015]1、本發(fā)明人原代成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為表皮細(xì)胞操作方法簡單，重復(fù)性好。過程中成纖維細(xì)胞和表皮細(xì)胞的培養(yǎng)都應(yīng)用常用的DMEM培養(yǎng)基及細(xì)胞培養(yǎng)條件。而既往未有相關(guān)發(fā)現(xiàn)，可能是因為成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為表皮細(xì)胞所需的轉(zhuǎn)化周期長，本發(fā)明是一次意外事件偶然發(fā)現(xiàn)120天以上能夠轉(zhuǎn)化成表皮細(xì)胞。[0016]2、本發(fā)明人原代成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為表皮細(xì)胞過程中，并未采用細(xì)胞重編程技術(shù)外源性誘導(dǎo)細(xì)胞基因變化，沒有影響成纖維細(xì)胞本身的遺傳特性。對于后期成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化表皮細(xì)胞過程中細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞基因表達(dá)和細(xì)胞功能等研究打下良好基礎(chǔ);也為后期明確轉(zhuǎn)化機制，縮短轉(zhuǎn)化時間，提高轉(zhuǎn)化效率提供了研究條件。[0017]3、原代表皮細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和體外擴增難度很大，培養(yǎng)基昂貴，生長緩慢。成纖維細(xì)胞的來源比較廣泛，培養(yǎng)和擴增的技術(shù)相對比較成熟。誘導(dǎo)所得表皮細(xì)胞具有理想的功能性和安全性。誘導(dǎo)所得細(xì)胞保留了表皮細(xì)胞促進(jìn)創(chuàng)面愈合，改善創(chuàng)面修復(fù)質(zhì)量的特性，同時又不具備形成腫瘤的特性?！靖綀D說明】[0018]圖1為本發(fā)明中人原代成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為表皮細(xì)胞的過程。[0019]圖2為G418篩選綠色熒光GFP陽性的成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為表皮細(xì)胞的過程。[0020]圖3為采用免疫熒光的方法鑒定人原代成纖維細(xì)胞向表皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)化過程。[0021]圖4為細(xì)胞成球?qū)嶒?。[0022]圖5為裸鼠荷瘤實驗。[0023]圖6為裸鼠全層皮膚缺損移植人原代成纖維細(xì)胞組(人原代成纖維細(xì)胞組)、人原代表皮細(xì)胞(人原代表皮細(xì)胞組)、誘導(dǎo)所得表皮細(xì)胞(誘導(dǎo)表皮細(xì)胞組)及空白對照組的創(chuàng)面愈合過程大體觀。[0024]圖7為裸鼠全層皮膚缺損移植術(shù)后24天病理切片HE染色圖?！揪唧w實施方式】[0025]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明提供的【具體實施方式】作詳細(xì)說明。[0026]實施例1.成纖維細(xì)胞的制備和培養(yǎng)[0027]1、成纖維細(xì)胞的獲取[0028]經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，包皮切除患者知情同意，選擇肝炎病毒抗體、梅毒抗體及HIV均為陰性的患者的手術(shù)切除包皮，利用洗必泰清洗5minX3遍，再用PBS清洗5minX3遍，無菌條件下修建包皮，去除包皮多余的真皮及皮下組織，將包皮修建為0.5X0.5cm大小的皮片，將皮片浸入0.25%DispaseII酶，4°C消化16h。在無菌條件下鈍性分離皮片表皮和真皮層，將所得真皮加入0.2%膠原酶I370C水浴消化Ih，以10%FBS培養(yǎng)基終止消化后將真皮組織過200目濾器研磨過濾，獲取人原代成纖維細(xì)胞。[0029]2、人原代成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定[0030]將人原代成纖維細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS的DMEM中，37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3-5天換液，根據(jù)細(xì)胞的生長速度和細(xì)胞培養(yǎng)皿中成纖維細(xì)胞密度進(jìn)行1:3傳代(結(jié)果見圖1)。圖2采用免疫熒光技術(shù)，Vimentin和a-SMA雙標(biāo)鑒定人原代成纖維細(xì)胞，證明該細(xì)胞為成纖維細(xì)胞。[0031]實施例2.成纖維細(xì)胞向表皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)化[0032]1、人原代成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為表皮細(xì)胞[0033]將人原代成纖維細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，37°C、5%⑶2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3-5天換液，根據(jù)細(xì)胞的生長速度和細(xì)胞培養(yǎng)皿中成纖維細(xì)胞密度進(jìn)行I:3傳代。在第100天，部分成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為表皮細(xì)胞，在第120天，90%以上成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化表皮細(xì)胞(結(jié)果見圖1)。圖3采用免疫焚光技術(shù)，keratin6和keratin18雙標(biāo)鑒定誘導(dǎo)所得表皮細(xì)胞，證明該細(xì)胞為表皮細(xì)胞。[0034]2、G418篩選綠色熒光GFP陽性的成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為表皮細(xì)胞[0035]利用電轉(zhuǎn)染技術(shù)將GFP陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)入人皮膚原代成纖維細(xì)胞(300v，10ms)。利用G418將GFP陰性的細(xì)胞篩除，顯微鏡下觀察視野中約剩余2個成纖維細(xì)胞，均為典型的長條狀成纖維細(xì)胞，視野中未見表皮細(xì)胞。第70天，成纖維細(xì)胞形態(tài)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槎噙呅危?20天，細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)化為多邊形和圓形的表皮細(xì)胞(結(jié)果見圖2)。[0036]3、細(xì)胞成球?qū)嶒灆z測誘導(dǎo)所得表皮細(xì)胞的多能性[0037]將人原代成纖維細(xì)胞、人原代表皮細(xì)胞、誘導(dǎo)所得表皮細(xì)胞和肝癌Hep3B細(xì)胞加入懸浮球特定培養(yǎng)基(含類胰島素生長因子、表皮細(xì)胞生長因子和成纖維細(xì)胞生長因子)，7天后顯微鏡觀察每組細(xì)胞懸浮球形態(tài)，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞成球大而且數(shù)量多，人原代成纖維細(xì)胞和誘導(dǎo)所得表皮細(xì)胞可以形成懸浮球，人原代表皮細(xì)胞無懸浮球形成(圖4A)。采用免疫熒光技術(shù)，利用0CT3/4抗體單標(biāo)懸浮球，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞Hep3B懸浮球高表達(dá)0CT3/4，而人原代成纖維細(xì)胞和誘導(dǎo)所得表皮細(xì)胞不表達(dá)(圖4B)。[0038]實施例3.動物實驗[0039]1、裸鼠荷瘤實驗檢測誘導(dǎo)所得細(xì)胞的安全性[0040]取雄性裸鼠10只(由上海西普爾一必凱實驗動物有限公司提供)，將人原代表皮細(xì)胞和誘導(dǎo)所得表皮細(xì)胞用流式細(xì)胞儀計數(shù)為IX107/ml，選取裸鼠右側(cè)背部皮下注射。裸鼠注射細(xì)胞處皮膚可見點狀突起，40天后，裸鼠背部皮膚無突起(圖5A)。解剖皮下組織進(jìn)行HE染色，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)所得表皮細(xì)胞組有毛囊樣結(jié)構(gòu)出現(xiàn)，兩組裸鼠均未見腫瘤組織(圖5B)。[0041]2、誘導(dǎo)所得表皮細(xì)胞修復(fù)裸鼠創(chuàng)面實驗[0042]取雄性裸鼠24只，常規(guī)I%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，酒精消毒。于每只裸鼠背部右側(cè)分別制作直徑為IX1.5cm的長方形全層皮膚缺損創(chuàng)面，將裸鼠隨機分為人原代成纖維細(xì)胞組、人原代表皮細(xì)胞組、誘導(dǎo)表皮細(xì)胞組及空白對照組，每組6個創(chuàng)面。人原代成纖維細(xì)胞組、人原代表皮細(xì)胞組和誘導(dǎo)表皮細(xì)胞組均將0.2ml的IX107/ml單細(xì)胞懸液均勻滴涂在創(chuàng)面上，空白對照組創(chuàng)面不做任何處理。三組創(chuàng)面應(yīng)用凡士林紗布覆蓋保護(hù)創(chuàng)面，用4-0號線將包裹無菌紗布的凡士林紗布打包固定于創(chuàng)周皮膚。術(shù)后第6、12、18和24天進(jìn)行觀察拍照(圖6)。通過圖像分析軟件ImageJ比較各組創(chuàng)面愈合率(創(chuàng)面愈合率=(初始創(chuàng)面面積-殘余創(chuàng)面面積)/初始創(chuàng)面面積)。[0043]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，移植后18天人原代表皮細(xì)胞組和誘導(dǎo)表皮細(xì)胞組創(chuàng)面愈合速度即明顯高于空白對照組(P〈0.05)。移植后24天，人原代表皮細(xì)胞組和誘導(dǎo)表皮細(xì)胞組創(chuàng)面基本愈合，而人原代成纖維細(xì)胞組和空白對照組還殘留創(chuàng)面(結(jié)果見圖6)。移植后24天取材切片行HE染色和免疫組化，可見誘導(dǎo)表皮細(xì)胞組出現(xiàn)明顯的新生表皮結(jié)構(gòu)，而在空白對照組未觀察到此結(jié)構(gòu);免疫組化結(jié)果顯示誘導(dǎo)表皮細(xì)胞治療組表皮層基底部有人角蛋白6陽性細(xì)胞(圖7)。[0044]實驗結(jié)果表明，本發(fā)明轉(zhuǎn)化所得的表皮細(xì)胞具有明確的細(xì)胞多能性和安全性，在特定培養(yǎng)基中可以培養(yǎng)形成懸浮球，但免疫熒光結(jié)果證實該懸浮球不表達(dá)腫瘤相關(guān)基因，裸鼠荷瘤實驗同樣也證實了該細(xì)胞不具有成瘤特性。另外，該細(xì)胞保持了表皮細(xì)胞的功能性，在裸鼠創(chuàng)面修復(fù)實驗中，該細(xì)胞和原代表皮細(xì)胞同樣可以明顯加速創(chuàng)面愈合。因此，將人原代成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為表皮細(xì)胞有望成為臨床工作中創(chuàng)面修復(fù)的一種新手段。[0045]以上已對本發(fā)明創(chuàng)造的較佳實施例進(jìn)行了具體說明，但本發(fā)明創(chuàng)造并不限于所述實施例，熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不違背本發(fā)明創(chuàng)造精神的前提下還可做出種種的等同的變型或替換，這些等同的變型或替換均包含在本申請權(quán)利要求所限定的范圍內(nèi)?！局鳈?quán)項】1.一種人原代成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為表皮細(xì)胞的方法，其特征在于，包括以下步驟:將人原代成纖維細(xì)胞培養(yǎng)于含體積百分比10%胎牛血清的DMEM中，37°C、5%⑶2培養(yǎng)，每3-5天換液，根據(jù)細(xì)胞的生長速度和細(xì)胞培養(yǎng)皿中成纖維細(xì)胞密度進(jìn)行I:3傳代，培養(yǎng)120天以上。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人原代成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為表皮細(xì)胞的方法，其特征在于，所述的人原代成纖維細(xì)胞為人皮膚組織來源的人原代成纖維細(xì)胞。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人原代成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為表皮細(xì)胞的方法，其特征在于，所述的人皮膚組織來源的人原代成纖維細(xì)胞的制備方法，包括以下步驟:將皮膚組織利用洗必泰清洗，再用PBS清洗，無菌條件下修剪，去除皮下組織，將修剪好的皮片浸入體積百分比0.25%DispaseII酶，4°C消化16h;在無菌條件下鈍性分離皮片表皮和真皮層，將真皮加入體積百分比0.2%膠原酶I37°C水浴消化lh，以體積百分比10%FBS培養(yǎng)基終止消化后將真皮組織過200目濾器研磨過濾，得到人原代成纖維細(xì)胞。4.一種誘導(dǎo)得到的表皮細(xì)胞，其特征在于，采用權(quán)利要求1-3任一所述的人原代成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為表皮細(xì)胞的方法制備得到。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的誘導(dǎo)得到的表皮細(xì)胞，其特征在于，所述的誘導(dǎo)得到的表皮細(xì)胞的培養(yǎng)和凍存方法:配制含體積百分比10%二甲基亞砜和體積百分比90%FBS的凍存培養(yǎng)液，取對數(shù)生長期的細(xì)胞，用胰蛋白酶把單層生長的細(xì)胞消化下來移至15ml離心管中，離心lOOOrpm，5min，去除胰蛋白酶加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液，調(diào)節(jié)細(xì)胞的密度為IX17/ml，利用程序降溫冰盒冷凍細(xì)胞，而后移入液氮凍存?zhèn)溆谩?.根據(jù)權(quán)利要求4所述的誘導(dǎo)得到的表皮細(xì)胞的應(yīng)用，其特征在于，用于制備促進(jìn)創(chuàng)面愈合或改善創(chuàng)面修復(fù)質(zhì)量的藥物或制劑?！疚臋n編號】C12N5/071GK105925524SQ201610389144【公開日】2016年9月7日【申請日】2016年6月2日【發(fā)明人】劉善榮,張放,張丹丹【申請人】中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)