胍基取代的芳香化合物修飾的高分子材料、制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及高分子化學(xué)、有機合成以及生物材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于胍 基取代的芳香化合物修飾的高分子材料及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 基因轉(zhuǎn)染是指將具有生物功能的核酸導(dǎo)入到細胞內(nèi)并使核酸在細胞內(nèi)表達其生 物功能的過程。在這個過程中，高分子材料扮演了重要的角色。早期的轉(zhuǎn)染方法是利用磷 酸鈣進行轉(zhuǎn)染，然而這種方法的效率很低，且對很多種細胞無效，不能滿足很多科研工作的 要求。因此為了提高基因轉(zhuǎn)染效率，開發(fā)了兩大類的載體：病毒類載體和非病毒類載體。利 用病毒轉(zhuǎn)染方法可以獲得高效基因轉(zhuǎn)染效果，但病毒類載體存在細胞株適用性，攜帶基因 能力有限，容易引起細胞免疫反應(yīng)，存在安全隱患等問題。因此對非病毒類高分子材料一陽 離子脂質(zhì)體、陽離子聚合物以及其經(jīng)過修飾所得到的載體進行了廣泛的研究。
[0003]聚酰胺-胺樹形高分子（polyamidoamine，PAMAM)是TomaliaD.A.于 1985 年首 次報道的具有幾何分支的橢圓形結(jié)構(gòu)的樹形大分子。其高效低毒安全的特點已經(jīng)在基因轉(zhuǎn) 染中被廣泛研究和應(yīng)用，得到了人們的廣泛關(guān)注。1993年，Meijer等用外向發(fā)散法合成聚 丙稀亞胺（Polypropyleneimine，PPI)樹形高分子，首次實現(xiàn)了大規(guī)模合成和商業(yè)化，為樹 形高分子的廣泛研究和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。樹形高分子的特殊結(jié)構(gòu)使其易于結(jié)合基因質(zhì)粒 片段，并且其內(nèi)部三級胺結(jié)構(gòu)可以起到"質(zhì)子海綿"的作用，促進其在細胞內(nèi)涵體的逃逸行 為，有效地確保目的基因在細胞內(nèi)的穩(wěn)定性。近年來，將聚酰胺-胺、聚丙烯亞胺、聚賴氨酸 樹形高分子以及聚乙烯亞胺陽離子高分子表面氨基進行化學(xué)修飾成為主要修飾形式之一。 例如在表面氨基上共價連接疏水基團、氨基酸，可以獲得相對較好的基因轉(zhuǎn)染效果。其中， 在陽離子高分子表面氨基修飾疏水基團，例如修飾脂肪鏈可以有效地提高材料的抗血清能 力，增強材料的膜融合能力、細胞攝入能力和細胞內(nèi)的核酸釋放能力。此外修飾了脂肪鏈 的陽離子高分子還可以通過窖蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑進入細胞。因此疏水修飾廣泛應(yīng)用于 提高高分子材料的基因轉(zhuǎn)染效果。陽離子高分子表面修飾氨基酸，例如精氨酸或賴氨酸， 也能夠有效地提高陽離子高分子的基因轉(zhuǎn)染效果。精氨酸富含胍基基團，胍基基團能夠和 細胞膜相互作用，富含精氨酸的肽鏈可以直接作為基因轉(zhuǎn)染載體。胍基基團能夠通過靜電 力和氫鍵兩種力的相互作用有效的結(jié)合磷酸根，從而提高樹形高分子結(jié)合細胞膜的能力。 但是通過在樹形高分子表面氨基和胍基之間引入不同長度的連接鍵證明：連接鍵在胍基和 細胞膜相互作用中具有重要作用，不同的連接鍵會導(dǎo)致樹形高分子在細胞中的攝入能力不 同。研究結(jié)果充分說明了胍基基團只有和恰當(dāng)?shù)倪B接鍵相連才能充分發(fā)揮其作用。以第五 代聚酰胺胺樹形高分子表面修飾精氨酸為例，精氨酸能夠有效的提高樹形高分子的轉(zhuǎn)染 效率。但是精氨酸修飾對樹形高分子的轉(zhuǎn)染能力提高有限，無法和廣泛使用的商業(yè)化試劑 Lipofectamine2000(Lipo2K)相比。研究結(jié)果表明精氨酸修飾中連接胍基和樹形高分子 表面氨基的連接鍵并不是最佳的連接方式。
[0004] 苯基作為一種疏水基團連接在樹形高分子表面的氨基上，能夠增加樹形高分子的 疏水性，有利于樹形高分子穿過細胞膜的疏水脂雙層。但是由于樹形高分子和細胞膜之間 主要通過靜電力相互作用，樹形高分子表面氨基修飾苯甲酸后雖然增加了材料的疏水性， 卻也同時削弱了樹形高分子表面的正電荷，因此樹形高分子表面氨基修飾苯甲酸，不能有 效的提高樹形高分子的轉(zhuǎn)染效率。因此在苯基上連接功能基團成為一種非常重要的提高樹 形高分子轉(zhuǎn)染能力的方式。
[0005] 已知的基于脂肪鏈或精氨酸修飾的高分子材料的較高的細胞毒性、較低的轉(zhuǎn)染效 果以及細胞株的選擇性，是制約這些材料在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的主要因素。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，獲得具有更好的轉(zhuǎn)染效果以及生物相容性的載體， 本發(fā)明提出了一種胍基取代的芳香化合物修飾的高分子材料及其制備方法，即基于胍基取 代的芳香化合物表面化學(xué)共價修飾的高分子材料及其制備方法。本發(fā)明的合成方法高效、 安全，合成步驟簡潔，獲得的高分子材料細胞毒性較小，且能在多種難轉(zhuǎn)染的細胞中具有高 轉(zhuǎn)染效率。并且所制備的高分子材料不論是DNA轉(zhuǎn)染還是RNA轉(zhuǎn)染都和商業(yè)化轉(zhuǎn)染試Lipo 2K相當(dāng)甚至超越商業(yè)化轉(zhuǎn)染試劑，更值得人注意的是在蛋白轉(zhuǎn)染中，所制備的材料的轉(zhuǎn)染 效率遠超過商業(yè)化轉(zhuǎn)染試劑Lipo2K。
[0007] 本發(fā)明提供了一種胍基取代的芳香化合物修飾的高分子材料，即基于陽離子高分 子和胍基取代的芳香化合物的高分子材料，包括陽離子高分子骨架和胍基取代的芳香化合 物功能基團，所述胍基取代的芳香化合物功能基團共價連接在所述陽離子高分子骨架表 面。
[0008] 其中，所述胍基取代的芳香化合物修飾的高分子材料的結(jié)構(gòu)如式（1)所示：
[0009]
[0010] 式⑴中：
[0011] R為陽離子高分子骨架；
[0012] Y為連接鍵；
[0013] X為 1-1024 的整數(shù)。
[0014] 其中，所述R為如（8)所示的聚酰胺-胺樹形高分子、如式（9)所示的聚丙烯亞胺 樹形高分子、如式（10)所示的聚賴氨酸樹形高分子、如式（11)所示的支化聚乙烯亞胺或 如式（12)所示的線性聚乙烯亞胺；
[0015]
[0016]其中，式（8)、式（9)、式（10)中：
[0017] Μ是陽離子高分子的核心，包括氨、乙二胺、丁二胺、己二胺、辛二胺、葵二胺和1， 12-十二烷二胺；
[0018] η是1-10的整數(shù)；
[0019] m是2-4的整數(shù)；
[0020] 式（11)和式（12)中：
[0021] y和z是1-5117的整數(shù)。
[0022] 其中，所述Y如式（13)、式（14)、式（15)、式（16)、式（17)或式（18)所示：
[0024]式（17)中：
[0025]k為1-20的整數(shù)。
[0026] 本發(fā)明還提出了一種高分子材料，其結(jié)構(gòu)如式（1)所示；其中，所述R為如式（8) 所示的聚酰胺-胺樹形高分子；所述Y為如式（13)所示的酰胺鍵；所述X為1-1024的整數(shù) 倍；
[0027]
[0028]式（8):
[0029]Μ是聚酰胺-胺樹形高分子的核心，包括氨、乙二胺、丁二胺、己二胺、辛二胺、癸二 胺和1，12-十二燒二胺；
[0030] η是1-10的整數(shù)；
[0031] m是2-4的整數(shù)。
[0032] 其中，所述高分子表面為伯胺基團或仲胺基團。
[0033] 本發(fā)明還提出了一種胍基取代的芳香化合物修飾的高分子材料的制備方法，將胍 基取代的芳香化合物和陽離子高分子溶解于有機溶劑中，加入一定量的催化劑和堿，在室 溫下攪拌充分反應(yīng)，除去未反應(yīng)的胍基取代的芳香化合物以及相關(guān)溶劑，即得到所述的胍 基取代的芳香化合物修飾的的高分子材料，所述高分子材料結(jié)構(gòu)如式（1)所示。本發(fā)明制 備方法是通過將胍基取代的芳香化合物共價連接到陽離子高分子表面上，即陽離子高分子 的伯胺基團或仲胺基團與胍基取代的芳香化合物通過化學(xué)反應(yīng)相連，從而制備得到如式 (1)所示的高分子材料。
[0034] 其中，所述制備方法中，所述催化劑選自：二環(huán)己基碳二亞胺，N-羥基琥珀酰亞 胺。
[0035] 所述堿為三乙胺。
[0036] 所述有機溶劑選自：二甲基亞砜，N，N_二甲基甲酰胺。
[0037] 本發(fā)明還提出了胍基取代的芳香化合物修飾的高分子材料作為核酸或蛋白分子 的輸送載體的應(yīng)用。其中胍基取代的芳香化合物修飾的高分子材料如式（1)所示，其在體 外作為核酸或蛋白分子的輸送載體。其中，所述核酸包括DNA、siRNA、shRNA、micoRNA或修 飾的核酸；所述蛋白為肽、修飾的肽、蛋白或修飾的蛋白。
[0038] 本發(fā)明還提出了一種新的復(fù)合物，其包括如式（1)所示的胍基取代的芳香化合物 修飾的高分子材料、核酸或蛋白；其中，在該復(fù)合物中，由所述高分子材料攜帶所述核酸或 蛋白。
[0039] 在一個具體的實施例中，在室溫下，將胍基取代的芳香化合物修飾的高分子材料 和綠色熒光蛋白質(zhì)粒或熒光素酶質(zhì)?；騭iRN