一種黨參愈傷組織和懸浮細(xì)胞的快速繁殖方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公布了一種黨參愈傷組織和懸浮細(xì)胞的快速繁殖方法，包括無(wú)菌外植體的獲得、愈傷組織的誘導(dǎo)、懸浮細(xì)胞培養(yǎng)、水楊酸調(diào)控懸浮細(xì)胞中酶的活性及黨參多糖含量等步驟，本發(fā)明方法所制備的黨參懸浮細(xì)胞中含有較高含量的黨參多糖。本發(fā)明方法利用水楊酸對(duì)黨參懸浮細(xì)胞進(jìn)行有目的的調(diào)控，可以在短期內(nèi)獲得大量的制藥原料，并能有效降低生產(chǎn)成本。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種黨參愈傷組織和懸浮細(xì)胞的快速繁殖方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及黨參懸浮細(xì)胞的制備方法，尤其是水楊酸對(duì)黨參懸浮細(xì)胞中多糖含量的調(diào)控。
【背景技術(shù)】
[0002]黨參(Codonopsis pilosula)別名三葉菜、葉子單、臭黨參,為桔?？浦参稂h參、素花黨參或川黨參的干燥根。其性味甘平、無(wú)毒、有補(bǔ)中益氣、生津止渴等功效。和人參、丹參等傳統(tǒng)中藥材比較，黨參是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)較少人研究的傳統(tǒng)草本藥物。黨參中含量最多的為黨參多糖，黨參多糖亦是黨參中的有效成分之一，近年來(lái)的研究表明，黨參多糖具有降血糖，降血脂作用，抗?jié)兓钚缘茸饔?，其在調(diào)節(jié)免疫功能中具有抗病毒、抗衰老、抗氧化、抗腫瘤等作用，本發(fā)明為其今后藥用成分的開(kāi)發(fā)利用提供基礎(chǔ)。
[0003]水楊酸(SA)是一種廣泛存在于植物體內(nèi)的酚類(lèi)物質(zhì)參與植物體內(nèi)許多生理過(guò)程，特別是作為植物系統(tǒng)獲得性抗性所需的信號(hào)分子引起人們的廣泛關(guān)注。植物中加入水楊酸可以改變酶的活性，提高植物的抗逆性，抗病性，還可以促進(jìn)植物體內(nèi)次生代謝物的合成。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供黨參細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的快速繁殖方法，并通過(guò)水楊酸對(duì)懸浮細(xì)胞調(diào)控獲得生長(zhǎng)良好，多糖含量高的懸浮細(xì)胞，可以規(guī)?；臑樗帍S提供多糖的來(lái)源。
[0005]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用下列技術(shù)方案:
取黨參葉片和芽，洗衣粉浸泡4分鐘，流水沖洗I小時(shí)，經(jīng)酒精20s，氯化汞消毒lOmin，無(wú)菌水沖洗5遍，接種入MS培養(yǎng) 基中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，附加激素0.5mg/LNAA, 3mg/LIBA,蔗糖 30g/L，瓊脂 6.5g/L，pH=5.8-6.0，溫度 23°C，濕度 40% ~60%，光強(qiáng)度 1000LX ;光期 12h暗期12h ;取誘導(dǎo)出來(lái)的嫩綠松散的愈傷組織，接種到盛有50 mLMS液體培養(yǎng)基100 mL三角瓶中，培養(yǎng)基配方為B5+lmg/L IAA+lmg/LKT，搖床轉(zhuǎn)速為120r/min，溫度為25°C，黑暗培養(yǎng)，每隔7d繼代一次，連續(xù)培養(yǎng)4-5代后逐漸形成穩(wěn)定的細(xì)胞系，進(jìn)行懸浮培養(yǎng)系的誘導(dǎo)。將2mg/L水楊酸溶液加入誘導(dǎo)出的懸浮培養(yǎng)系中進(jìn)行調(diào)控，25天后取樣稱(chēng)重，測(cè)定酶的活性和多糖的含量。
[0006]所述培養(yǎng)基消毒方式為在121°C下滅菌20min。
[0007]所述的稀土優(yōu)選是硝酸鈰稀土。
[0008]所述的多糖提取方法為精密稱(chēng)取干樣品lg，用潔凈研缽小心研碎，轉(zhuǎn)入200 mL容量瓶中，加入50 mL甲醇(100%)，于超聲波液體振蕩器上振蕩45 min，溫度60°C，過(guò)濾分離，收集濾液，最后用100%甲醇細(xì)心洗下，合并各次洗液于25 mL棕色容量瓶中作為待檢測(cè)液。
[0009]所述的多糖測(cè)定方法為蒽酮硫酸法，使用葡萄糖配制不同濃度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。取提取出來(lái)的提取液1.0mL加蒽酮試劑5mL，在620nm波長(zhǎng)下顯色測(cè)定吸光度，重復(fù)3次，求平均值。
[0010]結(jié)果計(jì)算
多糖含量(W)=CVtZio6WV1
式中:C:從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得葡萄糖量(μ g)；
Vt:樣品提取液總體積(mL)；
V1:顯色時(shí)取樣量(mL)；
W:樣品重(g)。
[0011]所述的酶活性的測(cè)定方法采用分光光度法測(cè)定
采用本發(fā)明制備的黨參懸浮細(xì)胞，生長(zhǎng)速度快，多糖含量高，利于大生產(chǎn)操作，能耗小，污染小，黨參懸浮細(xì)胞增量為對(duì)照的4倍，多糖得率為12.87%。
[0012]下面將結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明要求保護(hù)的范圍并不局限于下列實(shí)施方式。
【具體實(shí)施方式】
[0013]實(shí)施例1
取室外黨參春天新出幼嫩葉片，嫩芽，洗衣粉浸泡4分鐘，流水沖洗I小時(shí)，經(jīng)酒精20s，氯化汞消毒lOmin，無(wú)菌水沖洗5遍，接種入MS培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，附加激素0.5mg/LNAA，3mg/LIBA，蔗糖 30g/L，瓊脂 6.5g/L,pH=5.8-6.0，溫度 23°C，濕度 40% ~60%，光強(qiáng)度IOOOLX ;光期12 h暗期12h ;取誘導(dǎo)出來(lái)的嫩綠松散的愈傷組織，接種到盛有50mLMS液體培養(yǎng)基100 mL三角瓶中，培養(yǎng)基配方為B5+0.2mg/L ΙΑΑ+Ο.5 mg/LKT，搖床轉(zhuǎn)速為120r/min，溫度為25°C，黑暗培養(yǎng).每隔7d繼代一次，連續(xù)培養(yǎng)4_5代后逐漸形成穩(wěn)定的細(xì)胞系，進(jìn)行懸浮培養(yǎng)系的誘導(dǎo)。將lmg/L水楊酸溶液加入誘導(dǎo)出的懸浮培養(yǎng)系中進(jìn)行調(diào)控，25天后取樣稱(chēng)重，測(cè)定酶的活性和多糖的含量。黨參懸浮細(xì)胞增量為對(duì)照的1.5倍，多糖得率為10.24%。
[0014]實(shí)施例2
取室外黨參春天新出幼嫩葉片，嫩芽，洗衣粉浸泡4分鐘，流水沖洗I小時(shí)，經(jīng)酒精20s，氯化汞消毒lOmin，無(wú)菌水沖洗5遍，接種入MS培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，附加激素0.5mg/LNAA，3mg/LIBA，蔗糖 30g/L，瓊脂 6.5g/L，ρΗ=5.8~6.0，溫度 23 °C，濕度 40%~60%，光強(qiáng)度IOOOIx ;光期12 h暗期12h ;取誘導(dǎo)出來(lái)的嫩綠松散的愈傷組織，接種到盛有40 mLMS液體培養(yǎng)基100 mL三角瓶中，培養(yǎng)基配方為匕+0.2 mg/L IAA+lmg/LKT，搖床轉(zhuǎn)速為120r/min，溫度為25°C，黑暗培養(yǎng).每隔7d繼代一次，連續(xù)培養(yǎng)4_5代后逐漸形成穩(wěn)定的細(xì)胞系，進(jìn)行懸浮培養(yǎng)系的誘導(dǎo)。將2mg/L水楊酸溶液加入誘導(dǎo)出的懸浮培養(yǎng)系中進(jìn)行調(diào)控，25天后取樣稱(chēng)重，測(cè)定酶的活性和多糖的含量，黨參懸浮細(xì)胞增量為對(duì)照的1.83倍，多糖得率為 10.79%ο
[0015]實(shí)施例3
取室外黨參春天新出幼嫩葉片，嫩芽，洗衣粉浸泡4分鐘，流水沖洗I小時(shí)，經(jīng)酒精20s，氯化汞消毒lOmin，無(wú)菌水沖洗5遍，接種入MS培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，附加激素0.5mg/LNAA，3mg/LIBA，蔗糖 30g/L，瓊脂 6.5g/L,pH=5.8-6.0，溫度 23°C，濕度 40% ~60%，光強(qiáng)度1000LX ;光期12 h暗期12h ;取誘導(dǎo)出來(lái)的嫩綠松散的愈傷組織，接種到盛有40mLMS液體培養(yǎng)基100 mL三角瓶中，培養(yǎng)基配方為B5+0.5 mg/L IAA+0.5 mg/LKT，搖床轉(zhuǎn)速為120r/min，溫度為25°C，黑暗培養(yǎng).每隔7d繼代一次，連續(xù)培養(yǎng)4_5代后逐漸形成穩(wěn)定的細(xì)胞系，進(jìn)行懸浮培養(yǎng)系的誘導(dǎo)。將2mg/L水楊酸溶液加入誘導(dǎo)出的懸浮培養(yǎng)系中進(jìn)行調(diào)控，25天后取樣稱(chēng)重，測(cè)定酶的活性和多糖的含量。黨參懸浮細(xì)胞增量為對(duì)照的2.47倍，多糖得率為11.03%。
[0016]實(shí)施例4
取室外黨參春天新出幼嫩葉片，嫩芽，洗衣粉浸泡4分鐘，流水沖洗I小時(shí)，經(jīng)酒精20s，氯化汞消毒lOmin，無(wú)菌水沖洗5遍，接種入MS培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，附加激素0.5mg/LNAA，3mg/LIBA，蔗糖 30g/L，瓊脂 6.5g/L，pH=5.8-6.0，溫度 23 °C，濕度 40% ~60%，光強(qiáng)度1000LX ;光期12 h暗期12h ;取誘導(dǎo)出來(lái)的嫩綠松散的愈傷組織，接種到盛有40mLMS液體培養(yǎng)基100 mL三角瓶中，培養(yǎng)基配方為匕+0.5 mg/L IAA+1 mg/LKT，搖床轉(zhuǎn)速為120r/min，溫度為25°C，黑暗培養(yǎng).每隔7d繼代一次，連續(xù)培養(yǎng)4_5代后逐漸形成穩(wěn)定的細(xì)胞系，進(jìn)行懸浮培養(yǎng)系的誘導(dǎo)。將2mg/L水楊酸溶液加入誘導(dǎo)出的懸浮培養(yǎng)系中進(jìn)行調(diào)控，25天后取樣稱(chēng)重，測(cè)定酶的活性和多糖的含量。黨參懸浮細(xì)胞增量為對(duì)照的3.13倍，多糖得率為10.65%。
[0017]實(shí)施例5
取室外黨參春天新出幼嫩葉片，嫩芽，洗衣粉浸泡4分鐘，流水沖洗I小時(shí)，經(jīng)酒精20s，氯化汞消毒lOmin，無(wú)菌水沖洗5遍，接種入MS培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，附加激素0.5mg/LNAA，3mg/LIBA，蔗糖 30g/L，瓊脂 6.5g/L，pH=5.8-6.0，溫度 23 °C，濕度 40% ~60%，光強(qiáng)度IOOOlx ;光期12 h暗期12h ;取誘導(dǎo)出來(lái)的嫩綠松散的愈傷組織，接種到盛有40mLMS液體培養(yǎng)基100 mL三角瓶中，培養(yǎng)基配方為匕+1 mg/L IAA+0.5 mg/LKT，搖床轉(zhuǎn)速為120r/min，溫度為25°C，黑暗培養(yǎng).每隔7d繼代一次，連續(xù)培養(yǎng)4_5代后逐漸形成穩(wěn)定的細(xì)胞系，進(jìn)行懸浮培養(yǎng)系的誘導(dǎo)。 將2mg/L水楊酸溶液加入誘導(dǎo)出的懸浮培養(yǎng)系中進(jìn)行調(diào)控，25天后取樣稱(chēng)重，測(cè)定酶的活性和多糖的含量。黨參懸浮細(xì)胞增量為對(duì)照的3.58倍，多糖得率為11.94%ο
[0018]實(shí)施例6
取室外黨參春天新出幼嫩葉片，嫩芽，洗衣粉浸泡4分鐘，流水沖洗I小時(shí)，經(jīng)酒精20s,氯化汞消毒lOmin，無(wú)菌水沖洗5遍，接種入MS培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，附加激素 0.5mg/LNAA，3mg/LIBA，蔗糖 30g/L，瓊脂 6.5g/L，pH=5.8-6.0，溫度 23 °C，濕度 40% ~60%，光強(qiáng)度1000LX ;光期12 h暗期12h ;取誘導(dǎo)出來(lái)的嫩綠松散的愈傷組織，接種到盛有40 mLMS液體培養(yǎng)基100 mL三角瓶中，培養(yǎng)基配方為B5+l mg/L IAA+lmg/LKT，搖床轉(zhuǎn)速為120r/min，溫度為25°C，黑暗培養(yǎng).每隔7d繼代一次，連續(xù)培養(yǎng)4_5代后逐漸形成穩(wěn)定的細(xì)胞系，進(jìn)行懸浮培養(yǎng)系的誘導(dǎo)。將lmg/L水楊酸溶液加入誘導(dǎo)出的懸浮培養(yǎng)系中進(jìn)行調(diào)控，25天后取樣稱(chēng)重，測(cè)定酶的活性和多糖的含量。黨參懸浮細(xì)胞增量為對(duì)照的2.98倍，多糖得率為12.13%。
[0019]實(shí)施例7
取室外黨參春天新出幼嫩葉片，嫩芽，洗衣粉浸泡4分鐘，流水沖洗I小時(shí)，經(jīng)酒精20s，氯化汞消毒lOmin，無(wú)菌水沖洗5遍，接種入MS培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，附加激素
0.5mg/LNAA，3mg/LIBA，蔗糖 30g/L，瓊脂 6.5g/L，ρΗ=5.8-6.0，溫度 23 °C，濕度 40% ~60%，光強(qiáng)度IOOOlx ;光期12 h暗期12h ;取誘導(dǎo)出來(lái)的嫩綠松散的愈傷組織，接種到盛有40mLMS液體培養(yǎng)基100 mL三角瓶中，培養(yǎng)基配方為^+1 mg/L IAA+2 mg/LKT，搖床轉(zhuǎn)速為120r/min，溫度 為25°C，黑暗培養(yǎng).每隔7d繼代一次，連續(xù)培養(yǎng)4_5代后逐漸形成穩(wěn)定的細(xì)胞系，進(jìn)行懸浮培養(yǎng)系的誘導(dǎo)。將3mg/L水楊酸溶液加入誘導(dǎo)出的懸浮培養(yǎng)系中進(jìn)行調(diào)控，25天后取樣稱(chēng)重，測(cè)定酶的活性和多糖的含量。黨參懸浮細(xì)胞增量為對(duì)照的3.17倍，多糖得率為12.24%ο
【權(quán)利要求】
1.一種黨參愈傷組織和懸浮細(xì)胞的快速繁殖方法，包括無(wú)菌外植體的獲得、愈傷組織的誘導(dǎo)、懸浮細(xì)胞培養(yǎng)、水楊酸調(diào)控黨參懸浮細(xì)胞中多糖的含量，其主要步驟如下: (1)按照植物組織培養(yǎng)常規(guī)消毒方法對(duì)野外采取的黨參外植體材料進(jìn)行消毒處理，獲得無(wú)菌的外植體； (2)將步驟(I)獲得的無(wú)菌黨參葉片，芽接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，誘導(dǎo)出來(lái)的愈傷組織繼代培養(yǎng)4-5代，獲得嫩綠松散的愈傷組織； (3)將步驟(2)獲得的嫩綠松散的愈傷組織用鑷子夾取接種在附加激素0.2-1 mg/LIAA和0.5-2 mg/L KT的B5培養(yǎng)基中進(jìn)行震蕩懸浮培養(yǎng)，形成穩(wěn)定的細(xì)胞系； (4)將步驟(3)獲得的黨參懸浮細(xì)胞接種入B5+0.5mg/LIAA+2mg/LKT+水楊酸l_3mg/L，收集黨參懸浮細(xì)胞稱(chēng)重，然后分兩份，一份-70°C冰箱保存鮮樣測(cè)酶的活性，一份60°C烘干保存干樣，對(duì)黨參多糖進(jìn)行提取，檢測(cè)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的制備方法，其特征在于:步驟(I)中所述無(wú)菌的黨參外植體葉片和芽按照下述方法得到:取黨參葉片和芽，洗衣粉浸泡4分鐘，流水沖洗I小時(shí)，經(jīng)酒精消毒處理20s，氯化汞消毒處理10分鐘，無(wú)菌水沖洗5遍，用吸水紙吸去無(wú)菌外植體表面的水分。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的制備方法中，其特征在于:所述的培養(yǎng)條件為溫度23°C，濕度40%~60%，光強(qiáng)度IOOOlx ;光期12 h暗期12h。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的制備方法中，其特征在于:步驟(2)所述的黨參愈傷組織按照按照下述方法得到:將獲得的無(wú)菌黨參葉片和芽切成Icm2小塊，接種入MS培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，每瓶接種3塊，附加激素0.5mg/LNAA, 3mg/LIBA,鹿糖30g/L,瓊脂6.5g/L, pH=8,初代培養(yǎng)30天，連續(xù)繼代4-5次，繼代周期20天，獲得嫩綠松散的愈傷組織。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的制備方法中，其特征在于:步驟(3)所述的黨參懸浮細(xì)胞按照按照下述方法得到:取誘導(dǎo)出來(lái)的嫩綠松散的愈傷組織，用鑷子夾取接種在附加激素0.2-1 mg/L IAA和0.5-2 mg/L KT的匕培養(yǎng)基中進(jìn)行震蕩懸浮培養(yǎng)，每IOOmL的三角瓶中加入液體培養(yǎng)基50mL，搖床轉(zhuǎn)速為120r/min，溫度為25°C，黑暗培養(yǎng)，每隔7d繼代一次，連續(xù)培養(yǎng)4_5代后逐漸形成穩(wěn)定的細(xì)胞系，完成懸浮培養(yǎng)系的誘導(dǎo)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的制備方法中，其特征在于:步驟(4)所述水楊酸對(duì)黃芪懸浮細(xì)胞的調(diào)控按照下述方法實(shí)施:將l_3mg/l水楊酸溶液加入誘導(dǎo)出的懸浮培養(yǎng)系中進(jìn)行調(diào)控，30天后取樣測(cè)定黨參多糖的含量，精密稱(chēng)取干樣品lg，用潔凈研缽小心研碎，轉(zhuǎn)入200 mL容量瓶中，加入50 mL甲醇(100%)，于超聲波液體振蕩器上振蕩45 min，溫度60°C，過(guò)濾分離，收集濾液，最后用100%甲醇細(xì)心洗下，合并各次洗液于25 mL棕色容量瓶中。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的制備方法中，其特征在于:步驟(4)中所述的多糖提取采用的是40%甲醇提取。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的制備方法中，其特征在于:步驟(4)中所述的多糖的檢測(cè)采用的是蒽酮-硫酸法。
【文檔編號(hào)】C12N5/04GK103461122SQ201310410879
【公開(kāi)日】2013年12月25日 申請(qǐng)日期:2013年9月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月11日
【發(fā)明者】蘇劉花 申請(qǐng)人:南京澤朗農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司