一種枳椇懸浮細胞生產(chǎn)黃酮的方法
【專利摘要】本發(fā)明研究了一種枳椇懸浮細胞生產(chǎn)黃酮的方法。包括無菌葉片的獲得，愈傷組織的誘導，懸浮細胞培養(yǎng)，細胞懸浮體系的優(yōu)化，黃酮的提取測定等步驟。本發(fā)明方法所制備的枳椇懸浮細胞中含有較高含量的黃酮。本發(fā)明有助于解決枳椇資源短缺和保護枳椇種質(zhì)資源的可持續(xù)生長，并且有利于建立枳椇懸浮細胞的大規(guī)模工廠化生產(chǎn)，為黃酮生產(chǎn)提供新的途徑。
【專利說明】一種枳犋懸浮細胞生產(chǎn)黃酮的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及組培條件下枳犋懸浮細胞的培養(yǎng)，尤其是鈣離子對懸浮細胞中黃酮的調(diào)控。
【背景技術(shù)】
[0002]積犋(Hovenia acerba Lindl.),又名拐率、雞爪梨、木室、龍率、長壽果,為鼠李科(Rhamnaceae)積犋屬(Hovenia Thunb)植物。它集材、果、藥、觀賞于一身，生長快，適應(yīng)性強，是一種極具開發(fā)價值的珍稀樹種。主要分布在陜西、四川、重慶、湖北、湖南、江西、江蘇、浙江、福建、廣東、安徽、河北、河南等省。到目前為止共從該屬植物中分離出70多種成分，主要為黃酮類和三萜皂苷類化合物。枳犋全身都是寶。枳犋具有解酒、保肝、抗癌、抗衰老等作用，我國枳犋資源豐富，但優(yōu)良品種較少，目前的主要繁殖方法單一，多為實生繁殖。用枳犋成熟植株不同外植體進行組培并成功分化成完整植株的工作，國內(nèi)外尚未見報道。未來既要利用傳統(tǒng)的雜交、誘變方式，也要利用分子生物學的方式培育出更適應(yīng)人們需求的新品種。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供枳犋懸浮細胞培養(yǎng)的快速繁殖方法，并通過水楊酸對懸浮細胞調(diào)控獲得生長良好，黃酮含量高的懸浮細胞。
[0004]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用下列技術(shù)方案:選用枳犋幼嫩的葉片，用洗潔精浸泡三分鐘，自來水沖洗30分鐘,在超凈工作臺上用0.1 %的升汞消毒9分鐘,無菌水沖洗4-5次。接種在MS+NAA0.2 mg/L+IBA3mg/L愈傷組織誘導培養(yǎng)基上，培養(yǎng)條件為暗室培養(yǎng)，溫度25°C，濕度50%~60%，將誘導出來的愈傷組織接入液體培養(yǎng)基MS+NAA0.2mg/L+ 2，4-D0.3mg/L上進行懸浮細胞培養(yǎng)30天，轉(zhuǎn)速:90r/min，溫度25°C，待懸浮細胞生長穩(wěn)定，在培養(yǎng)基中附加前體物誘導子檸檬酸進行枳犋懸浮細胞的調(diào)控，取培養(yǎng)出來的枳犋懸浮細胞使用微波提取方法提取黃酮，采用HPLC法檢測黃酮的含量。
[0005]采用本發(fā)明制備的枳犋懸浮細胞，生長速度快，能耗小，污染小，黃酮含量3.713%。
[0006]下面將結(jié)合【具體實施方式】對本發(fā)明作進一步闡述，但本發(fā)明要求保護的范圍并不局限于下列實施方式。
【具體實施方式】
[0007] 實施例1
選用枳犋幼嫩的葉片，用洗潔精浸泡三分鐘，自來水沖洗30分鐘，在超凈工作臺上用
0.1 %的升汞消毒9分鐘，無菌水沖洗4-5次。接種在MS+NAA0.lmg/L+IBA2mg/L愈傷組織誘導培養(yǎng)基上，培養(yǎng)條件為暗室培養(yǎng)，溫度25°C，濕度50%~60%，將誘導出來的愈傷組織接入液體培養(yǎng)基MS+NAA0.2mg/L+ 2,4-D0.7mg/L上進行懸浮細胞培養(yǎng)30天，待懸浮細胞生長穩(wěn)定，在培養(yǎng)基中附加前體物誘導子檸檬酸進行枳犋懸浮細胞的調(diào)控，取培養(yǎng)出來的枳犋懸浮細胞使用微波提取方法提取黃酮，采用HPLC法檢測黃酮的含量，黃酮含量2.905 %。
[0008]實施例2
選用枳犋幼嫩的葉片，用洗潔精浸泡三分鐘，自來水沖洗30分鐘，在超凈工作臺上用0.1 %的升汞消毒9分鐘，無菌水沖洗4-5次。接種在MS+NAA0.3 mg/L+IBA3mg/L愈傷組織誘導培養(yǎng)基上，培養(yǎng)條件為暗室培養(yǎng)，溫度25°C，濕度50%~60%，將誘導出來的愈傷組織接入液體培養(yǎng)基MS+NAA0.3mg/L+ 2,4-Dlmg/L上進行懸浮細胞培養(yǎng)30天，待懸浮細胞生長穩(wěn)定，在培養(yǎng)基中附加前體物誘導子檸檬酸進行枳犋懸浮細胞的調(diào)控，取培養(yǎng)出來的枳犋懸浮細胞使用微波提取方法提取黃酮，采用HPLC法檢測黃酮的含量，黃酮含量2.932 %。
[0009]實施例3
選用枳犋幼嫩的葉片，用洗潔精浸泡三分鐘，自來水沖洗30分鐘，在超凈工作臺上用0.1 %的升汞消毒9分鐘，無菌水沖洗4-5次。接種在MS+NAA0.3mg/L+IBA4mg/L愈傷組織誘導培養(yǎng)基上，培養(yǎng)條件為暗室培養(yǎng)，溫度25°C，濕度50%~60%，將誘導出來的愈傷組織接入液體培養(yǎng)基MS+NAA0.3mg/L+ 2,4-Dlmg/L上進行懸浮細胞培養(yǎng)30天，待懸浮細胞生長穩(wěn)定，在培養(yǎng)基中附加前體物誘導子檸檬酸進行枳犋懸浮細胞的調(diào)控，取培養(yǎng)出來的枳犋懸浮細胞使用微波提取方法提取黃酮，采用HPLC法檢測黃酮的含量，黃酮含量3.157 %。
[0010]實施例4
選用枳犋幼嫩的葉片，用洗潔精浸泡三分鐘，自來水沖洗30分鐘，在超凈工作臺上用0.1 %的升汞消毒9分鐘，無菌水沖洗4-5次。接種在MS+NAA0.2mg/L+IBA4mg/L愈傷組織誘導培養(yǎng)基上，培養(yǎng)條件為暗室培養(yǎng)，溫度25°C，濕度50%~60%，將誘導出來的愈傷組織接入液體培養(yǎng)基MS+NAA0.2mg/L+ 2,4-D0.3mg/L上進行懸浮細胞培養(yǎng)30天，待懸浮細胞生長穩(wěn)定，在培養(yǎng)基中附加前體物誘導子檸檬酸進行枳犋懸浮細胞的調(diào)控，取培養(yǎng)出來的枳犋懸浮細胞使用微波提取方法提取黃酮，采用HPLC法檢測黃酮的含量，黃酮含量3.468 %。
【權(quán)利要求】
1.一種枳犋懸浮細胞生產(chǎn)黃酮的方法，其特征是:枳犋的葉片經(jīng)消毒處理，接種在MS+NAA0.1-0.3 mg/L+IBA2^4mg/L愈傷組織誘導培養(yǎng)基上，將誘導出來的愈傷組織接入液體培養(yǎng)基MS+NAA0.1-0.3mg/L+ 2,4-D0.3~lmg/L上進行懸浮細胞培養(yǎng)30天，待懸浮細胞生長穩(wěn)定，在培養(yǎng)基中附加前體物誘導子檸檬酸進行枳犋懸浮細胞的調(diào)控，取培養(yǎng)出來的枳犋懸浮細胞使用微波提取方法提取黃酮，采用HPLC法檢測黃酮的含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種枳犋懸浮細胞生產(chǎn)黃酮的方法，其特征是:所述的消毒處理為:選用枳犋幼嫩的葉片，用洗潔精浸泡三分鐘，自來水沖洗30分鐘，在超凈工作臺上用0.1 %的升汞消毒9分鐘,無菌水沖洗4-5次。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種枳犋懸浮細胞生產(chǎn)黃酮的方法，其特征是:誘導愈傷組織的條件為暗室培養(yǎng)，溫度25°C，濕度50%~60%，為防止愈傷組織褐化，培養(yǎng)基中加入少量VC0
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種枳犋懸浮細胞生產(chǎn)黃酮的方法，其特征是:培養(yǎng)基中加入的檸檬酸為過濾滅菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種枳犋懸浮細胞生產(chǎn)黃酮的方法，其特征是:枳犋懸浮細胞提取方法為微波提取方法。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種枳犋懸浮細胞生產(chǎn)黃酮的方法，其特征是:HPLC檢測條件:色譜柱，C18柱，甲醇-0.5%磷酸(55:45)，流速1.5ml/min，注溫:29°C，波長360nm。
【文檔編號】C12N5/04GK103468632SQ201310423711
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月17日
【發(fā)明者】楊存 申請人:南京通澤農(nóng)業(yè)科技有限公司