一種酶活及熱穩(wěn)定性提高的過氧化氫酶突變體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種酶活及熱穩(wěn)定提高的過氧化氫酶突變體，屬于生物工程領(lǐng)域。將來源于枯草芽孢桿菌（B.subtilis?WSHDZ-01）的過氧化氫酶進行基因進行定點突變，使其編碼的氨基酸序列在第114位由賴氨酸K分別突變?yōu)槔野彼醂、纈氨酸V、蛋氨酸M或異亮氨酸I。本發(fā)明所述的過氧化氫酶突變體的表達量分別是突變之前的2.23、2.41、1.46、1.38倍，在溫度耐受性方面突變之后的酶的半衰期分別是突變前的2.17、1.5、2、1.67倍。本發(fā)明所得過氧化氫酶突變體更加適合工業(yè)化的生產(chǎn)需求，具有廣闊的應用前景。
【專利說明】一種酶活及熱穩(wěn)定性提高的過氧化氫酶突變體
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種酶活及熱穩(wěn)定性提高的過氧化氫酶突變體，屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]過氧化氫酶(catalase)簡稱CAT,其系統(tǒng)名稱是:H202氧化還原酶，以H2O2為專一底物，通過催化一對電子的轉(zhuǎn)移而最終將其降解為水和氧氣。過氧化氫酶在紡織、食品、醫(yī)藥、臨床等行業(yè)都有著廣泛的用途。過氧化氫酶在食品加工工業(yè)中可使食品保鮮，并作為消除啤酒、飲料中活性氧和自由基的抗氧化劑。與葡萄糖氧化酶并用作氧的去除劑，牛乳殺菌及干酪原料乳的殺菌；在醫(yī)藥行業(yè)常用于器械消毒；在臨床分析中，過氧化氫酶對研究自由基代謝失衡，抗衰老和腫瘤發(fā)病機理具有一定價值，對某些疾病的診斷，鑒別診斷亦具有重要意義上等行業(yè)有著廣泛的用途。迄今CAT已經(jīng)成為農(nóng)業(yè)，以及與之相關(guān)的食品與乳制品業(yè)、紙漿和造紙業(yè)、以及農(nóng)業(yè)環(huán)保產(chǎn)業(yè)中有應用價值的酶之一。近年來隨著過氧化氫酶在紡織、造紙、制漿等行業(yè)的普遍應用，市場對過氧化氫酶的需求大幅增長。
[0003]近年來嗜熱子囊菌，粘質(zhì)沙雷氏菌，蘋果炭疽菌、芽孢桿菌等微生物菌種均有用于過氧化氫酶的生產(chǎn)研究。但利用野生菌株生產(chǎn)過氧化氫酶，資源消耗大、原料利用率低、產(chǎn)量較低，難以滿足日益增長的市場需求；通過傳統(tǒng)方法育種，工作量大、盲目性大、回復突變率高，難以篩選得到理想的突變菌株。有通過重組大腸桿菌生產(chǎn)過氧化氫酶，但大腸桿菌本身產(chǎn)生的熱源、內(nèi)毒素不易除去，產(chǎn)品純化問題較多；蛋白的高水平表達常形成包涵體，提取和純化步驟繁瑣，而且蛋白復性困難，易出現(xiàn)肽鏈的不正確折疊等問題。生物安全性要求我們的宿主菌最好具有非致病性。而絕大多數(shù)芽孢桿菌恰恰能滿足這一要求，而且還具備了一些其他菌株所沒有的優(yōu)良特性。事實表明，芽孢桿菌可以作為一些原核生物、真核生物和哺乳動物等的外源蛋白的表達宿主。芽孢桿菌表達系統(tǒng)具有的非致病性；細胞壁的組成簡單；能夠大量分泌某些胞外蛋白，`蛋白跨越細胞膜后，被加工和直接釋放到培養(yǎng)基中而不發(fā)生聚集，回收和純化蛋白較為簡單等優(yōu)點，使之成為CAT的良好表達宿主。
[0004]過氧化氫酶活性可被苯酚類、尿素、氰化合物、疊氮化物、堿等物質(zhì)所抑制，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis WSHDZ-OI)具有耐熱耐堿的特性，且已用于工業(yè)化生產(chǎn)，利用該菌株作為宿主過量表達CAT，發(fā)酵條件易于控制，可大幅度提高CAT的產(chǎn)量。
[0005]江南大學的郭婭瓊從枯草芽孢桿菌(B.subtilis WSHDZ-Ol)基因組中獲得編碼過氧化氫酶(CAT)的基因katA帶有自身信號肽和啟動子序列，與質(zhì)粒PST0P1622上具有的木糖啟動子構(gòu)成了雙啟動子表達系統(tǒng)，在一定程度上增加了過氧化氫酶mRNA的轉(zhuǎn)錄量，促使CAT的表達，很大程度地提高了 CAT的產(chǎn)量。但該過氧化氫酶也存在著一定的缺陷，尤其是其對溫度比較敏感，使得其在工業(yè)應用中有一定的局限性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明要解決的問題是提供一種酶活及熱穩(wěn)定性提高的過氧化氫酶突變體(CAT)。是對氨基酸序列如NCBI登錄號BAB21251.1所示的過氧化氫酶第114位的賴氨酸K進行定點突變，將含突變后基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進入枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)WSHDZ-Ol進行表達，得到酶活及熱穩(wěn)定性均增強的過氧化氫酶突變體。
[0007]編碼所述親本過氧化氫酶的核苷酸序列如NCBI登錄號為AB046412的序列所示。
[0008]所述突變是將第114位的賴氨酸K分別變?yōu)槔野彼醂、纈氨酸V、蛋氨酸M或異亮氨酸I。
[0009]獲得所述突變體的方法，是以pST0P1622_katA質(zhì)粒(一種高產(chǎn)過氧化氫酶的重組枯草芽孢桿菌及其構(gòu)建方法和應用，申請?zhí)?201110328753.1)為模版，設(shè)計引物，通過PCR進行定點突變得到含有突變后基因的重組質(zhì)粒pST0P1622-katKX，將pST0P1622_katKX轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌(B.subtilis WSHDZ-OI)發(fā)酵生產(chǎn)CAT。
[0010]所述枯草芽孢桿菌(B.subtilis WSHDZ-01)購買于武漢中國典型培養(yǎng)物保藏中心，編號為 CCTCC NO:M206062o
[0011]獲得所述突 變體的方法，具體地是:
[0012](I)突變表達載體的構(gòu)建
[0013]通過分析過氧化氫酶的3D結(jié)構(gòu)，確定114位的賴氨酸K為目的突變?yōu)辄c，設(shè)計突變實驗，將該位點的賴氨酸分別突變?yōu)槔野彼醂、纈氨酸V、蛋氨酸M或異亮氨酸I。
[0014]以pST0P1622_katA質(zhì)粒為模版，設(shè)計引物，通過PCR進行定點突變得到含有突變后基因的重組質(zhì)粒PST0P1622-katKX (X為突變后的氨基酸);將該質(zhì)粒利用DpnI核酸內(nèi)切酶進行酶切消化DNA模板，酶切反應溫度為37°C，反應時間為30分鐘，然后將酶切產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化到E.coli JM109菌株，提取質(zhì)粒進行測序。
[0015](2)含突變體的基因工程菌的獲得
[0016]制備枯草芽孢桿菌WSHDZ-Ol感受態(tài)，將pStopl622_katAKX的連接液加入500 μ L的枯草芽孢桿菌感受態(tài)細胞中，篩選轉(zhuǎn)化子，并提取質(zhì)粒測序驗證。
[0017](3)重組枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)突變CAT
[0018]將產(chǎn)CAT重組枯草芽孢桿菌活化后制備種子液，以1%-5%的接種量轉(zhuǎn)接入裝有20-50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，每間隔4h取樣。
[0019]活化培養(yǎng)基:質(zhì)量百分比為6%的麥芽汁。
[0020]重組枯草芽孢桿菌的發(fā)酵條件為:溫度設(shè)為30-40°C，搖床轉(zhuǎn)速設(shè)為150-250rpm，發(fā)酵時間36h-72h。發(fā)酵培養(yǎng)基組成為(g/L):葡萄糖10-20，NaN035-10，MgSO4.7Η200.5，Na2HP049.52，KH2PO40.6，F(xiàn)eSO4.7Η200.0025，pH 自然;木糖誘導濃度為 0.1 -
1.0% (w/w)。
[0021]發(fā)酵條件優(yōu)選:溫度設(shè)為37°C，搖床轉(zhuǎn)速設(shè)為200rpm，發(fā)酵時間48h-56h。發(fā)酵培養(yǎng)基組成為(g/L):葡萄糖 10，NaN035，MgSO4.7Η200.5，Na2HP049.52，KH2PO40.6，F(xiàn)eSO4.7Η200.0025，pH 自然；木糖誘導濃度為 0.5% (w/w)。
[0022]本發(fā)明通過定點突變改造過氧化氫酶基因，將過氧化氫酶第114位由賴氨酸K分別突變?yōu)槔野彼醂、纈氨酸V、蛋氨酸M或異亮氨酸I，所得過氧化氫酶突變體的表達量分別是突變之前的2.23,2.41、1.46、1.38倍，在溫度耐受性方面突變之后的酶的半衰期分別是突變前的2.17、1.5、2、1.67倍；CAT的產(chǎn)量和酶學性質(zhì)都有有大幅度提高，更加適合工業(yè)化生產(chǎn)需求，滿足社會生產(chǎn)的要求?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0023]圖1為本發(fā)明構(gòu)建的突變株以及原始菌株發(fā)酵胞外酶活情況。
[0024]圖2為本發(fā)明構(gòu)建的突變體以及原始酶在60°C的半衰期。
【具體實施方式】
[0025]CAT發(fā)酵檢測:取ImL發(fā)酵液于5mL離心管中，10000rpm，4°C下離心lOmin，取上清液為胞外CAT測定樣品；沉淀以50mmol/L K2HPO4-KH2PO4緩沖液(pH7.0)洗滌2次，以ImL緩沖液重懸后置冰浴預冷，超聲波間歇破碎9min，IOOOOrpm離心15min，上清液作為胞內(nèi)CAT
測定樣品。
[0026]過氧化氫酶總酶活=胞內(nèi)酶活+胞外酶活，總酶活用紫外分光光度計在240nm下測定。
[0027]過氧化氫酶熱穩(wěn)定性檢測:在不同溫度下按照標準方法測定酶活力，以酶活力最高者為100%.，將酶液分別在30、37、42、50、60°C下保溫60min，利用冰浴迅速冷卻后，按上述方法測殘余酶活力，考察其熱穩(wěn)定性。
[0028]實施例1突變表達質(zhì)粒的構(gòu)建及重組枯草芽孢桿菌的獲得
[0029]1.突變表達載體的構(gòu)建
[0030]以枯草芽孢桿菌pST0P1622_katA質(zhì)粒(一種高產(chǎn)過氧化氫酶的重組枯草芽孢桿菌及其構(gòu)建方法和應用，申請?zhí)?201110328753.1 ;Plasmid system for theintracellular production and purification of affinity-tagged proteins inBacillus megaterium, Biedendieck R, Yang Y, Deckwer WD, Malten M, Jahn D)為模板，利用PCR體外擴增含突變基因的質(zhì)`粒。
[0031]用于定點突變的引物為:
[0032]katAKY primerl:5’-ACCCGCGCGGATTTGCTGTTTATTTTTATACTGAAGAAGGAAA-3’
[0033]katAKY primer2:5’-TTTCCTTCTTCAGTATAAAAATAAACAGCAAATCCGCGCGGGT-3’
[0034]katAKV primerl:5’-CCCGCGCGGATTTGCTGTTGTATTTTATACTGAAGAAGG-3’
[0035]katAKV primer2:5’-CCTTCTTCAGTATAAAATACAACAGCAAATCCGCGCGGG-3’
[0036]katAKM primerl:5’-CCCGCGCGGATTTGCTGTTATGTTTTATACTGAAGAAGGAAA-3’
[0037]katAKM primer2:5’-TTTCCTTCTTCAGTATAAAACATAACAGCAAATCCGCGCGGG-3’
[0038]katAKI primerl:5’-CCGCGCGGATTTGCTGTTATATTTTATACTGAAGAAGG-3’
[0039]katAKI primer2:5’-CCTTCTTCAGTATAAAATATAACAGCAAATCCGCGCGG-3’ ；
[0040]PCR反應體系如下:(引物濃度為2O μ mol/L)
[0041]
【權(quán)利要求】
1.一種酶活及熱穩(wěn)定性提高的過氧化氫酶突變體，其特征在于，是對氨基酸序列如NCBI登錄號BAB21251.1所示的過氧化氫酶進行定點突變得到。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變體，其特征在于，是對過氧化氫酶第114位的賴氨酸K進行突變。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的突變體，其特征在于，是將過氧化氫酶第114位的賴氨酸K突變?yōu)槔野彼醂、纈氨酸V、蛋氨酸M或異亮氨酸I。
4.編碼權(quán)利要求1所述突變體的基因。
5.含有權(quán)利要求4所述基因的質(zhì)粒或細胞。
6.獲得權(quán)利要求1所述突變體的方法，其特征在于，是以質(zhì)粒pStopl622-katA為模版，設(shè)計引物，通過PCR獲得編碼突變體的基因及質(zhì)粒，以枯草芽孢桿菌為宿主表達過氧化氫酶突變體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，是以質(zhì)粒pStopl622-katA為模版，設(shè)計引物，通過PCR獲得編碼突變體的重組質(zhì)粒，將含有重組質(zhì)粒的枯草芽孢桿菌種子培養(yǎng)液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基，在30-40°C、150-250rpm條件下發(fā)酵時間36h-72h ;所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:葡萄糖 10 -20g/L, NaN035 -10g/L, MgSO4.7Η200.5g/L，Na2HP049.52g/L，KH2PO40.6g/L，F(xiàn)eSO4.7H200.0025g/L, pH 自然；木糖誘導濃度為 0.1 -1.0% (w/w)。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于，表達宿主優(yōu)選枯草芽孢桿菌(Bacillus subtil i s) WSHDZ-OU B.subtilis WB600 或巨大芽孢桿菌。
9.權(quán)利要求1所述 突變體在紡織、造紙、食品、醫(yī)藥中的應用。
【文檔編號】C12R1/125GK103451163SQ201310410789
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年9月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月10日
【發(fā)明者】陳堅, 堵國成, 康振, 曹汶龍 申請人:江南大學