專利名稱：乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)亞硝酸還原酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物學(xué)、酶工程、發(fā)酵工程、生物化學(xué)、食品化學(xué)、食品科學(xué)、食品安全等領(lǐng)域，具體涉及一種乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)亞硝酸還原酶的方法。該發(fā)明生產(chǎn)的亞硝酸還原酶主要應(yīng)用于消除農(nóng)產(chǎn)品、食品、飼料和環(huán)境中亞硝酸鹽殘留，提高食品安全和食品質(zhì)量，減少亞硝酸鹽引起的食物中毒和癌癥發(fā)生率。
背景技術(shù)：
農(nóng)業(yè)生產(chǎn)氮肥大量施用，N、P、K比例失調(diào)，使環(huán)境中硝酸鹽、亞硝酸鹽大量富集，致使農(nóng)產(chǎn)品、食品及飼料中大量亞硝酸鹽殘留。亞硝酸鹽是一種對(duì)人體有害的物質(zhì)，它不僅使人、畜和禽直接中毒、致死；而且是致癌物亞硝胺的前體。據(jù)我國(guó)衛(wèi)生部食品衛(wèi)生監(jiān)督檢驗(yàn)所對(duì)北京、河南、青島、吉林地區(qū)的蔬菜、糧食、鮮魚(yú)類、鮮肉類、鮮蛋類、食鹽、醬腌菜、乳與乳制品中亞硝酸鹽分析，調(diào)查結(jié)果表明，市場(chǎng)供應(yīng)的正常八大類食品均有亞硝酸鹽被檢出，其中醬腌菜的檢出率高達(dá)94.7％，最高值為85.6mg/kg。據(jù)山東省食品衛(wèi)生監(jiān)督檢驗(yàn)所食物中毒資料顯示1983～1997年全省共發(fā)生亞硝酸鹽引起的食物中毒82起，發(fā)病1089人，造成死亡39人。亞硝酸鹽中毒，潛伏期最短為10min，最長(zhǎng)的4h，平均在30min左右發(fā)病。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，目前全國(guó)的發(fā)病率增加了十幾倍甚至幾十倍。因此，采取有效措施消除和減少農(nóng)產(chǎn)品、食品、飼料和環(huán)境中亞硝酸鹽殘留是食品安全生產(chǎn)、提高食品質(zhì)量，減少亞硝酸鹽引起的食物中毒和癌癥發(fā)生率的必要條件。查新表明消除農(nóng)產(chǎn)品、飼料、食品及環(huán)境中亞硝酸鹽殘留國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有比較科學(xué)、便捷、有效、快速的方法。
亞硝酸還原酶是降解亞硝酸鹽最有效途徑。亞硝酸鹽在亞硝酸還原酶的作用下轉(zhuǎn)化為氨，可表示為因此，在農(nóng)產(chǎn)品、食品、飼料和環(huán)境中加入亞硝酸還原酶可以快速降解亞硝酸鹽，排除其對(duì)人類的危害和致病性。利用對(duì)人有益的乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)的亞硝酸還原酶，在原料前處理時(shí)期添加0.01‰～0.5‰的亞硝酸還原酶，在20～60℃保溫5～60min，即可將殘留于農(nóng)產(chǎn)品、食品、飼料和環(huán)境中的亞硝酸鹽完全降解。在應(yīng)用上解決了亞硝酸鹽殘留對(duì)人、畜和禽產(chǎn)生的危害和致病性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)亞硝酸還原酶的方法，該方法是在26～32℃、亞硝酸鹽誘導(dǎo)下乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)亞硝酸還原酶的方法，這種生產(chǎn)方法獲得的亞硝酸還原酶粗酶液活性可以達(dá)到2600U/ml，如再經(jīng)過(guò)分離和純化，可以得到不同濃度和純度的酶制劑。當(dāng)該酶的活性為1000U/ml或1000U/g，0.01‰～0.5‰的使用量應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品、食品、飼料和環(huán)境中，在20～60℃保溫5～60min可以將殘留的亞硝酸鹽完全降解。利用亞硝酸還原酶消除亞硝酸鹽殘留操作簡(jiǎn)單、方便、快捷、成本低、安全可靠。可以從根本上解除亞硝酸鹽殘留引起人、畜和禽直接中毒、致死、致癌的危害。
本發(fā)明所述的一種乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)亞硝酸還原酶的方法具體包括以下步驟(1)將產(chǎn)生亞硝酸還原酶的乳酸菌進(jìn)行活化、按常規(guī)方法逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，制備成液體一級(jí)種子和二級(jí)種子；(2)將液體一級(jí)種子或二級(jí)種子，按發(fā)酵液體積的3～8％接種量接入液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，在26～32℃培養(yǎng)36～72h時(shí)，添加40～150mg/L亞硝酸鹽，再培養(yǎng)12～24h，即乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)亞硝酸還原酶結(jié)束；(3)將(2)的發(fā)酵液在8,000～10,000rpm，離心收集乳酸菌菌體；(4)用(3)收集到的菌體體積2～3倍pH值7.0的緩沖液清洗，待菌體完全懸浮后在8,000～10,000rpm離心收集乳酸菌菌體，重復(fù)上述清洗菌體操作2～3次，最終將菌體制備成乳酸菌菌懸液；(5)將(4)制備成的乳酸菌菌懸液減壓破碎菌體；(6)將(5)得到的菌體破碎懸液在12,000～140,000rpm、4℃離心，收集到的上清液即為粗酶液。
(7)根據(jù)不同需要和使用對(duì)象不同，還可以將(6)得到的粗酶液進(jìn)一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。
本發(fā)明中使用的菌種來(lái)源于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，可商購(gòu)獲得，活化和生長(zhǎng)條件按菌種保藏單位提供的說(shuō)明進(jìn)行。亞硝酸還原酶產(chǎn)生乳酸菌(例如，CGMCC菌種編號(hào)1.11或1.19或1.557或1.2029或1.1480或1.1878等)，菌株活化后發(fā)酵生產(chǎn)亞硝酸還原酶時(shí)按產(chǎn)酶條件進(jìn)行培養(yǎng)，該菌株在4℃環(huán)境中可保存4個(gè)月。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一(1)、培養(yǎng)基制備①菌種活化培養(yǎng)基酪蛋白胨10.0g，牛肉提取物10.0g，酵母提取物5.0g，葡萄糖5.0g，乙酸鈉5.0g，檸檬酸二胺2.0g，Tween 80 1.0g，K2HPO41.0g，MgSO4·7H2O 0.2g，MnSO4·H2O0.05g，CaCO320.0g，瓊脂15.0g，蒸餾水1.0L，pH值6.8，121℃高壓蒸氣滅菌30min。
②液體種子培養(yǎng)基酪蛋白胨10.0g，牛肉提取物10.0g，酵母提取物5.0g，葡萄糖5.0g，乙酸鈉5.0g，檸檬酸二胺2.0g，Tween 80 1.0g，K2HPO41.0g，MgSO4·7H2O 0.2g，MnSO4·H2O0.05g，CaCO320.0g，自來(lái)水1.0L，pH值7.0，121℃高壓蒸氣滅菌30min。
③產(chǎn)酶培養(yǎng)基酪蛋白胨3.0～7.0g，牛肉提取物2.0～8.0g，酵母提取物3.0～9.0g，玉米淀粉糖3.0～10.0g，乙酸鈉0.5～2.0g，檸檬酸二胺0.6～2.0g，Tween80 0.3～1.4g，K2HPO40.4～1.5g，CaCO320.0g，自來(lái)水1.0L，pH值7.0，121℃高壓蒸氣滅菌30min。
(2)將產(chǎn)生亞硝酸還原酶的乳酸菌，按中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株說(shuō)明進(jìn)行活化；(3)將(2)活化好的乳酸菌接種3針至5ml的液體種子試管中，在26～28℃培養(yǎng)48～72h，而后按5％的接種量進(jìn)行逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，制備成液體一級(jí)種子和二級(jí)種子；(4)將(3)制備的二級(jí)種子按發(fā)酵液體積3～5％的接種量接入10L的產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，在26～28℃培養(yǎng)60～72h時(shí)，添加40～80mg/L亞硝酸鹽，再培養(yǎng)12～24h，即乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)亞硝酸還原酶結(jié)束。
(5)將(4)的發(fā)酵液在8,000～10,000rpm，離心收集乳酸菌菌體；(6)用(5)收集到的菌體體積2～3倍pH值7.0的磷酸鹽緩沖液清洗，待菌體完全懸浮后在8,000～10,000rpm離心收集乳酸菌菌體，重復(fù)上述清洗菌體操作2～3次，最終將菌體制備成乳酸菌菌懸液；(7)將(6)制備成的乳酸菌菌懸液減壓破碎菌體；(8)將(7)得到的菌體破碎懸液在12,000～140,000rpm、4℃離心，收集到的上清液即為粗酶液。
(9)根據(jù)不同需要和使用對(duì)象不同，還可以將(8)得到的粗酶液進(jìn)一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。
實(shí)施例二(1)、培養(yǎng)基制備①菌種活化培養(yǎng)基酪蛋白胨10.0g，牛肉提取物10.0g，酵母提取物5.0g，葡萄糖5.0g，乙酸鈉5.0g，檸檬酸二胺2.0g，Tween 80 1.0g，K2HPO41.0g，MgSO4·7H2O 0.2g，MnSO4·H2O0.05g，CaCO320.0g，瓊脂15.0g，蒸餾水1.0L，pH值6.8，121℃高壓蒸氣滅菌30min。
②液體種子培養(yǎng)基酪蛋白胨10.0g，牛肉提取物10.0g，酵母提取物5.0g，葡萄糖5.0g，乙酸鈉5.0g，檸檬酸二胺2.0g，Tween 80 1.0g，K2HPO41.0g，MgSO4·7H2O 0.2g，MnSO4·H2O0.05g，CaCO320.0g，自來(lái)水1.0L，pH值7.0，121℃高壓蒸氣滅菌30min。
③產(chǎn)酶培養(yǎng)基酪蛋白胨3.0～7.0g，牛肉提取物2.0～8.0g，酵母提取物3.0～9.0g，玉米淀粉糖3.0～10.0g，乙酸鈉0.5～2.0g，檸檬酸二胺0.6～2.0g，Tween80 0.3～1.4g，K2HPO40.4～1.5g，CaCO320.0g，自來(lái)水1.0L，pH值7.0，121℃高壓蒸氣滅菌30min。
(2)將產(chǎn)生亞硝酸還原酶的乳酸菌，按中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株說(shuō)明進(jìn)行活化；(3)將(2)活化好的乳酸菌接種3針至5ml的液體種子試管中，在28～30℃培養(yǎng)48～60h，而后按5％的接種量進(jìn)行逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，制備成液體一級(jí)種子和二級(jí)種子；(4)將(3)制備的二級(jí)種子按發(fā)酵液體積6～8％的接種量接入20L的產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，在28～30℃培養(yǎng)36～48h時(shí)，添加81～120mg/L亞硝酸鹽，再培養(yǎng)12～24h，即乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)亞硝酸還原酶結(jié)束。
(5)將(4)的發(fā)酵液在8,000～10,000rpm，離心收集乳酸菌菌體；(6)用(5)收集到的菌體體積2～3倍pH值7.0的磷酸鹽緩沖液清洗，待菌體完全懸浮后在8,000～10,000rpm離心收集乳酸菌菌體，重復(fù)上述清洗菌體操作2～3次，最終將菌體制備成乳酸菌菌懸液；(7)將(6)制備成的乳酸菌菌懸液減壓破碎菌體；(8)將(7)得到的菌體破碎懸液在12,000～140,000rpm、4℃離心，收集到的上清液即為粗酶液。
(9)根據(jù)不同需要和使用對(duì)象不同，還可以將(8)得到的粗酶液進(jìn)一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。
實(shí)施例三(1)、培養(yǎng)基制備①菌種活化培養(yǎng)基酪蛋白胨10.0g，牛肉提取物10.0g，酵母提取物5.0g，葡萄糖5.0g，乙酸鈉5.0g，檸檬酸二胺2.0g，Tween 80 1.0g，K2HPO41.0g，MgS04·7H2O0.2g，MnSO4·H2O0.05g，CaCO320.0g，瓊脂15.0g，蒸餾水1.0L，pH值6.8，121℃高壓蒸氣滅菌30min。
②液體種子培養(yǎng)基酪蛋白胨10.0g，牛肉提取物10.0g，酵母提取物5.0g，葡萄糖5.0g，乙酸鈉5.0g，檸檬酸二胺2.0g，Tween 80 1.0g，K2HPO41.0g，MgSO4·7H2O 0.2g，MnSO4·H2O0.05g，CaCO320.0g，自來(lái)水1.0L，pH值7.0，121℃高壓蒸氣滅菌30min。
③產(chǎn)酶培養(yǎng)基酪蛋白胨3.0～7.0g，牛肉提取物2.0～8.0g，酵母提取物3.0～9.0g，玉米淀粉糖3.0～10.0g，乙酸鈉0.5～2.0g，檸檬酸二胺0.6～2.0g，Tween80 0.3～1.4g，K2HPO40.4～1.5g，CaCO320.0g，自來(lái)水1.0L，pH值7.0，121℃高壓蒸氣滅菌30min。
(2)將產(chǎn)生亞硝酸還原酶的乳酸菌，按中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株說(shuō)明進(jìn)行活化；(3)將(2)活化好的乳酸菌接種3針至5ml的液體種子試管中，在30～32℃培養(yǎng)36～48h，而后按5％的接種量進(jìn)行逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，制備成液體一級(jí)種子和二級(jí)種子；(4)將(3)制備的二級(jí)種子按發(fā)酵液體積3～5％的接種量接入50L的產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，在30～32℃培養(yǎng)36～48h時(shí)，添加121～150mg/L亞硝酸鹽，再培養(yǎng)12～24h，即乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)亞硝酸還原酶結(jié)束。
(5)將(4)的發(fā)酵液在8,000～10,000rpm，離心收集乳酸菌菌體；(6)用(5)收集到的菌體體積2～3倍pH值7.0的磷酸鹽緩沖液清洗，待菌體完全懸浮后在8,000～10,000rpm離心收集乳酸菌菌體，重復(fù)上述清洗菌體操作2～3次，最終將菌體制備成乳酸菌菌懸液；(7)將(6)制備成的乳酸菌菌懸液減壓破碎菌體；(8)將(7)得到的菌體破碎懸液在12,000～140,000rpm、4℃離心，收集到的上清液即為粗酶液。
(9)根據(jù)不同需要和使用對(duì)象不同，還可以將(8)得到的粗酶液進(jìn)一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。
實(shí)施例四按實(shí)施例一、二和三方法生產(chǎn)的乳酸菌亞硝酸還原酶，經(jīng)測(cè)定，粗酶液平均酶活性為2600U/ml，如再經(jīng)過(guò)分離和純化，可以得到不同活性、純度和劑型的酶制劑。將活性為1000U/ml或1000U/g的亞硝酸還原酶，按原料重量0.01‰～0.5‰的量添加于農(nóng)產(chǎn)品、食品、飼料和環(huán)境中，在20～60℃處理5～60min進(jìn)行亞硝酸鹽檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)下表。

檢測(cè)結(jié)果表明殘留于農(nóng)產(chǎn)品、食品、飼料和環(huán)境中的亞硝酸鹽，經(jīng)亞硝酸還原酶制劑處理，亞硝酸鹽完全降解；同時(shí)也說(shuō)明亞硝酸還原酶是消除亞硝酸鹽殘留最簡(jiǎn)單、方便、快捷，有效的方法。
權(quán)利要求
1.一種乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)亞硝酸還原酶的方法，其包括以下步驟(1)將產(chǎn)生亞硝酸還原酶的乳酸菌按常規(guī)方法進(jìn)行活化、逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，制備成液體一級(jí)種子和二級(jí)種子；(2)將液體一級(jí)種子或二級(jí)種子，按發(fā)酵液體積的3～8％接種量接入液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，在26～32℃培養(yǎng)36～72h時(shí)，添加40～150mg/L亞硝酸鹽，再培養(yǎng)12～24h；(3)將(2)的發(fā)酵液在8,000～10,000rpm，離心收集乳酸菌菌體；(4)用(3)收集到的菌體體積2～3倍pH值7.0的緩沖液清洗，待菌體完全懸浮后，在8,000～10,000rpm下離心收集乳酸菌菌體，重復(fù)上述清洗菌體操作2～3次，最終將菌體制備成乳酸菌菌懸液；(5)將(4)制備成的乳酸菌菌懸液減壓破碎菌體；(6)將(5)得到的菌體破碎懸液在12,000～140,000rpm、4℃離心，收集到的上清液即為粗酶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，在步驟(6)之后包括將步驟(6)得到的粗酶液進(jìn)一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基為酪蛋白胨3.0～7.0g，牛肉提取物2.0～8.0g，酵母提取物3.0～9.0g，玉米淀粉糖3.0～10.0g，乙酸鈉0.5～2.0g，檸檬酸二胺0.6～2.0g，Tween80 0.3～1.4g，K2HPO40.4～1.5g，CaCO320.0g，自來(lái)水1.0L，pH值7.0，121℃高壓蒸氣滅菌30min。
全文摘要
本發(fā)明提供一種乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)亞硝酸還原酶的方法，將產(chǎn)生亞硝酸還原酶的乳酸菌進(jìn)行活化、按常規(guī)方法逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，制備成液體種子；按發(fā)酵液體積的3～8％接種量接入液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，在26～32℃培養(yǎng)36～72h時(shí)，添加40～150mg/L亞硝酸鹽，再培養(yǎng)12～24h，即乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)亞硝酸還原酶結(jié)束；這種生產(chǎn)方法獲得的亞硝酸還原酶粗酶液活性可以達(dá)到2600U/ml，如再經(jīng)過(guò)分離和純化，可以得到不同濃度、純度和劑型的酶制劑。
文檔編號(hào)C12N9/02GK1687408SQ200510073389
公開(kāi)日2005年10月26日 申請(qǐng)日期2005年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月3日
發(fā)明者張慶芳, 遲乃玉 申請(qǐng)人:張慶芳, 遲乃玉