專利名稱：一種細(xì)菌亞硝酸鹽還原酶活性測定方法
一種細(xì)菌亞硝酸鹽還原酶活性測定方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物酶學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種細(xì)菌亞硝酸鹽還原酶活性測定方法。
背景技術(shù)：
亞硝酸鹽還原酶是還原亞硝酸鹽的酶。廣泛存在于植物，微生物中。同化型亞硝酸鹽還原酶含siroheme，進(jìn)行6個(gè)電子的還原產(chǎn)生氨。高等植物、綠藻及藍(lán)藻的酶以鐵氧還原蛋白為電子供體。菠菜葉亞硝酸鹽還原酶(分子量6萬)，含siroheme、非血紅素鐵及對(duì)酸不穩(wěn)定的硫。粗糙脈孢菌亞硝酸鹽還原酶(分子量四萬)及大腸埃希氏菌亞硝酸鹽還原酶 (分子量19萬)含F(xiàn)AD、非血紅素鐵及siroheme，以NAD (P) H為電子供體。異化型酶參與亞硝酸氧化有機(jī)物質(zhì)的過程，其中脫氮細(xì)菌的酶生成N0，再由其它還原酶的作用經(jīng)N2O而還原為隊(duì)。脫氮細(xì)菌的亞硝酸鹽還原酶有二種，一為銅蛋白，以細(xì)胞色素C為電子供體的酶， 如糞產(chǎn)堿菌亞硝酸鹽還原酶。另一為細(xì)胞色素c和d為電子供體的酶，如菲氏無色桿菌亞硝酸鹽還原酶。
目前大多數(shù)細(xì)菌亞硝酸還原酶活性測定方法是基于酶反應(yīng)后，用鹽酸萘乙二胺法 (又稱格里斯試劑比色法)比色測定亞硝酸鹽的方法。其原理是亞硝酸鹽與對(duì)氨基苯磺酸重氮化后，與鹽酸萘乙二胺偶合形成紫紅色染料，與亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線比較定量。通過測定反應(yīng)前后亞硝酸鹽的含量差值，來反應(yīng)亞硝酸鹽還原酶活性大小。但該方法存在費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、 費(fèi)試劑，操作過程比較繁瑣的技術(shù)問題。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決上述技術(shù)中的費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、費(fèi)試劑及操作過程比較繁瑣的技術(shù)問題而提供一種細(xì)菌中亞硝酸還原酶活性測定方法，即對(duì)常用萘乙二胺法測定生物樣品中亞硝酸鹽的測定進(jìn)行簡化，改進(jìn)蛋白及脂類去除過程，在酶反應(yīng)后不用一般鹽酸萘乙二胺法比色測定，而采用多孔板和多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行測定分析。
本發(fā)明的技術(shù)方案一種細(xì)菌亞硝酸鹽還原酶活性測定方法，具體包括以下步驟 (1)、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 ①、配制標(biāo)準(zhǔn)曲線制作所用試劑濃度0. 2%(ff/V)的鹽酸萘乙二胺溶液稱取0. Ig鹽酸萘乙二胺，溶解于50mL蒸餾水中，混勻后，置棕色瓶中，避光4°C冰箱內(nèi)保存，現(xiàn)用現(xiàn)配；濃度0. 4%(ff/V)的對(duì)氨基苯磺酸溶液稱取0. 4g對(duì)氨基苯磺酸，溶于IOOmL 20 %鹽酸中，置于棕色瓶中混勻，避光保存； 濃度0. 2mg/mL的亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液準(zhǔn)確稱取0. IOOOg于干燥器中干燥24h的亞硝酸鈉，加蒸餾水溶解移入500 mL容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，混勻；濃度0. 005mg/mL的亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液的稀釋液吸取濃度0. 2mg/mL亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液5. OOmL置于200mL容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度；②、標(biāo)準(zhǔn)曲線制作分別吸取 0,0. 2,0. 4,0. 6,0. 8，1. 0，1. 5,2. 0,2. 5mL 濃度 0. 005mg/mL 亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液的稀釋液，分別置于25 mL容量瓶中，加蒸餾水20 mL左右，搖勻；每個(gè)容量瓶中分別滴加2 mL濃度0.4%(W/V)的對(duì)氨基苯磺酸溶液，混勻，避光靜置 3min，再分別加入ImL濃度0J%(W/V)的鹽酸萘乙二胺溶液，蒸餾水定容至25 mL，混勻，避光靜置15min ；將溶液用酶標(biāo)儀在波長538nm處測定吸光值，并根據(jù)所得的吸光度與相應(yīng)的亞硝酸鈉濃度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；(2)、細(xì)菌中亞硝酸鹽還原酶的提?、?、細(xì)菌中亞硝酸鹽還原酶提取所用的溶液的制備分別稱取 8g NaCl,0. 2g KCl, 1. 44gNa2HP04，0. 24g KH2PO4,加 Λ 800ml 蒸餾水溶解，再加入8. 32g乙二胺四乙酸，用HCl調(diào)節(jié)pH值至7. 4，再加入500 μ 1吐溫-20，Iml TritonX-IOO及4g聚乙烯吡咯烷酮，混勻后加蒸餾水定容至1L，即得細(xì)菌中亞硝酸鹽還原酶提取所用的溶液；②、細(xì)菌中亞硝酸鹽還原酶的提取將細(xì)菌培養(yǎng)液用8000r/m離心收集菌體，每克濕菌加入IOml于4°C預(yù)冷Ih的上述①中所得的細(xì)菌中亞硝酸鹽還原酶提取所用的溶液，冰浴超聲波破碎菌體20min，每超聲1秒停 2秒，超聲后取出15000r/m離心15min，取上清即待測細(xì)菌中亞硝酸鹽還原酶蛋白樣品液， 于4°C保存待測試；所述的細(xì)菌培養(yǎng)液，即將液體種子按體積分?jǐn)?shù)3-5%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，控制溫度為30°C，時(shí)間4 后所得的發(fā)酵液；所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中原料的組分及含量為葡萄糖20.0 g;牛肉膏10.0 g;酵母膏 5.0 g ；大豆蛋白胨10. Og ；無水乙酸鈉5. Og ；檸檬酸三銨2. Og ；磷酸氫二鉀2. Og ；硫酸鎂0. 58 g ；硫酸錳0. 25 g ；吐溫80 1 mL ；亞硝酸鈉120mg;去離子水:1000 mL，用濃度為lmol/L的HCl調(diào)節(jié)pH值為6. 4后，于121°C高壓蒸汽滅菌20 min ；(3)、測定過程中所用的反應(yīng)混合液的配制分別稱 200mgNa2S204、15mgNADPH、0. 025g 甲基紫精溶解于 15ml 0. 29M NaHCO3 溶液中， 待全部溶解后即得測定過程中所用的反應(yīng)混合液；(4)、細(xì)菌亞硝酸鹽還原酶催化亞硝酸鹽還原反應(yīng)(即酶促反應(yīng))①、取Iml步驟(2)中的②所得的待測細(xì)菌中亞硝酸鹽還原酶樣品液放入EP管，再加入 lmL-2ml濃度為0. 002 g /ml _0. 02g/ml的NaNO2溶液，輕輕搖晃振蕩，加入0. 5ml步驟(3) 所得的反應(yīng)混合液，37°C培養(yǎng)箱，避光靜置Imin后，取出加入5 10 μ 1濃度為30%的H2O2，在搖床上，輕輕搖動(dòng)5、min，直至藍(lán)紫色完全退去，立即放入90°C水中，3-5min后于15000r/ m離心收集上清A ；取上清AO. 5ml放入2mlEP管中，加入0. 5ml體積比即苯酚氯仿異戊醇為25:24:1的苯酚、氯仿和異戊醇組成的混合溶液，劇烈振蕩后，15000r/m離心取上清B，重復(fù)此步驟2 次，最后離心所得上清c即為酶反應(yīng)后待測亞硝酸鹽溶液；②、取Iml蒸餾水放入EP管，再加入lmL-2ml濃度為0. 002g/ml-0. 02g/ml的NaNO2 溶液，輕輕搖晃振蕩，加入0. 5ml反應(yīng)混合液，37°C培養(yǎng)箱，避光靜置Imin后，取出加入 5^10 μ 1濃度為30%的H2O2，在搖床上，輕輕搖動(dòng)5、min，所得溶液為酶反應(yīng)前待測亞硝酸鹽溶液；(5)、細(xì)菌中亞硝酸鹽還原酶活性的測定①、酶反應(yīng)前亞硝酸鹽溶液吸光值的測定吸取10 μ 1-100 μ 1步驟(4)的②中所得到的酶反應(yīng)前待測亞硝酸鹽溶液于多孔板的孔中，加蒸餾水100-190 μ 1，搖勻，滴加15 μ 1-30 μ 1濃度0. 4%(ff/V)的對(duì)氨基苯磺酸溶液， 混勻，避光靜置3 !^11，再加入1(^1 -15μ 1濃度0. 2%(ff/V)的鹽酸萘乙二胺溶液，混勻，避光靜置15min，在波長538nm處測定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可測得酶反應(yīng)前的NaNO2含量；②、酶反應(yīng)后待測亞硝酸鹽溶液吸光值的測定吸取10 μ 1-100 μ 1步驟(4)的①中所得到的酶反應(yīng)后待測亞硝酸鹽溶液于多孔板的孔中，加蒸餾水ΙΟΟμΙ -190μ 1，搖勻，滴加15μ 1 -30μ 1濃度0.4%(W/V)的對(duì)氨基苯磺酸溶液，混勻，避光靜置3min，再加入10 μ 1 -15 μ 1濃度0. 2%(ff/V)的鹽酸萘乙二胺溶液， 混勻，避光靜置15min，在波長538nm處測定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可測得酶反應(yīng)后NaNO2含量；再通過酶活力計(jì)算公式計(jì)算待測細(xì)菌中亞硝酸鹽還原酶的活力；酶活力計(jì)算公式如下Y:酶活力(U)Xl 酶反應(yīng)前NaNO2含量(μ g/mL) X2 酶反應(yīng)后NaNO2含量(μ g/mL) t 酶催化時(shí)間(min)。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明的一種細(xì)菌亞硝酸還原酶活性測定方法，對(duì)常用鹽酸萘乙二胺法測定酶反應(yīng)樣品中亞硝酸鹽方法進(jìn)行簡化，改進(jìn)蛋白及脂類去除過程和比色測定技術(shù)，在酶反應(yīng)后不用一般萘乙二胺法比色測定，而采用多孔板和多功能酶標(biāo)儀分析測定，可以節(jié)省分析試劑的用量，鹽酸萘乙二胺法每個(gè)樣品測定需要0. 3%(ff/V)鹽酸萘乙二胺溶液約IOOOuL和 1%(W/V)的對(duì)氨基苯磺酸約IOOOuL,本發(fā)明只要0. 2%(ff/V)的鹽酸萘乙二胺溶液約30uL和 0. 4%(ff/V)的對(duì)氨基苯磺酸約15uL。
本發(fā)明由于采用多孔板和多功能酶標(biāo)儀測定，一次可以檢測多個(gè)樣品，因此，可以節(jié)省人力和測試時(shí)間，大大提高了檢測效率。


圖1、在波長538nm處的吸光度與相應(yīng)的亞硝酸鈉濃度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施方式
下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步闡述，但并不限制本發(fā)明。
本發(fā)明的實(shí)施例中所用的細(xì)菌為植物乳桿菌LactohciBm plantarum,購自上海工業(yè)微生物研究所；本發(fā)明測定方法中所用主要試劑連二亞硫酸鈉、NADPH、甲基紫精購自Sigma公司；吐溫-20、TritonX-100、苯酚、氯仿、異戊醇購自英國Oxoid公司；亞硝酸鈉、鹽酸萘乙二胺、對(duì)氨基苯磺酸、濃鹽酸、氫氧化鈉、碳酸氫鈉、乙二胺四乙酸、聚乙烯吡咯烷酮購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純；本發(fā)明所用主要測定儀器高速離心機(jī)、多孔板即96孔板、酶標(biāo)儀購自美國Thermo Fisher公司；SYQ-DSX-280型滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠)；PHSJ-4A型PH計(jì)(上海大中分析儀器廠)；SHP-150型(X)2恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏設(shè)備有限公司)。
本發(fā)明的細(xì)菌中亞硝酸還原酶酶活力計(jì)算公式如下
權(quán)利要求
1. 一種細(xì)菌中亞硝酸還原酶活性測定方法，其特征在于具體包括以下步驟(1)、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作①、配制標(biāo)準(zhǔn)曲線制作所用試劑濃度0. 2%(ff/V)的鹽酸萘乙二胺溶液稱取0. Ig鹽酸萘乙二胺，溶解于50mL蒸餾水中，混勻后，置棕色瓶中，避光4°C冰箱內(nèi)保存，現(xiàn)用現(xiàn)配；濃度0. 4%(ff/V)的對(duì)氨基苯磺酸溶液稱取0. 4g對(duì)氨基苯磺酸，溶于IOOmL 20 %鹽酸中，置于棕色瓶中混勻，避光保存；濃度0. 2mg/mL的亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液準(zhǔn)確稱取0. IOOOg于干燥器中干燥24h的亞硝酸鈉，加蒸餾水溶解移入500 mL容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，混勻；濃度0. 005mg/mL的亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液的稀釋液吸取濃度0. 2mg/mL的亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液5. OOmL,置于200mL容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度；②、標(biāo)準(zhǔn)曲線制作分別稱取 0，0. 2,0. 4,0. 6,0. 8,1. 0,1. 5,2. 0,2. 5 mL 濃度 0. 005mg/mL 亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液的稀釋液，分別置于25 mL容量瓶中，加蒸餾水20 mL左右，搖勻；每個(gè)容量瓶中分別滴加2 mL濃度0.4%(W/V)的對(duì)氨基苯磺酸溶液，混勻，避光靜置 3min，再分別加入ImL濃度0J%(W/V)的鹽酸萘乙二胺溶液，蒸餾水定容至25 mL，混勻，避光靜置15min ；將溶液用酶標(biāo)儀在波長538nm處測定吸光值，并根據(jù)所得的吸光度與相應(yīng)的亞硝酸鈉濃度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；(2)、細(xì)菌中亞硝酸鹽還原酶的提?、佟⒓?xì)菌中亞硝酸鹽還原酶提取所用溶液的制備分別稱取 8g NaCl,0. 2g KCl，1. 44gNa2HP04,0 . 24g KH2PO4,加 Λ 800ml 蒸餾水溶解，再加入8. 32g乙二胺四乙酸，用HCl調(diào)節(jié)pH值至7. 4，再加入500 μ 1吐溫-20，Iml TritonX-IOO及4g聚乙烯吡咯烷酮，混勻后加蒸餾水定容至IL ；②、細(xì)菌中亞硝酸鹽還原酶的提取將細(xì)菌培養(yǎng)液用8000r/m離心收集菌體，每克濕菌加入IOml于4°C預(yù)冷Ih的上述①中所得的細(xì)菌亞硝酸鹽還原酶提取所用的溶液，冰浴超聲波破碎菌體20min，每超聲1秒停2 秒，超聲后取出15000r/m離心15min，取上清即待測細(xì)菌中亞硝酸鹽還原酶蛋白樣品液，于 4°C保存待測試；(3)、測定過程中所用的反應(yīng)混合液的配制分別稱20011^妝2&04、1511^嫩0 !1、0.0258甲基紫精溶解于151111 0. 29M NaHCO3溶液中， 待全部溶解后即得測定過程中所用的反應(yīng)混合液；(4 )、細(xì)菌亞硝酸鹽還原酶催化亞硝酸鹽還原反應(yīng)①、取Iml步驟(2)的②所得的待測細(xì)菌中亞硝酸鹽還原酶樣品液放入EP管，再加入 lmL-2ml濃度為0. 002 g /ml _0. 02g/ml的NaNO2溶液，輕輕搖晃振蕩，加入0. 5ml步驟(3) 所得的反應(yīng)混合液，37°C培養(yǎng)箱，避光靜置Imin后，取出加入5 10 μ 1濃度為30%的H2O2，在搖床上，輕輕搖動(dòng)5、min，直至藍(lán)紫色完全退去，立即放入90°C水中，3-5min后于15000r/ m離心收集上清A ；取上清AO. 5ml放入2mlEP管中，加入0. 5ml體積比即苯酚氯仿異戊醇為25:24:1的苯酚、氯仿和異戊醇組成的混合溶液，劇烈振蕩后，15000r/m離心取上清B，再重復(fù)此步驟2 次，最后離心所得上清c即為酶反應(yīng)后待測亞硝酸鹽溶液；②、取Iml蒸餾水放入EP管，再加入lmL-2ml濃度為0. 002g/ml-0. 02g/ml的NaNO2 溶液，輕輕搖晃振蕩，加入0. 5ml反應(yīng)混合液，37°C培養(yǎng)箱，避光靜置Imin后，取出加入 5^10 μ 1濃度為30%的H2O2，在搖床上，輕輕搖動(dòng)5、min，所得溶液為酶反應(yīng)前待測亞硝酸鹽溶液；(5)、細(xì)菌中亞硝酸鹽還原酶活性的測定①、反應(yīng)前亞硝酸鹽溶液吸光值的測定吸取10 μ 1-100 μ 1步驟(4)中②所得的酶反應(yīng)前待測亞硝酸鹽溶液于多孔板的孔中， 加蒸餾水100-190 μ 1，搖勻，滴加15 μ 1-30 μ 1濃度0. 4% (ff/V)的對(duì)氨基苯磺酸溶液，混勻， 避光靜置3 min，再加入10 μ 1 -15 μ 1濃度0. 2% (ff/V)的鹽酸萘乙二胺溶液，混勻，避光靜置15min，在波長538nm處測定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可測得酶反應(yīng)前的NaNO2含量Xl ；②、反應(yīng)后待測亞硝酸鹽溶液吸光值的測定吸取10μ 1-100μ 1步驟(4)中①所得的酶反應(yīng)后待測亞硝酸鹽溶液于多孔板的孔中， 加蒸餾水100 μ 1 -190 μ 1，搖勻，滴加15 μ 1 -30 μ 1濃度0. 4% (ff/V)的對(duì)氨基苯磺酸溶液， 混勻，避光靜置3min，再加入10 μ 1 -15 μ 1濃度0. 2% (ff/V)的鹽酸萘乙二胺溶液，混勻，避光靜置15min，在波長538nm處測定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可測得酶反應(yīng)后NaNO2含量X2 ； 再通過酶活力計(jì)算公式計(jì)算待測細(xì)菌亞硝酸鹽還原酶的活力； 酶活力計(jì)算公式如下
2.如權(quán)利要求1所述的一種細(xì)菌中亞硝酸還原酶活性測定方法，其特征在于步驟(5) 中所述的多孔板為96孔板。
3.利用如權(quán)利要求1 2所述的一種細(xì)菌中亞硝酸還原酶活性測定方法對(duì)細(xì)菌中亞硝酸還原酶活性的測定。
4.利用如權(quán)利要求1 2所述的一種細(xì)菌中亞硝酸還原酶活性測定方法對(duì)植物乳桿菌中亞硝酸還原酶活性的測定。
5.如權(quán)利要求4所述的利用一種細(xì)菌中亞硝酸還原酶活性測定方法對(duì)植物乳桿菌中亞硝酸還原酶活性的測定，其特征在于具體包括如下步驟(1)、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作①、配制標(biāo)準(zhǔn)曲線制作所用試劑濃度0. 2%(ff/V)的鹽酸萘乙二胺溶液稱取0. Ig鹽酸萘乙二胺，溶解于50mL蒸餾水中，混勻后，置棕色瓶中，避光4°C冰箱內(nèi)保存，現(xiàn)用現(xiàn)配；濃度0. 4%(ff/V)的對(duì)氨基苯磺酸溶液稱取0. 4g對(duì)氨基苯磺酸，溶于IOOmL 20 %鹽酸中，置于棕色瓶中混勻，避光保存； 濃度0. 2mg/mL的亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液準(zhǔn)確稱取0. IOOOg于干燥器中干燥24h的亞硝酸鈉，加蒸餾水溶解移入500 mL容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，混勻；濃度0. 005mg/mL的亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液的稀釋液稱吸濃度0. 2mg/mL的亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液5. OOmL，置于200mL容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度；②、標(biāo)準(zhǔn)曲線制作分別稱取 0，0. 2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.5,2.0,2.5 mL 濃度 0. 005mg/mL 亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液稀釋液，分別置于25 mL容量瓶中，加蒸餾水20 mL左右，搖勻；每個(gè)容量瓶中分別滴加2 mL濃度0.4%(W/V)的對(duì)氨基苯磺酸溶液，混勻，避光靜置 3min，再分別加入ImL濃度0J%(W/V)的鹽酸萘乙二胺溶液，蒸餾水定容至25 mL，混勻，避光靜置15min ；將溶液用酶標(biāo)儀在波長538nm處測定吸光值，并根據(jù)所得的吸光度與相應(yīng)的亞硝酸鈉濃度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；(2)、植物乳桿菌LactohciBm plantarum中亞硝酸鹽還原酶的提?、?、植物乳桿菌LactohciBmplantarum中亞硝酸鹽還原酶提取所用的溶液的制備分別稱取 8g NaCl, 0. 2g KCl, 1. 44g，Na2HPO4 0. 24g KH2PO4,加 Λ 800ml 蒸餾水溶解，再加入8. 32g乙二胺四乙酸，用HCl調(diào)節(jié)pH值至7. 4，再加入500 μ 1吐溫-20，Iml TritonX-IOO及4g聚乙烯吡咯烷酮，混勻后加蒸餾水定容至1L，即得細(xì)菌中亞硝酸鹽還原酶提取所用的溶液；②、植物乳桿菌Lactobacillusplan tarum中亞硝酸鹽還原酶的提取將植物乳桿菌LacioAaciBiz1S plantarum培養(yǎng)液IOOmL用8000rpm離心收集菌體,每克濕菌加入IOml于4°C預(yù)冷Ih的上述①中所述的細(xì)菌中亞硝酸鹽還原酶提取所用的溶液， 冰浴超聲波破碎菌體20min，每超聲1秒停2秒，超聲后取出15000rpm離心15min，取上清即得待測即細(xì)菌植物乳桿菌LactohciBm plantarum中亞硝酸鹽還原酶蛋白樣品液，于 4°C保存待測試；所述的植物乳桿菌LactohciBm plantarum培養(yǎng)液，即將液體種子按體積分?jǐn)?shù)3_5% 的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，控制溫度為30°C，時(shí)間4 后所得的發(fā)酵液； 所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中原料的組分及含量如下 葡萄糖20. Og牛肉膏10. Og酵母膏5.0大豆蛋白胨10. Og無水乙酸鈉5. Og檸檬酸三銨2. Og磷酸氫二鉀2. Og硫酸鎂0. 58g硫酸錳0. 25g吐溫80ImL亞硝酸鈉120mg去離子水IOOOmL用濃度為lmol/L的HCl調(diào)節(jié)pH值為6. 4，121 °C高壓蒸汽滅菌20 min即可；(3)、測定過程中所用的反應(yīng)混合液的配制分別稱 200mgNa2S204、15mgNADPH、0. 025g 甲基紫精溶解于 15ml 0. 29M NaHCO3 溶液中， 待全部溶解后即得測定過程中所用的反應(yīng)混合液；其他試劑與制標(biāo)準(zhǔn)曲線制作所用的試劑相同；(4 )、植物乳桿菌Lac tobacillus plan tarum中亞硝酸鹽還原酶催化亞硝酸鹽還原反應(yīng)①、取Iml步驟(2)的②所得的待測植物乳桿菌LactohciBmplantarum中亞硝酸鹽還原酶蛋白樣品液放入EP管，再加入ImL濃度為0.002 g /ml的NaNO2溶液，輕輕搖晃振蕩， 加入0. 5ml步驟(3)所得的反應(yīng)混合液，37°C培養(yǎng)箱，避光靜置Imin后，取出加入5 10 μ 1 濃度為30%的H2O2，在搖床上，輕輕搖動(dòng)5、min，直至藍(lán)紫色完全退去，立即放入90°C水中， 3-5min后于15000r/m離心收集上清A ；取上清AO. 5ml放入2mlEP管中，加入0. 5ml體積比即苯酚氯仿異戊醇為25:24:1 的苯酚、氯仿和異戊醇組成的混合溶液，劇烈振蕩后，15000r/m離心取上清B，重復(fù)此步驟2 次，最后離心所得上清c為酶反應(yīng)后待測亞硝酸鹽溶液；②、取Iml蒸餾水放入EP管，再加入lmL-2ml濃度為0.002g/ml的NaNO2溶液，輕輕搖晃振蕩，加入0. 5ml步驟(3)所得的反應(yīng)混合液，37°C培養(yǎng)箱，避光靜置Imin后，取出加入 5^10 μ 1濃度為30%的H2O2，在搖床上，輕輕搖動(dòng)5、min，所得溶液為酶反應(yīng)前待測亞硝酸鹽溶液；(5)、植物乳桿菌LactohciBm plantarum中亞硝酸鹽還原酶活性的測定①、酶反應(yīng)前亞硝酸鹽溶液吸光值的測定吸取100μ 1步驟(4)中②所得的反應(yīng)前待測亞硝酸鹽溶液于多孔板的孔中，加蒸餾水 100 μ 1，搖勻，滴加30 μ 1濃度0. 4% (W/V)的對(duì)氨基苯磺酸溶液，混勻，避光靜置3 min,再加入15μ 1濃度0. 2%(ff/V)的鹽酸萘乙二胺溶液，混勻，避光靜置15min，在波長538nm處測定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可測得酶反應(yīng)前的NaNO2含量Xl ；②、酶反應(yīng)后待測亞硝酸鹽溶液吸光值的測定吸取100μ 1步驟(4)中①所得的酶反應(yīng)后待測亞硝酸鹽溶液于多孔板的孔中，加蒸餾水100 μ 1，搖勻，滴加30 μ 1濃度0. 4% (W/V)的對(duì)氨基苯磺酸溶液，混勻，避光靜置3min，再加入15 μ 1濃度0. 2%(ff/V)的鹽酸萘乙二胺溶液，混勻，避光靜置15min，在波長538nm處測定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可測得酶反應(yīng)后NaNO2含量X2 ；再通過細(xì)菌中亞硝酸還原酶酶活力計(jì)算公式計(jì)算出細(xì)菌即植物乳桿菌L^tohciBm plantarum中亞硝酸還原酶酶的活力，細(xì)菌中亞硝酸還原酶酶活力計(jì)算公式如下Y 酶活力(u/ml)Xl 酶反應(yīng)前NaNO2含量(μ g/mL) X2 .酶反應(yīng)后NaNO2含量(μ g/mL) t 酶催化時(shí)間(min)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種細(xì)菌亞硝酸還原酶活性測定方法，包括標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作、細(xì)菌亞硝酸鹽還原酶的提取、測定過程中所用的反應(yīng)混合液的配制、細(xì)菌亞硝酸鹽還原酶促反應(yīng)及細(xì)菌亞硝酸鹽還原酶活性的測定，即通過多孔板和酶標(biāo)儀測定反應(yīng)前、后亞硝酸鹽溶液吸光值并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可測得酶促反應(yīng)前、后NaNO2含量，再通過酶活力計(jì)算公式計(jì)算待測細(xì)菌亞硝酸鹽還原酶的活力。本發(fā)明的一種細(xì)菌亞硝酸還原酶活性測定方法，在酶促反應(yīng)后采用多孔板和酶標(biāo)儀分析方法，即節(jié)省分析試劑的用量，同時(shí)節(jié)省人力和測試時(shí)間，大大提高了檢測效率。
文檔編號(hào)G01N21/31GK102495011SQ20111037685
公開日2012年6月13日 申請日期2011年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月24日
發(fā)明者何婷婷, 高然, 龔鋼明 申請人:上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院