專利名稱:一種植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶基因及其編碼的蛋白質(zhì)和應用的制作方法
技術領域:
本發(fā)明屬于基因工程技術領域,具體涉及一種植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶基因, 含有該基因的重組載體、用該載體轉(zhuǎn)化的宿主以及利用該轉(zhuǎn)化體生產(chǎn)該基因的表達產(chǎn)物及其應用。
背景技術:
亞硝酸鹽還原酶是一類催化亞硝酸鹽還原的酶。亞硝酸鹽廣泛存在于腌制或新鮮食物以飼料中。食品中亞硝酸鹽的過量,會使血紅蛋白氧化成高鐵血紅蛋白,降低血液的載氧能力,造成高鐵血紅蛋白血癥,對人體造成嚴重危害。亞硝酸鹽還可在人體內(nèi)與仲胺、 叔胺和氨基化合物反應形成強致癌物亞硝胺化合物,從而誘發(fā)消化系統(tǒng)癌變。鑒于食品中超標亞硝酸鹽污染可引起食品安全問題,人們正在努力尋找有效控制或降解亞硝酸鹽的方法,生物酶法消除食品亞硝酸鹽是一條可行的途徑。迄今,有不少報道認為植物乳酸菌具有降解亞硝酸鹽的能力,并推測植物乳酸菌降解亞硝酸鹽與所含的亞硝酸鹽還原酶有關。然而,目前植物乳酸菌亞硝酸鹽還原酶的基因及其基因編碼的酶蛋白序列還未見研究報道。參考文獻王琦,李悅鵬,婁峰閣.亞硝酸鹽的危害及其替代物的研究進展[J].中國飲食衛(wèi)生與健康,2005,2 (9) :36-37孫菲菲,蔣芳玲,侯喜林,李英等.白菜亞硝酸還原酶基因BcNiR的克隆及表達分析[J].園藝學報,2009,36 (10) 1511-1518Eugene J. Mitacek, Klaus D. Brunnemann, Maitree Suttaj it, Lee S. Caplan. Geographic Distribution of Liver and Stomach Cancers in Thailand in Relation to Estimated Dietary Intake of Nitrate, Nitrite, and Nitrosodimethylamine[J]. Nutrition and Cancer, 60:2,196-203龔鋼明,管世敏,邵海,呂玉濤.降解亞硝酸鹽乳酸菌的分離鑒定[J].食品工業(yè), 2009(5) :12-13G. Wolf, W. P. Hammes. Effect of hematin on the activities of nitrite reductase and catalase in lactobacilli[J]. Arch Microbiol (1988) 149: 220 -224Krishna P. Rai, Chunhui Zhang, Wen Shui Xia. Effects of pure starter cultures on physico-chemical and sensory quality of dry fermented Chinese-style sausage[J], Food Sci Technol, 2010, 47(2) :188 - 194陳燕紅,程萍,喻國輝,潘麗晶.沼澤紅假單胞菌Rhodopseudomonaspalustris 2-8的亞硝酸鹽還原酶基因克隆和序列分析[J].微生物學通報,2011,38(5): 647 653Braker G, Fesefeldt A, Witzel KP. Development of PCR primer systems foramplification of nitrite reductase genes (nirK and nirS) to detect denitrifying bacteria in environmental samples[P]. Applied and Environmental Microbiology, 1998,64(10) : 3769 3775. Lima I, Moreira S M, Osten J R V, et al. Biochemical responses of the marine mussel Myfilus gal loprovincialis to petrochemical environmental contamination along the North-western coast of Portugal [J]. Chemosphere, 2006, 66 (7) :1230-1242. Danes V, Alhama J, Navas JI, et al. Ecotoxicological effects of metal pollution in two mollusc species from the Spanish South Atlantic littoral [ J]. Environ Poll, 2006,139 :214-223. Antonio T, Carlos M. Environmental impacts of intensive aquaculture culture in marine waters[J]. Water Research, 2000 , 34(1):334-342。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一為了解決上述的問題而提供一種人工合成的植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶的基因;
本發(fā)明的目的之二提供了一種由上述的一種植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶的基因編碼的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的目的之三是提供含有上述的一種植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶的基因轉(zhuǎn)化而成的質(zhì)粒。本發(fā)明的目的之四在于提供了一種含有上述的一種植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶基因轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒的重組大腸桿菌。本發(fā)明的技術原理
以金黃色葡萄球菌,銅綠假單胞菌、布魯氏桿菌;大腸桿菌等的亞硝酸鹽還原酶基因為參考,進行引物設計,用植物乳桿菌提取的基因組DNA為模板,通過PCR技術擴增植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶的基因片段,將該片的連接到pET-32a ( + )表達載體中,再轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)細胞中,經(jīng)IPTG誘導后,進行植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶(NiRL)蛋白表達, 獲得植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶蛋白。本發(fā)明的技術方案
一種植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶的基因,其堿基序列如SEQ ID NO: 1的多核苷酸; 含有上述的一種植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶的基因的重組質(zhì)粒。上述的重組質(zhì)粒優(yōu)選為pET_32a ( + ) - NiRL質(zhì)粒,其中所用的載體pET_32a ( + ) 還可以采用常用的其他PET、pKK223-3或ρΗΤ載體替代。當選用PET載體時,可以選用大腸桿菌或枯草桿菌表達,當選用ΡΚΚ223-3載體時要用大腸桿菌JM105表達,而當選用ρΗΤ載體時要用枯草桿菌表達系統(tǒng)。所述的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化而成的重組微生物,所述的重組微生物為重組大腸桿菌或重組枯草桿菌,且所述的重組大腸桿菌優(yōu)選為Ε. coliBL21 (DE3)或JM105。利用上述的重組大腸桿菌或重組枯草桿菌生產(chǎn)的一種植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶,該還原酶的氨基酸序列為SEQ ID N0:2。
本發(fā)明的技術效果
本發(fā)明通過以金黃色葡萄球菌,銅綠假單胞菌、布魯氏桿菌;大腸桿菌等的亞硝酸鹽還原酶基因為參考,進行引物設計,用植物乳桿菌提取的基因組DNA為模板,通過PCR技術擴增植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶的基因片段,將該片的連接到pET-32a ( + )表達載體中,再轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)細胞中,經(jīng)IPTG誘導后,進行植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶(NiRL) 蛋白表達,從而獲得了一種植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶蛋白。另外,所得的植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶蛋白可以用于處理肉腌制品或飼料中過量的亞硝酸鹽殘留,也可以用于植物乳酸菌亞硝酸鹽還原酶的分子結構等理論研究。
圖1、PCR擴增產(chǎn)物鑒定圖,其中M =DNA分子量標準,1 =PCR擴增產(chǎn)物,2 陰性對
照圖2、重組質(zhì)粒雙酶切鑒定圖,其中M =DNA分子量標準,1 雙酶切重組質(zhì)粒; 圖3、PCR產(chǎn)物鑒定圖,其中M =DNA分子量標準;1 :PCR擴增產(chǎn)物,2 陰性對照; 圖4、重組蛋白誘導表達后菌體全蛋白SDS-PAGE電泳檢測,其中M 低分子量蛋白標準; 1 誘導后重組菌體全蛋白;2 誘導后非重組菌體全蛋白;
圖5、實施例4含有植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶蛋白提取液的酶活性測定結果; 圖6、實施例4無植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶蛋白提取液的酶活性測定的陰性對照。
具體實施例方式下面通過實施例并結合附圖對本發(fā)明進一步闡述,但并不限制本發(fā)明的實質(zhì),僅僅是對本發(fā)明的技術方案進行說明,以便本領域技術人員進一步理解本發(fā)明。本發(fā)明所用的蛋白胨、牛肉膏和酵母粉抽提物購自英國Oxoid公司; IPTG、Ampici 11 in購自上海生工生物公司;
回收試劑盒購自BI0MIGA公司;
Taq DNA聚合酶、high ligation連接酶、限制性內(nèi)切酶BamH I ,Xho I、Hind III均購自Fermentas公司;
其他化學試劑均為國產(chǎn)分析純。本發(fā)明所用的植物乳桿菌(Lac ο如以7ΛΛ5 /^a/ iar腫)購自中國微生物菌種保藏中心(保藏編號CCTCC NO 22708);
本發(fā)明所用的大腸桿菌E. coli TGU E. coli BL21 (DE3)及質(zhì)粒pET_32a ( + )由本實驗室保存。本發(fā)明所用的設備
TGL-160冷凍離心機為上海恒科儀器有限公司;
SHP-150s生化培養(yǎng)箱HWS12電熱恒溫水浴、酶標儀為美國Thermo Fisher公司; SYQ-DSX-280型滅菌鍋、Tan Gis 1000凝膠電泳圖成像系統(tǒng)為上海天能科技有限公
司;
SUB_Cell GT電泳儀為美國BIO-RAD公司;
SG412壓力蒸汽式滅菌鍋為上海華線醫(yī)用儀器有限公司。
本發(fā)明最終所得的植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶的酶活測定方法參照GENMED公司細菌亞硝酸鹽還原酶總活性比色測定法進行。實施例1
一種人工合成的植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶的基因,其堿基序列如SEQ ID N0:1,該序列通過如下方式獲得
(1)、PCR引物設計
以金黃色葡萄球菌,銅綠假單胞菌I3SeudomonaS aeruginosa、布魯氏桿菌;大腸桿菌hcherichia coli的亞硝酸鹽還原酶基因為參考,設計出PCR引物即上游引物為 5’ GCGGATCCATGAGTCAAAGCTTATG3,(BamH I ),見 SEQ ID NO:3,下游引物為 5' CCGCTCGAGTTAATTCCGTACACTG3' (Xho I),見 SEQ ID N0:4,并人工合成;
(2)、植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶的基因組DNA的提取
①、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)(保藏編號CCTCC NO 22708)培養(yǎng)物 5000r/min,離心15min,棄上清,取沉淀(菌體)0. 05g置1. 5ml EP中,加Iml TE緩沖液,使沉淀懸浮均勻后,于12000r/min,離心10 min,棄上清,再加入Iml TE緩沖液,使沉淀重懸, 13000r/m,離心IOmin ;重復上述步驟2次,收集沉淀;
②、沉淀物中加入200μ 1 TE緩沖液,使沉淀懸浮均勻后,加入300 μ 1溶菌酶溶液,混勻,于37°C保溫lh,再加入10 μ 1蛋白酶K溶液和200 μ 1 5% SDS,混勻,55°C保溫30min。 取去置于冰浴中冷卻anin,于12000r/m,離心lOmin,將上清液轉(zhuǎn)移至另一個滅菌的EP管中;
③、加入與上清液等體積的飽和酚,使之混勻,于12000rpm離心lOmin,將上清液轉(zhuǎn)移至另一潔凈的EP管中,再加入等體積的酚-氯仿,使之混勻,12000r/m離心5min,將上清液轉(zhuǎn)入另一潔凈的EP管中,加入等體積的氯仿,使之混勻,12000r/m離心lOmin,將上清液轉(zhuǎn)入另一潔凈的EP管中;
④、加入上清液0.1倍體積的5mol/L NaCl溶液和2倍體積預冷的無水乙醇,輕輕混勻,0°C下放置Ih;
⑤、于12000r/m離心lOmin,棄上清液,向沉淀中加入Iml70%乙醇,輕輕混勻洗滌沉淀,12000r/m,離心lOmin,棄上清;
重復該步驟⑤一次,棄上清并吸干;
⑥、沉淀于37°C放置5min,使殘留乙醇揮發(fā),沉淀用50μ 1 TE懸浮均勻,即得到植物乳桿菌基因組DNA提取物,樣品置-20°C保存待用;
(3)、目的基因的擴增
以實施例1中步驟(2)的⑥提取的植物乳桿菌基因組DNA為模板,采用PCR方法擴增目的基因片段,PCR反應條件為94°C預變性^iin ;94°C變性45s,61°C退火45s,72°C延伸45s,共30個循環(huán);72°C延伸lOmin,得PCR擴展的植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶的基因組 DNA ;
用1%瓊脂糖電泳檢測目的基因PCR產(chǎn)物;電泳檢測結果如圖1,在1600附近有一條明顯的DNA條帶,即為上述所得的植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶的基因組DNA。實施例2
含有實施例1所得的PCR擴展的植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶的基因組DNA的重組表達載體的構建,步驟如下
將實施例1所得的PCR擴展的植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶的基因組DNA與pET-32a( + ) 表達載體連接,室溫反應30 min,然后80°C保溫10 min,冷卻至4°C,得到連接產(chǎn)物,連接反應體系如下
權利要求
1.一種植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶的基因,其特征在于該基因的序列為SEQ ID Ν0:1ο
2.含有如權利要求1所述的一種植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶的基因的重組質(zhì)粒。
3.如權利要求2所述的重組質(zhì)粒為pET-32a( + ) - NiRL質(zhì)粒。
4.利用如權利要求2或3所述的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化而成的重組微生物。
5.如權利要求4所述的重組微生物,其特征在于所述的重組微生物為重組大腸桿菌或重組枯草桿菌。
6.如權利要求5所述的重組微生物,其特征在于所述的重組大腸桿菌優(yōu)選為含有重組質(zhì)粒為 pET-32a ( + ) - NiRL 的 E. coliBL21 (DE3)或 JM105。
7.利用如權利要求6所述的重組微生物生產(chǎn)的一種植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶,其特征在于該還原酶的氨基酸序列為SEQ ID N0:2。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶基因,含有該基因的重組載體、用該載體轉(zhuǎn)化的宿主以及利用該轉(zhuǎn)化體生產(chǎn)該基因的表達產(chǎn)物及其應用。即以金黃色葡萄球菌,銅綠假單胞菌、布魯氏桿菌;大腸桿菌的亞硝酸鹽還原酶基因為參考,進行引物設計,用植物乳桿菌提取的基因組DNA為模板,通過PCR技術擴增植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶的基因片段,將該片的連接到pET-32a(+)表達載體中,再轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)細胞中,經(jīng)IPTG誘導后,進行植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶(NiRL)蛋白表達,從而獲得植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶蛋白。
文檔編號C12N15/70GK102559715SQ20121003777
公開日2012年7月11日 申請日期2012年2月20日 優(yōu)先權日2012年2月20日
發(fā)明者何婷婷, 高然, 龔鋼明 申請人:上海應用技術學院