專利名稱：：質(zhì)粒dna(lipogenes的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及基因治療領(lǐng)域，特別涉及制備適合將多核苷酸傳遞給受治療者的肽-脂質(zhì)-多核苷酸復(fù)合體的方法。如此產(chǎn)生的肽-脂質(zhì)-多核苷酸復(fù)合體可有效抑制患者腫瘤疾病的進(jìn)展。
背景技術(shù)：
：貫穿該申請中，各種出版物、專利和公開的專利說明書以作者和日期或以專利識別號引入。就在權(quán)利要求之前提供了出版物的全部著書目錄的引文。這些出版物、專利和公開的專利說明書的公開內(nèi)容這里作為參考文獻(xiàn)引入本發(fā)明公開內(nèi)容中以更充分描述本發(fā)明所屬領(lǐng)域的狀態(tài)。基因治療是生物醫(yī)學(xué)研究最近形成的領(lǐng)域，該領(lǐng)域極其有望治療急性和慢性疾病并有潛力給分子醫(yī)學(xué)帶來革命性的時(shí)代。然而，盡管已做了大量臨床前和臨床研究，常規(guī)使用基因治療來治療人類疾病尚不成熟。仍存在對基因治療重要的未滿足的需求，這就是創(chuàng)建有效導(dǎo)向受治療者中感興趣的特定細(xì)胞，同時(shí)控制有害副作用的基因傳遞系統(tǒng)。基因治療旨在將治療上重要的基因?qū)牖颊叩捏w細(xì)胞。在臨床實(shí)驗(yàn)中對基因傳遞治療已經(jīng)顯示出順應(yīng)性的疾病包括，癌癥(黑素瘤，乳腺癌，淋巴瘤，頭部和頸部癌，卵巢癌，結(jié)腸癌，前列腺癌，腦癌，慢性髓細(xì)胞白血病，非小細(xì)胞肺癌，肺腺癌，結(jié)腸直腸癌，成神經(jīng)細(xì)胞瘤，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，星形細(xì)胞瘤和其它癌癥)，AIDS，囊性纖維化，腺苷脫氨酶缺乏，心血管疾病(再狹窄，家族性高膽固醇血癥，外周動脈疾病)，戈謝病，α1-抗胰蛋白酶缺乏，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和其它疾病。期望成為臨床試驗(yàn)對象的人類疾病包括血友病A和B，帕金森氏病，眼病，著色性干皮病，高血壓，肥胖。ADA缺乏是1990年KennethCulver進(jìn)行的第一次人類“基因傳遞”實(shí)驗(yàn)成功治療的疾病。參見Culver，K.W.(1996)inGeneTherapyAPrimerforPhysicians，SecondEd.，MaryAnnLiebert，Inc.Publ，NewYork，pp.1-198?；蛑委煹闹饕康氖切迯?fù)或取代突變的基因，調(diào)節(jié)基因表達(dá)和信號傳導(dǎo)，操縱免疫系統(tǒng)，或?qū)驉盒院推渌?xì)胞進(jìn)行破壞。參見Anderson，W.F.(1992)Science256808-813；Lasic，D.(1997)inLiposomesinGeneDelivery，CRCPress，pp.1-295；Boulikas，T.(1998)GeneTher.Mol.Biol.11-172；Martin，F(xiàn).和Boulikas，T.(1998)GeneTher.Mol.Biol.1173-214；Ross，G.等人(1996)人.GeneTher.71781-1790。人類癌癥是有效基因治療方法將為之提供特別有效臨床益處的特殊疾病情況。基因治療治療這種疾病的概念包括刺激免疫反應(yīng)以及操縱影響惡性表型的各種可替換細(xì)胞功能。盡管很多人類腫瘤無免疫原性或免疫原性弱，但是非體內(nèi)用細(xì)胞因子基因GM-CSF，IL-12，IL-2，IL-4，IL-7，IFN-γ和TNF-α轉(zhuǎn)導(dǎo)患者細(xì)胞，隨后給患者細(xì)胞接種疫苗(如真皮內(nèi))以加強(qiáng)T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤作用(癌癥免疫治療)可加強(qiáng)和指派免疫系統(tǒng)消滅癌細(xì)胞。用編碼腫瘤抗原基因進(jìn)行DNA疫苗接種和用合成腫瘤肽疫苗進(jìn)行免疫治療是目前正在測試的進(jìn)一步發(fā)展。在人類臨床實(shí)驗(yàn)中用于癌癥基因治療的基因包括大量腫瘤抑制基因(p53，RB，BRCA1，ElA)，反義癌基因(反義c-fos，c-myc，K-ras)，和自殺基因(HSV-tk，與9-[1，3-二羥-2-丙氧甲基]鳥嘌呤組合，胞嘧啶脫氨酶與5-氟胞嘧啶組合)。已經(jīng)建議用于癌癥基因治療的其它重要基因包括bcl-2，MDR-1，p21，p16，bax，bcl-xs，E2F，IGF-I，VEGF，制管張素，CFTR，LDL-R，TGF-β和leptin。妨礙這些基因治療成功實(shí)施的一個(gè)主要障礙是有效傳遞有效劑量多核苷酸到達(dá)腫瘤部位的困難。因此，轉(zhuǎn)染能力增強(qiáng)的基因傳遞系統(tǒng)將非常有利。已經(jīng)提出了大量不同的載體技術(shù)和基因傳遞方法并測試了體內(nèi)傳遞基因，包括病毒載體和各種核酸包封技術(shù)?？晒┻x擇的用于基因的病毒傳遞載體包括小鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒，重組腺病毒載體，腺伴隨病毒，HSV，EBV，HIV載體和桿狀病毒。非病毒基因傳遞方法使用陽離子或中性脂質(zhì)體，直接注射質(zhì)粒DNA和聚合物。已經(jīng)測試了增強(qiáng)基因傳遞效率的各種策略，如促融合肽與脂質(zhì)體或聚合物組合來增加質(zhì)粒DNA從核內(nèi)體釋放。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)每種基因傳遞技術(shù)都擁有不同的優(yōu)勢和弱點(diǎn)。重組逆轉(zhuǎn)錄病毒穩(wěn)定整合到染色體中，但需要宿主DNA合成來插入。腺病毒可感染不分裂細(xì)胞，但引起消除治療性轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的免疫反應(yīng)。腺伴隨病毒(AAV)是非致病性的且不引起免疫反應(yīng)，但是需要新的生產(chǎn)策略來得到用于臨床前和臨床研究的高AAV滴度。野生型AAVs整合到染色體19中，而重組AAVs喪失了位點(diǎn)特異性整合并且也可以持續(xù)作為游離體。單純皰疹病毒(HSV)載體可感染不復(fù)制細(xì)胞，如神經(jīng)元細(xì)胞，并且對外源DNA具有高負(fù)載能力，但引起細(xì)胞毒性作用?？磥砻糠N傳遞系統(tǒng)都將不依賴其它系統(tǒng)而發(fā)展且每種傳遞系統(tǒng)都將表明對于某些應(yīng)用的優(yōu)勢和弱點(diǎn)。目前，逆轉(zhuǎn)錄病毒最普遍用于人臨床試驗(yàn)，其后是腺病毒，陽離子脂質(zhì)和AAV。由于完善基因治療技術(shù)的挑戰(zhàn)已經(jīng)變得很明顯，已經(jīng)建議用各種另外的傳遞系統(tǒng)來繞開用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)觀察到的困難。例如，使用移植給患者組織的聚合物包封的同種或同種異體細(xì)胞的基于細(xì)胞的基因傳遞可用于分泌治療蛋白。此方法正在使用睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子基因?qū)∥s性側(cè)索硬化的試驗(yàn)中進(jìn)行檢測，并可以延及到因子VIII和IX對血友病，白介素基因、分泌多巴胺的細(xì)胞治療帕金森氏病，神經(jīng)營養(yǎng)因子對早老性癡呆和其它疾病的作用。發(fā)展中的其它技術(shù)包括，含Cre-LoxP重組酶系統(tǒng)的載體清除轉(zhuǎn)染細(xì)胞中不期望的病毒DNA序列，使用組織特異性啟動子在特定細(xì)胞類型中表達(dá)基因，或使用識別細(xì)胞表面分子的配體指導(dǎo)基因載體到達(dá)特定細(xì)胞類型中。已建議用于提高基因治療技術(shù)功效的另外方法包括設(shè)計(jì)爆炸腫瘤細(xì)胞的p53“基因炸彈”，開發(fā)HIV-1病毒改造基因傳遞載體，與聚合物或陽離子脂質(zhì)的病毒聯(lián)合改善基因傳遞，細(xì)胞核定位信號肽與寡核苷酸連接指導(dǎo)基因到達(dá)核中，分子轉(zhuǎn)換系統(tǒng)的發(fā)展允許基因隨意開啟或關(guān)閉。然而，由于廣泛的疾病情況需要基因治療，以及發(fā)展這種疾病的治療方法的復(fù)雜性，仍需要進(jìn)行基因治療的改進(jìn)技術(shù)。本發(fā)明提供了解決這些問題的方法和組合物。發(fā)明公開內(nèi)容公開了一種將DNA和負(fù)電荷藥物包封到其內(nèi)和外膜雙層具有不同脂質(zhì)成分的脂質(zhì)體中的方法。該脂質(zhì)體在靜脈內(nèi)注射給動物和人后能夠到達(dá)原發(fā)腫瘤及其轉(zhuǎn)移灶。該方法包括DNA與在10-90％乙醇中陽離子脂質(zhì)和肽分子摩爾比例接近中和比例的混合物之間形成微膠粒；陽離子肽指定細(xì)胞核定位并具有賦予膜融合而改善復(fù)合體通過細(xì)胞膜的入口的疏水部分。以其陽離子部分插入的這些肽指向凝聚的DNA，它們的疏水鏈與脂質(zhì)的疏水鏈一起埋在微膠粒膜單層中。DNA/脂質(zhì)/肽微膠粒轉(zhuǎn)變成脂質(zhì)體是通過與預(yù)先制備的脂質(zhì)體或脂質(zhì)混合，隨后用水溶液稀釋和透析以去除乙醇并允許脂質(zhì)體形成和通過膜擠出得到高產(chǎn)量的直徑低于160nm的包入和包封DNA。包封的DNA對消滅各種人實(shí)體腫瘤有高的治療功效，包括但不限于乳腺癌和前列腺癌。質(zhì)粒是用攜帶抗癌基因的DNA構(gòu)建的，包括但不限于p53，RB，BRCA1，E1A，bcl-2，MDR-1，p21，p16，bax，bcl-xs，E2F，IGF-IVEGF，制管張素，制瘤素，內(nèi)皮他丁，GM-CSF，IL-12，IL-2，IL-4，IL-7，IFN-γ，TNF-α，HSV-tk(與9-[1，3-二羥-2-丙氧甲基]鳥嘌呤組合)，大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶(與5-氟胞嘧啶組合)并與包封的順鉑或與類似的全身傳遞的抗腫瘤藥物組合抑制癌癥。附圖簡述圖1闡明了導(dǎo)向癌的脂質(zhì)體復(fù)合體的結(jié)構(gòu)。圖2闡明了質(zhì)粒DNA與各種活性劑以及陽離子脂質(zhì)的各種制劑凝聚，轉(zhuǎn)染K562人紅白血病細(xì)胞培養(yǎng)物后，對β-半乳糖苷酶報(bào)道基因表達(dá)水平的影響的結(jié)果。圖3闡明了SCID小鼠中的腫瘤尋靶。圖3A顯示了X-Gal染色前和后具有大和小的人乳房腫瘤的SCID小鼠，檢測傳遞基因的表達(dá)。兩個(gè)腫瘤都變?yōu)樯钏{(lán)色。藍(lán)色的強(qiáng)度與β半乳糖苷酶基因的表達(dá)成比例。圖3B顯示了在初次染色的小腫瘤中，注射區(qū)的皮膚和腸道是首先變藍(lán)的器官。圖3C是動物背部的視圖。在去除皮膚(頂部)后，兩個(gè)腫瘤清晰可見。小腫瘤染成深色和大腫瘤染成淺藍(lán)色在染色初期很明顯(底部)。圖3D是動物前面的視圖。去除皮膚后，兩個(gè)腫瘤清晰可見。在底部的圖中，兩個(gè)腫瘤染成深色在染色后期很明顯。圖3E顯示了染色后期兩個(gè)腫瘤染成深色的正面(頂部)和背面(底部)高放大視圖。也可見到小腫瘤周圍的血管系統(tǒng)染色(底部)。表格簡述表1是能夠形成微膠粒的分子列表。表2列出了幾種促融合肽并描述了它們的性能，連同參考文獻(xiàn)。表3列出了簡單的細(xì)胞核定位信號(NLS)肽。表4顯示了“二分”或“分開”NLS肽。表5列出了缺乏精氨酸/賴氨酸簇的“非正NLS”肽。表6列出了具有核仁定位信號(NoLS)的肽。表7列出了在無膜蛋白激酶上具有親核簇的肽。表8列出了DNA修復(fù)蛋白上的細(xì)胞核定位信號肽。表9列出了轉(zhuǎn)錄因子中的NLS肽。表10列出了其它核蛋白中的NLS肽。發(fā)明實(shí)施方式定義除非另外指出，本發(fā)明的實(shí)施將利用常規(guī)的免疫學(xué)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和重組DNA技術(shù)。這些方法在下列出版物中描述。如參見Sambrook，等人MOLECULARCLONINGALABORATORYMANUAL，2ndEdition(1989)；CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY，F(xiàn).M.Ausubel，等人eds.，(1987)；theseriesMETHODSINENZYMOLOGY(AcademicPress，Inc.)；PCRAPRACTICALAPPROACH，M.MacPherson，等人，IRLPressatOxfordUniversityPress(1991)；PCR2APRACTICALAPPROACH，MacPherson等人，eds.(1995)；ANTIBODIES，ALABORATORYMANUAL，Harlow和Lane，eds.(1988)；和ANIMALCELLCULTURE，R.I.Freshney，ed.(1987)。如說明書和權(quán)利要求中使用的，單數(shù)形式“一個(gè)”和“該”包括復(fù)數(shù)引用，除非上下文清楚地另外指出。例如，術(shù)語“一個(gè)細(xì)胞”包括大量細(xì)胞，包括其混合物。術(shù)語“包括”意在指包括引用的元件的組合物和方法，但不排除其它。“主要由……組成”當(dāng)用于限定組合物和方法時(shí)，應(yīng)該是指排除對組合有任何主要重要性的其它元件。因此，這里定義的主要由元件組成的組合物將不排除來自分離和純化方法的微量污染物和藥物可接受載體，如磷酸鹽緩沖鹽水、防腐劑等等?！坝伞M成”應(yīng)該是指排除更多其它成分的微量元件和給予本發(fā)明組合物的基本方法步驟。這些轉(zhuǎn)換術(shù)語中每一個(gè)限定的實(shí)施方案都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。術(shù)語“多核苷酸”和“核酸分子”可互換使用，指的是聚合形式的任何長度的核苷酸。多核苷酸可以含有脫氧核糖核酸、核糖核酸和/或其類似物。核苷酸可以具有任何三維結(jié)構(gòu)，并可以執(zhí)行任何功能，已知的或未知的。術(shù)語“多核苷酸”包括，例如，單、雙鏈和三螺旋分子，基因或基因片段，外顯子，內(nèi)含子，mRNA，tRNA，rRNA，核酶，cDNA，重組多核苷酸，支鏈多核苷酸，質(zhì)粒，載體，任何序列的分離DNA，任何序列的分離RNA，核酸探針和引物。核酸分子也可以包括修飾的核酸分子?！盎颉笔侵负兄辽僖粋€(gè)可讀框的，轉(zhuǎn)錄和翻譯后能夠編碼特定多肽或蛋白的多核苷酸?！盎虍a(chǎn)物”是指當(dāng)基因轉(zhuǎn)錄和翻譯時(shí)產(chǎn)生的氨基酸(如肽或多肽)。這里使用下列縮寫DDAB二甲基雙十八烷基溴化銨(同N，N-二硬脂基-N，N-二甲基溴化銨)；DODACN，N-二油基-N，N-二甲基氯化銨；DODAP1，2-二油酰基-3-二甲基銨丙烷；DMRIEN-[1-(2，3-二肉豆蔻氧基)丙基]-N，N-二甲基-N-(2-羥乙基)溴化銨；DMTAP1，2-二肉豆蔻酰-3-三甲基銨丙烷；DOGS雙十八烷基氨基甘氨酰精胺；DOTAP(同DOTMA)N-(1-(2，3-二油酰氧基)丙基)-N，N，N-三甲基氯化銨；DOSPAN-(1-(2，3-二油基氧基)丙基)-N-(2-(精胺甲酰氨基)乙基)-N，N-二甲基三氟醋酸銨；DPTAP1，2-二棕櫚酰-3-三甲基銨丙烷；DSTAP1，2-二硬脂?；?3-三甲基銨丙烷；DOPE，1，2-sn-二油酰磷脂酰乙醇胺；DC-Chol，3β-(N-(N’，N’-二甲基氨基乙烷)甲氨酰)膽固醇。參見Gao等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.179280-285(1991)。這里使用的術(shù)語“藥物可接受陰離子”是指在藥物制劑中提供無毒鹽的有機(jī)和無機(jī)酸的陰離子。這種陰離子的實(shí)例包括鹵化物陰離子、氯化物、溴化物和碘化物的陰離子，無機(jī)陰離子如硫酸根、磷酸根和硝酸根，和有機(jī)陰離子。有機(jī)陰離子可以來自簡單的有機(jī)酸，如乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、蘋果酸、丙二酸、琥珀酸、馬來酸、延胡索酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、肉桂酸、杏仁酸、甲烷磺酸、乙烷磺酸、對-甲苯磺酸等等。藥物可接受鹽的制備在Berge，等人，J.Pharm.Sci.661-19(1977)中描述，這里引入作為參考。生理可接受載體、賦形劑或穩(wěn)定劑是在使用的劑量和濃度下對接受者無毒的，包括緩沖液如磷酸、檸檬酸和其它有機(jī)酸；抗氧化劑包括抗壞血酸；低分子量(小于大約10個(gè)殘基)多肽；蛋白，如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其它糖類包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑如EDTA；糖醇如甘露醇或山梨醇；成鹽反離子如鈉；和/或非離子表面活性劑如Tween，P1uronics或聚乙二醇(PEG)。PEG分子也包含具有與PEG分子末端共價(jià)連接的附加細(xì)胞核定位信號(NLS)的促融合肽。術(shù)語“陽離子脂質(zhì)”是指在生理pH下帶凈正電荷的大量脂質(zhì)種類中的任何一種。這種脂質(zhì)包括但不限于DDAB，DMRIE，DODAC，DOGS，DOTAP，DOSPA和DC-Chol。另外，可得到大量商業(yè)上的陽離子脂質(zhì)制劑，可用于本發(fā)明中。這些包括，例如LIPOFECTIN(包含DOTMA和DOPE的商業(yè)上可得到的陽離子脂質(zhì)，來自GIBCO/BRL，GrandIsland，N.Y.，USA)；LIPOFECTAMINE(包含DOSPA和DOPE的商業(yè)上可得到的陽離子脂質(zhì)體，來自GIBCO/BRL)；和TRANSFECTAM(在乙醇中包含DOGS的商業(yè)上可得到的陽離子脂質(zhì)，來自PromegaCorp.，Madison，Wis.，USA)。本發(fā)明進(jìn)一步提供了多種制備包入治療藥物的微膠粒的方法。該方法可特別有效地生產(chǎn)具有總的凈負(fù)電荷的藥物或成分如DNA、RNA或負(fù)電荷小分子的微膠粒。例如，DNA可包含在質(zhì)粒載體中并編碼治療蛋白，如野生型p53，HSV-tk，p21，Bax，Bad，IL-2，IL-12，GM-CSF，制管張素，內(nèi)皮他丁和制瘤素。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法需要將有效量治療劑與有效量陽離子脂質(zhì)組合?？捎糜诒景l(fā)明方法中的陽離子脂質(zhì)包括但不限于，DDAB二甲基雙十八烷基溴化銨；DMRIEN-[1-(2，3-二肉豆蔻氧基)丙基]-N，N二甲基-N-(2-羥乙基)溴化銨；DMTAP1，2-二肉豆蔻酰-3-三甲基銨丙烷；DOGS雙十八烷基氨基甘氨酰精胺；DOTAP(同DOTMA)N-(1-(2，3-二油酰氧基)丙基)-N，N，N-三甲基氯化銨；DPTAP1，2-二棕櫚酰-3-三甲基銨丙烷；DSTAP1，2-二硬脂酰基-3-三甲基銨丙烷。一方面，負(fù)電荷治療劑內(nèi)包含的大約30至90％比例的磷酸鹽在有效濃度乙醇被脂質(zhì)分子(負(fù)電荷過剩)上的正電荷中和形成靜電微膠粒復(fù)合體中。一方面，乙醇溶液是約20％至約80％的乙醇。在另一個(gè)方面，乙醇濃度是大約30％。然后，乙醇/陽離子脂質(zhì)/治療劑復(fù)合體與有效量促融合-親核肽綴合物組合。一方面，有效量的綴合物是大約0.0至大約0.3的比例范圍(肽上的正電荷比磷酸基上的負(fù)電荷)以中和治療劑的磷酸基上殘余的大部分負(fù)電荷，由此導(dǎo)致復(fù)合體幾乎完全中和。最佳條件使復(fù)合體略帶負(fù)電荷。然而，當(dāng)陽離子脂質(zhì)上的正電荷超過DNA上的負(fù)電荷時(shí)，過量的正電荷被DPPG(二棕櫚酰磷脂酰甘油)及其衍生物，或被最終微膠粒復(fù)合體中的其它陽離子脂質(zhì)分子中和。在可供選擇的實(shí)施方案中，可以通過添加選自精胺、亞精胺和中和一定百分比(1-20％)磷酸基的鎂或其它二價(jià)金屬離子的DNA凝聚劑來改進(jìn)上面的方法。在另外的實(shí)施方案中，陽離子脂質(zhì)與有效量促融合脂質(zhì)DOPE以各種摩爾比例組合，例如，以大約1∶1陽離子脂質(zhì)∶DOPE的摩爾比例。在可供選擇的實(shí)施方案中，陽離子脂質(zhì)與有效量促融合/NLS肽綴合物組合。促融合/NLS肽綴合物的實(shí)例包括但不限于(KAWLKAF)3(SEQIDNO1)，GLFKAAAKLLKSLWKLLLKA(SEQIDNO2)，LLLKAFAKLLKSLWKLLLKA(SEQIDNO3)，以及原型(疏水3-親核1-疏水2-親核1)2-3的所有衍生物，其中疏水是A，I，L，V，P，G，W，F(xiàn)中任何一個(gè)和親核是K，R或H中任何一個(gè)，每第3個(gè)或第4個(gè)氨基酸含正電荷殘基，形成α螺旋并使凈正電荷指向螺旋的相同方向。另外的實(shí)例包括但不限于來自流感病毒血細(xì)胞凝聚素HA-2的GLFKAIAGFIKNGWKGMIDGGGYC(SEQIDNO4)；來自HIV的TAT的YGRKKRRQRRR(SEQIDNO5)；MSGTFGGILAGLIGLL(K/R/H)1-6(SEQIDNO6)，來自鴨乙型肝炎病毒S蛋白的N末端區(qū)，但添加了一至六個(gè)正電荷賴氨酸、精氨酸或組氨酸殘基，以及這些的組合，能夠直接與質(zhì)粒或寡核苷酸DNA的磷酸基相互作用，抵消由陽離子脂質(zhì)提供的部分正電荷。GAAIGLAWIPYFGPAA(SEQIDNO7)來自埃博拉病毒跨膜蛋白的促融合肽；載脂蛋白(apo)AII肽的殘基53-70(C-末端螺旋)；HIV-1跨膜糖蛋白gp41的23個(gè)殘基促融合N末端肽；來自Alzheimer’sβ-淀粉樣肽的29-42個(gè)殘基的片段；仙臺病毒的融合肽和N末端七元重復(fù)序列；卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶的56-68個(gè)螺旋片段。包括在這些實(shí)施方案中的是這些肽的較短型，已知可誘導(dǎo)單層脂質(zhì)囊泡或類似衍生的一切融合衍生中添加了一至六個(gè)正電荷賴氨酸、精氨酸或組氨酸殘基(K/R/H)1-6，能夠直接與質(zhì)粒或寡核苷酸DNA的磷酸基相互作用，抵消由陽離子脂質(zhì)提供的部分正電荷。促融合/NLS綴合物中的促融合肽代表這些肽序列的疏水氨基酸序列段和較小片段，它們包括在插入到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的膜或分泌蛋白中使用的所有信號肽序列。另外，該綴合物代表這些肽序列的跨膜結(jié)構(gòu)域和較小片段。在本發(fā)明的一個(gè)方面中，促融合/NLS肽綴合物中的NLS肽成分衍生于促融合疏水肽。然而，對于含側(cè)接脯氨酸(P)或甘氨酸(G)的至少四個(gè)正電荷氨基酸的蛋白中的五個(gè)或更多親核氨基酸序列段來說，有源自大量已知NLS肽以及由細(xì)胞核蛋白數(shù)據(jù)庫檢索得到的，添加了5-6個(gè)氨基酸的親核細(xì)胞核定位信號(NLS)。NLS肽的實(shí)例在表1-8中顯示。促融合/NLS肽綴合物中的NLS肽成分是含有上述NLS，但在肽的中心部分被附加的K，R，H殘基進(jìn)一步修飾或在N或C末端用P或G修飾的合成肽。在另外的方面中，促融合/NLS肽綴合物源自所述促融合疏水肽，但在NLS的位置添加了H4-6(四至六個(gè)組氨酸殘基)片段。在組氨酰殘基是正電荷的pH5-6微膠粒形成，但在生物學(xué)液體的接近中性的pH時(shí)失去它們的電荷，因此從它們的靜電相互作用中釋放質(zhì)粒或寡核苷酸DNA。促融合肽/NLS肽綴合物通過提供內(nèi)源性蛋白酶切割位點(diǎn)的短氨基酸序列段彼此連接。在本發(fā)明的優(yōu)選方面中，用于本發(fā)明的優(yōu)選原型促融合/NLS肽綴合物的結(jié)構(gòu)是PKKRRGPSP(L/A/I)12-20(SEQIDNO8)，其中(L/A/I)12-20是12-20個(gè)含A，L，I，Y，W，F(xiàn)的疏水氨基酸和其它疏水氨基酸的序列段。通過轉(zhuǎn)變?yōu)橹|(zhì)體，本發(fā)明進(jìn)一步提供了用上述方法制備的微膠粒。有效量的脂質(zhì)體(直徑從大約80至大約160nm)，或有效量的由膽固醇(從大約10％至大約50％)，中性磷脂如氫化大豆卵磷脂(HSPC)(從大約40％至大約90％)，和大約1至大約7摩爾百分比的衍生形成囊泡的脂質(zhì)PEG-DSPE(二硬脂酰磷脂酰乙醇胺)組成的脂質(zhì)溶液添加到微膠粒溶液中。在具體的實(shí)施方案中，脂質(zhì)體由形成囊泡的脂質(zhì)和聚乙二醇衍生的大約1至大約7摩爾百分比的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)組成。權(quán)利要求20的成分，其中聚乙二醇具有大約1,000至5,000道爾頓之間的分子量。微膠粒轉(zhuǎn)變?yōu)橹|(zhì)體同時(shí)乙醇濃度伴隨降低，這可以通過脂質(zhì)體復(fù)合體經(jīng)過可透過膜來透析或通過擠出通過膜降至80-160nm直徑而去除乙醇來完成。本發(fā)明進(jìn)一步提供了用上述方法制備的包封治療劑的脂質(zhì)體。這里也提供了將治療劑如質(zhì)粒DNA或寡核苷酸通過靜脈內(nèi)或其它類型注射微膠?；蛑|(zhì)體傳遞給體內(nèi)組織細(xì)胞的方法。這個(gè)方法通過微膠?；蛑|(zhì)體復(fù)合體長時(shí)間循環(huán)特異性導(dǎo)向原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移灶，這是由于其表面PEG鏈的暴露，其小的尺寸(80-160nm)和實(shí)體腫瘤從中心到其外周的流體靜水壓降低支持腫瘤血管系統(tǒng)優(yōu)先滲出到腫瘤細(xì)胞外間隙。這里描述的使用微膠?；蛑|(zhì)體復(fù)合體傳遞質(zhì)粒或寡核苷酸DNA穿過腫瘤的細(xì)胞膜屏障的方法是可行的，因?yàn)閺?fù)合體中存在促融合肽。尤其是，提供了靜脈內(nèi)注射復(fù)合體后，將質(zhì)?；蚬押塑账酓NA傳遞給肝、脾和骨髓的方法。進(jìn)一步提供的是將治療基因傳遞到癌癥和非癌癥患者的肝、脾和骨髓中而產(chǎn)生分泌形式的治療蛋白的方法，所述治療基因包括但不限于用于治療血友病的因子VIII或IX，多藥物耐藥性，用于癌癥免疫治療的細(xì)胞因子基因，緩解疼痛的基因，緩解糖尿病的基因和可導(dǎo)入肝、脾和骨髓組織中的基因。公開的療法也提供了降低腫瘤大小的方法，該方法通過將攜帶一個(gè)或多個(gè)選自p53，RB，BRCA1，E1A，bcl-2，MDR-1，p21，p16，bax，bcl-xs，E2F，IGF-IVEGF，制管張素，制瘤素，內(nèi)皮他丁，GM-CSF，IL-12，IL-2，IL-4，IL-7，IFN-γ，TNF-α，HSV-tk(與9-[1，3-二羥-2-丙氧甲基]鳥嘌呤組合)，大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶(與5-氟胞嘧啶組合)的抗癌基因的包封的質(zhì)粒DNA與針對控制細(xì)胞周期或信號途徑的基因的包封的反義寡核苷酸(反義c-fos，c-myc，K-ras)、核酶或形成三聯(lián)體的寡核苷酸組合。可以通過將攜帶一個(gè)或多個(gè)抗癌基因的包封的質(zhì)粒DNA與包封的或游離的抗腫瘤藥物組合來改進(jìn)這些方法，所述抗腫瘤藥物由下列一組組成阿霉素，制管張素，硫唑嘌呤，博萊霉素，busulfane，喜樹堿，卡鉑，卡莫司汀，chlorambucile，chlormethamine，chloroquinoxaline磺胺，cisplatin，環(huán)磷酰胺，cycloplatam，阿糖胞苷，達(dá)卡巴嗪，更生霉素，柔紅霉素，didox，阿霉素，內(nèi)皮他丁，enloplatin，雌莫司汀，依托泊苷，extramustinephosphat，氟胞嘧啶，氟脫氧尿苷，氟尿嘧啶，硝酸鎵，羥基脲，碘苷，干擾素，白介素，leuprolide，lobaplatin，羅氮芥，甘露莫司汀，氮芥，mechlorethaminoxide，苯丙氨酸氮芥，巰基嘌呤，氨甲喋呤，普卡霉素，mitobronitole，絲裂霉素，霉酚酸，nocodazole，制瘤素，oxaliplatin，紫杉醇，溴新斯的明，鉑-三胺復(fù)合體，普卡霉素，強(qiáng)的松龍，強(qiáng)的松，丙卡巴肼，蛋白激酶C抑制劑，puromycine，司莫司汀，信號傳導(dǎo)抑制劑，螺鉑，streptozotocine，stromelysin抑制劑，紫杉酚，呋氟尿嘧啶，端粒酶抑制劑，替尼泊苷，沙利度胺，硫咪嘌呤，thioguanine，噻替派，tiamiprine，三胺嗪，三亞胺苯醌，trifosfamide，酪氨酸激酶抑制劑，嘧啶苯芥，阿糖腺苷，長春堿，vincaalcaloids，長春新堿，長春地辛，vorozole，折尼拉汀，zeniplatin和凈司他丁。下列實(shí)施例旨在闡明，而非限制本發(fā)明。脂質(zhì)體的組成脂質(zhì)體是由同心的脂質(zhì)雙層組成的用顯微鏡可見的囊泡。在結(jié)構(gòu)上，脂質(zhì)體大小和形狀范圍從長管到球形，直徑從幾百埃至幾分之一毫米。選擇形成囊泡的脂質(zhì)以達(dá)到提供外層的脂質(zhì)成分的最終復(fù)合體的特殊程度的流動性和剛性。這些脂質(zhì)是中性(膽固醇)或雙極性的且包括磷脂，如卵磷脂(PC)，磷脂酰乙醇胺(PE)，磷脂酰肌醇(PI)和鞘磷脂(SM)和其它類型的雙極性脂質(zhì)，包括但不限于1，2-sn-二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)，碳?xì)滏滈L度范圍是14-22，并且是飽和的，或具有一個(gè)或多個(gè)C＝C雙鍵。能夠單獨(dú)，或與其它脂質(zhì)成分組合產(chǎn)生穩(wěn)定脂質(zhì)體的脂質(zhì)的實(shí)例是磷脂，如氫化大豆卵磷脂(HSPC)，卵磷脂，磷脂酰乙醇胺，溶血卵磷脂，溶血磷脂酰乙醇胺，磷脂酰絲氨酸，磷脂酰肌醇，鞘磷脂，腦磷脂，心磷脂，磷脂酸，腦苷脂，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)，二油酰卵磷脂(DOPC)，二棕櫚酰卵磷脂(DPPC)，二棕櫚酰油酰卵磷脂(PoPC)，二棕櫚酰油酰磷脂酰乙醇胺(POPE)和二油酰磷脂酰乙醇胺4-(N-馬來酰亞氨基-甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯(DOPE-mal)?？蓳饺胫|(zhì)體的另外的非含磷脂質(zhì)包括硬脂胺，十二胺，十六胺，肉豆蔻酸異丙基酯，三乙醇胺-月桂硫酸酯，烷基-芳基硫酸酯，棕櫚酸乙酰酯，蓖麻油酸甘油酯，硬脂酸十六烷基酯，兩性丙烯酸聚合物，聚乙氧基化脂肪酸酰胺和上面提及的陽離子脂質(zhì)(DDAB，DODAC，DMRIE，DMTAP，DOGS，DOTAP(DOTMA)，DOSPA，DPTAP，DSTAP，DC-Chol)。負(fù)電荷脂質(zhì)包括能夠形成囊泡的磷脂酸(PA)，二棕櫚酰磷脂酰甘油(DPPG)，二油酰磷脂酰甘油(DOPG)和雙十六烷基硫酸酯。用于本發(fā)明的優(yōu)選脂質(zhì)是膽固醇，氫化大豆卵磷脂(HSPC)和衍生的形成囊泡的脂質(zhì)PEG-DSPE。典型地，基于脂質(zhì)體總的大小和層狀結(jié)構(gòu)的性質(zhì)，脂質(zhì)體可分為三類。這三類，如紐約學(xué)院科學(xué)會議″LiposomesandTheirUseinBiologyandMedicine，″1977年12月提出的，是多層囊泡(MLVs)，小單層囊泡(SUVs)和大單層囊泡(LUVs)。SUVs直徑范圍從大約20至50nm，由環(huán)繞含水隔室的單一脂質(zhì)雙層組成。單層囊泡也可以制備成直徑從大約50nm至600nm的大小。盡管單層是相當(dāng)均一大小的單一隔室囊泡，但MLVs的大小可在不超過10,000mn或左右的范圍內(nèi)發(fā)生很大變化，其結(jié)構(gòu)是多隔室且含有一個(gè)以上的單一雙層。LUV脂質(zhì)體如此得名是因?yàn)槠浞秶鷱拇蠹s600nm至30,000nm的大直徑；它們也含有一個(gè)以上的單一雙層。可以用很多方法制備脂質(zhì)體，但不是所有的都能產(chǎn)生三種不同類型的脂質(zhì)體。例如，依靠將金屬探針直接浸入MLVs懸液的超聲分散是制備SUVs的普通方法。制備MLV類的脂質(zhì)體通常包括將脂質(zhì)溶于適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑中，然后在氣體或空氣流下去除溶劑。這在容器表面留下了干燥脂質(zhì)薄膜。然后為了使脂質(zhì)材料脫離容器側(cè)邊，將水溶液振蕩引入容器中。這個(gè)過程可分散脂質(zhì)，使其形成脂質(zhì)聚集體或脂質(zhì)體。LUV類脂質(zhì)體可以通過脂質(zhì)薄層用蒸餾水或某種水溶液緩慢水合而制備。另外，可以通過凍干制備脂質(zhì)體。這個(gè)過程包括在氮?dú)饬飨聦⒅|(zhì)溶液干燥成膜。然后將此膜溶于揮發(fā)性溶劑中，冰凍，并置于凍干裝置上以去除溶劑。為了制備含藥物的藥物制劑，將藥物溶液添加到凍干的脂質(zhì)中，于是形成脂質(zhì)體。制備陽離子脂質(zhì)體/陽離子肽/核酸微膠粒陽離子脂質(zhì)體，除了鞘氨醇和原始生活型的一些脂質(zhì)外，不會自然產(chǎn)生。本發(fā)明使用單鏈兩親物，它們是包括但不限于C12和C16鏈的烷基三甲基銨表面活性劑的氯化和溴化鹽，縮寫為DDAB(同DODAB)或CTAB。這些分子的分子幾何學(xué)決定臨界微膠粒濃度(溶液中的游離單體與微膠粒中的分子之比)。兩種狀態(tài)之間的脂質(zhì)交換是高度動態(tài)過程；磷脂臨界微膠粒濃度值低于10-8M且在脂質(zhì)體中更穩(wěn)定；然而，單鏈洗滌劑，如硬脂胺，稀釋或在毫秒內(nèi)靜脈內(nèi)注射時(shí)可從脂質(zhì)體膜中浮出(Lasic，1997)。陽離子脂質(zhì)包括但不限于，DDAB二甲基雙十八烷基溴化銨(同N，N-二硬脂基-N，N-二甲基溴化銨)；DODACN，N-二油基-N，N-二甲基氯化銨；DODAP1，2-二油?；?3-二甲基銨丙烷；DMRIEN-[1-(2，3-二肉豆蔻氧基)丙基]-N，N-二甲基-N-(2-羥乙基)溴化銨；DMTAP1，2-二肉豆蔻酰-3-三甲基銨丙烷；DOGS雙十八烷基氨基甘氨酰精胺；DOTAP(同DOTMA)N-(1-(2，3-二油酰氧基)丙基)-N，N，N-三甲基氯化銨；DOSPAN-(1-(2，3-二油基氧基)丙基)-N-(2-(精胺甲酰氨基)乙基)-N，N-二甲基三氟醋酸銨；DPTAP1，2-二棕櫚酰-3-三甲基銨丙烷；DSTAP1，2-二硬脂?；?3-三甲基銨丙烷；DOPE，1，2-sn-二油酰磷脂酰乙醇胺；DC-Chol，3β-(N-(N’，N’-二甲基氨基乙烷)甲氨酰)膽固醇。已經(jīng)用兩種方法之一制備了基因傳遞中使用的基于脂質(zhì)的載體。在一個(gè)方法中，將核酸導(dǎo)入由陽離子脂質(zhì)和中性脂質(zhì)的混合物制成的預(yù)先形成的脂質(zhì)體中。由此形成的復(fù)合體具有不明確和復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，血清存在時(shí)轉(zhuǎn)染效率大大降低。預(yù)先形成的脂質(zhì)體是商業(yè)可獲得的LIPOFECTIN和LIPOFECTAMINE。第二個(gè)方法包括在中性脂質(zhì)不存在下DNA與單或聚陽離子脂質(zhì)形成復(fù)合體。這些復(fù)合體在乙醇存在下制備且在水中不穩(wěn)定。另外，血清消極影響這些復(fù)合體(參見Behr，Acc.Chem.Res.26274-78(1993))。商業(yè)可獲得聚陽離子脂質(zhì)的實(shí)例是TRANSFECTAM。將DNA包封入基于脂質(zhì)的制劑的其它努力沒有克服這些問題(參見Szoka等人，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9467(1980)；和Deamer的美國專利4，515，736)。核苷酸聚合物可以是單鏈DNA或RNA，或雙鏈DNA或DNA-RNA雜種。雙鏈DNA的實(shí)例包括結(jié)構(gòu)基因，基因包括調(diào)控和終止區(qū)，和自身復(fù)制系統(tǒng)如質(zhì)粒DNA。特別優(yōu)選的核酸是質(zhì)粒。單鏈核酸包括反義寡核苷酸(與DNA或RNA互補(bǔ))，核酶和形成三聯(lián)體的寡核苷酸。為了增加穩(wěn)定性，將優(yōu)選用穩(wěn)定的非磷酸二酯鍵，包括，例如硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，硫酸硒酸酯，甲基膦酸酯或O-烷基磷酸三酯鍵取代一些或全部核苷酸鍵的一些單鏈核酸。陽離子脂質(zhì)體/陽離子肽/核酸微膠粒包封至中性脂質(zhì)體中與促融合肽/NLS綴合物共同使用的提供顆粒內(nèi)層的陽離子脂質(zhì)可以是選自DDAB，DODAC，DMRIE，DMTAP，DOGS，DOTAP(DOTMA)，DOSPA，DPTAP，DSTAP，DC-Chol的大量物質(zhì)中的任何一種。陽離子脂質(zhì)與DOPE組合。在一組實(shí)施方案中，優(yōu)選的陽離子脂質(zhì)是DDABDOPE1∶1。這里使用的提供顆粒外層的中性脂質(zhì)可以是在生理pH下以不帶電荷或中性兩性離子形式存在的大量脂質(zhì)種類中的任何一種。這種脂質(zhì)選自二?；字Ｄ憠A，二?；字Ｒ掖及?，神經(jīng)酰胺，鞘磷脂，腦磷脂和腦苷酯。在一組實(shí)施方案中，優(yōu)選含有碳鏈長度在C14至C22的飽和，單或雙不飽和脂肪酸的脂質(zhì)。通常，弱飽和脂質(zhì)更容易調(diào)整大小，特別是當(dāng)為了過濾滅菌，脂質(zhì)體大小必須低于大約0.16微米時(shí)。考慮到脂質(zhì)體大小，最終制劑中脂質(zhì)體的剛性和穩(wěn)定性，其不泄露包封的DNA的保存期和在血流中的穩(wěn)定性，通常引導(dǎo)選擇中性脂質(zhì)提供本發(fā)明基因載體的外包被層。含鏈長度和飽和程度變化的各種酰基鏈的脂質(zhì)可以得到或可以用熟知技術(shù)分離或合成。在另一組實(shí)施方案中，使用碳鏈長度在C14至C22的范圍內(nèi)的脂質(zhì)。優(yōu)選，用于本發(fā)明的中性脂質(zhì)是氫化大豆卵磷脂(HSPC)，膽固醇和PEG-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)或PEG神經(jīng)酰胺。制備脂質(zhì)體的方法在幾項(xiàng)頒發(fā)的專利，例如美國專利4,229,360；4,224,179；4,241,046；4,737,323；4,078,052；4,235,871；4,501,728和4,837,028，以及在文章Szoka等人，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9467(1980)和Hope等人，Chem.Phys.Lip.4089(1986)中已經(jīng)描述了制備各種脂質(zhì)體形式的各種方法。這些方法不能制備所有三種不同類型的脂質(zhì)體(MLVs，SUVs，LUVs)。例如，依靠將金屬探針直接浸入MLVs懸液的超聲分散是制備SUVs的普通方法。制備MLV類的脂質(zhì)體通常包括將脂質(zhì)體溶于適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑中，然后在氣體或空氣流下去除溶劑。這在容器表面留下了干燥脂質(zhì)薄膜。然后為了使脂質(zhì)材料脫離容器側(cè)邊，將水溶液振蕩引入容器中。這個(gè)過程可分散脂質(zhì)，使其形成脂質(zhì)聚集體或脂質(zhì)體。LUV類脂質(zhì)體可以通過脂質(zhì)薄層用蒸餾水或某種水溶液緩慢水合而制備。另外，可以通過凍干制備脂質(zhì)體。這個(gè)過程包括在氮?dú)饬飨聦⒅|(zhì)溶液干燥成膜。然后將此膜溶于揮發(fā)性溶劑中，冰凍，并置于凍干裝置上以去除溶劑。為了制備含藥物的藥物制劑，將藥物溶液添加到凍干的脂質(zhì)中，于是形成脂質(zhì)體。脂質(zhì)體制備后，可以調(diào)整脂質(zhì)體大小以獲得期望的大小范圍和脂質(zhì)體大小相對窄的分布。優(yōu)選，預(yù)先形成的脂質(zhì)體大小達(dá)大約80至160mn的平均直徑(體內(nèi)給予前，過濾滅菌的大小上限)?？衫脦追N技術(shù)將脂質(zhì)體調(diào)整到期望的大小。浴或探針超聲處理脂質(zhì)體懸液使得大小進(jìn)行性下降至大小低于大約0.05微米(50mn)的小單層囊泡。脂質(zhì)體通過小孔聚碳酸酯擠出是我們將脂質(zhì)體大小降至相對完全確定的大小分布的優(yōu)選方法。該脂質(zhì)體可以成功通過小孔膜擠出，以完成脂質(zhì)體大小漸降。用于以脂質(zhì)包被DNA的一種方法是通過洗滌劑從陽離子脂質(zhì)/DNA/洗滌劑復(fù)合體中受控耗盡。此方法可得到在血漿中具有穩(wěn)定性的復(fù)合體。Hofland等人(1996)通過透析DOSPA/DOPE/DNA/辛基糖苷的混合物，已經(jīng)制備了這種復(fù)合體。本發(fā)明的包含陽離子脂質(zhì)體/核酸復(fù)合體的藥物組合物是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備的并進(jìn)一步包含藥物可接受載體。通常，將使用普通鹽水作為藥物可接受載體。對于體內(nèi)給藥，優(yōu)選腸胃外給予藥物組合物，即，靜脈內(nèi)，腹膜內(nèi)，皮下，鞘內(nèi)，注射到脊髓，肌肉內(nèi)，關(guān)節(jié)內(nèi)，門靜脈注射或腫瘤內(nèi)。更優(yōu)選，靜脈內(nèi)或腫瘤內(nèi)快速濃注給予藥物組合物。在其它方法中，可以通過將制劑直接施用于組織而使藥物制劑與靶組織接觸。該施用可以通過局部“開放”或“封閉”步驟進(jìn)行。術(shù)語“局部”是指將藥物制劑直接施用于暴露在環(huán)境中的組織，如皮膚，施用于身體的任何表面，鼻咽，外耳道，眼內(nèi)給藥和給予任何體腔的表面，吸入肺中，生殖器粘膜等等?！伴_放”步驟是包括切割患者皮膚并直接顯現(xiàn)藥物制劑所施用的其下組織的那些步驟。這通常通過手術(shù)步驟完成，如胸廓切開術(shù)到達(dá)肺，剖腹術(shù)到達(dá)腹部內(nèi)臟，或其它直接手術(shù)方法到達(dá)靶組織?！胺忾]”步驟是非侵入性步驟，內(nèi)部靶組織不直接顯現(xiàn)，但通過皮膚上的小傷口插入儀器而到達(dá)。例如，可以通過針灌洗將制劑給予腹膜。同樣，可以在腰穿過程中通過灌注將藥物制劑給予腦脊膜或脊髓，隨后如通常實(shí)踐用于脊椎麻醉或脊髓的室椎影造影對患者進(jìn)行合適的定位。另外，可以通過內(nèi)窺鏡裝置給予制劑。實(shí)施例材料和方法DDAB，DOPE(二油酰磷脂酰乙醇胺)和這里使用的多數(shù)其它脂質(zhì)購自AvantiPolarLipids；PEG-DSPE來自Syngena。質(zhì)粒pLF的改造用XbaI切割pGL3-C(Promega)并使用大腸桿菌DNA聚合酶的Klenow片段進(jìn)行平端連接。然后用HindIII切割，凝膠純化攜帶熒光素酶基因的1689bp片段。用SmaI和HindIII切割pGFP-N1質(zhì)粒(Clontech)，凝膠中分離的4.7kb片段與熒光素酶片段連接。JM109大腸桿菌細(xì)胞轉(zhuǎn)化，選擇20個(gè)集落；它們中大約一半顯示了存在插入片段；用BamHI和XhoI切割含插入片段的8個(gè)克隆進(jìn)一步證實(shí)熒光素酶基因的存在；它們中七個(gè)是陽性。放射性標(biāo)記的質(zhì)粒pLF由在3H-胸腺嘧啶核苷-5’-三磷酸酯或32p無機(jī)磷酸鹽(5mCi)(Dupont/NEN，Boston，Mass.)中培養(yǎng)大腸桿菌產(chǎn)生并使用如上述的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)純化。DLS測量使用CoulterN4M光線散射儀，在90°角，設(shè)置200秒的運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)間，使用4至25微秒樣品時(shí)間。使用塑料比色杯，20℃和0.01泊粘度下獲得1ml樣品體積中的顆粒大小分布的掃描。在一個(gè)方面，該發(fā)明提供了捕獲DNA進(jìn)入脂質(zhì)的方法，該方法增加每體積單位質(zhì)粒的含量，降低用于捕獲質(zhì)?；蚬押塑账酓NA的陽離子脂質(zhì)的毒性。DNA變得隱藏在最終復(fù)合體的內(nèi)膜雙層中。此外，賦予了基因傳遞復(fù)合體在體液中長期循環(huán)時(shí)間和優(yōu)選滲出到實(shí)體腫瘤和它們的轉(zhuǎn)移灶和結(jié)中。在靜脈內(nèi)注射攜帶基因的載體后，通過人或動物身體多數(shù)部位中它們的脈管系統(tǒng)發(fā)生滲出。這是由于它們的尺寸小(100-160nm)，它們在其外膜雙層中的中性至略帶負(fù)電荷脂質(zhì)的含量，以及它們被PEG包裹而發(fā)生的。這些基因傳遞載體到達(dá)細(xì)胞外腫瘤間隙后能夠通過細(xì)胞膜屏障，因?yàn)榇嬖谂c親核肽綴合的促融合肽。推測載體在脂質(zhì)膜上某一預(yù)先確定的方向，其正末端朝向DNA和其疏水尾埋藏在疏水脂質(zhì)雙層內(nèi)側(cè)。內(nèi)吞后，易變的NLS-促融合肽鍵被切割，與質(zhì)粒DNA結(jié)合的剩余NLS肽協(xié)助它的細(xì)胞核攝取。這特別發(fā)生在導(dǎo)向不分裂細(xì)胞時(shí)，如肝、脾或骨髓細(xì)胞，它們代表了這些載體而不是實(shí)體腫瘤滲出和集中的主要部位。有機(jī)溶劑從期望的脂質(zhì)成分中制備微膠粒的合適溶劑是乙醇、甲醇或其它脂肪醇如丙醇、異丙醇、丁醇、叔丁醇、異丁醇、戊醇和己醇。兩種或多種溶劑的混合物可以用于實(shí)施本發(fā)明。也應(yīng)理解可與乙醇溶液混溶的，甚至是少量混溶的任何溶劑可用于提高微膠粒形成及其隨后轉(zhuǎn)變?yōu)橹|(zhì)體，包括氯仿、二氯甲烷、二乙基醚、環(huán)己烷、環(huán)戊烷、苯和甲苯。陽離子脂質(zhì)在另外的實(shí)施方案中，這里描述的包囊DNA的脂質(zhì)體進(jìn)一步包含有效量的陽離子脂質(zhì)。陽離子脂質(zhì)已經(jīng)廣泛用于基因傳遞；大量臨床試驗(yàn)(到1997年12月為止220項(xiàng)RAC許可總方案中有34項(xiàng))使用陽離子脂質(zhì)。盡管許多細(xì)胞培養(yǎng)研究已經(jīng)在文獻(xiàn)中記載，用陽離子脂質(zhì)在體內(nèi)進(jìn)行全身基因傳遞一直非常有限。所有臨床方案都使用皮下、真皮內(nèi)和腫瘤內(nèi)和顱內(nèi)注射以及鼻內(nèi)、胸膜內(nèi)或氣霧劑給予，而不是I.V.傳遞，因?yàn)殛栯x子脂質(zhì)和DOPE的毒性(見Martin和Boulikas，1998)。由DOPE和基于二?；谆@丙烷(分別是二油酰，二肉豆蔻酰，二棕櫚酰，二硬脂酰-三甲基銨丙烷或DOTAP，DMTAP，DPTAP，DSTAP)的陽離子脂質(zhì)或DDAB配制的脂質(zhì)體在體外與吞噬細(xì)胞(巨噬細(xì)胞和U937細(xì)胞)培養(yǎng)，但不接近非吞噬T淋巴細(xì)胞時(shí)，具有輕微毒性。毒性等級順序是DOPE/DDAB＞DOPE/DOTAP＞DOPE/DMTAP＞DOPE/DPTAP＞DOPE/DSTAP；毒性由陽離子脂質(zhì)體對一氧化氮(NO)和巨噬細(xì)胞激活產(chǎn)生的TNF-α合成的作用確定。進(jìn)行I.V.注射前的另一個(gè)待考慮的方面是負(fù)電荷血清蛋白可相互作用并使陽離子脂質(zhì)體失活(Yang和Huang，1997)。發(fā)現(xiàn)用于質(zhì)粒傳遞的凝聚劑包括聚賴氨酸，轉(zhuǎn)鐵蛋白-聚賴氨酸，第五代聚(氨基胺)(PAMAM)樹狀聚合物(dendrimer)，聚(乙烯亞胺)和幾種陽離子脂質(zhì)(DOTAP，DC-Chol/DOPE，DOGS/DOPE和DOTMA/DOPE)可不同程度地激活補(bǔ)體系統(tǒng)。用長鏈聚賴氨酸，樹狀聚合物(dendrimer)，聚(乙烯亞胺)和DOGS看到了強(qiáng)烈的補(bǔ)體激活。用聚乙二醇修飾預(yù)先形成的DNA復(fù)合體表面(Plank等人，1996)可大大降低補(bǔ)體激活。陽離子脂質(zhì)通過使生物膜，包括原生質(zhì)、內(nèi)體和溶酶體膜失去穩(wěn)定性而增加轉(zhuǎn)染效率。分離的溶酶體與低濃度DOTAP培養(yǎng)使β-半乳糖苷酶的自由活性顯著增加，甚至使酶釋放到培養(yǎng)基中。這證明脂質(zhì)可強(qiáng)烈地使溶酶體膜失去穩(wěn)定性。認(rèn)為失穩(wěn)機(jī)制包括陽離子脂質(zhì)體和溶酶體膜的陰離子脂質(zhì)之間的相互作用，因此允許脂質(zhì)雙層間融合。這個(gè)過程在pH5時(shí)沒有在pH7.4時(shí)明顯，陰離子兩親脂質(zhì)能夠部分阻礙這種膜的失穩(wěn)(Wattiaux等人，1997)。與在pH7.4下100％帶電荷的DOTAP和DMRIE相比，用pH敏感性熒光團(tuán)監(jiān)測DC-CHOL僅大約50％帶電荷。這個(gè)差異降低了脂質(zhì)體外表面上的電荷，提出促進(jìn)含DC-CHOL的雙層較早從質(zhì)粒DNA解離，增加DNA-脂質(zhì)復(fù)合體從內(nèi)體釋放到胞質(zhì)(ZuidamandBarenholz，1997)。盡管陽離子脂質(zhì)已經(jīng)廣泛用于基因傳遞，但是極少研究使用全身I.V.注射陽離子脂質(zhì)體-質(zhì)粒復(fù)合體。這是由于動物模型，而不是人中脂質(zhì)成分的毒性。I.V.注射給予兩種類型結(jié)構(gòu)類似的陽離子脂質(zhì)，DOTMA和DOTAP，顯示轉(zhuǎn)染效率主要由陽離子脂質(zhì)的結(jié)構(gòu)和陽離子脂質(zhì)與DNA的比例決定；熒光素酶和GFP基因在不同器官的表達(dá)是短暫的，高峰水平在4和24小時(shí)之間，到第4天降至低于高峰水平的1％(Song等人，1997)。脂質(zhì)體傳遞基因或寡核苷酸后可導(dǎo)向體內(nèi)很多不同器官。通過小鼠尾靜脈靜脈內(nèi)注射陽離子脂質(zhì)體-質(zhì)粒復(fù)合體，主要導(dǎo)向肺，較少程度上導(dǎo)向肝、脾、心臟、腎和其它器官(Zhu等人，1993)。給i.p.接種了包含K-ras點(diǎn)突變的AsPC-1胰腺癌細(xì)胞的裸鼠腹膜內(nèi)注射表達(dá)反義K-rasRNA的質(zhì)粒-脂質(zhì)體復(fù)合體和PCR分析表明注射的DNA傳遞到除了腦之外的各種器官中(Aoki等人，1995)。發(fā)現(xiàn)DOTAP膽固醇/DNA復(fù)合體制備的許多因素包括DNA脂質(zhì)體比例，適度超聲處理，加熱和擠出對于提高全身傳遞很重要；當(dāng)使用大小在200-450nm之間的DNA脂質(zhì)體復(fù)合體的同源群體時(shí)，得到最高基因表達(dá)。低溫電子顯微鏡顯示在這些制劑中，DNA在凹入的脂質(zhì)體內(nèi)部兩層脂質(zhì)雙層間凝聚，這是被認(rèn)為有助于體內(nèi)高轉(zhuǎn)染效率和廣泛組織分布的因素(Templeton等人，1997)。提高脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因傳遞到體細(xì)胞的步驟包括質(zhì)粒在血液循環(huán)中的存留，進(jìn)入入口和轉(zhuǎn)運(yùn)通過細(xì)胞膜，從內(nèi)體隔室釋放到細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞核通過細(xì)胞核被膜的孔復(fù)合體?？慷?，由適當(dāng)啟動子/增強(qiáng)子調(diào)控元件驅(qū)動的表達(dá)，和質(zhì)粒在細(xì)胞核中長期持續(xù)存在(Boulikas，1998a)。質(zhì)粒與精胺凝聚在另外的實(shí)施方案中，這里描述的脂質(zhì)體包封的DNA與精胺和/或亞精胺凝聚。DNA可作為與聚陽離子如聚賴氨酸，或堿性蛋白如魚精蛋白，總組蛋白或特定的組蛋白組分的復(fù)合體呈遞給培養(yǎng)物中的細(xì)胞(BoulikasandMartin，1997)。質(zhì)粒DNA與硫酸魚精蛋白之間的相互作用，隨后添加DOTAP陽離子脂質(zhì)體，為質(zhì)粒DNA抗酶促消化提供更好的保護(hù)。與DOTAP/DNA復(fù)合體相比，通過尾靜脈注射該方法使在小鼠中的基因表達(dá)水平始終較高。每只小鼠50μg熒光素酶-質(zhì)粒得到了每mg肺中提取的組織蛋白含20ng熒光素酶蛋白，這早在注射后1小時(shí)檢測到，在6小時(shí)達(dá)到高峰，之后下降。與I.V.注射相比，門脈內(nèi)注射魚精蛋白/DOTAP/DNA導(dǎo)致肺中基因表達(dá)降低大約100倍。內(nèi)皮細(xì)胞是lacZ轉(zhuǎn)基因表達(dá)的主要部位(LiandHuang，1997)。使用單價(jià)陽離子脂質(zhì)體制劑(DC-Chol和脂質(zhì)轉(zhuǎn)染物)，硫酸魚精蛋白增強(qiáng)質(zhì)粒傳遞到幾種不同類型的體外細(xì)胞中。在多價(jià)陽離子脂質(zhì)體制劑lipofectamine中，這種作用不太明顯(Sorgi等人，1997)，在細(xì)胞培養(yǎng)和動物研究中發(fā)現(xiàn)精胺增強(qiáng)DNA-陽離子脂質(zhì)體復(fù)合體的轉(zhuǎn)染效率。這種源于生物的聚胺在高濃度下引起脂質(zhì)體融合，最可能是由一分子的精胺(四個(gè)正電荷氨基)與兩個(gè)或多個(gè)分子的脂質(zhì)的極性頭部基團(tuán)之間同時(shí)相互作用而促進(jìn)的。在低濃度(0.03-0.1mM)下，它促進(jìn)脂質(zhì)體-DNA復(fù)合體固定到細(xì)胞表面并顯著增強(qiáng)轉(zhuǎn)染效率(Boulikas，未出版)。聚陽離子聚凝胺，魚精蛋白，DEAE-葡聚糖和聚-L-賴氨酸顯著增加在細(xì)胞培養(yǎng)物中腺病毒介導(dǎo)的基因傳遞的效率。認(rèn)為這是通過中和了降低腺病毒介導(dǎo)的基因傳遞效率的膜糖蛋白所帶負(fù)電荷而起作用的(Arcasoy等人，1997)。寡核苷酸傳遞在另外的實(shí)施方案中，脂質(zhì)體包封寡核苷酸DNA。寡核苷酸包封到脂質(zhì)體中增加它們的治療指數(shù)，防止在培養(yǎng)細(xì)胞中和在人血清中降解，和降低對細(xì)胞的毒性(ThierryandDritschilo，1992；Capaccioli等人，1993；Lewis等人，1996)。然而，多數(shù)研究已經(jīng)在細(xì)胞培養(yǎng)物中進(jìn)行，很少在動物體內(nèi)進(jìn)行。在這些方法能夠進(jìn)展到臨床研究前仍需要大量改進(jìn)。ZelphatiandSzoka(1997)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)熒光標(biāo)記的寡核苷酸與DOTAP脂質(zhì)體的復(fù)合體，使用主要涉及未包被囊泡的細(xì)胞內(nèi)途徑進(jìn)入細(xì)胞。寡核苷酸從點(diǎn)狀細(xì)胞質(zhì)區(qū)域重新分布到細(xì)胞核中。這一過程不依賴于內(nèi)體囊泡的酸化。寡核苷酸的細(xì)胞核攝取依賴于幾個(gè)因素，如顆粒的電荷，其中正電荷復(fù)合體是增加細(xì)胞核攝取所需的。DOTAP使特異性抗熒光素酶寡核苷酸的反義活性增加超過100倍。不同陽離子脂質(zhì)組分的寡核苷酸-脂質(zhì)體復(fù)合體的物理化學(xué)研究表明細(xì)胞膜中其它脂質(zhì)上的磷脂酰乙醇胺或負(fù)電荷是與陽離子脂質(zhì)體-寡核苷酸復(fù)合體有效融合從而促進(jìn)進(jìn)入細(xì)胞所需的。Lappalainen等人(1997)報(bào)道了類似的結(jié)果。與聚陽離子DOSPA和單陽離子DDAB(DOPE作為輔助脂質(zhì))復(fù)合的地高辛標(biāo)記的寡脫氧核苷酸(ODNs)被培養(yǎng)物中CaSki細(xì)胞通過內(nèi)吞接納。發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核膜形成對抗細(xì)胞核引入在核周區(qū)域蓄積的ODNs的屏障。盡管DOSPA/DOPE脂質(zhì)體可將ODNs傳遞到胞質(zhì)溶膠中，但是它們不能介導(dǎo)細(xì)胞核引入ODNs。相反，含凈正電荷的寡核苷酸-DOSPA/DOPE復(fù)合體從囊泡釋放到細(xì)胞質(zhì)中。確定DOSPA/DOPE介導(dǎo)細(xì)胞核引入寡核苷酸。插入在帶DOTAP的陽離子脂質(zhì)顆粒的DOPE-血紅素(三鐵原卟啉IX)綴合物保護(hù)寡核糖核苷酸不被人血清降解和增加寡核糖核苷酸被2.2.15人肝細(xì)胞瘤細(xì)胞攝取。只有在顆粒中凈負(fù)電荷時(shí)，血紅素的增強(qiáng)作用才明顯(Takle等人，1997)。在I..V.尾注射后，111In標(biāo)記的和由DC-Chol和DOPE組成的脂質(zhì)體最初被肝攝取，有一些蓄積在脾和皮膚中，很少量在肺中。陽離子脂質(zhì)體與寡核苷酸硫代磷酸酯預(yù)先溫育促使脂質(zhì)在肺中戲劇性但短暫地蓄積，逐漸重新分布到肝中。肺攝取的機(jī)制包括在注射后15分鐘通過栓塞，肺毛細(xì)管內(nèi)包埋寡核苷酸大聚集體。注射后24小時(shí)，標(biāo)記的寡核苷酸最初位于Kupffer細(xì)胞的吞噬泡中。在體內(nèi)沒有觀察到細(xì)胞核攝取寡核苷酸(Litzinger等人，1996)。聚乙二醇(PEG)包裹的脂質(zhì)體在另外的實(shí)施方案中，這里描述的包封DNA的脂質(zhì)體進(jìn)一步包括用PEG包裹步驟2(圖1)中的最終復(fù)合體。通常期望脂質(zhì)與提供半衰期延長的聚合物，如聚乙二醇(PEG)綴合。使用的衍生脂質(zhì)包括PEG修飾的DSPE或PEG-神經(jīng)酰胺。添加PEG成分防止復(fù)合體聚集，增加顆粒(脂質(zhì)體、蛋白、其它復(fù)合體、藥物)的循環(huán)持續(xù)時(shí)間并增加脂質(zhì)-核酸復(fù)合體傳遞到靶組織中。參見Maxfield等人，Polymer16505-509(1975)；Bailey，F(xiàn).E.等人，inNonionicSurfactants，Schick，M.J.，ed.，pp.794-821(1967)；Abuchowski，A.等人，J.Biol.Chem.2523582-3586(1977)；Abuchowski，A.等人，CancerBiochem.Biophys.7175-186(1984)；Katre，N.V.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA8414871491(1987)；Goodson，R.等人BioTechnology8343-346(1990)。報(bào)道了與PEG的綴合使免疫原性和毒性降低。參見Abuchowski等人，J.Biol.Chem.2523578-3581(1977)。美國專利5,013,556中描述了通過用PEG包裹，脂質(zhì)體血液循環(huán)時(shí)間增加的程度。典型地，復(fù)合體中PEG修飾的磷脂，或PEG-神經(jīng)酰胺的濃度將是大約1-7％。在具體的優(yōu)選實(shí)施方案中，PEG修飾的脂質(zhì)是PEG-DSPE。設(shè)計(jì)惰性材料包裹脂質(zhì)體表面從而掩飾脂質(zhì)體避開身體的宿主防御系統(tǒng)，顯示顯著增加了脂質(zhì)體的血漿壽命。這個(gè)“表面修飾的”亞支的生物學(xué)范例是紅細(xì)胞-被密集的一層碳水化合物基團(tuán)包裹和負(fù)責(zé)逃避免疫系統(tǒng)檢測并循環(huán)幾個(gè)月(在被負(fù)責(zé)清除脂質(zhì)體的同一類型細(xì)胞清除前)的細(xì)胞。1987年產(chǎn)生了第一次突破，那時(shí)鑒定了糖脂(腦組織衍生的神經(jīng)節(jié)苷脂GM1)，當(dāng)摻入脂質(zhì)間質(zhì)內(nèi)部時(shí)，允許脂質(zhì)體在血流中循環(huán)很多小時(shí)(AllenandChonn，1987)。也發(fā)現(xiàn)了第二個(gè)糖脂-磷脂酰肌醇可使脂質(zhì)體在血漿中長期存留并且，由于它是從大豆，而不是腦組織中提取的，據(jù)信是藥物更可接受的賦形劑(Gabizon等人，1989)。表面修飾的亞支的主要進(jìn)展是開發(fā)了聚合物包裹的脂質(zhì)體(Allen等人1991)。聚乙二醇(PEG)修飾已經(jīng)使用多年來延長生物蛋白(如酶和生長因子)的半衰期和降低其免疫原性(例如Beauchamp等人，1983)。在1990s早期報(bào)道了PEG包裹的脂質(zhì)體在靜脈內(nèi)給藥后循環(huán)明顯長的時(shí)間。在小鼠和大鼠中見到大約24小時(shí)左右的半衰期，在狗中超過30小時(shí)。由于其躲避免疫系統(tǒng)攔截的能力，將術(shù)語“秘密”用于這些脂質(zhì)體。PEG親水聚合物形成密集的“構(gòu)象云”防止其它大分子與表面的相互作用，甚至在保護(hù)性聚合物濃度低時(shí)(GabizonandPapahadjopoulos，1988；Papahadjopoulos等人，1991；reviewedbyTorchilin，1998)。用兩親PEG5000包裹后，脂質(zhì)體親水性增加導(dǎo)致網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)非特異性攝取降低。然而被PEG包裹的抗肌球蛋白免疫脂質(zhì)體的半衰期是40分鐘，在靜脈內(nèi)注射給兔后，它們增加其半衰期至1000分鐘(Torchilin等人，1992)。微膠粒、表面活性劑和小單層囊泡在另外的實(shí)施方案中，這里描述的脂質(zhì)體包封的DNA進(jìn)一步包括陽離子脂質(zhì)和凝聚的質(zhì)?；蚬押塑账酓NA之間在乙醇溶液中形成微膠粒的最初步驟。微膠粒是由某些類型的脂質(zhì)分子，洗滌劑或表面活性劑在濃度、溶劑和溫度限定的條件下形成的小兩親型膠體顆粒。它們由單一脂質(zhì)層組成。微膠?？删哂醒b配使得其疏水尾部接觸溶劑(例如在30-60％含水乙醇溶液)的親水頭部基團(tuán)，或可逆轉(zhuǎn)它們的結(jié)構(gòu)使得它們的極性頭部接觸溶劑如使乙醇濃度降至低于10％(反微膠粒)。微膠粒系統(tǒng)處于與溶劑分子和環(huán)境的熱力學(xué)平衡。這導(dǎo)致恒定的位相改變，特別是當(dāng)接觸生物材料，如引入細(xì)胞培養(yǎng)物中，注射給動物，稀釋，接觸蛋白或其它大分子時(shí)。這些改變引起微膠?？焖俜纸饣蛐跄?。這與脂質(zhì)體雙層高得多的穩(wěn)定性形成對照。單鏈表面活性劑能夠形成微膠粒(見下表1)。這些表面活性劑包括陰離子(十二烷基硫酸鈉，膽酸鹽或油酸鹽)或陽離子(十六烷基-三甲基溴化銨，CTAB)表面活性劑。CTAB，CTAC和DOIC微膠粒比含中性脂質(zhì)和CTAB(1∶1)的相應(yīng)SUV顆粒產(chǎn)生更大的溶解間隙(膠體懸浮DNA濃度較低)(Lasic，1997)。表1能夠形成微膠粒的分子層至微膠粒轉(zhuǎn)變發(fā)生時(shí)存在臨界的洗滌劑/磷脂比例。例如，對于含大單層脂質(zhì)體的十二烷基麥芽糖苷觀察到囊泡-微膠粒轉(zhuǎn)變。十二烷基麥芽糖苷造成的溶解過程的驚人特征是發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新相，由含長絲線樣微膠粒，長度超過1至2微米的非常粘的“凝膠樣”結(jié)構(gòu)組成。長循環(huán)復(fù)合體需要少許陰離子。因此，用于微膠粒轉(zhuǎn)變?yōu)橹|(zhì)體的脂質(zhì)體含有雙極性脂質(zhì)(PC，PE)和1-30％負(fù)電荷脂質(zhì)(DPPG)。有毒性的陽離子脂質(zhì)隱藏在內(nèi)部脂質(zhì)體膜雙層中。那些到達(dá)實(shí)體腫瘤的脂質(zhì)將發(fā)揮它們引起編程性細(xì)胞死亡的毒性作用。編程性細(xì)胞死亡會由將毒性藥物或抗腫瘤基因或寡核苷酸傳遞給癌癥細(xì)胞而引起，也可以由陽離子脂質(zhì)(與質(zhì)粒DNA一起)細(xì)胞核定位到細(xì)胞核中引起。實(shí)際上，大量研究提示質(zhì)粒DNA被引入核；其易位停駐在靜電附著于DNA上的陽離子脂質(zhì)分子上。這些陽離子脂質(zhì)分子通過干擾核小體和引起局部失穩(wěn)的染色質(zhì)的域結(jié)構(gòu)而發(fā)揮其毒性。這種失調(diào)或異常染色質(zhì)重新組織會在質(zhì)粒DNA附著進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，自主復(fù)制或通過重組而整合的細(xì)胞核間質(zhì)水平上而產(chǎn)生。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)表面活性劑在制劑如乳劑(包括微乳狀液)和脂質(zhì)體中的廣泛應(yīng)用。很多不同類型表面活性劑，天然和合成的，性能分類和分級最普通的方法是通過使用親水/親脂平衡(HLB)。已經(jīng)綜述了表面活性劑在藥物產(chǎn)品、制劑和乳劑中的應(yīng)用(Rieger，nPharmaceuticalDosageForms，MarcelDekker，Inc.，NewYork，1988，p.285)。發(fā)現(xiàn)非離子表面活性劑在藥物和化妝品產(chǎn)品中廣泛應(yīng)用并可在廣范圍的pH值下使用。通常，根據(jù)它們的結(jié)構(gòu)，它們的HLB值范圍從2至大約18。非離子表面活性劑包括，非離子酯如乙二醇酯，丙二醇酯，甘油酯，聚甘油酯，脫水山梨醇酯，蔗糖酯和乙氧基化酯。非離子鏈烷醇酰胺和酯，如脂肪醇乙氧基化物，丙氧基化醇和乙氧基/丙氧基化的，嵌段聚合物也包括在這類中。聚氧乙烯表面活性劑是非離子表面活性劑類的最普遍成員。陰離子表面活性劑包括羧化物如皂類，?；樗猁}，氨基酸的酰胺，硫酸的酯如烷基硫酸酯和乙氧基化烷基硫酸酯，磺酸鹽如烷基苯磺酸鹽，酰基羥乙基磺酸鹽，酰基?；撬猁}和磺基琥珀酸鹽和磷酸鹽。陰離子表面活性劑類的最重要成員是烷基硫酸酯和皂類。陽離子表面活性劑包括季銨鹽和乙氧基化胺。季銨鹽是這類中最常用的成員。如果表面活性劑分子具有攜帶正或負(fù)電荷的能力，該表面活性劑分類為兩性的。兩性表面活性劑包括丙烯酸衍生物，取代烷基酰胺，N-烷基甜菜堿和磷脂。經(jīng)典的微膠?？赡懿荒苡行ё鳛榛騻鬟f載體，但是可作為包封藥物或核酸的脂質(zhì)體復(fù)合體形成的重要中間體。單鏈表面活性劑-DNA-膠體系統(tǒng)的穩(wěn)定性低于含中性脂質(zhì)和CTAB(1∶1)的SUV顆粒。然而，第二代微膠粒能夠?qū)蝮w內(nèi)腫瘤。Weissigandcoworkers(1998)使用大豆胰蛋白酶抑制劑(STI)作為模型蛋白導(dǎo)向腫瘤。STI用N-戊二酰-磷脂酰-乙醇胺(NGPE)的疏水殘基修飾并摻入聚乙二醇(分子量5000)-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)微膠粒(＜20nm)和PEG-DSPE修飾的長循環(huán)脂質(zhì)體(約100nm)。如使用111In蛋白標(biāo)記通過蛋白粘連二亞乙基三胺五醋酸，DTPA與大豆胰蛋白酶抑制劑連接而確定，在尾靜脈注射后，PEG-脂質(zhì)微膠粒比固定在長循環(huán)PEG-脂質(zhì)體中的相同蛋白在小鼠皮下建立的Lewis肺癌中蓄積更好。裝填有兩親藥物的脂質(zhì)體分散體可能使相轉(zhuǎn)變?yōu)槲⒛z粒溶液。將乳白色外觀的脂質(zhì)體分散體(顆粒大小200nm)轉(zhuǎn)變成接近透明的微膠粒(顆粒大小低于25nm)來完成從高比例的磷脂與藥物的轉(zhuǎn)變(從2∶1至1∶1向下)。參見SchutzeandMuller-Goymann(1998)。促融合肽在另外的實(shí)施方案中，這里描述的脂質(zhì)體包封的DNA進(jìn)一步包括有效量的促融合肽。促融合肽屬于特征為沿長螺旋軸呈疏水性梯度的螺旋兩親肽類。這個(gè)疏水性梯度引起肽在膜中傾斜插入，因此使脂質(zhì)核心失去穩(wěn)定性，由此增強(qiáng)膜融合(Decout等人，1999)。血細(xì)胞凝聚素(HA)是流感病毒的均三聚表面糖蛋白。在感染時(shí)，它促使低pH下病毒和內(nèi)體膜之間的膜融合。每個(gè)單體由受體結(jié)合HA1域和膜相互作用HA2域組成。HA2域的NH2末端區(qū)域(氨基酸1至127)，所謂的“融合肽”插入目標(biāo)膜中并在觸發(fā)病毒和內(nèi)體膜之間融合中起決定性作用。基于用胱氨酸置換區(qū)域5-14的8個(gè)氨基酸和旋轉(zhuǎn)標(biāo)記電子順磁共振，得到結(jié)論該肽形成α螺旋，從膜水平面傾斜近25度，從磷酸基的最大深度15埃(Macosko等人，1997)。使用來自流感病毒血細(xì)胞凝聚素HA-2的促融合肽大大增加了細(xì)胞攝取轉(zhuǎn)鐵蛋白-聚賴氨酸-DNA復(fù)合體的效率。該肽與聚賴氨酸連接，復(fù)合體通過轉(zhuǎn)鐵蛋白受體介導(dǎo)的內(nèi)吞而傳遞(Boulikas，1998a綜述)。這個(gè)肽具有序列GLFEAIAGFIENGWEGMIDGGGYC(SEQIDNO9)并能夠促使熒光染料鈣黃綠素從卵黃卵磷脂制備的脂質(zhì)體中釋放，在酸性pH更強(qiáng)。在0.1-1mM濃度下，使用在培養(yǎng)物中的CEM-SS淋巴細(xì)胞這個(gè)肽也能夠使反義寡核苷酸的抗HIV潛能增加到高達(dá)10倍。這個(gè)肽在內(nèi)體輕微較酸環(huán)境下改變構(gòu)象，失穩(wěn)并打破了內(nèi)體膜(Boulikas，1998a綜述)。膜中存在負(fù)電荷脂質(zhì)對于證明有些肽的促融合性能很重要，但對其它性能不重要。而肽的促融合活性，代表推定的ferrilin-參與精子-卵融合的精子表面蛋白的融合域，依賴于負(fù)電荷脂質(zhì)的存在，HIV2肽的促融合活性不是這樣(MartinandRuysschaert，1997)。例如，為了分析流感病毒血細(xì)胞凝聚素HA的促融合肽上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，設(shè)計(jì)HA的細(xì)胞質(zhì)尾和/或跨膜結(jié)構(gòu)域被仙臺病毒相應(yīng)的促融合糖蛋白F的結(jié)構(gòu)域取代的HA-嵌合體。制備細(xì)胞質(zhì)尾被人神經(jīng)元顆粒蛋白1型(NF1)(殘基1441至1518)或c-Raf-1(殘基51至131)的肽取代的HA構(gòu)建體，并使用牛痘病毒T7聚合酶瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)在CV-1細(xì)胞中表達(dá)。親本或嵌合HA蛋白介導(dǎo)的CV-1細(xì)胞和結(jié)合人紅細(xì)胞(RBCs)間的膜融合顯示，pH降低后，發(fā)生了含水熒光團(tuán)鈣黃綠素從預(yù)先承載RBCs流向表達(dá)蛋白的CV-1細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。這表明膜融合包括脂質(zhì)雙層的兩個(gè)小葉并導(dǎo)致水融合孔形成(Schroth-Diaz等人，1998)。顯著的發(fā)現(xiàn)是HIV的TAT蛋白能夠穿過細(xì)胞膜(GreenandLoewenstein，1998)和TAT的36個(gè)氨基酸的結(jié)構(gòu)域，當(dāng)與異源蛋白化學(xué)交聯(lián)時(shí)，賦予了轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞中的能力。TAT的11個(gè)氨基酸促融合肽(YGRKKRRQRRR(SEQIDNO10))是核仁定位信號(參見Boulikas，1998b)。另一個(gè)HIV蛋白，糖蛋白gp41，含有促融合肽。源自gp41胞外域的膜最近區(qū)的線性肽具有作為抗HIV劑和通過采取螺旋構(gòu)象而抑制傳染性的潛在應(yīng)用(Judice等人，1997)。23個(gè)氨基酸殘基，HIV-1gp41的N末端肽具有使負(fù)電荷大單層囊泡失穩(wěn)的能力。缺乏陽離子時(shí)，主要結(jié)構(gòu)是成孔α螺旋，而在Ca2+存在下，構(gòu)象轉(zhuǎn)變成促融合的，主要是延伸的β型結(jié)構(gòu)。HIV(ala)(含R22→A置換)的融合活性降低70％，而當(dāng)包括第二個(gè)置換(V2-E)時(shí)，促融合性完全喪失，爭辯是主動失穩(wěn)含膽固醇的電中性膜的HIV-1融合肽采取的不是α螺旋，而是延伸的結(jié)構(gòu)(Pereira等人，1997)。朊病毒蛋白(PrP)是功能未知的糖蛋白，通常在神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞表面發(fā)現(xiàn)。它參與疾病如牛海綿狀腦病，和人Creutzfeldt-Jakob病，其中PrP轉(zhuǎn)變?yōu)楦淖冃问?術(shù)語稱PrPSc)。根據(jù)計(jì)算機(jī)模擬化計(jì)算，PrP的120至133和118至135結(jié)構(gòu)域是傾斜方式插入脂質(zhì)雙層的傾斜脂質(zhì)關(guān)聯(lián)肽并能與脂質(zhì)體相互作用促使包封鈣黃綠素泄露(Pillot等人，1997b)。Alzheimer淀粉樣肽的C末端片段(氨基酸29-40和29-42)具有與促使體外脂質(zhì)體融合的病毒蛋白的融合肽相關(guān)的性能。這些特性可介導(dǎo)淀粉樣肽與細(xì)胞膜的直接相互作用并解釋淀粉樣肽的部分細(xì)胞毒性。考慮到早老性癡呆的病理學(xué)和載脂蛋白E(apoE)多態(tài)性之間的流行病學(xué)和生物化學(xué)關(guān)聯(lián)，三個(gè)普通apoE同種型和淀粉樣肽C末端片段之間的潛在相互作用的研究顯示只有apoE2和apoE3，不是apoE4，是淀粉樣肽促融合和聚集性能的有力抑制劑。認(rèn)為apoE抗淀粉樣聚集體形成的保護(hù)性作用是由形成穩(wěn)定的apoE/淀粉樣肽復(fù)合體介導(dǎo)的(Pillot等人，1997a；Lins等人，1999)。當(dāng)11個(gè)氨基酸殘基組成的兩親凈負(fù)電荷肽(WAE11)固定于脂質(zhì)體膜時(shí)，強(qiáng)烈提高該肽的促融合性能。該肽的融合活性看來不依賴于pH和膜合并，和目標(biāo)膜需要通過摻入賴氨酸耦聯(lián)磷脂酰乙醇胺(PE-K)的提供的正電荷。而耦聯(lián)肽可使囊泡通過與PE-K的非特異性靜電相互作用而聚集，游離肽不能促使PE-K囊泡聚集(Pecheur等人，1997)。大量研究提示肽在插入細(xì)胞或脂質(zhì)體膜的脂質(zhì)雙層后，其α螺旋二級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性負(fù)責(zé)肽的膜融合性能。Zn2+，增強(qiáng)肽的促融合活性，因?yàn)樗€(wěn)定α螺旋結(jié)構(gòu)。例如，唾液抗微生物肽的HEXXH(SEQIDNO11)結(jié)構(gòu)域，位于histatin-5的C末端功能域，識別的鋅結(jié)合基元是螺旋構(gòu)象(Martin等人，1999；Melino等人，1999；Curtain等人，1999)。融合肽已經(jīng)與DNA質(zhì)粒配制以產(chǎn)生基于肽的基因傳遞系統(tǒng)。用于將質(zhì)粒凝聚成40至200nm的納米顆粒的YKAKnWK(SEQIDNO12)肽與設(shè)計(jì)利于質(zhì)粒從內(nèi)體釋放的pH敏感性溶解劑GLFEALLELLESLWELLLEA(SEQIDNO13)兩親肽組合，增強(qiáng)含β-半乳糖苷酶報(bào)道基因的表達(dá)系統(tǒng)(Duguid等人，1998)。見下表2。表2促融合肽促融合脂質(zhì)DOPE是促融合脂質(zhì)；彈性蛋白酶切割N-甲氧基-琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Val-DOPE(SEQIDNO19)將此衍生物轉(zhuǎn)變?yōu)镈OPE(總的正電荷)而將包封的熒光探針，鈣黃綠素傳遞到細(xì)胞質(zhì)中(Pak等人，1999)。與β-內(nèi)啡肽mRNA區(qū)域互補(bǔ)的30個(gè)堿基的寡脫氧核苷酸序列，在其包封到含賦予促融合活性的二棕櫚酰-DL-α-磷脂酰-L-絲氨酸的小單層囊泡(50nm)中后，引起細(xì)胞培養(yǎng)物中β-內(nèi)啡肽產(chǎn)生的濃度依賴性抑制。細(xì)胞核定位信號(NLS)在另外的實(shí)施方案中，這里描述的脂質(zhì)體包封的質(zhì)?；蚬押塑账酓NA進(jìn)一步包括有效量的細(xì)胞核定位信號(NLS)肽。細(xì)胞核蛋白通過核孔復(fù)合體從它們在細(xì)胞質(zhì)中的合成部位到細(xì)胞核中的功能部位的流通由待引入細(xì)胞核中的蛋白上的NLSs介導(dǎo)(表3-10，在下面)。蛋白從細(xì)胞質(zhì)運(yùn)輸?shù)胶速|(zhì)包括(i)karyopherinα與NLS-蛋白形成復(fù)合體；(ii)karyopherinβ的隨后結(jié)合；(iii)在核孔蛋白上復(fù)合體與FXFG肽重復(fù)序列的結(jié)合；(iv)通過p10，Ran-GDP停駐在核孔蛋白和karyopherin雜二聚體上；(v)核孔蛋白上大量結(jié)合-解離反應(yīng)，使引入底物停駐在核質(zhì)側(cè)，伴發(fā)GDP-GTP交換反應(yīng)，該反應(yīng)將Ran-GDP轉(zhuǎn)變?yōu)镽an-GTP并由karyopherinα催化；和(vi)Ran-GTP使得karyopherinα/NLS-蛋白與karyopherinβ解離并釋放到核質(zhì)中。在多數(shù)一級結(jié)構(gòu)已經(jīng)檢測的非膜絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶中發(fā)現(xiàn)親核和酸性簇(表6)。這些親核簇可能介導(dǎo)激酶分子固定到轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白上進(jìn)行它們受調(diào)節(jié)的細(xì)胞核引入和可能構(gòu)成細(xì)胞核定位信號。與僅位于細(xì)胞核中的具有由在側(cè)接脯氨酸和甘氨酸螺旋打斷子的六肽內(nèi)的至少四個(gè)精氨酸(R)和賴氨酸(K)組成的強(qiáng)力親核肽的蛋白轉(zhuǎn)錄因子相比，蛋白激酶通常含有一個(gè)組氨酸和三個(gè)K+R殘基(Boulikas，1996)。提出這是指定弱NLS結(jié)構(gòu)，引起細(xì)胞核引入總細(xì)胞質(zhì)激酶的成分，以及它們微弱停留在不同的離子強(qiáng)度細(xì)胞核環(huán)境中。蛋白激酶中推定的NLS肽可能也含有提出進(jìn)一步減少它們發(fā)揮強(qiáng)NLS作用的能力的疏水性或龐大的芳香氨基酸。參與DNA修復(fù)途徑的多數(shù)哺乳動物蛋白看來具有在六個(gè)氨基酸的序列段中含至少四個(gè)R+K的強(qiáng)親核簇(表7)。預(yù)計(jì)未知蛋白細(xì)胞核定位的規(guī)則已經(jīng)提出從其氨基酸序列預(yù)計(jì)功能未知的蛋白細(xì)胞核定位的幾個(gè)簡單規(guī)則(i)NLS被定義為在六肽內(nèi)的四個(gè)精氨酸(R)加賴氨酸(K)；在親核六肽的四元組中存在一個(gè)或多個(gè)組氨酸(H)，常常在具有細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核功能的蛋白激酶中發(fā)現(xiàn)，可能指定功能可能受磷酸化調(diào)節(jié)的弱NLS或可能指定在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中都起作用的蛋白(Boulikas，1996)；(ii)K/R簇由α螺旋打斷子G和P側(cè)接，由此將NLS置于螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋或α螺旋末端。負(fù)電荷氨基酸(D，E)常常在NLS側(cè)翼發(fā)現(xiàn)，在一些情況下可能打斷負(fù)電荷NLS簇；(iii)龐大的氨基酸(W，F(xiàn)，Y)不存在于NLS六肽中；(iv)NLS信號可能不由長段疏水氨基酸(如五個(gè))側(cè)接；帶電荷和疏水氨基酸的混合物起線粒體導(dǎo)向信號作用；(v)NLSs數(shù)量越多，分子越容易引入細(xì)胞核(Dworetzky等人，1988)。甚至小蛋白，例如組蛋白(10-22kDa)，需要主動引入來增加它們與小分子通過孔擴(kuò)散的慢速度相比的引入速度；(vi)信號肽是比NLSs更強(qiáng)的蛋白流通量的決定因素。信號肽指導(dǎo)蛋白到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔進(jìn)行分泌或插入細(xì)胞膜(跨膜域存在)(Boulikas，1994)；(vii)線粒體引入蛋白的信號(疏水和親核氨基酸的混合物)可能對抗細(xì)胞核引入信號，具有兩種類型信號的蛋白可能易位到線粒體和細(xì)胞核；(Viii)蛋白與大細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)(膜蛋白，中間絲狀體)的強(qiáng)烈結(jié)合使得這種蛋白不能引入，盡管它們具有NLS樣肽(Boulikas，1994)；(ix)轉(zhuǎn)錄因子和其它細(xì)胞核蛋白具有大量不同的推定的NLS段。十六個(gè)可能形式的推定NLS結(jié)構(gòu)中，最豐富的類型是θθxθθ，θθθxθ，θθθθ和θθxθxθ，其中θ是R或K，總計(jì)占在轉(zhuǎn)錄因子上全部親核簇的大約70％(Boulikas，1994)；(x)少量細(xì)胞核蛋白看來缺乏典型的親核NLS。非親核肽既不起它們細(xì)胞核引入的作用，因?yàn)檫@種分子具有二分NLSs，引入也不絕對依賴于這些缺少NLS的蛋白在細(xì)胞質(zhì)中與待引入的細(xì)胞核蛋白伙伴的強(qiáng)烈復(fù)合作用(Boulikas，1994)。這個(gè)機(jī)制可能確保細(xì)胞核中兩種分子的某一化學(xué)計(jì)算比，且可能具有生理意義；和(xi)大量蛋白可能通過其它機(jī)制被引入，不依賴于經(jīng)典的NLS。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)很多過程受細(xì)胞核引入的調(diào)節(jié)，包括轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，rNFIL-6，ISGF3，SRF，c-Fos，GR以及人細(xì)胞周期蛋白A和B1，酪蛋白激酶II，cAMP依賴性蛋白激酶II，蛋白激酶C，ERK1和ERK2的細(xì)胞核易位。細(xì)胞不能將特定蛋白引入細(xì)胞核可導(dǎo)致癌發(fā)生。例如，BRCA1主要位于乳房和卵巢癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，而在正常細(xì)胞中蛋白位于細(xì)胞核中。mRNA通過與具有細(xì)胞核輸出信號(NES)的細(xì)胞核蛋白的復(fù)合體相同的途徑輸出。大量含NES的蛋白是結(jié)合并護(hù)送RNAs到細(xì)胞質(zhì)的RNA結(jié)合蛋白。然而，其它含NES的蛋白在輸出蛋白中起作用；與其它蛋白上的NES序列結(jié)合并與細(xì)胞核孔復(fù)合體相互作用的CRM1是真核細(xì)胞中NES依賴性細(xì)胞核輸出蛋白的必需中介物。細(xì)胞核定位和輸出信號(NLS和NES)在很多重要分子中發(fā)現(xiàn)，包括p53，v-Rel，轉(zhuǎn)錄因子NF-Atc，c-Ab1非受體酪氨酸激酶，和脆弱的X綜合癥精神遲緩基因產(chǎn)物。它們正常引入/輸出流通的解控是人類疾病的重要暗示。細(xì)胞核引入和輸出過程可受蛋白與NLS或NES肽綴合的操縱?；蛑委熯^程中，外來DNA需要進(jìn)入細(xì)胞核進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。提出途徑包括質(zhì)粒和寡核苷酸與開始存在的具有NLSs的細(xì)胞核蛋白的復(fù)合作用作為它們細(xì)胞核引入的必要條件。(Boulikas，1998b)提出NLS肽與寡核苷酸和質(zhì)粒的共價(jià)連接或質(zhì)粒與具有多個(gè)NLS肽的蛋白形成復(fù)合體可增加它們的引入速度和基因表達(dá)效率。預(yù)計(jì)癌細(xì)胞與最終分化的細(xì)胞相比，可更有效地將外來DNA引入細(xì)胞核，因?yàn)樗鼈冊鲋澈偷鞍滓氲乃俣仍黾??？鼓[瘤藥物在另外的實(shí)施方案中，這里描述的脂質(zhì)體包封的質(zhì)粒或寡核苷酸DNA進(jìn)一步包括其與包封或游離抗腫瘤劑組合用于降低腫瘤大小或限制其生長。優(yōu)選抗腫瘤劑是(i)具有雙-(2-氯乙基)-胺基的烷基化劑，如氮芥，苯丁酸氮芥，苯丙氨酸氮芥，嘧啶苯芥，甘露醇氮芥，extramustinephosphat，氧氮芥，環(huán)磷酰胺，異環(huán)磷酰胺，或trifosfamide；(ii)具有取代環(huán)乙亞胺基的烷基化劑，例如三銨嗪，噻替派，三亞胺苯醌或絲裂霉素；(iii)甲磺酸酯型的烷基化劑如白消安；(iv)烷基化N-烷基-N-亞硝基脲衍生物，例如卡莫司汀，羅氮芥，司莫司汀，或鏈脲霉素；(v)二溴甘露醇，達(dá)卡巴嗪或丙卡巴肼型的烷基化劑；(vi)絡(luò)合劑如順鉑；(vii)葉酸型抗代謝藥，例如氨甲喋呤；(viii)嘌呤衍生物如巰基嘌呤，硫鳥嘌呤，硫唑嘌呤，硫米嘌呤，阿糖腺苷，或嘌呤霉素和嘌呤核苷磷酸化酶抑制劑；(ix)嘧啶衍生物，例如氟尿嘧啶，氟尿苷，呋氟尿嘧啶，阿糖胞苷，碘苷，氟胞嘧啶；(x)抗生素如更生霉素，柔紅霉素，阿霉素，普卡霉素，博萊霉素或依托泊苷；(xi)長春堿；(xii)蛋白在癌細(xì)胞中過度表達(dá)的抑制劑如端粒酶抑制劑，谷胱苷肽抑制劑，蛋白酶體抑制劑；(xiii)信號傳導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)物或抑制劑如磷酸酶抑制劑，蛋白激酶C抑制劑，酪蛋白激酶抑制劑，胰島素樣生長因子-1受體抑制劑，fas抑制劑，ras-GAP抑制劑，蛋白酪氨酸磷酸酶抑制劑；(xiv)腫瘤血管生成抑制劑如制管張素，制瘤素，內(nèi)皮他丁，沙利度胺；(xv)免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)物和細(xì)胞因子，如干擾素，白介素，TNF-α；(xvi)胞外間質(zhì)調(diào)節(jié)物如介質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑，stromelysin抑制劑，纖溶酶原激活抑制劑；(xvii)激素依賴性癌癥的激素調(diào)節(jié)物(乳腺癌，前列腺癌)，如抗雄激素，雌激素；(xviii)編程性細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)物；(xix)bFGF抑制劑；(xx)多藥物耐受性基因抑制劑；(xxi)對抗在癌癥細(xì)胞中過度表達(dá)的抗原的單克隆抗體或抗體片段(對于乳腺癌的抗Her2/neu)；(xxii)表達(dá)將引起編程性細(xì)胞死亡，終止細(xì)胞周期，誘發(fā)對抗癌細(xì)胞的免疫反應(yīng)，抑制腫瘤血管生成，即血管系統(tǒng)形成的抗癌基因，腫瘤抑制基因(p53，RB，BRCA1，E1A，bcl-2，MDR-1，p21，p16，bax，bcl-xs，E2F，IGF-IVEGF，制管張素，制瘤素，內(nèi)皮他丁，GM-CSF，IL-12，IL-2，IL-4，IL-7，IFN-γ和TNF-α)；和(xxiii)反義寡核苷酸(反義c-fos，c-myc，K-fas)。任選這些藥物與chlormethamine，強(qiáng)地松龍，強(qiáng)的松，或丙卡巴肼組合或與放療聯(lián)合給藥。添加到廠中的未來的新抗癌藥物可望是核酶，形成三聯(lián)體的寡核苷酸，基因滅活寡核苷酸，針對控制細(xì)胞增殖或信號傳導(dǎo)途徑的基因的很多新基因，和阻斷信號傳導(dǎo)的化合物?？拱┧幬锇ò⑽骶S辛，阿柔比星，鹽酸阿考達(dá)唑，阿克羅寧，阿多來新，阿霉素，aldesleukin，六甲蜜胺，安波霉素，阿美蒽醌甲地孕酮，氨魯米特，安丫啶，anastrozole，安曲霉素，天冬酰胺酶，曲林菌素，氮胞苷，阿扎替派，含氮霉素，巴馬司他，苯佐替派，bicalutamide，鹽酸比生群，bisnafidedimesylate，bizelesin，博萊霉素硫酸鹽，brequinarsodium，溴匹立明，白消安，放線菌素C，7β17α二甲睪酮，卡醋胺，卡貝替姆，卡鉑，卡莫司汀，鹽酸洋紅霉素，carzelesin，cedefingol，苯丁酸氮芥，西羅霉素，順鉑，克拉立平，crisnatolmesylate，環(huán)磷酰胺，阿糖胞苷，達(dá)卡巴嗪，更生霉素，鹽酸柔紅霉素，decitabine，dexormaplatin，地扎呱寧，dezaguaninemesylate，地吖醌，docetaxel，阿霉素，鹽酸阿霉素，屈洛昔芬，屈洛昔芬citrate，丙酸甲雄烷酮，偶氮霉素，edatrexate，鹽酸依氟鳥氨酸，elsamitrucin，enloplatin，恩普氨酯，雙環(huán)氧派啶，鹽酸表柔比星，erbulozole，鹽酸依索比星，雌二醇氮芥，雌二醇氮芥磷酸鈉，依他硝唑，依托泊苷，磷酸依托泊苷，氯苯乙嘧胺，鹽酸法唑，法扎拉濱，芬維A胺，氟尿苷，磷酸氟達(dá)拉濱，氟尿嘧啶，氟環(huán)胞苷，fosquidone，磷曲星sodium，gemcitabine，gemcitabinehydrochloride，羥基脲，鹽酸伊達(dá)比星，異環(huán)磷酰胺，伊莫福斯，干擾素α-2a，干擾素α-2b，干擾素α-nl，干擾素α-n3，干擾素β-ia，干擾素γ-ib，異丙鉑，irinotecanhydrochloride，lanreotideacetate，letrozole，醋酸亮丙瑞林，liarozolehydrochloride，lometrexolsodium，羅氮芥，losoxantronehydrochloride，馬索丙考，美坦素，鹽酸氮芥，醋酸甲地孕酮，醋酸美侖孕酮，美法侖，美諾立爾，巰基嘌呤，氨甲喋呤，氨甲喋呤鈉，氯苯氨啶，美妥替派，米丁度胺，mitocarcin，絲裂紅素，米托菌素，米托馬星，絲裂霉素，米托司培，米托坦，鹽酸米托蒽醌，霉酚酸，諾考達(dá)唑，諾加霉素，ormaplatin，奧昔舒侖，紫杉醇，天門冬酰胺酶，佩里霉素，溴新斯的明，硫酸培洛霉素，過磷酰胺，哌泊溴烷，哌泊舒凡，piroxantronehydrochloride，普卡霉素，plomestane，卟菲爾鈉sodium，泊非霉素，潑尼莫斯汀，潑尼松，鹽酸丙卡巴肼，嘌呤霉素，鹽酸嘌呤霉素，吡唑霉素，利波腺苷，洛太米特，safingol，safingolhydrochloride，司莫司汀，辛曲秦，sparfosatesodium，司帕霉素，鹽酸螺旋鍺，螺莫司汀，螺鉑，鏈黑霉素，鏈脲霉素，sulofenur，他利霉素，紫杉酚，tecogalansodium，呋氟尿嘧啶，teloxantronehydrochloride，temoporfin，替尼泊苷，替羅昔隆，睪內(nèi)酯，硫咪嘌呤，硫鳥嘌呤，噻替派，噻唑呋林，tirapazamine，鹽酸托泊替堪，托瑞米芬citrate，醋酸曲托龍，曲西立濱phosphate，三甲曲沙，曲美沙特glucuronate，曲普瑞林，鹽酸妥布氯唑，尿嘧啶芥末，烏瑞替哌，vapreotide，verteporfin，硫酸長春堿，硫酸長春新堿，長春地辛，硫酸長春地辛，硫酸長春匹定，硫酸長春甘酯，硫酸環(huán)氧長春堿，長春瑞賓tartrate，硫酸異長春堿，硫酸長春利定，伏羅唑，折尼拉汀，凈司他丁，鹽酸佐柔比星。其它抗癌藥物包括20-表-1，25二羥基維生素D3，5-ethynyluracil，abiraterone，阿柔比星，acylfulvene，adecypenol，阿多來新，aldesleukin，ALL-TK拮抗劑，六甲蜜胺，安巴司丁，amidox，氨磷汀，aminolevulinicacid，amrubicin，安丫啶，阿那格雷，anastrozole，穿心蓮內(nèi)酯，血管生成抑制劑，拮抗劑D，拮抗劑G，安雷利克斯，anti-dorsalizing形態(tài)發(fā)生蛋白-1，抗雄激素，抗雌激素，抗瘤酮，反義寡核苷酸，甘氨酸阿飛迪霉素，編程性細(xì)胞死亡基因調(diào)節(jié)物，編程性細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)物，脫嘌呤核酸，ara-CDP-DL-PTBA，精氨酸脫氨酶，asulacrine，阿他美坦，阿曲氮芥，axinastatin1，axinastatin2，axinastatin3，阿扎西隆，azatoxin，azatyrosine，漿果赤霉素III衍生物，balanol，巴馬司他，BCR/ABL拮抗劑，benzochlorins，benzoylstaurosporine，β內(nèi)酰胺衍生物，beta-alethine，betaclamycinB，樺木酸，bFGF抑制劑，bicalutamide，比生群，bisaziridinylspermine，bisnafide，bistrateneA，bizelesin，breflate，溴匹立明，布多替鈦，buthioninesulfoximine，鈣泊三醇，calphostinC，喜樹堿衍生物，canarypoxIL-2，capecitabine，carboxamide-氨基-三唑，carboxyamidotriazole，CaRestM3，CARN700，來自軟骨的衍生物，carzelesin，酪蛋白激酶抑制劑(ICOS)，粟精胺，殺菌肽B，西曲瑞利克斯，chlorlns，chloroquinoxalinesulfonamide，西卡前列素，順卟啉，克拉立平，氯米芬類似物，克霉唑，collismycinA，collismycinB，combretastatinA4，combretastatin類似物，conagenin，crambescidin816，crisnatol，cryptophycin8，cryptophycinA衍生物，curacinA，cyclopentanthraquinones，cycloplatam，cypemycin，阿糖胞苷ocfosfate，細(xì)胞溶解因子，磷酸己烷雌酚，dacliximab，decitabine，dehydrodidemninB，deslorelin，dexifosfamide，地拉佐生，dexverapamil，地吖醌，didemninB，didox，diethylnorspermine，二氫-5-氮胞苷，dihydrotaxol，9-dioxamycin，diphenylspiromustine，二十二醇，dolasetron，去氧氟尿苷，屈洛昔芬，屈大麻酚，duocarmycinSA，依布硒啉，ecomustine，edelfosine，edrecolomab，依氟鳥氨酸，欖香烯，emitefur，表柔比星，epristeride，雌二醇氮芥類似物，雌激素激動劑，雌激素拮抗劑，依他硝唑，磷酸依托泊苷，依西美坦，法唑，法扎拉濱，芬維A胺，非爾司亭，finasteride，flavopiridol，flezelastine，fluasterone，氟達(dá)拉濱，fluorodaunorunicinhydrochloride，福酚美克，福麥斯坦，磷曲星，福莫司汀，gadolinium，枸櫞酸鎵texaphyrin，galocitabine，ganirelix，明膠酶抑制劑，gemcitabine，谷胱苷肽抑制劑，hepsulfam，heregulin，環(huán)己烷bisacetamide，金絲桃素，ibandronicacid，伊達(dá)比星，idoxifene，idramantone，伊莫福新，ilomastat，imidazoacridones，imiquimod，免疫刺激肽，胰島素樣生長因子1受體，抑制劑，干擾素激動劑，干擾素，白介素，碘芐胍，碘阿霉素，ipomeanol，4-，irinotecan，iroplact，伊索格拉定，isobengazole，isohomohalicondrinB，itasetron，jasplakinolide，kahalalideF，lamellarin-Ntriacetate，lanreotide，leinamycin，來諾拉提，硫酸香菇多糖，leptolstatin，letrozole，白血病抑制因子，白細(xì)胞α干擾素，leuprolide+雌激素+孕激素，亮丙瑞林，左旋咪唑，liarozole，線性聚胺類似物，親脂二糖肽，親脂鉑化合物，lissoclinamide7，lobaplatin，蚯蚓磷脂，lometrexol，氯尼達(dá)明，losoxantrone，洛伐他汀，羅唑利賓，lurtotecan，lutetiumtexaphyrin，lysofylline，溶解肽，美坦新，mannostatinA，marimastat，馬索丙考，maspin，matrilysin抑制劑，間質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑，美諾立爾，merbarone，meterelin，methioninase，胃復(fù)安，MIF抑制劑，米非司酮，米爾佛森，mirimostim，錯(cuò)配雙鏈RNA，米托胍腙，二溴衛(wèi)矛醇，絲裂霉素類似物，米托萘胺，mitotoxin成纖維細(xì)胞生長因子-saporin，米托蒽醌，mofarotene，莫拉司丁，單克隆抗體，人絨毛膜促性腺激素，單磷脂酰脂質(zhì)A十分枝桿菌細(xì)胞壁sk，單哌潘生丁，多藥物耐性基因抑制劑，基于多腫瘤抑制劑1的治療，芥末抗癌劑，mycaperoxideB，分枝桿菌細(xì)胞壁提取物，myriaporone，Nacetyldinaline，N-取代苯甲酰胺，那法瑞林，nagrestip，納洛酮+鎮(zhèn)痛新，napavin，naphterpin，nartograstim，nedaplatin，nemorubicin，neridronicacid，中性內(nèi)肽酶，尼魯米特，nisamycin，一氧化氮調(diào)節(jié)物，硝基氧抗氧化劑，nitrullyn，06-benzylguanine，奧曲肽，okicenone，寡核苷酸，onapristone，奧丹亞龍，奧丹亞龍，oracin，口服細(xì)胞因子誘導(dǎo)劑，ormaplatin，osaterone，奧沙利鉑，oxaunomycin，紫杉醇類似物，紫杉醇衍生物，palauamine，palmitoylrhizoxin，pamidronicacid，panaxytriol，panomifene，parabactin，帕折普汀，天門冬酰胺酶，peldesine，戊聚糖聚硫酸鈉，噴司他丁，pentrozole，perflubron，過磷酰胺，perillylalcohol，phenazinomycin，乙酸苯酯，磷酸酶抑制劑，溶鏈菌，鹽酸毛果蕓香堿，吡柔比星，吡曲克辛，placetinA，placetinB，纖溶酶原激活抑制劑，鉑復(fù)合體，鉑化合物，鉑三胺復(fù)合體，卟菲爾鈉sodium，甲基絲裂霉素，丙基雙丫啶酮，前列腺素J2，蛋白酶體抑制劑，基于蛋白A的免疫調(diào)節(jié)物，蛋白激酶C抑制劑，microalgal.，蛋白酪氨酸磷酸酶抑制劑，嘌呤核苷磷酸化酶抑制劑，紅紫素，pyrazoloacridine，吡醇羥乙酯血紅蛋白聚氧化乙烯綴合物，raf拮抗劑，raltitrexed，ramosetron，ras法尼蛋白轉(zhuǎn)移酶抑制劑，ras抑制劑，ras-GAP抑制劑，脫甲基retelliptine，錸Re186羥乙磷酸鹽，rhizoxin，核酶，RIIretinamide，洛太米特，rohitukine，羅莫肽，羅喹美克，rubiginoneB1，ruboxyl，safingol，saintopin，SarCNU，sarcophytolA，沙莫司亭，Sdi1模擬物，司莫司汀，變老衍生抑制劑1，正義寡核苷酸，信號傳導(dǎo)抑制劑，信號傳導(dǎo)調(diào)節(jié)物，單鏈抗原結(jié)合蛋白，西佐喃，sobuzoxane，sodiumborocaptate，乙酸苯酯鈉，solverol，促生長因子結(jié)合蛋白，sonermin，sparfosicacid，spicamycinD，螺莫司汀，splenopentin，spongistatin1，squalamine，干細(xì)胞抑制劑，干細(xì)胞分裂抑制劑，stipiamide，stromelysin抑制劑，sulfinosine，超活性血管腸肽拮抗劑，suradista，蘇拉明，八氫吲嗪三醇，合成糖胺聚糖，tallimustine，甲碘化三苯氧胺，牛磺莫司汀，tazarotene，tecogalansodium，呋氟尿嘧啶，tellurapyrylium，端粒酶抑制劑，temoporfin，替莫唑胺，替尼泊苷，tetrachlorodecaoxide，tetrazomine，thaliblastine，沙利度胺，thiocoraline，thrombopoietin，thrombopoietin模擬物，thymalfasin，胸腺生成素受體激動劑，thymotrinan，甲狀腺刺激激素，tinethyletiopurpurin，tirapazamine，二氯環(huán)戊二烯鈦，托泊替堪，topsentin，托瑞米芬，totipotent干細(xì)胞因子，翻譯抑制劑，維A酸，三乙酰尿苷，曲西立濱，三甲曲沙，曲普瑞林，托比色創(chuàng)，turosteride，酪氨酸激酶抑制劑，tyrphostins，UBC抑制劑，烏苯美司，泌尿生殖竇衍生生長抑制因子，尿激酶受體拮抗劑，vapreotide，variolinB，velaresol，veramine，verdins，verteporfin，長春瑞賓，vinxaltine，vitaxin，伏羅唑，zanoterone，折尼拉汀，zilascorb，凈司他丁stimalamer。pH敏感性肽-DNA復(fù)合體在本發(fā)明的另外的實(shí)施方案中，提出質(zhì)粒DNA中的基因與促融合肽/NLS綴合物相互作用。在另外的實(shí)施方案中，NLS部分是在大約5至6的pH時(shí)能夠呈現(xiàn)凈正電荷和在pH7以上時(shí)顯示降低或完全釋放這個(gè)電荷的一段組氨酰殘基。這些正電荷肽與負(fù)電荷質(zhì)粒DNA分子間在pH5-6建立的靜電相互作用，在生理pH時(shí)變?nèi)?pH敏感性肽-DNA復(fù)合體)。本發(fā)明的第一步包括帶組氨酰/促融合肽綴合物的質(zhì)?；蚬押塑账酓NA和脂質(zhì)成分之間在10-90％乙醇中，pH5.0至6.0形成復(fù)合體。條件應(yīng)該是組氨酰殘基具有凈正電荷和可建立與質(zhì)粒，寡核苷酸或負(fù)電荷藥物間的靜電相互作用。同時(shí)，正電荷脂質(zhì)分子存在可促進(jìn)微膠粒形成。第二步中，用水稀釋并與預(yù)先制備的脂質(zhì)體或脂質(zhì)在pH5-6混合使得微膠粒轉(zhuǎn)換到脂質(zhì)體中。之后在pH7下透析并通過膜擠出，包入和包封質(zhì)?；蚬押塑账岬礁弋a(chǎn)量。然而，第一步中肽和陽離子脂質(zhì)的成分提供了內(nèi)雙層的脂質(zhì)，添加到第2步中的脂質(zhì)體或脂質(zhì)類型提供了最終脂質(zhì)體制劑的外包被層(圖1)。肽制劑的實(shí)例包括HHHHHSPSL16(SEQIDNO623)和HHHHHSPS(LAI)5(SEQIDNO624)。以1∶0.5∶0.5摩爾比(DNA上的負(fù)電荷陽離子脂質(zhì)體組氨酸肽)添加。肽以α螺旋構(gòu)象插入脂質(zhì)雙層內(nèi)側(cè)且不僅進(jìn)行DNA凝聚，也賦予復(fù)合體膜融合性能以改善通過細(xì)胞膜的入口。肽鏈中疏水氨基酸的類型(例如，芳香氨基酸的含量)非常重要如同肽鏈長度確保復(fù)合體的整體性和剛性。用與脂質(zhì)綴合的聚乙二醇、透明質(zhì)酸和其它聚合物包裹復(fù)合體的外表面使得顆粒具有在體液中長時(shí)間循環(huán)的性能和在靜脈內(nèi)注射后導(dǎo)向?qū)嶓w腫瘤和它們的轉(zhuǎn)移灶的能力，以及穿過腫瘤細(xì)胞膜能力的顆粒。肽中NLS和促融合部分之間的蛋白酶敏感性連接微膠粒轉(zhuǎn)換到脂質(zhì)體中本發(fā)明一個(gè)重要的問題是在乙醇存在下，DNA和陽離子脂質(zhì)間形成的微膠粒轉(zhuǎn)換到脂質(zhì)體中。這是將微膠粒復(fù)合體直接添加到預(yù)先形成的脂質(zhì)體含水溶液中完成的。脂質(zhì)體具有80-160nm的平均大小或反之亦然，使得最終乙醇溶液濃度低于10％。適合藥物用途和注射給人和動物的制劑將需要脂質(zhì)體是PEG包裹的中性成分(如膽固醇，PE，PC)。然而，另一個(gè)重要的方面是本發(fā)明的研究應(yīng)用，如轉(zhuǎn)染培養(yǎng)物中的細(xì)胞。脂質(zhì)體含水溶液的成分是含陽離子脂質(zhì)和因此適合轉(zhuǎn)染培養(yǎng)物中的細(xì)胞的任何類型脂質(zhì)體，如DDABDOPE1∶1。這些脂質(zhì)體是預(yù)先形成的且用超聲處理或擠出通過膜小型化至直徑80-160nm。乙醇微膠粒制劑接著添加到脂質(zhì)體含水溶液中，伴隨乙醇溶液稀釋到低于10％。這一步將使DNA進(jìn)一步凝聚或DNA上的負(fù)電荷磷酸基與脂質(zhì)上的正電荷基團(tuán)間的相互作用。必須注意應(yīng)只有部分DNA上的負(fù)電荷被微膠粒中的脂質(zhì)所中和。剩余的DNA電荷中和由在第二步中預(yù)先形成的脂質(zhì)體的陽離子成分來提供。調(diào)控DNA和細(xì)胞核間質(zhì)附著的DNA本發(fā)明另外的實(shí)施方案中，質(zhì)粒DNA中的基因由使用鳥槍選擇方法從細(xì)胞核間質(zhì)附著的DNA中分離的調(diào)控DNA序列來驅(qū)動。染色質(zhì)的致密結(jié)構(gòu)組織和各個(gè)染色體在細(xì)胞內(nèi)的適當(dāng)空間取向部分是由細(xì)胞核間質(zhì)提供的。細(xì)胞核間質(zhì)由DNA，RNA和蛋白組成，是細(xì)胞核中DNA復(fù)制，基因轉(zhuǎn)錄，DNA修復(fù)和染色體附著的部位。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多樣的DNA序列組與細(xì)胞核間質(zhì)關(guān)聯(lián)并稱作間質(zhì)附著區(qū)域或MARs。MARs執(zhí)行很多功能，作為基因轉(zhuǎn)錄的激活劑，基因表達(dá)的沉默子，轉(zhuǎn)錄活性的隔離物，細(xì)胞核保留信號和DNA復(fù)制起點(diǎn)。當(dāng)前的研究表明在不同組織類型中發(fā)現(xiàn)不同亞組MARs并可能協(xié)助調(diào)節(jié)細(xì)胞的特殊功能。間質(zhì)中這種結(jié)構(gòu)和調(diào)控分子的復(fù)合體分類的存在，以及DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄復(fù)合體原位定位在間質(zhì)中強(qiáng)烈表明細(xì)胞核間質(zhì)在細(xì)胞核過程中起著基礎(chǔ)的獨(dú)特的作用。基因組結(jié)構(gòu)化為結(jié)構(gòu)域具有功能意義?；騻鬟f載體中包括特殊MAR元件在很多實(shí)驗(yàn)和基因治療應(yīng)用中可具有實(shí)用性。很多基因治療應(yīng)用需要一個(gè)或多個(gè)基因在目的細(xì)胞類型中特異性表達(dá)延長的一段時(shí)間。載體內(nèi)的MARs可增強(qiáng)導(dǎo)入的轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄，延長那個(gè)序列在細(xì)胞核內(nèi)的保留或?qū)⒛莻€(gè)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)與共同轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因表達(dá)相隔離(綜述見Boulikas，1995；Bodeetal，1996)。已經(jīng)使用各種生物化學(xué)步驟鑒定基因內(nèi)的調(diào)控區(qū)域。傳統(tǒng)地，調(diào)控DNA序列的鑒定和選擇依賴于冗長步驟如體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子足跡法，或從報(bào)道基因上游的較大基因組DNA序列亞克隆較小片段。這些方法最初已經(jīng)用于鑒定最接近基因5’末端的區(qū)域。然而，在很多情況下，發(fā)現(xiàn)調(diào)控區(qū)域在與基因最接近的5’末端有相當(dāng)大距離的地方，并提供細(xì)胞類型或發(fā)育階段的特異性。例如，Grosveld和Engel(Lakshmanan等人，1999)組的研究表明GATA-3基因位周圍的625kb以上的基因組序列是轉(zhuǎn)基因小鼠中基因正確發(fā)育表達(dá)所需要的。發(fā)現(xiàn)基因上游5-20kb距離的延伸DNA序列段負(fù)責(zé)表達(dá)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)特異性?；蛏嫌?0至130kb間的區(qū)域含有GATA-3泌尿生殖系特異性表達(dá)的調(diào)控區(qū)域，而基因下游90-180kb的序列提供心內(nèi)特異性表達(dá)。目前公開的方法具有快速鑒定調(diào)控區(qū)域的潛力。在細(xì)胞中，染色質(zhì)環(huán)形成，不同的附著區(qū)域用于不同的細(xì)胞類型或發(fā)育階段以調(diào)節(jié)基因表達(dá)。目前公開的基于它們與細(xì)胞核間質(zhì)的附著而分離調(diào)控區(qū)域的方法可鑒定調(diào)控區(qū)域而不考慮它們與基因的距離。盡管人類基因組計(jì)劃預(yù)期到2000年基本完成，但不能得到有關(guān)估計(jì)的500,000個(gè)調(diào)控區(qū)域的絕大多數(shù)的位置和性質(zhì)的信息。實(shí)施例1質(zhì)粒DNA與各種試劑，以及各種陽離子脂質(zhì)體制劑凝聚。凝聚影響轉(zhuǎn)染K562人紅白血病細(xì)胞培養(yǎng)物后β-半乳糖苷酶報(bào)道基因的表達(dá)水平。脂質(zhì)體成分在下表和圖2中顯示。所有脂質(zhì)來自AvantiPolarLipids(700IndustrialParkDrive，Alabaster，AL35007)。脂質(zhì)與DNA的最佳比例是7nmol總脂質(zhì)/μgDNA。將轉(zhuǎn)染試劑(10μgDNA與70nmol總脂質(zhì)混合)轉(zhuǎn)移到小培養(yǎng)瓶中，隨后添加10mlK562細(xì)胞培養(yǎng)物(總細(xì)胞大約2百萬)；在DNA與脂質(zhì)體混合后5-10分鐘，細(xì)胞與轉(zhuǎn)染試劑混合。在轉(zhuǎn)染后1-30天，檢測幾次細(xì)胞的β-半乳糖苷酶活性。轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為正常細(xì)胞培養(yǎng)物維持在細(xì)胞培養(yǎng)物中。當(dāng)用于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞數(shù)量低，不接近融合時(shí)，得到最好結(jié)果。在所有實(shí)驗(yàn)中，在血清和抗生素存在下，不去除轉(zhuǎn)染試劑或洗滌細(xì)胞，直接加入轉(zhuǎn)染材料。這簡化了轉(zhuǎn)染步驟并適合淋巴樣細(xì)胞和不貼附平皿但在懸液中生長的其它類型細(xì)胞培養(yǎng)物。所有DNA凝聚劑購自Sigma。它們以0.1mg/ml懸浮于水中。質(zhì)粒pCMVβ購自Clontech并使用AltheaTechnologies的Anaconda試劑盒(SanDiego，CA)純化。聚K是聚賴氨酸，分子量9400。聚R是聚精氨酸。聚H是聚組氨酸。向100μl質(zhì)粒溶液(10μg總質(zhì)粒DNA)中加入20μl或50μl聚K，聚R，聚H；用水將體積調(diào)節(jié)到250μl，隨后加入大約70μl脂質(zhì)體(7nmol/μgDNA)。在20℃溫育10分鐘至1小時(shí)后，使轉(zhuǎn)染混合物接觸細(xì)胞培養(yǎng)物。與普及的聚賴氨酸相比，最好的DNA凝聚劑是聚組氨酸。最好的陽離子脂質(zhì)是DC-膽固醇(DC-CHOL3β[N-(N’，N’-二甲基氨基乙烷)甲氨酰]膽固醇)。SFV是表達(dá)β-半乳糖苷酶的賽姆利基森林病毒。結(jié)果在圖2中顯示。實(shí)施例2使用基因載體(Lipogenes)將基因?qū)蚰[瘤如圖3所示，將人MCF-7乳腺癌細(xì)胞，在兩個(gè)部位皮下植入SCID(嚴(yán)重組合免疫缺陷)小鼠。在接種后大約30天，允許細(xì)胞發(fā)育到大的可測量的實(shí)體腫瘤。每只攜帶細(xì)菌β-半乳糖苷酶報(bào)道基因的小鼠腹膜內(nèi)注射0.2mg質(zhì)粒pCMVβDNA(質(zhì)粒大小是～4kb)。質(zhì)粒DNA(200μg，2.0mg/ml，0.1ml)與200μl由40％膽固醇，20％二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)，12％棕櫚酰油酰卵磷脂(POPC)，10％氫化大豆卵磷脂(HSPC)，10％二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)，5％鞘磷脂(SM)和3％衍生的形成囊泡的脂質(zhì)M-PEG-DSPE組成的中性脂質(zhì)體溫育5分鐘。在這個(gè)階段，質(zhì)粒DNA與中性(兩性離子)脂質(zhì)體發(fā)生弱復(fù)合。這確保了添加陽離子脂質(zhì)體的隨后步驟中，質(zhì)粒DNA均勻分布到脂質(zhì)體中。質(zhì)粒DNA與兩性離子脂質(zhì)體復(fù)合后，加入50μl陽離子脂質(zhì)體(DC-Chol1μmole/mlDOPE1.4μmole/ml)并在室溫溫育10分鐘。在這個(gè)階段，存在混合脂質(zhì)體群體，最可能是形成了一種類型含來自兩性離子和陽離子脂質(zhì)的脂質(zhì)的脂質(zhì)體-DNA復(fù)合體。將材料注射(0.35ml總體積)到動物的腹膜內(nèi)腔。注射后5天，殺死動物，去除皮膚，尸體在X-gal染色溶液中37℃溫育大約30分鐘。動物在定影液X-gal染色溶液中溫育大約30分鐘(100μl濃縮的戊二醛添加到30mlX-gal染色溶液中)并在染色溶液中繼續(xù)溫育。在溫育期間經(jīng)過一定的時(shí)間照像顯示β-半乳糖苷酶表達(dá)發(fā)生的優(yōu)選器官。由于圖3E顯示了腫瘤血管系統(tǒng)導(dǎo)向，所以數(shù)據(jù)暗示制管張素，內(nèi)皮他丁或制瘤素基因轉(zhuǎn)移到腫瘤(它們的基因產(chǎn)物限制血管生長和抑制給腫瘤供血)可望成為癌癥治療的合理方法。而且，使用抗癌lipogenes與包封的藥物裝入導(dǎo)向腫瘤的脂質(zhì)體的組合治療看來是合理的癌癥療法。應(yīng)該理解的是盡管已經(jīng)結(jié)合上面的實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但是前述說明書和下列實(shí)施例旨在闡述而非限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明范圍內(nèi)的其它方面，優(yōu)點(diǎn)和改進(jìn)對本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是顯而易見的。表3簡單NLS表4“二分”或“斷裂”NLS表5缺乏精氨酸/賴氨酸簇的“非正NLS”表6核仁定位信號(NoLS)表7非膜蛋白激酶上的親核簇表8DNA修復(fù)蛋白上的細(xì)胞核定位信號表9轉(zhuǎn)錄因子中的NLS表10其它細(xì)胞核蛋白中的NLS參考資料U.S.PatentDocuments4,394,448July，1983Szoka，Jr.etal.4,598,051July，1986Papahadjopoulosetal.5,013,556May，1991Woodleetal.JournalArticlesAllen，T.M.andChonn，A.(1987)“LargeunilamellarliposomeswithloWuptakeintothereticuloendothelialsystem”FEBSLett.22342-46.Allen，T.M.etal.(1991)“Liposomescontainingsyntheticlipidderivativesofpolyethyleneglycolshowprolongedcirculationhalf-livesinvivo”Biochim.Biophys.Acta106629-36.Anderson，W.F.(1992)“Humangenetherapy”Science256808-813.Aoki，K.etal.(1995)“Liposome-mediatedinvivogenetransferofantisenseK-rasconstructinhibitspancreatictumordisseminationinthemurineperitonealcavity”CancerRes.553810-3816.Arcasoy，S.M.etal.(1997)“Polycationsincreasetheefficiencyofadenovirus-mediatedgenetransfertoepithelialandendothelialcellsinvitro”GeneTher.432-38.Beauchamp，C.O.etal.(1983)“Anewprocedureforthesynthesisofpolyethyleneglycol-proteinadducts；effectsonfunction，receptorrecognition，andclearanceofsuperoxidedismutase，laetoferrin，andalpha2-macroglobulin”Anal.Biochem.13125-33.Bongartz，J.-P.etal.(1994)“Improvedbiologicalactivityofantisenseoligonucleotidesconjugatedtoafusogenicpeptide”Nucl.AcidsRes.224681-4688.Boulikas，T.(1993)“Nuclearlocalizationsignals(NLS)”Crit.Rev.Eukar.GeneExpression3193-227.Boulikas，T.(1994)“Putativenuclearlocalizationsignals(NLS)inproteintranscriptionfactors”J.Cell.Biochem.5532-58.Boulikas，T.(1996a)“Cancergenetherapyandimmunotherapy”Intl.J.Oncol.9941-954.Boulikas，T.(1996b)“Genetherapytohumandiseasesexvivoandinvivostudies”IntL.J.Oncol.91239-1251.Boulikas，T.(1996c)“LiposomeDNAdeliveryanduptakebycells”O(jiān)ncol.Rep.3989-995.Boulikas，T.(1996d)“Nuclearimportofproteinkinasesandcyclins”J.Cell.Biochem.6061-82.Boulikas，T.(1997a)“Genetherapyofprostatecancerp53，suicidalgenes，andothertargets”AnticancerRes.171471-1506.Boulikas，T.(1997b)“NuclearimportofDNArepairproteins”AnticancerRes.17843-864.Boulikas，T.(1997c)“NuclearlocalizationsignalpeptidesfortheimportofplasmidDNAingenetherapy”Int.J.Oncol.10301-309.Boulikas，T.(1998a)“Statusofgenetherapyin1997Molecularmechanisms，diseasetargets，andclinicalapplications”GeneTher.Mol.Biol.11-172.Boulikas，T.(1998b)“NucleocytoplasmictraffickingimplicationsforthenuclearimportofplasmidDNAduringgenetherapy”GeneTher.Mol.Biol.1713-740.Boulikas，T.andMartin，F(xiàn).(1997)“Histones，protamine，andpolylysinebutnotpoly(EK)enhancetransfectionefficiency”Int.J.Oncol.10317-322.Capaccioli，S.etal.(1993)“Cationiclipidsimproveantisenseoligonucleotideuptakeandpreventdegradationinculturedcellsandinhumanserum”Biochem.Biophys.Res.Comm.197818-825.Creuzenet，C.etal.(1997)“Interactionofalphas2-andbeta-caseinsignalpeptideswithDMPCandDMPGliposomes”Peptides18463-472.Culver，K.W.(1996)inGeneTherapyAprimerforphysicians，SecondEdition.MaryAnnLiebert，Inc.Publications，NY，pp.1-198.Curtain，C.etal.(1999)“TheinteractionsoftheN-terminalfusogenicpeptideofHIV-1gp41withneutralphospholipids”Eur.Biophys.J.28427-436.delaMaza，A.etal.(1998)“Solubilizationofphosphatidylcholineliposomesbytheamphotericsurfactantdodecylbetaine”Chem.Phys.Lipids9471-79.Decout，A.etal.(1999)“Contnbutionofthehydrophobieitygradienttothesecondarystructureandactivityoffusogenicpeptides”Mol.Membr.Biol.16237-246.Duguid，J.G.etal.(1998)“Aphysicochemicalapproachforpredictingtheeffectivenessofpeptide-basedgenedeliverysystemsforuseinplasmid-basedgenetherapy”Biophys.J.742802-2814.Filion，M.C.andPhillips，N.C.(1997)“Toxicityandimmunomodulatoryactivityofliposomalvectorsformulatedwithcationiclipidstowardimmuneeffectorcells”Biochim.Biophys.Acta1329345-356.Fresta，M.etal.(1998)“Liposomaldeliveryofa30-merantisenseoligodeoxynucleotidetoinhibitproopiomelanocortinexpression”J.Pharm.Sci.87616-625.Gabizon，A.andPapahadjopoulos，D.(1988)“Liposomeformulationswithprolongedcirculationtimeinbloodandenhanceduptakebytumors”Proc.Natl.Acad.Sci.USA856949-6953.Gabizon，A.etal.(1989)“Pharmacokineticsandtissuelocalizationofdoxorubicinencapsulatedinstableliposomeswithlongcirculationtimes”J.Natl.CancerInst.811484-1488.Ghosh，J.K.andShai，Y.(1999)“DirectEvidencethattheN-TerminalHeptadRepeatofSendaiVirusFusionProteinParticipatesinMembraneFusion”J.Mol.Biol.292531-546.Green，M.andLoewenstein，P.M.(1988)“Autonomousfunctionaldomainsofchemicallysynthesizedhumanimmunodeficiencyvirustattransactivatorprotein”Cell551179-1188.Gupta，D.andKothekar，V.(1997)“500picosecondmoleculardynamicssimulationofamphiphilicpolypeptideAc(LKKL)4NHEtwith1，2di-mysristoyl-sn-glycero-3-phosphorylcholine(DMPC)molecules”IndianJ.Biochem.Biophys.34501-511.Hofland，H.E.J.etal.(1996)“Formationofstablecationiclipid/DNAcomplexesforgenetransfer”Proc.Natl.Acad.Sci.USA937305-7309.Jaaskelainen，I.etal.(1994)“Oligonucleotide-cationicliposomeinteractions.Aphysicochemicalstudy”Biochim.Biophys.Acta1195115-123.Judice，J.K.etal.(1997)“InhibitionofHIVtype1infectivitybyconstrainedalpha-helicalpeptidesimplicationsfortheviralfusionmechanism”Proc.Natl.Acad.Sci.USA9413426-13430.Kono，K.etal.(1993)“Fusionactivityofanamphiphilicpolypeptidehavingacidicaminoacidresiduesgenerationoffusionactivitybyalpha-helixformationandchargeneutralization”Biochin.Biophys.Acta116481-90.Lambert，G.etal.(1998)“TheC-terminalhelixofhumanapolipoproteinAIIpromotesthefusionofunilamellarliposomesanddisplacesapolipoproteinAIfromhigh-densitylipoproteins”Eur.J.Biochem.253328-338.Lambert，O.etal.(1998)“Anew“gel-like”phaseindodecylmaltoside-lipidmixturesimplicationsinsolubilizationandreconstitutionstudies”Biophys.J.74918-930.Lappalainen，K.etal.(1997)“Intracellulardistributionofoligonucleotidesdeliveredbycationicliposomeslightandelectronmicroscopicstudy”Histochem.Cytochem.45265-274.Lasic，D.(1997)inLiposomesinGeneDelivery，CRCPress，pp.1-295.Lee，S.etal.(1992)“Effectofamphipathicpeptideswithdifferentalpha-helicalcontentsonliposome-fusion”Biochim.Biophys.Acta1103157-162.Lelkes，P.I.andLazarovici，P.(1988)“Pardaxininducesaggregationbutnotfusionofphosphatidylserinevesicles”FEBSLett.230131-136.Leonard，A.N.andCohen，D.E.(1998)“Submicellarbilesaltsstimulatephosphatidylcholinetransferactivityofsterolcarrierprotein2”J.LipidRes.391981-1988.Lewis，J.G.etal.(1996)“Aserum-resistantcytofectinforcellulardeliveryofantisenseoligodeoxynucleotidesandplasmidDNA”Proc.Natl.Acad.Sci.USA933176-3181.Li，S.andHuang，L.(1997)“Invivogenetransferviaintravenousadministrationofcationiclipid-protamine-DNA(LPD)complexes”GeneTher.4891-900.Lins，L.etal.(1999)“MoleculardeterminantsoftheinteractionbetweentheC-terminaldomainofAlzheimer′sbeta-amyloidpeprideandapolipoproteinEalpha-helices”J.Neurochem.73758-769.Litzinger，D.C.etal.(1996)“Fateofcationicliposomesandtheircomplexwitholigonucleotideinvivo”Biochim.Biophys.Acta1281139-149.Lopez，O.etal.(1998)“DirectformationofmixedmicellesinthesolubilizationofphospholipidliposomesbyTritonX-100”FEBSLett.426314-318.Lusa，S.etal.(1998)“Directobservationoflipoproteincholesterolesterdegradationinlysosomes”Biochem.J.332451-457.Macosko，J.C.etal.(1997)“Themembranetopologyofthefusionpeptideregionofinfluenzahemagglutinindeterminedbyspin-labelingEPR”J.Mol.Biol.2671139-1148.Macreadie，I.G.etal.(1997)“CytotoxicityresultingfromadditionofHIV-1NefN-terminalpeptidestoyeastandbacterialcells”Biochem.Biophys.Res.Commun.232707-711.Martin，F(xiàn).andBoulikas，T.(1998)“Thechallengeofliposomesingenetherapy”GeneTher.Mol.Biol.1173-214.Martin，I.etal.(1999)“Membranefusioninducedbyashortfusogenicpeptideisassessedbyitsinsertionandorientationintotargetbilayers”Biochemistry389337-9347.Martin，I.andRuysschaert，J.M.(1997)“Comparisonoflipidvesiclefusioninducedbytheputativefusionpeptideoffertilin(aproteinactiveinsperm-eggfusion)andtheNH2-terminaldomainoftheHIV2gp41”FEBSLett.405351-355.Massari，S.andColonna，R.(1986)“Gramicidininducedaggregationandsizeincreaseofphosphatidylcholinevesicles”Chem.Phys.Lipids39203-220.Melino，S.etal.(1999)“Zn(2+)ionsselectivelyinduceantimicrobialsalivarypeptidehistatin-5tofusenegativelychargedvesicles.Identificationandcharacterizationofazinc-bindingmotifpresentinthefunctionaldomain”Biochemistry389626-9633.Midoux，P.andMonsigny，M.(1999)“Efficientgenetransferbyhistidylatedpolylysine/pDNAcomplexes”Bioconjug.Chem.10406-411.Murata，M.etal.(1991)“ModificationoftheN-terminusofmembranefusion-activepeptidesblocksthefusionactivity”Biochem.Biophys.Res.Commun.1791050-1055.Niidome，T.etal.(1997)“MembraneinteractionofsyntheticpeptidesrelatedtotheputativefusogenicregionofPH-30alpha，aproteininsperm-eggfusion”J.PeptideRes.49563-569.Pak，C.C.etal.(1999)“Elastaseactivatedliposomaldeliverytonucleatedcells”Biochim.Biophys.Acta1419111-126.Papahadjopoulos，D.etal.(1991)“StericallystabilizedliposomesImprovementsinpharmacokineticsandantitumortherapeuticefficacy”Proc.Natl.Acad.Sci.USA8811460-11464.Parente，R.A.etal.(1988)“pH-dependentfusionofphosphatidylcholinesmallvesicles.Inductionbyasyntheticamphipathicpeptide”J.Biol.Chem.2634724-4730.Partidos，C.D.etal.(1996)“Primingofmeaslesvirus-specificCTLresponsesafterimmunizationwithaCTLepitopelinkedtoafusogenicpeptide”Virology215107-110.Pecheur，E.I.etal.(1997)“Membraneanchoragebringsaboutfusogenicpropertiesinashortsyntheticpeptide”Biochemistry363773-3781.Peelman，F(xiàn).etal.(1999)“Characterizationoffunctionalresiduesintheinteffacialrecognitiondomainoflecithincholesterolacyltransferase(LCAT)”ProteinEng.1271-78.Pereira，F(xiàn).B.etal.(1997)“PermeabilizationandfusionofunchargedlipidvesiclesinducedbytheHIV-1fusionpeptideadoptinganextendedconformationdoseandsequenceeffects”Biophys.J.731977-1986.Pillot，T.etal.(1999)“Thenonfibrillaramyloidbeta-peptideinducesapoptoticneuronalcelldeathinvolvementofitsC-terminalfusogenicdomain”J.Neurochem.731626-1634.Pillot，T.etal.(1997)“SpecificmodulationofthefusogenicpropertiesoftheAlzheimerbeta-amyloidpeptidebyapolipoproteinEisoforms”Eur.J.Biochem.243650-659.Pillot，T.etal.(1997)“The118-135peptideofthehumanprionproteinformsamyloidfibrilsandinducesliposomefusion”J.Mol.Biol.274381-393.Plank，C.etal.(1996)“ActivationofthecomplementsystembysyntheticDNAcomplexesapotentialbarrierforintravenousgenedelivery”Hum.GeneTher.71437-1446.Rodriguez-Crespo，I.etal.(1994)“PredictionofaputativefusionpeptideintheSproteinofhepatitisBvirus”J.Gen.Virol.75637-639.Rodriguez-Crespo，I.etal.(1999)“Fusogenicactivityofhepadenaviruspeptidescorrespondingtosequencesdownstreamoftheputativecleavagesite”Virology261133-142.Ross，G.etal.(1996)“GenetherapyintheUnitedStatesafive-yearstatusreport”Hum.GeneTher.71781-1790.Schroeder，F(xiàn).etal.(1990)“Intermembranecholesteroltransferroleofsterolcarderproteinsandphosphatidylserine”Lipids25669-674.Schroth-Diez，B.etal.(1998)“Fusionactivityoftransmembraneandcytoplasmicdomainchimerasoftheinfluenzavirusglycoproteinhemagglutinin”J.Virol.72133-141.Schutze，W.andMuller-Goymann，C.C.(1998)“Phasetransformationofaliposomaldispersionintoamicellarsolutioninducedbydrug-loading”Pharm.Res.15538-543.Song，Y.K.etal.(1997)“Characterizationofcationicliposome-mediatedgenetransferinvivobyintravenousadministration”Hum.GeneTher.81585-1594.Sorgi，F(xiàn).L.etal.(1997)“Protaminesulfateenhanceslipid-mediatedgenetransfer”GeneTher.4961-968.Suenaga，M.etal.(1989)“Basicamphipathichelicalpeptidesinducedestabilizationandfusionofacidicandneutralliposomes”Biochim.Biophys.Acta981143-150.TaKle，G.B.etal.(1997)“DeliveryofoligoribonucleotidestohumanhepatomacellsusingcationiclipidparticlesconjugatedtoferricprotoporphyrinIX(heme)”AntisenseNucleicAcidDrugDev.7177-185.Templeton，N.S.etal.(1997)“ImprovedDNAliposomecomplexesforincreasedsystemicdeliveryandgeneexpression”NatureBiotechnol.15647-652.Thierry，A.R.andDritschilo，A.(1992)“Intracellularavailabilityofunmodified，phosphorothioatedandliposomallyencapsulatedoligodeoxynucleotidesforantisenseactivity”Nucl.AcidsRes.205691-5698.Tirosh，O.etal.(1998)“Hydrationofpolyethyleneglycol-graftedliposomes”Biophys.J.741371-1379.Torchilin，V.P.(1998)“Polymer-coatedlong-circulatingmicroparticulatepharmaceuticals”J.Microencapsul.151-19.Torchilin，V.P.etal.(1992)“Targetedaccumulationofpolyethyleneglycol-coatedimmunoliposomesininfarctedrabbitmyocardium”FASEB，J.62716-2719.Tournois，H.etal.(1990)“GramicidinAinducedfusionoflargeunilamellardioleoylphosphatidylcholinevesiclesanditsrelationtotheinductionoftypeIInonbilayerstructures”Biochemistry298297-8307.Ulrich，A.S.etal.(1999)“Ultrastructuralcharacterizationofpeptide-inducedmembranefusionandpeptideself-assemblyinthelipidbilayer”Biophys.J.77829-841.Voneche，V.etal.(1992)“The19-27aminoacidsegmentofgp51adoptsanamphiphilicstructureandplaysakeyroleinthefusioneventsinducedbybovineleukemiavirus”J.Biol.Chem.26715193-15197.Wattiaux，R.etal.(1997)“Cationiclipidsdestabilizelysosomalmembraneinvitro”FEBSLett.417199-202.Weissig，V.etal.(1998)“Accumulationofprotein-loadedlong-circulatingmicellesandliposomesinsubcutaneousLewislungcarcinomainmice”Pharm.Res.151552-1556.Zelphati，O.andSzoka，Jr.，F(xiàn).C.(1997)“Intracellulardistributionandmechanismofdeliveryofoligonueleotidesmediatedbycationiclipids”Pharm.Res.131367-1372.Zuidam，N.J.andBarenholz，Y.(1997)“Electrostaticparametersofcationicliposomescommonlyusedforgenedeliveryasdeterminedby4-heptadecyl-7-hydroxycoumarin”Biochim.Biophys.Acta1329211-222.權(quán)利要求1制備含包入治療劑的微膠粒的方法，包括(a)有效量負(fù)電荷治療劑與有效量陽離子脂質(zhì)在大約20％至大約80％乙醇中，按大約30％至大約90％負(fù)電荷原子被脂質(zhì)分子上的正電荷中和而形成靜電微膠粒復(fù)合體的比例組合；和(b)步驟a)的微膠粒復(fù)合體與有效量促融合-親核肽綴合物按大約0.0至大約0.3的比例范圍組合，由此制備含包入治療劑的微膠粒。2權(quán)利要求1的方法，其中負(fù)電荷治療劑是選自多核苷酸和負(fù)電荷藥物的治療劑。3權(quán)利要求2的方法，其中多核苷酸是DNA多核苷酸或RNA多核苷酸。4權(quán)利要求2的方法，其中多核苷酸是DNA多核苷酸。5權(quán)利要求4的方法，其中DNA多核苷酸包括質(zhì)粒DNA。6權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括在步驟a)中組合有效量的陰離子脂質(zhì)。7權(quán)利要求6的方法，其中陰離子脂質(zhì)是二棕櫚酰磷脂酰甘油(DDPG)或其衍生物。8權(quán)利要求4的方法，進(jìn)一步包括組合有效量的選自精胺、亞精胺、聚賴氨酸、聚精氨酸、聚組氨酸、聚鳥氨酸和鎂或二價(jià)金屬離子的DNA凝聚劑。9權(quán)利要求5的方法，其中質(zhì)粒DNA包括編碼p53，HSV-tk，p21，Bax，Bad，IL-2，IL-12，GM-CSF，制管張素，內(nèi)皮他丁和制瘤素的序列。10權(quán)利要求1的方法，其中陽離子脂質(zhì)選自3β-(N-(N’，N’-二甲基氨基乙烷)甲氨酰)膽固醇，二甲基雙十八烷基溴化銨(DDAB)，N-[1-(2，3-二肉豆蔻氧基)丙基]-N，N二甲基-N-(2-羥乙基)溴化銨(DMRIE)，1，2-二肉豆蔻酰-3-三甲基銨丙烷(DMTAP)，雙十八烷基氨基甘氨酰精胺(DOGS)，N-(1-(2，3-二油酰氧基)丙基)-N，N，N-三甲基氯化銨(DOTMA)，1，2-二棕櫚酰-3-三甲基銨丙烷(DPTAP)，1，2-二硬脂?；?3-三甲基銨丙烷(DSTAP)。11權(quán)利要求10的方法，其中陽離子脂質(zhì)與促融合脂質(zhì)DOPE以從約1∶1至約2∶1的摩爾比例組合。12權(quán)利要求11的方法，其中陽離子脂質(zhì)與促融合脂質(zhì)DOPE以1∶1的摩爾比例組合。13權(quán)利要求1的方法，其中促融合-親核肽是NLS肽。14權(quán)利要求13的方法，其中NLS肽是選自Seq.IDNos.20-622的肽。15權(quán)利要求1的方法，其中促融合-親核肽綴合物是單獨(dú)促融合肽。16權(quán)利要求1的方法，其中促融合-親核肽綴合物的NLS肽成分是選自Seq.IDNos.20-622的NLS肽。17權(quán)利要求1的方法，其中促融合/NLS肽綴合物包括選自(KAWLKAF)3(SEQIDNO1)，GLFKAAAKLLKSLWKLLLKA(SEQIDNO2)，LLLKAFAKLLKSLWKLLLKA(SEQIDNO3)以及原型(疏水3親核1疏水2親核1)2-3的所有衍生物的氨基酸序列，其中疏水是A，I，L，V，P，G，W，F(xiàn)中任何一個(gè)和親核是K，R或H中的任何一個(gè)，每第三個(gè)或第四個(gè)氨基酸含有正電荷殘基，形成α螺旋并使凈正電荷指向螺旋的相同方向。18權(quán)利要求1的方法，其中促融合/NLS肽綴合物包括選自來自流感病毒血細(xì)胞凝聚素HA-2的GLFKAIAGFIKNGWKGMIDGGGYC(SEQIDNO4)和來自HIV的TAT的YGRKKRRQRRR(SEQIDNO5)的氨基酸序列。19權(quán)利要求1的方法，其中促融合/NLS肽綴合物包括選自下列一組的氨基酸序列MSGTFGGILAGLIGLL(K/R/H)1-6(SEQIDNO6)，衍生于鴨乙型肝炎病毒S蛋白的N末端區(qū)但添加了一至六個(gè)正電荷賴氨酸，精氨酸或組氨酸殘基，和這些的組合，GAAIGLAWIPYFGPAA(SEQIDNO7)，衍生于埃博拉病毒跨膜蛋白的促融合肽；載脂蛋白(apo)AII肽的殘基53-70(C末端螺旋)，HIV-1跨膜糖蛋白gp41的23個(gè)殘基的促融合N末端肽，來自Alzheimer’sβ-淀粉樣肽的29-42個(gè)殘基的片段，仙臺病毒的融合肽和N末端七元重復(fù)序列，卵磷脂膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶的56-68個(gè)螺旋片段。20權(quán)利要求13至19任一項(xiàng)的方法，其中促融合/NLS肽綴合物的NLS肽成分是含上述NLS，但通過在該肽的中心部分添加了K，R，H殘基或在N或C末端添加了P或G而得到進(jìn)一步修飾的合成肽。21權(quán)利要求13的方法，其中促融合/NLS肽綴合物通過提供內(nèi)源性蛋白酶切割位點(diǎn)的短氨基酸序列段彼此連接。22權(quán)利要求1的方法，其中優(yōu)選的用于本發(fā)明的原型促融合/NLS肽綴合物的結(jié)構(gòu)是PKKRRGPSP(L/A/I)12-20(SEQIDNO8)，其中(L/A/I)12-20是12-20個(gè)含A，L，I，Y，W，F(xiàn)的疏水氨基酸和其它疏水氨基酸的序列段。23權(quán)利要求1的方法，其中促融合/NLS肽綴合物添加到DNA/陽離子脂質(zhì)混合物中并摻入到微膠粒中。24權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括向步驟b)中組合有效量的包封脂質(zhì)溶液。25權(quán)利要求24的方法，其中包封脂質(zhì)是包括膽固醇(40％)，二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)(20％)，棕櫚酰油酰卵磷脂(POPC)(12％)，氫化大豆卵磷脂(HSPC)(10％)，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)(10％)，鞘磷脂(SM)(5％)和衍生的形成囊泡的脂質(zhì)M-PEG-DSPE膽固醇(3％)的脂質(zhì)。26權(quán)利要求24的方法，其中包封脂質(zhì)是脂質(zhì)體。27權(quán)利要求26的方法，其中脂質(zhì)體包括形成囊泡的脂質(zhì)和約1至約7摩爾百分比間的與有效量聚乙二醇衍生的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)。28權(quán)利要求27的方法，其中脂質(zhì)體具有大約80至大約160nm的選定的平均大小。29權(quán)利要求27的方法，其中聚乙二醇具有大約1000至5000道爾頓的分子量。30用權(quán)利要求1的方法制備的含包入治療劑的微膠粒。31用權(quán)利要求24的方法制備的包封治療劑的脂質(zhì)體。32用權(quán)利要求31的方法，其中治療劑進(jìn)一步包括用肝、脾或骨髓調(diào)控DNA序列進(jìn)行的調(diào)節(jié)。33權(quán)利要求32的方法，其中調(diào)控DNA序列是分離自肝、脾或骨髓細(xì)胞的細(xì)胞核間質(zhì)DNA。34體內(nèi)傳遞治療劑的方法，包括給予受治療者有效量的權(quán)利要求30的微膠粒。35權(quán)利要求34的方法，其中治療劑進(jìn)一步包括用腫瘤特異性調(diào)控DNA序列進(jìn)行的調(diào)節(jié)。36權(quán)利要求35的方法，其中腫瘤特異性調(diào)控序列是分離自特定腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核間質(zhì)DNA。37體內(nèi)傳遞治療劑的方法，包括給予受治療者有效量的權(quán)利要求31的有效量包封治療劑的脂質(zhì)體。38權(quán)利要求34或37的方法，其中給藥是靜脈內(nèi)給藥或通過注射。39用權(quán)利要求9的方法制備的含包入DNA多核苷酸的微膠粒。40降低受治療者腫瘤大小的方法，包括給予受治療者有效量的權(quán)利要求39的微膠粒。41權(quán)利要求40的方法，進(jìn)一步包括給予有效量的第二種治療劑，其中治療劑選自9-[1，3-二羥-2-丙氧甲基]鳥嘌呤，5-氟胞嘧啶，反義寡核苷酸，核酶和針對控制細(xì)胞周期或信號途徑的基因的形成三聯(lián)體的寡核苷酸。42權(quán)利要求41的方法，進(jìn)一步包括給予有效量的第二種治療劑，其中第二種治療劑選自阿霉素，制管張素，硫唑嘌呤，博萊霉素，busulfane，喜樹堿，卡鉑，卡莫司汀，chlorambucile，chlormethamine，chloroquinoxaline磺胺，順鉑，環(huán)磷酰胺，cycloplatam，阿糖胞苷，達(dá)卡巴嗪，更生霉素，柔紅霉素，didox，阿霉素，內(nèi)皮他丁，enloplatin，雌二醇氮芥，依托泊苷，extramustinephosphat，氟胞嘧啶，fluorodeoxyuridine，氟尿嘧啶，硝酸鎵，羥基脲，碘苷，干擾素，白介素，leuprolide，lobaplatin，羅氮芥，甘露醇氮芥，氮芥，mechlorethaminoxide，美法侖，巰基嘌呤，氨甲喋呤，普卡霉素，mitobronitole，絲裂霉素，霉酚酸，nocodazole，制瘤素，oxaliplatin，紫杉醇，溴新斯的明，鉑-三胺復(fù)合體，普卡霉素，強(qiáng)地松龍，強(qiáng)的松，丙卡巴肼，蛋白激酶C抑制劑，puromycine，司莫司汀，信號傳導(dǎo)抑制劑，螺鉑，streptozotocine，stromelysin抑制劑，紫杉酚，呋氟尿嘧啶，端粒酶抑制劑，替尼泊苷，沙利度胺，硫咪嘌呤，thioguanine，噻替派，tiamiprine，三銨嗪，三亞胺苯醌，trifosfamide，酪氨酸激酶抑制劑，烏拉莫斯汀，阿糖腺苷，長春堿，vincaalcaloids，長春新堿，長春地辛，vorozole，折尼拉汀，zeniplatin和新制癌菌素。全文摘要公開了一種將質(zhì)粒，寡核苷酸或負(fù)電荷藥物包封到其內(nèi)和外膜雙層之間具有不同脂質(zhì)成分且在靜脈內(nèi)注射給動物和人后能夠到達(dá)原發(fā)腫瘤及其轉(zhuǎn)移灶的脂質(zhì)體中的方法。配制方法包括含陽離子脂質(zhì)分子的DNA與由大約10－20個(gè)氨基酸的疏水鏈組成的和在其一個(gè)末端也包括四個(gè)或更多組氨酸殘基或NLS的促融合/NLS肽綴合物之間形成復(fù)合體。包封的分子在根除各種固體人類腫瘤中顯示治療功效，包括但不限于乳腺癌和前列腺癌。質(zhì)粒，寡核苷酸或負(fù)電荷藥物與其它抗腫瘤藥物(正電荷順鉑，阿霉素)組合包封入脂質(zhì)體中具有治療價(jià)值。在癌癥根除中也具有治療價(jià)值的是包封的質(zhì)粒，寡核苷酸或負(fù)電荷藥物與HSV－tk加包封的9－[1，3－二羥－2－丙氧甲基]鳥嘌呤的組合。文檔編號A61K9/127GK1444472SQ01813308公開日2003年9月24日申請日期2001年6月8日優(yōu)先權(quán)日2000年6月9日發(fā)明者泰尼·布利卡斯申請人:泰尼·布利卡斯