附有dna修復(fù)抑制劑和核定位信號(hào)元件的納米顆粒的制作方法
【專利說(shuō)明】附有DNA修復(fù)抑制劑和核定位信號(hào)元件的納米顆粒
[0001] 本發(fā)明涉及放療或化療增敏復(fù)合物，其包含納米顆粒和附著于所述納米顆粒的 DNA修復(fù)抑制劑和核定位信號(hào)元件（NLS)。這樣的復(fù)合物用于治療疾病，例如癌癥。
[0002] 納米技術(shù)代表了著眼于原子和分子操作的科學(xué)領(lǐng)域，其產(chǎn)生在納米標(biāo)度范圍的新 結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)通常獲得獨(dú)特的和意外的性能。在癌癥納米技術(shù)中，焦點(diǎn)在于開(kāi)發(fā)可以診 斷、輸送治療劑、和監(jiān)測(cè)癌癥治療進(jìn)程的納米標(biāo)度設(shè)備。理論上，任何成像或治療系統(tǒng)會(huì)專 門(mén)地靶向腫瘤細(xì)胞簇或腫瘤細(xì)胞的脈管系統(tǒng)，優(yōu)選地在惡性轉(zhuǎn)化的早期具有所述能力。過(guò) 去的幾十年，我們?cè)诨A(chǔ)癌癥生物學(xué)和DNA損傷應(yīng)答的理解上看到突出的進(jìn)展（Risinger andGroden；CancerCell,6 ：539,2004 ；0rDriscollandJeggo；NatRevGenet；7 ：45, 2006,Girard,Kyselaetal；HumMolGenet13 ：1,2004,Weller,Kysela,Royetal； Science297:5527,2002)。然而這種進(jìn)展沒(méi)有伴隨著與之相當(dāng)?shù)呐R床進(jìn)步。舉例來(lái)說(shuō)，在 人類中的放射治療受益于技術(shù)進(jìn)步和計(jì)算機(jī)化，而不是基于知識(shí)來(lái)操縱癌細(xì)胞對(duì)治療性放 射的生物學(xué)應(yīng)答（Beggetal，Radiother0ncol，86:295,2008)。
[0003] 納米顆粒可用于引導(dǎo)材料進(jìn)入細(xì)胞。所述細(xì)胞吞噬和攝取所述納米顆粒以及任何 附著于所述顆粒的組分。
[0004] 申請(qǐng)人認(rèn)識(shí)到這具有促進(jìn)引導(dǎo)化療增敏和放療增敏復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞的潛力。這些 復(fù)合物許多需要靶向細(xì)胞核來(lái)起作用。因此申請(qǐng)人認(rèn)識(shí)到也有一種需求，一旦復(fù)合物在所 述細(xì)胞內(nèi)，能夠靶向引導(dǎo)它們到細(xì)胞核。
[0005] 因此，本發(fā)明提供一種放療或化療增敏復(fù)合物，其包含納米顆粒和附著于所述納 米顆粒的（i)DNA修復(fù)抑制劑；和（ii)核定位信號(hào)元件（NLS);任選地，通過(guò)一個(gè)或多個(gè)接 頭部分附著。
[0006] 所述納米顆粒直徑通常低于100nm，通常為l-50nm、5-30nm或10_15nm。
[0007] 所述DNA修復(fù)抑制劑作用為使所述細(xì)胞對(duì)于射線或化學(xué)治療劑敏感。
[0008] 所述DNA修復(fù)抑制劑和NLS可以分別附著于所述納米顆粒，任選地，通過(guò)接頭部分 附著。也就是說(shuō)，所述抑制劑和NLS可以附著于納米顆粒的不同部分?；蛘撸鯠NA抑制 劑可以通過(guò)，例如，接頭部分，附著于所述納米顆粒，并且所述NLS可以附著于所述DNA修復(fù) 抑制劑（如融合蛋白/肽）或附著于接頭部分的不同的部分，例如作為懸垂部分（pendant moiety)?；蛘撸鯪LS可以通過(guò)，例如，接頭部分，附著于所述納米顆粒，并且所述DNA修 復(fù)抑制劑可以附著于所述NLS，或所述接頭部分（例如作為懸垂部分）。
[0009] 許多放射治療劑，例如y射線或x射線，和化學(xué)治療劑（例如融合蛋白如博來(lái)霉 素），損傷靶細(xì)胞，誘導(dǎo)DNA鏈斷裂。DNA雙螺旋的一半被斷裂即發(fā)生單鏈斷裂。這樣的單 鏈斷裂相對(duì)易于通過(guò)細(xì)胞內(nèi)的DNA修復(fù)系統(tǒng)而修復(fù)。然而，可能在彼此相對(duì)的DNA螺旋的 兩條鏈上發(fā)生的雙鏈斷裂更難修復(fù)。其對(duì)于細(xì)胞特別成問(wèn)題，因?yàn)槠淇梢詫?dǎo)致基因組重排。 存在三種機(jī)制來(lái)修復(fù)雙鏈斷裂（DSB):非同源的末端連接、微同源介導(dǎo)的末端連接和同源 重組。如果鏈斷裂沒(méi)有被正確地修復(fù)或DNA雙鏈斷裂根本沒(méi)有修復(fù)，細(xì)胞經(jīng)常會(huì)在下次有 絲分裂時(shí)死亡。
[0010] 修復(fù)抑制劑是本領(lǐng)域眾所周知的。通常地，所述抑制劑可以是DNA雙鏈斷裂修復(fù) 的抑制劑，而如上討論的DSB可能殺死所述復(fù)合物所靶向的細(xì)胞或使其喪失能力。所述DNA抑制劑可以是NBS1(NijmegenBreakageSyndromel，Nibrin)。這是一種 754 個(gè)氨基酸的 蛋白質(zhì)，鑒定為NBSl/hMrell/RAD50雙鏈DNA斷裂修復(fù)復(fù)合體的成員。這個(gè)復(fù)合體識(shí)別DNA 損傷、迅速地重新定位到DSB位置并形成核焦點(diǎn)。典型的NBS1序列是KEESLADDL。
[0011] 也可以使用此抑制劑以及其他DNA修復(fù)抑制劑的片段，所述片段仍然保持DNA修 復(fù)抑制活性。
[0012] 所述DNA抑制劑可以是Ku70或其片段。Ku70是由XRCC6編碼的蛋白質(zhì)。蛋白 質(zhì)與Ku80 -起組成Ku異源二聚體，其結(jié)合到DBS端部并參與DNA修復(fù)。可以使用模擬所 述Ku80 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域的合成肽（EGGDVDDLDMI)KimetalJ.Pharmacol.Exp.Therap. (2002)303 ：353〇
[0013] PARP1 (聚[ADP-核糖]聚合酶-1)通過(guò)聚ADP-核糖基化修飾細(xì)胞核蛋白質(zhì)。它連 同BRCA參與DSB修復(fù)。另外，PARP1還參與單鏈DNA斷裂的修復(fù)?；蛘撸饕迯?fù)抑制劑可 以是Hlx或其片段。接頭組蛋白普遍存在于所有體細(xì)胞。參見(jiàn)，例如，PCT/GB2011/051180、 W0/2011/161457。
[0014] 還可以使用DNA磷酸激酶抑制劑。
[0015] 舉例來(lái)說(shuō)，所述NLS可以是腺病毒或SV40NLS，或合成的序列例如M4靶向序列。 所述M4靶向序列可以是KKKKKKGGRGDMFG。所述腺病毒NLS可以是GGFSTSLRARKA。
[0016] 還可以使用合成NLS。NLS是在本領(lǐng)域眾所周知的。上述M4靶向序列是合成肽， 所述腺病毒NLS是天然存在的靶向序列。
[0017] 所述納米顆粒通常是金屬納米顆粒，例如過(guò)渡金屬顆粒。這些包括金、鉑或鈀，或 其混合物。舉例來(lái)說(shuō)，鉑和金的優(yōu)點(diǎn)是這樣的顆粒可以通過(guò)產(chǎn)生光電子和俄歇電子增強(qiáng)電 離福射的效果（Zhengetal;Radiat.Res. (2008)，169:19，Hainfeldetal;Phys.Med. Biol. (2004)，49:N309,andBistonetal;CancerRes. (2004)，64:2317)。可以將所述 電離輻射調(diào)節(jié)到允許產(chǎn)生這樣的電子，從而增加在所靶向的細(xì)胞上的放射效果。通過(guò)放 射產(chǎn)生的電子的效果依賴于靠近DNA，因?yàn)樨?fù)責(zé)所述效果的次級(jí)電子的行進(jìn)的預(yù)期距離短 (Zhengetal(Supra)和Regullaetal(Rad.Res. (1998) 150:92)。NLS的存在幫助使所 述納米顆粒祀向所述細(xì)胞核，從而幫助納米顆粒定位靠近DNA。
[0018] 基于肽的DNA修復(fù)抑制劑和/或NLS可以通過(guò)眾所周知的系統(tǒng)附著于所述納米顆 粒上。舉例來(lái)說(shuō)，可以使用對(duì)金屬納米顆粒有親合力的接頭部分。這樣的接頭部分包括含硫 接頭例如硫辛酸、金結(jié)合肽 1(Brownetal，Nat.Biotech. (1997)，15 :269)、3R-GBP1 (其包 含3個(gè)MHGKTQATSGTIQS的結(jié)合到金和鉑表面的重復(fù)序列（Tamerleretal;Small(2006)2 : 1372))、CALNN肽（LevyR，J.Am.Chem.Soc. (2004) 126 (32)，10076-84)。
[0019] 也可以將一個(gè)或多個(gè)額外部分附著于所述復(fù)合物。舉例來(lái)說(shuō)，所述額外部分可以 使用例如上述的接頭部分直接附著于所述納米顆粒，或二者選一地，附著于所述DNA修復(fù) 抑制劑、NLS和/或它們的接頭部分。舉例來(lái)說(shuō)，一個(gè)或多個(gè)額外部分可以選自化學(xué)治療劑、 DNA交聯(lián)劑、顯像劑、造影劑和表面靶向劑?？梢允褂脙蓚€(gè)或更多個(gè)額外類型的部分。
[0020] 舉例來(lái)說(shuō)，化學(xué)治療劑可以是誘導(dǎo)DNA損傷（例如DNA單鏈或通常地雙鏈斷裂） 的藥劑。舉例來(lái)說(shuō)，博來(lái)霉素是一種通過(guò)細(xì)菌輪枝鏈霉菌（Streptomycesverticillus)產(chǎn) 生的糖肽抗生素。已知為抗癌劑，化學(xué)治療的形式主要地是博來(lái)霉素A2和B2。它通過(guò)引起 DNA斷裂來(lái)起作用。
[0021] 所述化學(xué)治療劑也可以是阿霉素。阿霉素是一種蒽環(huán)類抗生素，其通常用于治療 廣泛的癌癥，并插入到DNA中。
[0022] 可以與其他化學(xué)治療劑（包括博來(lái)霉素和calichaemycin)組合使用。另一種化 學(xué)治療劑可以是喜樹(shù)堿。喜樹(shù)堿是一種細(xì)胞毒性的喹啉生物堿，其抑制DNA酶拓?fù)洚悩?gòu)酶 I。喜樹(shù)堿和兩種類似物（托泊替康和依立替康）已經(jīng)用于癌癥化學(xué)療法。也可以使用這 樣的復(fù)合物的類似物。其它的藥劑包括氮芥類、替莫唑胺和本領(lǐng)域眾所周知的交聯(lián)劑，包括 cis-platinin(Brown et. al, J.Am.Soc. (2012) 132,4676-84)〇
[0023] 所述顯像劑可以是本領(lǐng)域眾所周知的熒光染料，如熒光黃。
[0024] 所述造影劑可以是釓、氧化鐵、錳或其它的順磁性造影劑。這些造影劑允許復(fù)合物 靶向待確診的癌癥的位置。
[0025] 所述表面靶向劑可以能夠特異性附著于癌細(xì)胞的部分。舉例來(lái)說(shuō)，該部分可以是 在癌細(xì)胞表面上發(fā)現(xiàn)的受體的配體。舉例來(lái)說(shuō)，維生素受體，例如葉酸受體，一般在許多癌 癥細(xì)胞中過(guò)表達(dá)。因此舉例來(lái)說(shuō)，所述細(xì)胞表面革G向劑可以是維生素，例如葉酸（Leamonet al，J.DrugTarget. (1999)7:157)。能夠使納米顆粒到祀向特定細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)是其幫助限制 對(duì)于正常細(xì)胞的毒副作用。舉例來(lái)說(shuō)，通過(guò)受體介導(dǎo)的胞吞作用可以使連接維生素的分子 內(nèi)在化。已經(jīng)顯示了對(duì)眾所周知的葉酸遞送的細(xì)胞毒性藥物的攝取，并且它們具有在臨床 前研宄中有前景的效果。所述維生素例如葉酸可以通過(guò)，例如，標(biāo)準(zhǔn)固相化學(xué)，與肽綴合。
[0026] 本發(fā)明的復(fù)合物可以與一個(gè)或多個(gè)藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑組合使用。它可 以用作藥物，例如所述藥物用于治療癌癥。
[0027] 還提供了一種治療對(duì)象體內(nèi)癌癥的方法，其包括施用藥學(xué)有效量的本發(fā)明的復(fù)合 物。
[0028] 所述復(fù)合物可以靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)或口服施用。可以治療腦瘤，例如通過(guò)顱骨 灌注越過(guò)血腦屏障。
[0029] 可以對(duì)所述患者另外進(jìn)行放射治療。舉例來(lái)說(shuō)，當(dāng)所述復(fù)合物包括金屬納米顆粒， 在施用所述復(fù)合物之后，所述患者可以用來(lái)自電離放射源的的放射療法來(lái)治療，所述電離 放射源調(diào)節(jié)到所述金屬納米顆粒的吸收限。如上面所討論的，這引起納米顆粒發(fā)射次級(jí)電 子。
[0030] 舉例來(lái)說(shuō)，所述電離輻射源可以是X射線源或同步加速器源。
[0031] 舉例來(lái)說(shuō)，本發(fā)明通過(guò)附著于同一顆粒的DNA損傷劑或通過(guò)經(jīng)由納米顆