通過跨越血腦屏障的納米顆粒遞送治療劑和顯像劑的方法
【專利說明】通過跨越血腦屏障的納米顆粒遞送治療劑和顯像劑的方法
[0001] 相關申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2013年5月14日提交的美國臨時專利申請61/822, 983的權益,該臨 時申請的全部內(nèi)容通過引用并入本文。
[0003] 政府權利
[0004] 本文公開的主題根據(jù)由美國國立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health) 給予的撥款號R01NS0711121和由美國國家癌癥研究所(National Cancer Institute)給 予的撥款號CA 151849在政府支持下做出。美國政府在本文公開的主題中擁有某些權利。
[0005] 背景
[0006] 在發(fā)達國家,中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system) (CNS)的慢性疾病是發(fā)病 和死亡的主要原因。在美國,單阿爾茨海默?。ˋlzheimer' s disease)就影響超過五百萬 人,并且預計在2050年前會增長至超過一千三百萬。在2012年,用于患有阿爾茨海默病的 人的護理總成本估計超過2000億美元,并且預計在未來四十年內(nèi)增長至1. 2萬億美元。此 外,在美國,雖然來自死亡的許多其他主要原因(諸如心臟疾病和中風)的死亡比例在過去 十年已發(fā)現(xiàn)顯著減少,但是來自阿爾茨海默病的死亡比例已增加了 68%。類似的趨勢,即高 經(jīng)濟成本和治療進展相對缺乏兩者,見于許多其他神經(jīng)退行性疾病,包括亨廷頓氏舞蹈癥 (Huntington' s disease)、帕金森?。≒arkinson' s disease)和多發(fā)性硬化癥(multiple sclerosis)發(fā)現(xiàn)了。
[0007] 治療這些疾病缺乏進展的重要原因是由于血腦屏障(blood-brain barrier) (BBB)的存在。BBB是CNS實質(zhì)和脈管系統(tǒng)之間的物理屏障,其在維持CNS內(nèi)的穩(wěn)態(tài)中起重 要作用。內(nèi)皮細胞之間存在緊密連接,其抑制極性分子、大分子和細胞的細胞旁路擴散。這 迫使進入CNS的溶質(zhì)運移主要發(fā)生于跨越單獨的內(nèi)皮細胞。雖然對于維持CNS穩(wěn)態(tài)至關重 要,BBB對大多數(shù)溶質(zhì)的不可透過性已證明對藥物遞送至CNS是巨大障礙。目前,98%的小 分子治療劑和基本上100 %的大分子治療劑,包括單克隆抗體、蛋白和基因療法,都不跨越 BBB0
[0008] 在由溶質(zhì)跨越BBB使用的內(nèi)源性方法中,受體介導的轉胞吞作用 (receptor-mediated transcytosis) (RMT)已經(jīng)顯示了用于藥物遞送的最大希望(見 Wiley等人,PNAS,110(21) :8662-667(2013),其通過引用以其整體并入本文)。盡管在過去 的二十多年,對開發(fā)用于遞送至腦的靶向治療劑已存在很大興趣,還尚未出現(xiàn)用于臨床研 究的可行的候選物。
[0009] 概述
[0010] 本文描述了通過向受試者施用具有納米顆粒核心和靶向劑的納米顆粒將納米顆 粒遞送至受試者腦部的方法。多種靶向劑可用來促進所述的納米顆粒的遞送。例如,靶向 劑可包含對由腦內(nèi)皮細胞表達的受體特異性的配體和將配體連接至納米顆粒核心的外表 面的銜接物。另外,當在細胞之內(nèi)時,銜接物可促進配體從納米顆粒解離。
[0011] 所述的方法可使用多種納米顆粒來進行。例如,納米顆粒核心的表面可由以下制 成:陽離子粘液酸聚合物(cationic mucic acid polymers) (cMAP)、聚乳酸-羥基乙酸共聚 物(poly(lactic-co_glycolic acid) (PLGA)、殼聚糖、合成的聚合物諸如聚乙稀亞胺、金、 氧化鐵或如由本領域技術人員所理解的其他類似材料。這些聚合物可與配體結合,所述配 體諸如轉鐵蛋白、對轉鐵蛋白受體特異性的抗體、特異性結合至轉鐵蛋白受體的多肽、胰島 素、對胰島素受體特異性的抗體、特異性結合至胰島素受體的多肽、胰島素樣生長因子1、對 胰島素樣生長因子受體1特異性的抗體或特異性結合至胰島素樣生長因子受體1的多肽。 另外,納米顆粒核心與配體可通過銜接物綴合,當在腦內(nèi)皮細胞之內(nèi)時所述銜接物促進配 體從納米顆粒解離。在一些所述的實施方案中,銜接物可包含二硫鍵,當納米顆粒在腦內(nèi)皮 細胞之內(nèi)時,所述二硫鍵可被還原導致配體從納米顆粒解離。在一些所述的實施方案中,銜 接物可包含多肽,當納米顆粒在腦內(nèi)皮細胞之內(nèi)時,所述多肽可被酶促裂解導致配體從納 米顆粒解離。在一些所述的實施方案中,銜接物可包含可水解的化學鍵,當納米顆粒在腦內(nèi) 皮細胞之內(nèi)時,所述可水解的化學鍵可在低PH下被破壞導致配體從納米顆粒解離。在一些 所述的實施方案中,銜接物可包含具有以下PKa的化學鍵,當納米顆粒在腦內(nèi)皮細胞之內(nèi) 時,所述化學鍵可在低PH下被破壞導致配體從納米顆粒解離。
[0012] 提供的方法可以用利用各種銜接物的靶向劑來進行,所述銜接物用于將配體綴合 至納米顆粒核心并且用于在腦內(nèi)皮細胞之內(nèi)后促進配體從納米顆粒核心解離。在一些實施 方案中,所述的方法可使用這樣的銜接物來進行,所述銜接物當未結合至納米顆粒時具有 硝基苯硼酸,該硝基苯硼酸在所述銜接物結合至納米顆粒核心時形成硝基苯硼酸酯,其中 銜接物和納米顆粒核心的解偶聯(lián)將在酸性PH(例如,約6. 8至約2.0)下是有利的。在另一 個實施方案中,靶向劑可包含二氨基縮酮(DAK)鍵連,在腦內(nèi)皮細胞之內(nèi)后,所述二氨基縮 酮(DAK)鍵連促進納米顆粒與配體解離,其中銜接物和納米顆粒核心的解偶聯(lián)將在酸性pH 下是有利的。另外,所述的方法可使用含具有二硫鍵的銜接物的靶向劑來進行,所述具有二 硫鍵的銜接物可在腦內(nèi)皮細胞中遇到的還原性條件下促進附連的配體從納米顆粒解離。在 一些所述的實施方案中,靶向劑包含位于配體和介導與納米顆粒核心綴合的區(qū)段之間的聚 乙二醇聚合物。
[0013] 為進行所述的方法,控制綴合至所述的納米顆粒的靶向劑的數(shù)目可以是有利的。 在一些實施方案中,所述的納米顆??删哂卸噙_1000個綴合的靶向劑。在其他實施方案 中,所述的納米顆??删哂卸噙_500個綴合的靶向劑??蛇x擇地,所述的納米顆??删哂猩?至從約20個至50個綴合的靶向劑。在還另一個實施方案中,所述的納米顆粒可具有少于 5個綴合的靶向劑。靶向劑的數(shù)目可依據(jù)被遞送的納米顆粒的種類、所遞送的靶、用于靶向 顆粒的配體或許多其他因素進行調(diào)整。
[0014] 所述方法可用于通過在將納米顆粒施用至受試者之前使所述納米顆粒負載感興 趣的治療劑或顯像劑,將治療劑或顯像劑遞送至受試者的腦部。遞送負載的納米顆粒之后, 靶向劑將促進至感興趣的靶細胞,諸如腦內(nèi)皮細胞的遞送。在由被靶細胞內(nèi)化后,納米顆粒 將從靶向劑解離。在腦內(nèi)皮細胞的情況下,內(nèi)化的納米顆粒然后將被從細胞被排出進入腦 間質(zhì)空間,在腦間質(zhì)空間,顆粒將去穩(wěn)定(destabilize)并分泌所負載的藥劑物質(zhì),從而將 藥劑物質(zhì)遞送到腦部或其他靶位置。在一些實施方案中,可進行所述的方法以將神經(jīng)遞質(zhì) 神經(jīng)遞質(zhì)諸如5-羥色胺或多巴胺遞送至腦部,所述神經(jīng)遞質(zhì)神經(jīng)遞質(zhì)可被用來治療神經(jīng) 紊亂。用于治療神經(jīng)紊亂的其他物質(zhì)還可經(jīng)由所述的方法遞送至腦部。自身可能不容易進 入腦部的顯像劑也可使用所述的方法進行遞送。此外,可使用所述的方法將一個或更多個 治療劑、顯像劑或治療劑和顯像劑兩者的組合遞送至受試者的腦部。
[0015] 本文還描述了用于產(chǎn)生靶向遞送至腦部的納米顆粒的試劑盒。例如,所述的試劑 盒可包含:組裝納米顆粒的材料和試劑,所述納米顆粒具有陽離子粘液酸聚合物(cMP)外 表面或聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)外表面,對由腦內(nèi)皮細胞表達的受體特異性的靶 向劑,其中靶向劑包含被綴合至銜接物的配體,所述銜接物在腦內(nèi)皮細胞內(nèi)部時導致配體 從納米顆粒解離;以及用于組裝納米顆粒的說明書。所述的試劑盒還可包含靶向腦內(nèi)皮細 胞的配體,諸如轉鐵蛋白、對轉鐵蛋白受體特異性的抗體、特異性結合至轉鐵蛋白受體的多 肽、胰島素、對胰島素受體特異性的抗體、特異性結合至胰島素受體的多肽、胰島素樣生長 因子1、對胰島素樣生長因子受體1特異性的抗體、特異性結合至胰島素樣生長因子受體1 的多肽。
[0016] 附圖簡述
[0017] 圖1用于將治療劑和/或顯像劑遞送至腦實質(zhì)的總體設計圖。納米顆粒具有三個 基本的設計組分:(1)納米顆粒核心;(2)間隔分子;以及(3)靶向劑。
[0018] 圖2被革巴向的納米顆粒(targeted nanoparticle)穿過血腦屏障(BBB)的運輸, 該運輸由靶向分子脫離納米顆粒所促進。(1)血液中被靶向的納米顆粒到達BBB腔表面。 (2)納米顆粒的配體結合至其在BBB血液側的受體上。(3)受體-納米顆粒復合體的內(nèi)化。 (4)納米顆粒當其跨越BBB時經(jīng)歷的化學和/或物理變化導致配體從納米顆粒剩余部分解 離。(5)未革巴向的納米顆粒(untargeted nanoparticle)到達BBB的腦側。(6)納米顆粒 擴散至CNS。納米顆粒的組分在圖左側的插入圖例(inset key)中示出。圖右側括號內(nèi)的 術語指出了參與此次序的相關分區(qū)。
[0019] 圖 3 PEG偶聯(lián)反應的MALDI-T0F 分析。NH2-PEG-SH(3. 4kDa)和 C00H-PEG-SH(2kDa) 反應在24小時時的MALDI光譜。峰A和B分別相應于反應物,C00H-PEG-SH和NH 2-PEG-SH。 峰C、D和E分別相應于如在方案1中概述的三個潛在產(chǎn)物,4kDa、5. 4kDa和6. 8kDa的聚合 物。
[0020] 圖 4 二硫鍵裂解反應的 MALDI-T0F 分析。NH2-PEG-SH(3. 4kDa)和 C00H-PEG-SH(2kDa)反應在加入過量β-巰基乙醇(BME)后的MALDI光譜。峰A和B分別相 應于親本聚合物C00H-PEG-SH和NH 2-PEG-SH。不存在來自由于過量BME所導致的巰基-二 硫鍵交換在PEG聚合物之間二硫鍵形成的產(chǎn)物的證據(jù)。
[0021] 圖5包含二硫鍵的納米顆粒與Neuro2A細胞的結合親合力(binding avidity)。 示出了測量的數(shù)據(jù)點,正方形、菱形或三角形分別指示包含二硫鍵的PLGA-PEG-Tf納米顆 粒(S-S)、用二硫蘇糖醇處理后的包含二硫鍵的PLGA-PEG-Tf納米顆粒(S-S+DTT)和甲氧基 封端的PLGA-PEG納米顆粒(mPEG)。每個制劑的模型曲線都基于Langmuir結合等溫線。
[0022] 圖6小鼠腦切片中PLGA-mPEG納米顆粒的共聚焦圖。圖A :488nm激發(fā),圖B :DAPI 信號,圖C:圖A和B的合并圖。圖D顯示出了圖C中合并圖的放大圖。實線箭頭指示與細 胞核共定位的熒光。由于該現(xiàn)象見于非靶向顆粒,其被認為是正常組織背景熒光。虛線箭 頭指示血管。
[0023] 圖7小鼠腦切片中低-Tf PLAGA-PEG納米顆粒的共聚焦圖。圖A示出了來自488nm 激發(fā)的熒光。圖B示出了 DAPI信號。圖C示出了圖A和B的合并圖。圖D示出了圖C中 的合并圖的放大圖。實線白色箭頭指示與細胞核共定位的熒光。虛線白色箭頭指示血管。 空心白色箭頭指示在實質(zhì)中與細胞核不相關的、確定為納米顆粒信號的熒光。
[0024] 圖8小鼠腦切片中高-Tf PLGA-PEG納米顆粒的共聚焦圖。圖A示出了來自488nm 激發(fā)的熒光。圖B示出了 DAPI信號。圖C示出了圖A和B的合并圖。圖D示出了圖C中 合并圖的放大圖。實線白色箭頭指示與細胞核共定位的熒光。虛線白色箭頭指示血管。空 心白色箭頭指示在實質(zhì)中與胞核不相關的、確定為納米顆粒信號的熒光。
[0025] 圖9小鼠腦切片中高-Tf加上二硫化PLGA-PEG納米顆粒的共聚焦圖。圖A示出 了來自488nm激發(fā)的熒光。圖B示出了DAPI信號。圖C示出了圖A和B的合并圖。圖D 示出了圖C中合并圖的放大圖。實線白色箭頭指示與細胞核共定位的熒光。虛線白色箭頭 指示血管??招陌咨^指示在實質(zhì)中與細胞核不相關的、確定為納米顆粒信號的熒光。
[0026] 圖10 DSS-DAK-PEG-OPSS與Tf綴合反應的MALDI-T0F追蹤。未反應的Tf和數(shù)個 階的PEG化的Tf被標記。
[0027] 圖11 Tf-DAK-PEG-OPSS隨時間在pH 5. 5緩沖液中的降解。示出了在5min⑷、 15min(B)、30min(C)、60min(D)、120min(E)、24 小時(F)孵育時間的粗混合物組成。
[0028] 圖12 Tf-DAK-PEG-Au納米顆粒與K562細胞在pH 5. 5 (正方形)或pH8 (菱形) 的緩沖液中孵育一個小時之后的結合。
[0029] 圖13示出了三種不同的納米顆粒隨時間至涂覆bEnd. 3的Transwells1'的底部孔 (basal well)的迀移。菱形圖反映顯示了僅涂覆了 mPEG的金納米顆粒的迀移,正方形圖反 映顯示了涂覆了不含可pH裂解的DAK銜接物的Tf-PEG的金納米顆粒的迀移,三角圖顯示 了涂覆了含可pH裂解的DAK銜接物的Tf-PEG的金納米顆粒的迀移。
[0030] 圖14示出了來自在用具有酸可裂解的銜接物的包含Tf的金納米顆粒處理之后小 鼠腦部的切片的圖。實線箭頭示出了血管中的NP,且空心(open)箭頭示出了腦中的NP。 [0031 ] 圖15組織培養(yǎng)Transwell龍系統(tǒng)的示意圖。
[0032] 圖16圖A示出了不可裂解納米顆粒的制備。圖B示出了包含二硫鍵的納米顆粒 的制備。每一種聚合物混合物在lOmg/mL的總PLGA濃度下在DMF中被制備,然后通過納米 沉淀法形成納米顆粒。
[0033] 說明性實施方案詳述
[0034] 本文提供了將納米顆粒遞送至受試者腦部的方法,還描述了納米顆粒以及可用于 連接遞送所述的納米顆粒或包含在納米顆粒中的感興趣的化合物的相關的組合物、方法和 試劑盒。
[0035] 當關于數(shù)字范圍、截斷值或具體值使用時,術語"約(about) "用來表示被列舉的數(shù) 值可從所列值變化多達10%。因為本文所用的許多數(shù)值是實驗確定的,本領域技術人員應 該理解,這樣的確定可,并且經(jīng)常情況下,將在不同的實驗中變化。本文所用的值不應該被 認為是由于此固有變化而過度限制。術語"約"用來包含多達或等于10%的此類變化。
[0036] 如本文所用的術語"納米顆粒(nanoparticle) "指納米級尺寸的復合結構。特別 地,納米顆粒通常是大小在從約1至約1000 nm范圍內(nèi)的顆粒,且盡管取決于納米顆粒組成 不同的形態(tài)是可能的,但通常是球形。納米顆粒接觸該納米顆粒的外部環(huán)境的部分通常被 確定為納米顆粒的表面。在本文所述的納米顆粒中,尺寸限制可限于兩個維度,并因此本文 所述的納米顆粒包括具有直徑從約1至約1000 nm的復合結構,其中具體直徑取決于根據(jù)實 驗設計的納米顆粒組成以及納米顆粒的預期用途。例如,用于一些治療應用中的納米顆粒 通常具有約200nm或以下的尺寸,并且特別地,用于與癌癥治療相關的遞送使用的納米顆 粒通常具有從約1至IOOnm的直徑。
[0037] 另外的可期望的納米顆粒特性,諸如表面電荷和空間穩(wěn)定,也可鑒于感興趣的具 體應用而變化。技術人員在閱讀本公開內(nèi)容之后可理解顆粒的特性。納米顆粒的尺寸和特 性可通過本領域已知的技術進行檢測。檢測顆粒尺寸的示例性技術包括但不限于:動態(tài)光 散射(DLS)和納米顆粒追蹤分析(NTA)以及多種顯微術諸如透射電子顯微術(TEM)和原子 力顯微術(AFM)。檢測顆粒形態(tài)的示例性技術包括但不限于TEM和AFM。檢測納米顆粒表 面電荷的示例性技術包括但不限于ζ電勢法。適合于檢測其他化學特性的另外的技術包 括 1H、11B和13C和19F NMR(核磁共振),UV/Vis (紫外/可見光)與紅外/拉曼(Raman)光 譜和熒光光譜和顯微術(當納米顆粒與熒光標記結合使用時)以及由技術人員可確認的另 外的技術。
[0038] 如本文所用的"遞送(deliver) "和"遞送(delivery) "指影響化合物的空間位置 且特別是指定化合物的優(yōu)選位置的活動。因此,從本公開內(nèi)容的意義上說,遞送化合物指影 響化合物在某一時間在某組條件下的定位和運動使得化合物在那些條件下的定位和運動 相對于化合物本來具有的定位和運動而變化的能力。
[0039] 如本文所用的術語"靶(target) "指包括器官、組織或其任何部分的感興趣的生物 系統(tǒng),且可包括體外或體內(nèi)生物系統(tǒng)或其任何部分。
[0040] 如本文所用的術語"聚合物(polymer) "指包含通常由共價化學鍵連接的重復結 構單元的大分子。適合的聚合物可以是線形和/或支鏈的,并可采取均聚物或共聚物的形 式。如果使用共聚物,共聚物可以是無規(guī)共聚物或支化共聚物。示例性的聚合物包括水分散 性聚合物和特別是水溶性聚合物。例如,適合的聚合物包括,但不限于多糖、聚酯、聚酰胺、 聚醚、聚碳酸酯、聚丙烯酸酯,等等。對于治療和/或藥物用途和應用,聚合物應當具有低毒 性,且特別是無毒或無細胞毒性的。適合的聚合物包括具有約500, 000或以下分子量的聚 合物。特別地,適合的聚合物可具有約100, 〇〇〇和以下的分子量。
[0041] 如本文所用的術語"包含硼酸的聚合物(polymer containing a boronic acid) " 或"具有硼酸的銜接物(linker having a boronic acid)"以及類似物,指包含呈遞用于結 合至包含多元醇的聚合物的羥基基團的至少一個硼酸基團。特別地,本文所述的納米顆粒 的包含硼酸的聚合物包括在至少一個結構單元中包含包含碳-硼化學鍵的烷基或芳基取 代的