使用具有降低的ispa活性的宿主細(xì)胞提高異戊二烯的產(chǎn)量的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及能夠產(chǎn)生異戊二烯的重組微生物以及利用這種重組微生物以好的效率產(chǎn)生異戊二烯。在本發(fā)明中，變更ispA基因的功能活性以在發(fā)酵過程中減少工程改造為產(chǎn)生異戊二烯的重組細(xì)胞中或由于別的原因易于發(fā)生類異戊二烯積聚的細(xì)胞中的類異戊二烯分子的產(chǎn)生。該降低的ispA基因功能活性使得宿主微生物中異戊二烯合成增強。
【專利說明】使用具有降低的ISPA活性的宿主細(xì)胞提高異戊二烯的產(chǎn) 量
[0001] 相關(guān)專利申請的交叉引用
[0002] 本專利申請要求于2011年12月23日提交的美國臨時專利申請No. 61/580, 163 和于2012年4月27日提交的美國臨時專利申請No. 61/639,855的優(yōu)先權(quán)，將這兩篇專利 申請每一者的公開內(nèi)容以引用的方式全文并入本文。
[0003] 以引用方式并入本f
[0004] 將如下ASCII文本文件的提交內(nèi)容以引用的方式全文并入本文：序列表的計算 機可讀形式（CRF)(文件名稱：643842004240. txt，記錄日期：2012年12月21日，大?。?65, 536 字節(jié)）。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0005] 本發(fā)明總體涉及用于從培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生異戊二烯的方法以及包括這些培養(yǎng)細(xì)胞的 組合物。

【背景技術(shù)】
[0006] 異戊二烯（2-甲基-1，3- 丁二烯）是多種合成聚合物（最值得注意的是合成橡 膠）的關(guān)鍵原料。異戊二烯由多種微生物、植物和動物物種自然產(chǎn)生。具體地講，已經(jīng)鑒別 了兩條進行異戊二烯生物合成的途徑：甲羥戊酸（MVA)途徑和非甲羥戊酸（DXP)途徑。然 而，天然存在的生物體的異戊二烯產(chǎn)率沒有商業(yè)吸引力。還可以通過分餾石油獲得異戊二 烯，但該材料的純化昂貴而且耗時。C5烴流的石油裂解僅生成約15%的異戊二烯。每年大 約有800, 000噸順式聚異戊二烯由異戊二烯的聚合反應(yīng)產(chǎn)生；這種聚異戊二烯大部分用于 輪胎和橡膠工業(yè)。異戊二烯還被共聚以用作其他產(chǎn)品中的合成彈性體，這些產(chǎn)品例如為鞋 類、機械產(chǎn)品、醫(yī)療產(chǎn)品、體育用品和乳膠。
[0007] 在微生物中的代謝過程中，甲羥戊酸依賴的生物合成途徑將乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為異 戊烯二磷酸（IPP)和二甲基烯丙基二磷酸（DMAPP)。IPP和DMAPP是異戊二烯的前體以及 是一類稱為類異戊二烯的高分子量分子的前體。類異戊二烯對大多數(shù)活生物體和細(xì)胞是至 關(guān)重要的，為維持細(xì)胞膜流動性和電子傳遞提供了手段。
[0008] 關(guān)于產(chǎn)生異戊二烯的最新進展公開了以可足以滿足穩(wěn)定商業(yè)過程的速率、滴度和 純度產(chǎn)生異戊二烯的方法（參見例如國際專利申請公布此.102009/07667642);然而，仍然 需要提高其產(chǎn)量和產(chǎn)率的可供選擇的途徑。
[0009] 本文提供的是培養(yǎng)的重組細(xì)胞、這些細(xì)胞的組合物以及使用這些細(xì)胞來增加異戊 二烯的產(chǎn)量的方法。
[0010] 在整篇本說明書中，參考了多個專利、專利申請以及其他類型的出版物（如雜志 文章）。特此將本文引用的所有專利、專利申請和出版物以引用的方式全文并入本文用于所 有目的。


【發(fā)明內(nèi)容】
toon] 本文提供的發(fā)明特別是公開了包含重組細(xì)胞的物質(zhì)的組合物以及制備和使用這 些重組細(xì)胞來產(chǎn)生異戊二烯的方法。在一些方面，重組微生物包含具有降低的功能活性的 ispA基因和一種或多種編碼一種或多種異戊二烯合酶和/或MVA途徑酶的核酸。
[0012] 因此，在一些方面，本文提供的是能夠產(chǎn)生異戊二烯的重組細(xì)胞，其中所述細(xì)胞包 含具有降低的功能活性的ispA基因和一種或多種編碼以下物質(zhì)的核酸：(a)異戊二烯合酶 多肽，其中所述異戊二烯合酶多肽由異源核酸編碼；和（b) -種或多種甲羥戊酸（MVA)途徑 多肽，其中在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述重組細(xì)胞提供所述多肽的產(chǎn)生和異戊二烯的合成。 在其他方面，ispA基因的功能活性通過如下來降低：缺失ispA基因；降低ispA基因表達(dá)； 降低ispA蛋白活性；降低ispA蛋白表達(dá)；或時序調(diào)節(jié)ispA表達(dá)。在另一個方面，ispA基 因表達(dá)通過將ispA基因設(shè)置于弱啟動子的控制下來降低。在一些方面，ispA基因表達(dá)通過 將ispA基因設(shè)置于自動調(diào)節(jié)啟動子的控制下來降低。在另外其他的方面，ispA蛋白活性通 過ispA蛋白與蛋白水解標(biāo)簽的翻譯融合來降低。在其他方面,ispA蛋白表達(dá)通過使用反義 RNA來降低。在一些方面，ispA蛋白表達(dá)通過將一個或多個突變引入位于ispA mRNA分子 中的核糖體結(jié)合位點來降低。在其他方面，ispA基因表達(dá)通過HrcA轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白來降低。 在另一個方面，ispA蛋白活性通過將內(nèi)源ispA基因替換為編碼多肽的基因來降低，所述多 肽包含的針對DMAPP的Km與由內(nèi)源ispA基因編碼的多肽的Km相比是增加的。在另一個 方面，ispA蛋白活性通過將內(nèi)源ispA基因替換為包含不同最適溫度的另一基因來降低。
[0013] 在任何本文所述細(xì)胞的其他方面，所述異戊二烯合酶多肽是植物異戊二烯合 酶多肽或其變體。在一些方面，所述異戊二烯合酶多肽是來自葛屬（Pueraria)或楊屬 (Populus)或雜種銀白楊X歐洲山楊（Populus alba X Populus tremula)的多肽或其變 體。在另一個方面，所述異戊二烯合酶多肽選自山葛（Pueraria montana)或野葛（Pueraria lobata)、美洲山楊（Populus tremuloides)、銀白楊、黑楊（Populus nigra)、毛果楊 (Populus trichocarpa)或其變體。在其他的方面，所述植物異戊二烯合酶多肽為葛異戊二 烯合酶多肽或其變體。在其他的方面，所述植物異戊二烯合酶多肽為桉樹（Eucalyptus)異 戊二烯合酶多肽或其變體。在任何本文所述細(xì)胞的一些方面，所述編碼（b)的一種或多種 MVA途徑多肽的一種或多種核酸是異源核酸。在一些方面，所述細(xì)胞包含一種或多種編碼 來自MVA上游途徑的MVA途徑多肽的核酸，其中所述MVA上游途徑核酸選自AA-輔酶A硫 解酶或乙酰乙酰輔酶A合酶、HMG-輔酶A合酶和HMG-輔酶A還原酶核酸。在一些方面，所 述細(xì)胞包含一種或多種編碼來自MVA下游途徑的MVA途徑多肽的核酸，其中所述MVA下游 途徑核酸選自MVK、PMK和MVD核酸。在一些方面，所述細(xì)胞包含一種或多種編碼完整MVA 途徑的MVA途徑多肽的核酸。在一些方面，所述細(xì)胞還包含一種或多種編碼異戊烯二磷酸 異構(gòu)酶（IDI)多肽的核酸。在任何本文所述細(xì)胞的其他方面，所述細(xì)胞還包含1-脫氧 木酮糖-5-磷酸合酶（DXS)多肽。在另一個方面，所述（b)的一種或多種編碼DXS多肽的 核酸為編碼DXS多肽的異源核酸。在又一個方面，所述（b)的一種或多種編碼DXS多肽的 核酸為編碼DXS多肽的內(nèi)源核酸的拷貝。在任何本文所述細(xì)胞的其他方面，將所述一種或 多種異源核酸設(shè)置于誘導(dǎo)型啟動子或組成型啟動子之下。在另一個方面，將所述一種或多 種異源核酸克隆進多拷貝質(zhì)粒中。在其他方面，將所述一種或多種異源核酸整合進所述細(xì) 胞的染色體中。
[0014] 在另外其他的方面，該細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞、藻類細(xì)胞、真菌細(xì)胞或酵母細(xì)胞。在一個 方面，該細(xì)胞為細(xì)菌細(xì)胞。在另一方面，該細(xì)菌細(xì)胞為革蘭氏陽性菌細(xì)胞或革蘭氏陰性菌細(xì) 胞。在一些方面，該細(xì)菌細(xì)胞選自大腸桿菌細(xì)胞、檸檬泛菌（p.citrea)細(xì)胞、枯草芽孢桿 菌（B. subtilis)細(xì)胞、地衣芽孢桿菌（B. licheniformis)細(xì)胞、遲緩芽胞桿菌（B. lentus) 細(xì)胞、短芽孢桿菌（B. brevis)細(xì)胞、嗜熱脂肪芽孢桿菌（B. stearothermophilus)細(xì)胞、 嗜堿芽孢桿菌（B.alkalophilus)細(xì)胞、解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens)細(xì)胞、 克勞氏芽孢桿菌（B. clausii)細(xì)胞、耐鹽芽孢桿菌（B.halodurans)細(xì)胞、巨大芽孢桿菌 (B.megaterium)細(xì)胞、凝結(jié)芽孢桿菌（B.coagulans)細(xì)胞、環(huán)狀芽孢桿菌（B.circulans) 細(xì)胞、燦爛類芽孢桿菌（B. lautus)細(xì)胞、蘇云金芽孢桿菌（B. thuringiensis)細(xì)胞、白色 鏈霉菌（S. albus)細(xì)胞、變鉛青鏈霉菌（S. lividans)細(xì)胞、天藍(lán)色鏈霉菌（S. coelicolor) 細(xì)胞、灰色鏈霉菌（S.griseus)細(xì)胞、假單胞菌屬物種（Pseudomonas sp.)細(xì)胞和產(chǎn)堿假 單胞菌（P. alcaligenes)細(xì)胞。在一個方面，該細(xì)胞是大腸桿菌。在另一個方面，該細(xì)胞 是藻類細(xì)胞。在又一另外的方面，藻類細(xì)胞選自綠藻、紅藻、灰藻（glaucophyte)、綠蝴藻 (chlorarachniophyte)、眼蟲、色藻（chromista)或腰鞭毛蟲類（dinoflagellates)。在另 一個方面，該細(xì)胞是真菌細(xì)胞。在一些方面，真菌細(xì)胞是絲狀真菌。在另一個方面，該細(xì)胞是 酵母細(xì)胞。在一個方面，酵母細(xì)胞選自酵母屬物種（Saccharomyces sp.)、裂殖酵母屬物種 (Schizosaccharomyces sp·)、畢赤酵母屬物種（Pichia sp.)或假絲酵母屬物種（Candida sp.)。在另一個方面，酵母細(xì)胞是釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)。
[0015] 本文提供的是包含任何本文所公開的細(xì)胞的組合物。
[0016] 本文還提供的是產(chǎn)生異戊二烯的方法，包括：(a)在適于合成異戊二烯的條件下 培養(yǎng)任何本文所述的重組細(xì)胞；以及（b)產(chǎn)生異戊二烯。在一些方面，該方法還包括回收由 所述重組細(xì)胞產(chǎn)生的異戊二烯。
[0017] 本文提供的是產(chǎn)生異戊二烯的方法，包括（a)培養(yǎng)能夠產(chǎn)生異戊二烯的重組細(xì) 胞，其中所述細(xì)胞包含具有降低的功能活性的ispA基因和一種或多種編碼以下物質(zhì)的核 酸：（i)異戊二烯合酶多肽，其中所述異戊二烯合酶多肽由異源核酸編碼；和（ii) 一種或多 種甲羥戊酸（MVA)途徑多肽，其中在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述重組細(xì)胞可提供所述多肽的 產(chǎn)生和異戊二烯的合成；以及（b)產(chǎn)生異戊二烯。在一些方面，該方法還包括回收由所述重 組細(xì)胞產(chǎn)生的異戊二烯。在本文所述方法的其他方面中，所述異戊二烯合酶多肽是植物異 戊二烯合酶多肽或其變體。在一些方面，所述異戊二烯合酶多肽是來自葛屬或楊屬或雜種 銀白楊X歐洲山楊的多肽或其變體。在另一個方面，所述異戊二烯合酶多肽選自山葛或野 葛、美洲山楊、銀白楊、黑楊、毛果楊或其變體。在其他的方面，所述植物異戊二烯合酶多肽 為葛異戊二烯合酶多肽或其變體。在其他的方面，所述植物異戊二烯合酶多肽為桉樹異戊 二烯合酶多肽或其變體。在任何本文所述方法的一些方面，所述（b)的一種或多種編碼一 種或多種MVA途徑多肽的核酸是異源核酸。在一些方面，所述細(xì)胞包含一種或多種編碼來 自MVA上游途徑的MVA途徑多肽的核酸，其中所述MVA上游途徑核酸選自AA-輔酶A硫解 酶核酸或乙酰乙酰輔酶A合酶核酸、HMG-輔酶A合酶核酸和HMG-輔酶A還原酶核酸。在 一些方面，所述細(xì)胞包含一種或多種編碼來自MVA下游途徑的MVA途徑多肽的核酸，其中所 述MVA下游途徑核酸選自MVK核酸、PMK核酸和MVD核酸。在一些方面，所述細(xì)胞包含一種 或多種編碼完整MVA途徑的MVA途徑多肽的核酸。在一些方面，所述細(xì)胞還包含一種或多 種編碼異戊烯二磷酸異構(gòu)酶（IDI)多肽的核酸。在任何本文所述細(xì)胞的其他方面，所 述細(xì)胞還包含1-脫氧木酮糖-5-磷酸合酶（DXS)多肽。在另一個方面，所述（b)的一種或 多種編碼DXS多肽的核酸為編碼DXS多肽的異源核酸。在又一個方面，所述（b)的一種或 多種編碼DXS多肽的核酸為編碼DXS多肽的內(nèi)源核酸的拷貝。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018] 圖la繪出了 CMP882和CMP884發(fā)酵期間的甲羥戊酸進料濃度。圖lb繪出了菌株 CMP882和CMP884發(fā)酵期間培養(yǎng)基中的甲羥戊酸積聚。
[0019] 圖2繪出了 CMP882和CMP884發(fā)酵期間的法尼基焦磷酸（FPP)濃度。
[0020] 圖3繪出了 CMP882和CMP884在發(fā)酵期間的細(xì)胞活力。
[0021] 圖4繪出了在菌株CMP882和CMP884發(fā)酵期間的呼吸率（CER)。
[0022] 圖5繪出了在發(fā)酵期間MVA途徑菌株（CMP457)及與之相比較的野生型對照菌株 (MCM1020)中的 yddV 表達(dá)。
[0023] 圖6繪出了菌株CMP457和MCM1020發(fā)酵期間的呼吸率（CER)。
[0024] 圖7a繪出了各種工程改造的產(chǎn)異戊二烯菌株的生長曲線（一式二份運行的平均 值）。圖7b繪出了各種工程改造的產(chǎn)異戊二烯菌株的比生產(chǎn)率（任意單位）（一式二份運 行的平均值）。
[0025] 圖8繪出了 IspA合成基因的核苷酸序列（SEQ ID N0:10)。
[0026] 圖 9 繪出了 pMCM1535 的核苷酸序列（SEQ ID NO: 11)。
[0027] 圖10繪出了質(zhì)粒構(gòu)建體pMCM1535。
[0028] 圖11繪出了禽法尼基二磷酸合酶A116W突變體的核苷酸序列（SEQ ID N0:12)。
[0029] 圖12繪出了禽法尼基二磷酸合酶N144'W突變體的核苷酸序列（SEQ ID NO: 13)。
[0030] 圖13繪出了隨時間推移15L發(fā)酵中，與對照菌株CMP1043(實心三角形）相比， yddV-ispA菌株CMP1082 (實心黑色正方形）所實現(xiàn)的從葡萄糖產(chǎn)生異戊二烯的產(chǎn)率。
[0031] 圖14繪出了隨時間推移15L發(fā)酵中，與對照菌株CMP1043(實心三角形）相比， yddV-ispA菌株CMP1082 (實心黑色正方形和空心正方形）所實現(xiàn)的異戊二烯滴度。
[0032] 圖15繪出了隨時間推移15L發(fā)酵中，與對照菌株CMP1043(實心三角形）相比， yddV-ispA菌株CMP1082 (實心黑色正方形）所實現(xiàn)的細(xì)胞生產(chǎn)力指數(shù)（CPI)。
[0033] 圖16繪出了隨時間推移15L發(fā)酵中，與對照菌株CMP1043(實心三角形）相比， yddV-ispA菌株CMP1082 (實心黑色正方形）所實現(xiàn)的體積生產(chǎn)率。
[0034] 圖17繪出了隨時間推移15L發(fā)酵中，與對照菌株CMP1043(實心三角形）相比， yddV-ispA菌株CMP1082 (實心黑色正方形）所實現(xiàn)的比生產(chǎn)率。
[0035] 圖18繪出了用于在大腸桿菌中表達(dá)的hrcA的密碼子優(yōu)化等位基因的核苷酸序列 (SEQ ID N0:14)。
[0036] 圖19繪出了隨時間推移每個15L發(fā)酵中所實現(xiàn)的從葡萄糖產(chǎn)生異戊二烯的產(chǎn)率。 CMP1082(pgl+)由空心三角形示出，而MP1136(pgl_)由實心正方形示出。
[0037] 圖20繪出了隨時間推移每個15L發(fā)酵中所實現(xiàn)的從葡萄糖產(chǎn)生異戊二烯的瞬時 產(chǎn)率。CMP1082(pgl+)由空心三角形示出，而MP1136(pgl_)由實心正方形示出。
[0038] 圖21示出了隨時間推移每個15L發(fā)酵中所實現(xiàn)的細(xì)胞生產(chǎn)力指數(shù)（CPI)。 CMP1082(pgl+)由空心三角形示出，而MP1136(pgl_)由實心正方形示出。
[0039] 圖22繪出了隨時間推移每個15L發(fā)酵中所實現(xiàn)的體積生產(chǎn)率。CMP1082(pgl+)由 空心三角形示出，而MP1136 (pgl_)由實心正方形示出。
[0040] 圖23繪出了隨時間推移每個15L發(fā)酵中所實現(xiàn)的比生產(chǎn)率。CMP1082(pgl+)由空 心三角形示出，而MP1136 (pgl_)由實心正方形示出。
[0041] 圖24繪出了隨時間推移每個15L發(fā)酵中所實現(xiàn)的從葡萄糖產(chǎn)生異戊二烯的產(chǎn)率。 使用_雞腸球菌（E. gallinarum)或鉛黃腸球菌（E. casseliflavus)進行的所有運行（分 別是三角形和正方形）均比使用糞腸球菌（E.faecalis)上游途徑酶進行的兩個運行（空 心菱形和實心菱形）實現(xiàn)更高的從葡萄糖產(chǎn)生異戊二烯的％產(chǎn)率。從葡萄糖產(chǎn)生的％重量 產(chǎn)率計算為：異戊二烯總量（t) / [(進料Wt (0)-進料Wt (t) +83. 5) *0. 59)]，其中0. 59為葡 萄糖進料液中葡萄糖的重量百分比，83. 5為在t = 0時分批供料進發(fā)酵罐中的該進料的克 數(shù)。獨立地對每次進料測量其重量％。
[0042] 圖25繪出了隨時間推移每個15L發(fā)酵中所實現(xiàn)的體積生產(chǎn)率。使用鶉雞腸球菌 或鉛黃腸球菌進行的所有運行（分別是三角形和正方形）均比使用糞腸球菌上游途徑酶進 行的兩個運行（空心菱形和實心菱形）實現(xiàn)更高的總體積生產(chǎn)率。使用下式計算體積生產(chǎn) 率：體積生產(chǎn)率（g/L/hr) = [S(ER(t)/1000*68. 117)]/[t-tJ，其中求和是從 tQ 到 t。未 納入罐的周轉(zhuǎn)時間。
[0043] 圖26繪出了隨時間推移每個15L發(fā)酵中所實現(xiàn)的比生產(chǎn)率。使用鶉雞腸球菌或鉛 黃腸球菌進行的所有運行（分別是三角形和正方形）均比使用糞腸球菌上游途徑酶進行的 兩個運行（空心菱形和實心菱形）實現(xiàn)更高的峰值比生產(chǎn)率。使用下式計算比生產(chǎn)率：t匕 生產(chǎn)率（mg/L/hr/OD) =HgER*68. 117g/mol/0D。HgER 為異戊二烯放出速率，單位為（mmol/ L/hr)。0D =光密度=550nm下的吸光度*在水中的稀釋系數(shù)。
[0044] 圖27繪出了所限定的菌株中的IspA濃度。
[0045] 圖28繪出了隨時間推移每個15L發(fā)酵中所實現(xiàn)的從葡萄糖產(chǎn)生異戊二烯的 產(chǎn)率。具有經(jīng)修飾的RBS位點的菌株，S卩CMP 1286 (RBS9yddV)、CMP 1284 (RBS3yddV)和 CMP1275(RBSl/3yddV)(分別為空心圓、空心正方形和空心三角形）所實現(xiàn)的從葡萄糖產(chǎn)生 異戊二烯的累積％產(chǎn)率與對照菌株（DW719,運行號為20120526和20120565,分別是實心正 方形和實心菱形）相似。從葡萄糖產(chǎn)生的％重量產(chǎn)率計算為：異戊二烯總量（t)/[(進料 Wt(0)-進料Wt(t)+83. 5) *0. 59)]，其中0. 59為葡萄糖進料液中葡萄糖的重量百分比，83. 5 為在t = 0時分批供料進發(fā)酵罐中的該進料的克數(shù)。獨立地對每次進料測量其重量％。
[0046] 圖29繪出了隨時間推移每個15L發(fā)酵中所實現(xiàn)的從葡萄糖產(chǎn)生異戊二烯的瞬 時產(chǎn)率。具有經(jīng)修飾的RBS位點的菌株，S卩CMP1286(RBS9yddV)、CMP1284(RBS3yddV)和 CMP1275(RBSl/3yddV)(分別為空心圓、空心正方形和空心三角形）所實現(xiàn)的從葡萄糖產(chǎn)生 異戊二烯的峰值瞬時產(chǎn)率與對照菌株（DW719,運行號為20120526和20120565,分別是實心 正方形和實心菱形）相似。所有經(jīng)修飾的菌株均在運行前期實現(xiàn)較高的瞬時收率值，而菌 株CMP1284在運行末期（56至64小時EFT)時具有最穩(wěn)健的性能。異戊二烯瞬時產(chǎn)率（g/ g% )計算為：所產(chǎn)生的異戊二烯α「〇/所消耗的葡萄糖
[0047] 圖30繪出了隨時間推移每個15L發(fā)酵中所實現(xiàn)的體積生產(chǎn)率。具有經(jīng)修飾的RBS 位點的菌株，即 CMP1286 (RBS9yddV)、CMP1284 (RBS3yddV)和 CMP1275 (RBSl/3yddV)(分別為 空心圓、空心正方形和空心三角形）所實現(xiàn)的異戊二烯體積生產(chǎn)率與對照菌株（DW719,運 行號為20120526和20120565,分別是實心正方形和實心菱形）相似。使用下式計算體積 生產(chǎn)率：體積生產(chǎn)率（g/L/hr) = [Σ (HGER(t)/1000*68. 117)]/[t-t。]，其中求和是從t0至 t。未納入罐的周轉(zhuǎn)時間。
[0048] 圖31繪出了隨時間推移每個15L發(fā)酵中所實現(xiàn)的細(xì)胞生產(chǎn)力指數(shù)（CPI)。 具有經(jīng)修飾的RBS位點的菌株，即CMP1286(RBS9yddV)、CMP1284(RBS3yddV)和 CMP1275(RBSl/3yddV)(分別為空心圓、空心正方形和空心三角形）所實現(xiàn)的CPI與對照菌 株（DW719,運行號為20120526和20120565,分別是實心正方形和實心菱形）相似。使用下 式計算細(xì)胞生產(chǎn)力指數(shù)（CPI) :CPI =異戊二烯總克數(shù)/干細(xì)胞重量總克數(shù)。
[0049] 圖32繪出了隨時間推移每個15L發(fā)酵中所實現(xiàn)的比生產(chǎn)率。具有經(jīng)修飾的RBS 位點的菌株，即 CMP1286 (RBS9yddV)、CMP1284 (RBS3yddV)和 CMP1275 (RBSl/3yddV)(分別為 空心圓、空心正方形和空心三角形）所實現(xiàn)的異戊二烯比生產(chǎn)率與對照菌株（DW719,運行 號為20120526和20120565,分別是實心正方形和實心菱形）相似。使用下式計算比生產(chǎn) 率：比生產(chǎn)率（mg/L/hr/OD) = HgER*68. 117g/mol/0D。HgER為異戊二烯放出速率，單位為 (mmol/L/hr)。0D =光密度=550nm下的吸光度*在水中的稀釋系數(shù)。
[0050] 圖33繪出了在發(fā)酵32小時和44小時后測量的FPP水平。
[0051] 圖34繪出了在發(fā)酵32小時和44小時后測量的GPP水平。
[0052] 圖35繪出了在發(fā)酵32小時和44小時后測量的DMAPP水平。
[0053] 圖36繪出了在發(fā)酵32小時和44小時后測量的IPP水平。
[0054] 圖37繪出了質(zhì)粒構(gòu)建體pCHL426。
[0055] 圖 38 繪出了 pCHL426 的核苷酸序列（SEQ ID N0:104)。
[0056] 圖39繪出了質(zhì)粒構(gòu)建體pCHL427。
[0057] 圖 40 繪出了 pCHL427 的核苷酸序列（SEQ ID N0:105)。
[0058] 圖41繪出了包含組成型表達(dá)的異戊二烯合酶變體的宿主細(xì)胞和對比的包含誘導(dǎo) 型異戊二烯合酶變體的宿主細(xì)胞的生長。
[0059] 圖42繪出了包含組成型表達(dá)的異戊二烯合酶變體的宿主細(xì)胞和對比的包含誘導(dǎo) 型異戊二烯合酶變體的宿主細(xì)胞的異戊二烯比生產(chǎn)率。

【具體實施方式】
[0060] 本文提供的發(fā)明特別是公開了在重組細(xì)胞中產(chǎn)生異戊二烯的組合物和方法，所述 重組細(xì)胞已工程改造為在發(fā)酵期間在精確的時期下調(diào)ispA基因的表達(dá)或功能活性。本發(fā) 明是基于這樣的發(fā)現(xiàn)：重組細(xì)胞在發(fā)酵期間ispA基因表達(dá)降低導(dǎo)致與不具有降低的ispA 基因功能活性的細(xì)胞相比異戊二烯產(chǎn)量水平較高。不受理論束縛，據(jù)信降低ispA基因表達(dá) 和/或功能活性可通過降低較高分子量類異戊二烯分子的產(chǎn)生和積聚從而導(dǎo)致供異戊二 烯合成的碳可利用率較高以及細(xì)胞活力改善來改善異戊二烯產(chǎn)率。然而，因為ispA基因產(chǎn) 生細(xì)菌和其他微生物穩(wěn)健生長所必需的酶，所以完全消除該基因（例如通過基因敲除）對 于改善異戊二烯產(chǎn)率而言不是可行的選項，因為據(jù)報道其導(dǎo)致細(xì)胞生長受損（Fukisaki等 人，2005, J. Biochem.(《生物化學(xué)雜志》），137(3) :395-400)或?qū)е录?xì)胞死亡（www. genome-wise, edu/resources/essential. htm ;Baba 等人， 2006, Mol. Syst. Biol. ， （《分子系統(tǒng)生物 學(xué)》）2006. 0008)。本發(fā)明人已根據(jù)他們的如下發(fā)現(xiàn)解決了該技術(shù)問題：在異戊二烯產(chǎn)生期 間（如發(fā)酵的線性生長期后）特定地和時間精確地降低ispA基因的表達(dá)和/或功能活性可 導(dǎo)致重組細(xì)胞的異戊二烯產(chǎn)率、滴度、細(xì)胞生產(chǎn)力、體積生產(chǎn)率、比生產(chǎn)率和細(xì)胞活力較高。
[0061] 誦用摶術(shù)
[0062] 除非另外指明，否則本發(fā)明的實施將采用分子生物學(xué)（包括重組技術(shù)）、微生物 學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，這些技術(shù)均為本領(lǐng)域的現(xiàn)有技術(shù)。這 些技術(shù)在以下文獻中有完整解釋'Molecular Cloning:A Laboratory Manual (《分子克 隆：實驗室手冊》）"，第三版（Sambrook 等人，2001) ;"01igonucleotide Synthesis (《寡 核苷酸合成》Gait 編輯，1984) ;"Animal Cell Culture:A practical approach (《動物細(xì)胞培養(yǎng)：實用方法》）"，第三版（J.R. Masters編輯，2000) ;"Methods in Enzymology(《酶學(xué)方法》）"（美國學(xué)術(shù)出版社（Academic Press, Inc·)) ;"Current Protocols in Molecular Biology(《分子生物學(xué)實驗室指南》）"（F.M.Ausubel等人編 輯，1987,以及定期更新版本）；"PCR:The Polymerase Chain Reaction(《PCR:聚合酶鏈 反應(yīng)》），'，（Mullis 等人編輯，1994)。Singleton 等人，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology3rd revised ed·,(《微生物學(xué)和分子生物學(xué)詞典第三修訂版》），約翰 威立父子出版公司（J. Wiley & Sons)(紐約州紐約市，2006年）以及March's Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure6th ed.(《馬奇高級有機化學(xué) 反應(yīng)、機理和結(jié)構(gòu)，第六版》），約翰威立父子出版公司（紐約州紐約市，2007年），為本領(lǐng)域 技術(shù)人員提供了關(guān)于本申請中所用的許多術(shù)語的一般性指導(dǎo)。
[0063] 定義
[0064] 術(shù)語"ispA"可以指任何生物體中的任何香葉基轉(zhuǎn)移酶或法尼基二磷酸（FPP)合 酶或異戊烯基轉(zhuǎn)移酶家族的可催異戊烯二磷酸（IPP)與3, 3-二甲基烯丙基二磷酸（DMAPP) 或香葉基二磷酸（GPP)縮合以生成FPP的酶的任何成員。在一些實施例中，ispA由ispA基 因編碼。
[0065] 術(shù)語"異戊二烯"是指2-甲基-1，3- 丁二烯（CAS#78-79-5)。其可以是由DMAPP 消除焦磷酸所得的直接和最終的揮發(fā)性C5烴產(chǎn)物。其可能不涉及IPP分子與DMAPP分子 的連接或聚合。除非本文中另外指明，否則術(shù)語"異戊二烯"通常不旨在受其產(chǎn)生方法的限 制。
[0066] 如本文所用，術(shù)語"多肽"包括多肽、蛋白質(zhì)、肽、多肽片段和融合多肽。
[0067] 如本文所用，"分離的多肽"不是多肽文庫（如2種、5種、10種、20種、50種或更多 種不同多肽的文庫）的一部分，并且與和其一起存在于自然界中的至少一種組分分離。分 離的多肽可例如通過編碼該多肽的重組核酸的表達(dá)來獲得。
[0068] 所謂"異源多肽"意指由衍生自其他生物體、物種或菌株而非宿主細(xì)胞的核酸序列 編碼的多肽。在一些實施例中，異源多肽不同于存在于自然界中相同宿主細(xì)胞內(nèi)的野生型 多肽。
[0069] 如本文所使用，"核酸"是指單股或雙股形式的共價連接在一起的兩個或更多個脫 氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸。
[0070] 所謂"重組核酸"意指這樣的目的核酸，其缺少位于該目的核酸旁側(cè)、目的核酸所 源自的有機體的天然存在基因組中的一種或多種核酸（如，基因）。因此，該術(shù)語包括（例 如）摻入載體中、摻入自主復(fù)制型質(zhì)?；虿《局?、或摻入原核生物或真核生物的基因組DNA 中，或者獨立于其他序列作為單獨分子（如，cDNA、通過PCR或限制性核酸內(nèi)切酶消化制備 的基因組DNA片段或cDNA片段）存在的重組DNA。
[0071] 所謂"異源核酸"意指衍生自其他生物體、物種或菌株而非宿主細(xì)胞的核酸序列。 在一些實施例中，異源核酸不同于自然界中的相同宿主細(xì)胞內(nèi)存在的野生型核酸。
[0072] 如本文所用，"表達(dá)控制序列"意指指導(dǎo)目的核酸轉(zhuǎn)錄的核酸序列。表達(dá)控制序列 可以為啟動子（例如組成型或誘導(dǎo)型啟動子）或增強子。表達(dá)控制序列可以是"天然的"或 異源的。天然的表達(dá)控制序列衍生自與所表達(dá)基因相同的生物體、物種或株系。異源表達(dá) 控制序列衍生自與所表達(dá)基因不同的生物體、物種或株系。"誘導(dǎo)型啟動子"是在環(huán)境或發(fā) 育調(diào)節(jié)下具有活性的啟動子。
[0073] 所謂"有效連接的"意指核酸表達(dá)控制序列（例如啟動子）與第二核酸序列之間 的功能性連接，其中該表達(dá)控制序列指導(dǎo)對應(yīng)于該第二序列的核酸的轉(zhuǎn)錄。
[0074] 如本文所用，術(shù)語"基礎(chǔ)培養(yǎng)基"是指含有細(xì)胞有可能生長所需的最少營養(yǎng)物，通 常不存在氨基酸的培養(yǎng)基。基本培養(yǎng)基通常含有：（1)用于細(xì)菌生長的碳源；（2)各種鹽，其 可因細(xì)菌物種和生長條件而變動；和（3)水。碳源的范圍很大，從簡單的糖如葡萄糖到其他 生物質(zhì)的較復(fù)雜水解產(chǎn)物如酵母提取物，如下文更詳細(xì)論述的。鹽通常提供必需元素如鎂、 氮、磷和硫以允許細(xì)胞合成蛋白質(zhì)和核酸。基本培養(yǎng)基還可補充有選擇劑，例如抗生素，以 針對某些質(zhì)粒的維持等進行選擇。例如，如果微生物對某一抗生素例如氨芐青霉素或四環(huán) 素具有抗性，則可將該抗生素添加至培養(yǎng)基以便防止缺乏該抗性的細(xì)胞生長。培養(yǎng)基可在 必要時補充有其他化合物以選擇所需的生理或生化特性，例如特定的氨基酸等。
[0075] 如本文所用，術(shù)語"類異戊二烯"是指數(shù)量大且多樣的一類天然存在的有機化合 物，其由兩個或更多個烴單元構(gòu)成，每個單元由以特定模式排列的五個碳原子組成。類異 戊二烯可包括（但不限于）萜類化合物（例如半萜類化合物、單萜類化合物、倍半萜類化 合物、二萜類化合物、二倍半萜類化合物、三萜類化合物、四萜類化合物和/或多萜類化合 物）。如本文所用，明確地將"異戊二烯"從"類異戊二烯"的定義中排除。
[0076] 如本文所用，術(shù)語"質(zhì)量產(chǎn)率"是指重組細(xì)胞（如細(xì)菌細(xì)胞）所產(chǎn)生的產(chǎn)物的質(zhì)量 除以重組細(xì)胞所耗費的葡萄糖的質(zhì)量乘以100。
[0077] 所謂"比生產(chǎn)率"，其意指細(xì)菌細(xì)胞所生成的產(chǎn)物的質(zhì)量除以產(chǎn)生產(chǎn)物的時間、細(xì) 胞密度和培養(yǎng)物體積。
[0078] 所謂"滴度"，其意指重組細(xì)胞（例如細(xì)菌細(xì)胞）所產(chǎn)生的產(chǎn)物的質(zhì)量除以培養(yǎng)物 的體積。
[0079] 如本文所用，術(shù)語"細(xì)胞生產(chǎn)力指數(shù)（CPI) "是指重組細(xì)胞（如細(xì)菌細(xì)胞）所產(chǎn)生 的產(chǎn)物的質(zhì)量除以培養(yǎng)物中產(chǎn)生的重組細(xì)胞的質(zhì)量。
[0080] 除非另外定義，否則本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語均具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普 通技術(shù)人員所一般理解的含義相同的含義。
[0081] 如本文所用，除非上下文另有明確說明，否則單數(shù)"一個"、"一種"和"該"包括復(fù) 數(shù)指代。
[0082] 在本說明書通篇中給出的每一最大數(shù)值限度旨在包括每一較低數(shù)值限度，就如同 此類較低數(shù)值限度在本文中明確地寫出一樣。在本說明書通篇中給出的每一最小數(shù)值限度 將包括每一較高數(shù)值限度，就如同此類上限值在本文中明確地寫出一樣。在本說明書通篇 中給出的每一個數(shù)值范圍將包括落入此類較寬數(shù)值范圍內(nèi)的每一個較窄數(shù)值范圍，就如同 此類較窄數(shù)值范圍在本文中全部明確地寫出一樣。
[0083] 能夠增大異戊二烯的產(chǎn)量的重纟目微牛物
[0084] 異戊二烯（2-甲基-1，3-丁二烯）是在大量應(yīng)用中使用的重要有機化合物。例如， 異戊二烯在多種化學(xué)組合物和聚合物的合成中，包括在合成橡膠的制備中用作中間體或原 料。異戊二烯也是由許多植物和動物天然合成的重要生物材料。甲羥戊酸依賴性生物合成 途徑（MVA途徑）是所有高等真核生物和某些細(xì)菌中存在的關(guān)鍵代謝途徑。除了對蛋白質(zhì) 異戊二烯化、細(xì)胞膜維持、蛋白質(zhì)錨定和N-糖基化等各種各樣的過程中所用的分子的產(chǎn)生 是重要的外，甲羥戊酸途徑還提供二甲基烯丙基二磷酸（DMAPP)和異戊烯二磷酸（IPP)的 主要來源，這些分子充當(dāng)類異戊二烯和異戊二烯二者的生物合成的基礎(chǔ)。
[0085] 類異戊二烯化合物如異戊烯基tRNA、類異戊二烯醌和糖載體脂質(zhì)由包括大腸桿菌 在內(nèi)的許多微生物作為正常代謝的一部分合成（Fujisaki等人，（1989)J.Bacteri 〇l.(《細(xì) 菌學(xué)雜志》）171:5654-5658)。用于類異戊二烯化合物產(chǎn)生的合成途徑的分支點涉及由酶法 尼基二磷酸（FPP)合酶催化的反應(yīng)，該酶使IPP與DMAPP或香葉基二磷酸（GPP)縮合而生 成FPP。FPP合酶（EC: 2. 5. 1. 10)屬于轉(zhuǎn)移酶家族的酶，具體地講是能夠在代謝反應(yīng)中轉(zhuǎn)移 芳基或除了甲基之外的烷基的那些酶。FPP合酶的其他通用名稱包括香葉基轉(zhuǎn)移酶、香葉基 轉(zhuǎn)移酶I、異戊烯基轉(zhuǎn)移酶、法尼基焦磷酸合成酶和法尼焦磷酸合成酶。
[0086] 如上所述，DMAPP和IPP為類異戊二烯和異戊二烯二者的生物合成提供了初始碳 源輸入。異戊二烯合酶使用這些分子來催化異戊二烯的產(chǎn)生而FPP合酶則利用它們來產(chǎn)生 GPP和FPP-這兩者則進一步被合成為更大分子量的類異戊二烯分子。因而，不受理論束縛， 據(jù)信對于工程改造為產(chǎn)生異戊二烯的重組細(xì)胞，F(xiàn)PP合酶的酶活性通過使可供由異戊二烯 合酶轉(zhuǎn)化成異戊二烯的DMAPP和IPP分子較少而導(dǎo)致供異戊二烯產(chǎn)生的碳可利用率降低。 此外，重組細(xì)胞中或由于別的原因易于發(fā)生類異戊二烯積聚的細(xì)胞中類異戊二烯產(chǎn)量增加 與差的形態(tài)和降低的細(xì)胞活力相關(guān)。
[0087] 在諸如大腸桿菌之類的微生物中，F(xiàn)PP合酶由ispA基因編碼（Fukisaki等人， (1990)，J.Biochem.(《生物化學(xué)雜志》）108:995-1000)。ispA基因與如下兩個其他基因位 于操縱子中：dxs基因，其編碼脫氧木酮糖-5-磷酸合酶（DXS)，以及xseB基因，其產(chǎn)生外 切核酸酶 VII 小亞基（Lois 等人，（1998 年 3 月 3 日）Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.(《美 國國家科學(xué)院院刊》）95 (5) :2105-2110)。IspA基因表達(dá)據(jù)報道是微生物穩(wěn)健生長所需 的，因為完全移除該基因會產(chǎn)生生長速率低于野生型株系的生長速率的細(xì)胞（Fukisaki等 人，2005, J. Biochem.(《生物化學(xué)雜志》）137(3) :395-400)或?qū)е录?xì)胞致死（www. genome-wise, edu/resources/essential. htm ;Baba 等人， 2006, Mol. Syst. Biol. (《分子系 統(tǒng)生物 學(xué)》）2006. 0008)。
[0088] 已工程改造為產(chǎn)生異戊二烯的重組細(xì)胞在培養(yǎng)中可表現(xiàn)具有兩個階段：1)生長 階段，其中重組細(xì)胞以線性方式分裂，和2)發(fā)酵階段，其中細(xì)胞利用碳源（如葡萄糖）來產(chǎn) 生異戊二烯。因而，在一些實施例中，重組細(xì)胞包含具有降低的功能活性的ispA。在一個方 面，ispA的功能活性僅在細(xì)胞培養(yǎng)的發(fā)酵階段期間降低。在另一個方面，ispA的功能活性 在細(xì)胞培養(yǎng)期間的線性生長階段期間不降低。在一些方面，ispA的功能活性在細(xì)胞培養(yǎng)的 生長階段和發(fā)酵階段二者中均降低。在又一個方面，ispA的功能活性在細(xì)胞培養(yǎng)的生長階 段和發(fā)酵階段二者中均降低，但是在發(fā)酵階段的降低較大。
[0089] 可將任何方法用于降低ispA的功能活性，例如但不限于缺失ispA基因、降低ispA 基因表達(dá)或降低由ispA基因編碼的多肽的活性或可利用率。在其他方面，本發(fā)明的重組 細(xì)胞包含具有降低的功能活性的ispA和涉及異戊二烯生物合成的一組基因中的一種或多 種，所述一組基因使得能在宿主微生物中合成異戊二烯。在另一個方面，本發(fā)明的重組宿主 細(xì)胞包含為了在宿主細(xì)胞中表達(dá)而經(jīng)密碼子優(yōu)化的重組ispA基因。在一些方面，密碼子優(yōu) 化的ispA基因整合進宿主基因組中。在其他方面，密碼子優(yōu)化的ispA基因在一段染色體 外DNA (如質(zhì)粒）上表達(dá)。在另一個方面，密碼子優(yōu)化的ispA基因在yhfS基因座處整合進 宿主細(xì)胞基因組中并且內(nèi)源ispA基因缺失。
[0090] 在一些方面，本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞包含重組ispA基因，該重組ispA基因編碼的 FPP合酶（例如禽FPP合酶）對DMAPP的Km值與內(nèi)源編碼的FPP合酶所展現(xiàn)的對DMAPP 的Km值相比增加。這種高Km FPP合酶已經(jīng)例如在Fernandez等人，Biochemistry (《生 物化學(xué)》)2000,39(50) :15316-21中進行了描述。在其他方面，本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞可包 含具有不同最適溫度的FPP合酶（例如但不限于在Koyama等人，1993，J.Biochem.(《生 物化學(xué)雜志》），113(3) :355-363中描述的嗜熱FPP合酶）、嗜冷FPP合酶（如在Nichols 等人，2004, J.Bact.(《細(xì)菌學(xué)雜志》）186:8508-8515中描述的FPP合酶，將其公開內(nèi)容以 引用方式全文并入本文）或來自海洋原核生物的FPP合酶（如在Ranzer等人，2009, Mar. Biotechnol (《海洋生物技術(shù)》），11:62-73中描述的FPP合酶）。在一些方面，任何本文所 述重組細(xì)胞中的內(nèi)源宿主細(xì)胞ispA基因被替換為編碼本文所述FPP合酶的任何備選基因。 在其他方面，重組ispA基因設(shè)置于誘導(dǎo)型啟動子或組成型啟動子的控制之下。在另一個方 面，重組ispA基因在多拷貝質(zhì)粒上表達(dá)。在又一方面，重組ispA基因整合進宿主細(xì)胞的染 色體中。
[0091] 在一些方面，本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞包含處于弱啟動子（即驅(qū)動ispA基因表達(dá)的 啟動子，其中表達(dá)量低于對于內(nèi)源或野生型ispA啟動子所觀察到的表達(dá)量）的控制下的 ispA基因。在一些方面，與發(fā)酵階段期間的ispA基因表達(dá)相比，在細(xì)胞培養(yǎng)期間的線性生 長階段，控制ispA基因表達(dá)的啟動子可以較高水平表達(dá)ispA基因。
[0092] ispA的降低的功能活件
[0093] 在一些方面，本文所述的重組細(xì)胞包含具有降低的功能活性的ispA。在該語境中 的"降低的功能活性"是指ispA多肽（例如由ispA基因編碼的多肽）將IPP和DMAPP轉(zhuǎn) 化為GPP和/或FPP (即后續(xù)產(chǎn)生類異戊二烯所必需的分子）的能力。在一些方面，任何本 文所公開的重組細(xì)胞可包含ispA基因，其中ispA的功能活性降低而使得與不包含具有降 低的功能活性的ispA的細(xì)胞中的GPP和/或FPP濃度相比，該細(xì)胞產(chǎn)生的GPP和/或FPP 濃度小于約 1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、 40 %、45 %、50 %、60 %、70 %、80 %、90 %或100 % (包括這些百分?jǐn)?shù)，且包括這些值之間的 任何百分?jǐn)?shù)）。在另一個方面，與包含一種或多種編碼MVA途徑的一個或多個成員的異源 核酸但不包含具有降低的功能活性的ispA的重組細(xì)胞中的GPP和/或FPP濃度相比，包含 一種或多種編碼具有異戊二烯合酶活性的多肽的異源核酸、一種或多種編碼MVA途徑的一 個或多個成員的異源核酸和具有降低的功能活性的ispA、已工程改造為產(chǎn)生異戊二烯的重 組細(xì)胞產(chǎn)生的GPP和/或FPP濃度小于約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、 15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90% 或 100% (包括這些 百分?jǐn)?shù)，且包括這些值之間的任何百分?jǐn)?shù)）。
[0094] 在其他方面，任何本文所公開的重組細(xì)胞可包含ispA，其中ispA的功能活性降低 而使得與不包含具有降低的功能活性的ispA的細(xì)胞中的類異戊二烯濃度相比，該細(xì)胞產(chǎn) 生的類異戊二烯濃度小于約 1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、 25 %、30 %、35 %、40 %、45 %、50 %、60 %、70 %、80 %、90 % 或 100 % (包括這些百分?jǐn)?shù)，且 包括這些值之間的任何百分?jǐn)?shù)）。在其他方面，任何本文所公開的重組細(xì)胞可包含ispA， 其中ispA基因的功能活性降低而使得與不包含具有降低的功能活性的ispA的細(xì)胞的活 力相比，該細(xì)胞表現(xiàn)出約 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100% (包括這些百分?jǐn)?shù)，且包括這些值之 間的任何百分?jǐn)?shù)）的改善的活力中的任一者。在另一個方面，與包含一種或多種編碼MVA 途徑的一個或多個成員的異源核酸但不包含具有降低的功能活性的ispA的細(xì)胞的活力相 t匕，包含一種或多種編碼MVA途徑的一個或多個成員的異源核酸和具有降低的功能活性 的ispA、已工程改造為產(chǎn)生異戊二烯的重組細(xì)胞可表現(xiàn)出約5%、10 %、15%、20%、25 %、 30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95% 或 100% (包括這些百分?jǐn)?shù)，且包括這些值之間的任何百分?jǐn)?shù)）的改善的活力中的任一者。如本文 所用，"改善的活力"意指在發(fā)酵過程期間產(chǎn)生較少的死亡、瀕死或另外在形態(tài)學(xué)上異常的 細(xì)胞。形態(tài)異?？砂ǖ幌抻谏扉L的細(xì)胞和/或來自死亡或瀕死細(xì)胞的細(xì)胞碎片。在一 些實施例中，"改善的活力"可意指較大數(shù)目的細(xì)胞通過本領(lǐng)域已知的細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)、分 子生物學(xué)技術(shù)或生物化學(xué)技術(shù)（如但不限于熒光激活細(xì)胞分選（FACS)或者DiBAC4(3)染 色）測定是有活力的。在一些方面，ispA功能活性在發(fā)酵的峰值異戊二烯產(chǎn)生階段期間降 低。在其他方面，ispA功能活性在發(fā)酵的線性生長階段期間不降低。
[0095] 測量ispA功能活性降低的方法有很多并且是本領(lǐng)域眾所周知的。例如，可將標(biāo)準(zhǔn) 方法用于確定細(xì)胞中的代謝物（例如FPP和GPP)產(chǎn)量，例如通過從全細(xì)胞用化學(xué)方法提取 代謝物，然后通過質(zhì)譜法鑒定。相似地，可將標(biāo)準(zhǔn)方法用于測定具有降低的ispA功能活性 的細(xì)胞的活力，例如通過顯微鏡法進行的形態(tài)分析和通過評估膜電位。膜電位保持不變的 細(xì)胞被認(rèn)為是活的和代謝活躍的，而沒有膜電位的細(xì)胞被認(rèn)為是死亡的和代謝惰性的。
[0096] ispA某閔的降低的表汰
[0097] 在一些方面，通過降低ispA基因的表達(dá)來降低ispA基因的功能活性。這可包括 缺失ispA基因本身（全部缺失或部分缺失），或通過用多種本文所述方法或本領(lǐng)域技術(shù)人 員已知方法來降低其表達(dá)。在一些方面，可將啟動子工程轉(zhuǎn)入細(xì)胞來控制ispA基因的表 達(dá)。在一個方面，驅(qū)動ispA基因表達(dá)的啟動子可因為類異戊二烯化合物的積聚增加而受到 抑制。當(dāng)引入這種啟動子來控制ispA的表達(dá)時，ispA可在對應(yīng)于流通過類異戊二烯途徑 的期間受到阻遏。然而，在通量低的期間，啟動子保持受到誘導(dǎo)并因而允許ispA表達(dá)。
[0098] 經(jīng)由自動調(diào)節(jié)啟動子講行的時序調(diào)節(jié)的表汰降低
[0099] 在一些方面，ispA基因表達(dá)通過將ispA基因設(shè)置于自動調(diào)節(jié)啟動子的控制下來 降低。在某些實施例中，可將僅在已工程改造為產(chǎn)生增加水平的異戊二烯的重組細(xì)胞的后 期發(fā)酵期間受阻遏的啟動子用于降低ispA基因的功能活性。不受理論束縛，假設(shè)這種啟動 子在類異戊二烯化合物隨發(fā)酵進行而積聚增加期間受到阻遏。因而，將ispA基因設(shè)置于這 些啟動子的控制之下可用于時序調(diào)節(jié)ispA的表達(dá)，使得在對應(yīng)于通過類異戊二烯途徑的 通量增加的時期發(fā)生ispA阻遏。然而，在類異戊二烯途徑通量低的時期，例如在發(fā)酵的線 性生長階段期間，則啟動子將保持受到誘導(dǎo)并從而允許ispA基因的表達(dá)。該標(biāo)記式活性譜 (signature activity profile)構(gòu)成了自動調(diào)節(jié)ispA表達(dá)控制系統(tǒng)。
[0100] 因此，在一些方面，任何本文所述重組細(xì)胞可包含具有降低的功能活性的ispA基 因，其中通過將ispA基因設(shè)置于自動調(diào)節(jié)啟動子的控制之下來降低ispA基因的功能活性。 在一些方面，自動調(diào)節(jié)啟動子選自：efeO、kpsC、kpsD、kpsD、kpsE、kpsF、kpsS、kpsU、nmpC、 sodA、ybll29、ybll30、ybll31、yddV 和 ydiU。在一個方面，將 ispA 基因設(shè)置于 yddV 啟動 子的控制之下。在其他方面，可從重組細(xì)胞（例如，重組大腸桿菌細(xì)胞）的基因組缺失內(nèi)源 ispA基因，并且可將新的ispA基因在一不同基因座處替代進基因組中。在一個方面，將異 源ispA基因在yhfS基因座處插入進重組細(xì)胞（例如，重組大腸桿菌細(xì)胞）的基因組中。 該異源ispA基因可以與缺失的內(nèi)源ispA基因相同或可為來自另一來源的ispA基因。在 其他方面，處于自動調(diào)節(jié)啟動子的控制之下的異源ispA基因在染色體外表達(dá)。在另一個 方面，本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞包含為了在宿主細(xì)胞中表達(dá)而經(jīng)密碼子優(yōu)化的重組ispA基 因。在一些方面，密碼子優(yōu)化的ispA基因整合進宿主基因組中。在另一個方面，密碼子優(yōu) 化的ispA基因處于選自如下的自動調(diào)節(jié)啟動子的控制之下：efeO、kpsC、kpsD、kpsD、kpsE、 kpsF、kpsS、kpsU、nmpC、sodA、ybll29、ybll30、ybll31、yddV 和 ydiU。在一些方面，密碼子 優(yōu)化的ispA基因處于yddV啟動子的控制之下。在又一個方面，任何本文所述的自動調(diào)節(jié) 啟動子可驅(qū)動選自如下的ispA基因的表達(dá)：密碼子優(yōu)化的ispA、編碼的酶與來自微生物的 ispA編碼的酶相比具有較高的Km的ispA等位基因（例如，禽ispA等位基因）和內(nèi)源ispA 等位基因。
[0101] 在一些方面，與不包含處于自動調(diào)節(jié)啟動子控制之下的ispA基因的細(xì)胞中的GPP 和/或FPP濃度相比，表達(dá)處于自動調(diào)節(jié)啟動子控制之下的ispA基因的重組細(xì)胞（如任何 本文所公開的重組細(xì)胞）產(chǎn)生的GPP和/或FPP濃度小于約1%、2%、3%、4%、5%、6%、 7%,8%,9 %U0%>15%,20 %,25%,30%,35 %,40%,45%,50 %,60%,70%,80 %,90% 或100% (包括這些百分?jǐn)?shù)，且包括這些值之間的任何百分?jǐn)?shù)）。在另一個方面，與包含一 種或多種編碼MVA途徑的一個或多個成員的異源核酸但不包含處于自動調(diào)節(jié)啟動子控制 之下的ispA基因的重組細(xì)胞中的GPP和/或FPP濃度相比，包含一種或多種編碼MVA途徑 的一個或多個成員的異源核酸和處于自動調(diào)節(jié)啟動子控制之下的ispA基因、工程改造為 產(chǎn)生異戊二烯的重組細(xì)胞產(chǎn)生的GPP和/或FPP濃度小于約1%、2%、3%、4%、5%、6%、 7 %,8%,9%U0 %>15%,20%,25 %,30%,35%,40 %,45%,50%,60 %,70%,80%,90 % 或100% (包括這些百分?jǐn)?shù)，且包括這些值之間的任何百分?jǐn)?shù)）。在一些方面，與不包含處于 自動調(diào)節(jié)啟動子控制之下的ispA基因的細(xì)胞中的類異戊二烯濃度相比，表達(dá)處于自動調(diào) 節(jié)啟動子控制之下的ispA基因的重組細(xì)胞（如任何本文所公開的重組細(xì)胞）產(chǎn)生的類異 戊二烯濃度小于約 1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、 35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90%或100% (包括這些百分?jǐn)?shù)，且包括這些值之 間的任何百分?jǐn)?shù)）。在其他方面，與不包含處于自動調(diào)節(jié)啟動子控制之下的ispA基因的細(xì) 胞的活力相比，表達(dá)處于自動調(diào)節(jié)啟動子控制之下的ispA基因的重組細(xì)胞（如任何本文所 公開的重組細(xì)胞）表現(xiàn)出 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%(包括這些百分?jǐn)?shù)，且包括這些值之 間的任何百分?jǐn)?shù)）的改善的活力中的任一者。在另一個方面，與包含一種或多種編碼MVA 途徑的一個或多個成員的異源核酸但不包含處于自動調(diào)節(jié)啟動子控制之下的ispA基因的 細(xì)胞的活力相比，包含一種或多種編碼MVA途徑的一個或多個成員的異源核酸和處于自動 調(diào)節(jié)啟動子控制之下的ispA基因、工程改造為產(chǎn)生異戊二烯的重組細(xì)胞可表現(xiàn)出約5%、 10 % U5 %,20 %,25 %,30 %,35 %,40 %,45 %,50 %,55 %,60 %,65 %,70 %,75 %,80 %, 85%、90%、95%或100% (包括這些百分?jǐn)?shù)，且包括這些值之間的任何百分?jǐn)?shù)）的改善的活 力中的任一者。
[0102] 通討異源陽遏蛋白HrcA講行的時序調(diào)節(jié)的表汰降低
[0103] 控制ispA表達(dá)的一種備選方法利用新月柄桿菌（Caulobacter crescentus)的 轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白HrcA(Roberts等人，1996，Journal of Bacteriology(《細(xì)菌學(xué)雜志》）， 178(7):1829-1841 ;Susin 等人，2004，Journal of Bacteriology (《細(xì)菌學(xué)雜志》）， 186(20) :6759-6767)。編碼HrcA的基因不天然存在于大腸桿菌中并且沒有已知的信息表 明CIRCE元件（為HrcA所識別）涉及控制大腸桿菌基因表達(dá)。因此，將CIRCE元件摻入進 控制大腸桿菌異戊二烯產(chǎn)生系統(tǒng)內(nèi)的ispA表達(dá)的調(diào)節(jié)序列內(nèi)將會允許HrcA-介導(dǎo)的ispA 阻遏。此外，可將異源hrcA基因引入進大腸桿菌產(chǎn)異戊二烯宿主中，在該宿主中其表達(dá)可 通過多種嚴(yán)格調(diào)節(jié)手段中的至少一種來控制。
[0104] 因此，在一些方面，任何本文所述重組細(xì)胞可包含具有降低的功能活性的ispA基 因，其中通過由hrcA基因編碼的HrcA轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白降低ispA基因的功能活性并且其中將 CIRCE元件工程改造進控制ispA表達(dá)的調(diào)節(jié)序列中。在一些方面，通過線性生長階段調(diào)節(jié) 啟動子控制hrcA表達(dá)，所述啟動子是在整個大規(guī)模產(chǎn)異戊二烯發(fā)酵中細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄譜內(nèi)鑒 別的。在一些方面，線性生長階段調(diào)節(jié)啟動子選自〇tsA、amiB和deoC。
[0105] 在其他方面，可通過正調(diào)節(jié)回路（positive regulatory-loop)控制hrcA表 達(dá)，該正調(diào)節(jié)回路自身經(jīng)由誘導(dǎo)信號（如嚴(yán)重營養(yǎng)限制或改變的溫度）在所需的發(fā)酵緩 慢生長階段打開。在該方面，反式激活肽如反式激活蛋白T與特定的信號感測啟動子 (signal-sensing promoter)功能性連接。引入誘導(dǎo)信號將會誘導(dǎo)該信號感測啟動子的活 性，其繼而上調(diào)反式激活蛋白T的表達(dá)。通過將另外拷貝的反式激活蛋白T基因連接至反 式激活蛋白T依賴性啟動子，正反饋回路被引發(fā)并且一旦移除誘導(dǎo)信號就得到維持。在其 他方面，將hrcA基因連接至至少一個反式激活蛋白T依賴性啟動子，從而導(dǎo)致在正調(diào)節(jié)回 路激活之后的期間HrcA連續(xù)表達(dá)。在某些方面，由轉(zhuǎn)錄激活蛋白T依賴性啟動子驅(qū)動的反 式激活蛋白T基因位于與hrcA基因相同的操縱子上。在其他方面，由轉(zhuǎn)錄激活蛋白T依賴 性啟動子驅(qū)動的反式激活蛋白T基因位于不含hrcA基因的獨立基因座中。
[0106] 在一些方面，與不包含處于HrcA阻遏蛋白控制之下的ispA基因的細(xì)胞中的GPP 和/或FPP濃度相比，表達(dá)處于HrcA阻遏蛋白控制之下的ispA基因的重組細(xì)胞（如任何 本文所公開的重組細(xì)胞）產(chǎn)生的GPP和/或FPP濃度小于約1 %、2 %、3 %、4 %、5 %、6 %、 7 %,8%,9%U0 %>15%,20%,25 %,30%,35%,40 %,45%,50%,60 %,70%,80%,90% 或100% (包括這些百分?jǐn)?shù)，且包括這些值之間的任何百分?jǐn)?shù)）。在另一個方面，與包含一種 或多種編碼MVA途徑的一個或多個成員的異源核酸但不包含處于HrcA阻遏蛋白控制之下 的ispA基因的重組細(xì)胞中的GPP和/或FPP濃度相比，包含一種或多種編碼MVA途徑的一 個或多個成員的異源核酸和處于HrcA阻遏蛋白控制之下的ispA基因、工程改造為產(chǎn)生異 戊二烯的重組細(xì)胞產(chǎn)生的GPP和/或FPP濃度小于約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、 9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90%或 100% (包括這些百分?jǐn)?shù)，且包括這些值之間的任何百分?jǐn)?shù)）。在一些方面，與不包含處于HrcA阻 遏蛋白控制之下的ispA基因的細(xì)胞中的類異戊二烯濃度相比，表達(dá)處于HrcA阻遏蛋白控 制之下的ispA基因的重組細(xì)胞（如任何本文所公開的重組細(xì)胞）產(chǎn)生的類異戊二烯濃度 小于約 1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、 45 %、50 %、60 %、70 %、80 %、90 %或100 % (包括這些百分?jǐn)?shù)，且包括這些值之間的任何百 分?jǐn)?shù)）。在其他方面，與不包含處于HrcA阻遏蛋白控制之下的ispA基因的細(xì)胞的活力相 t匕，表達(dá)處于HrcA阻遏蛋白控制之下的ispA基因的重組細(xì)胞（如任何本文所公開的重組 細(xì)胞）表現(xiàn)出 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、 70%、75%、80%、85%、90%、95%或100% (包括這些百分?jǐn)?shù)，且包括這些值之間的任何百 分?jǐn)?shù)）的改善的活力中的任一者。在另一個方面，與包含一種或多種編碼MVA途徑的一個 或多個成員的異源核酸但不包含處于HrcA阻遏蛋白控制之下的ispA基因的細(xì)胞的活力相 t匕，包含一種或多種編碼MVA途徑的一個或多個成員的異源核酸和處于HrcA阻遏蛋白控制 之下的ispA基因、工程改造為產(chǎn)生異戊二烯的重組細(xì)胞可表現(xiàn)出約5%、10%、15%、20%、 25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95% 或 100% (包括這些百分?jǐn)?shù)，且包括這些值之間的任何百分?jǐn)?shù)）的改善的活力中的任一者。
[0107] 通過木糖調(diào)節(jié)的i sdA表汰講行的時序調(diào)節(jié)的表汰降低
[0108] 通過碳源可利用率介導(dǎo)的受調(diào)節(jié)的基因表達(dá)是控制生產(chǎn)宿主（例如大腸桿菌生 產(chǎn)宿主）內(nèi)的ispA基因表達(dá)的另一可放大的備選方法。這種方法使得能夠提供健康穩(wěn)健快 速生長的細(xì)胞所需的相對正常和/或足夠水平的ispA基因表達(dá)，從而快速產(chǎn)生生物量。此 夕卜，當(dāng)據(jù)信FPP合酶活性對細(xì)胞活力有害從而導(dǎo)致從葡萄糖產(chǎn)生的異戊二烯產(chǎn)率降低時， 這種方法使得能夠限制葡萄糖支持的異戊二烯產(chǎn)生期間的ispA表達(dá)。
[0109] 因此，在一些方面，任何本文所述重組細(xì)胞可包含具有降低的功能活性的ispA基 因，其中通過將ispA基因設(shè)置于木糖調(diào)節(jié)的啟動子的控制之下來降低ispA基因的功能活 性。在一些方面，重組細(xì)胞（如重組大腸桿菌細(xì)胞）中的ispA表達(dá)設(shè)置在重組細(xì)胞內(nèi)的 內(nèi)源xylA或xylF啟動子的直接控制之下或處于由D-木糖正向影響和由葡萄糖負(fù)向影響 的任何啟動子的控制之下。這可通過缺失內(nèi)源ispA基因和替代處于xylA或xylF D-木 糖響應(yīng)啟動子的控制下的異源ispA來實現(xiàn)。大腸桿菌反向xylA-xylF啟動子及它們經(jīng) 由D-木糖進行的正向調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)錄激活因子XylR以及它們由葡萄糖進行的負(fù)向調(diào)節(jié)和分 解代謝物阻遏已經(jīng)有所描述（S. Song和C. Park, 1997, J. Bacterial.(《細(xì)菌學(xué)雜志》）， 179(22) :7025-7032)。在一些方面，ispA基因表達(dá)通過在不存在葡萄糖時木糖的可利用 性來正向控制以及通過葡萄糖的存在來負(fù)向控制。在一些方面，木糖誘導(dǎo)型ispA基因座 存在于重組細(xì)胞（如重組大腸桿菌細(xì)胞）的染色體內(nèi)，但作為另一種選擇，也可在染色體 外核苷酸序列如質(zhì)粒上編碼。木糖誘導(dǎo)型ispA構(gòu)建體的構(gòu)造以及其向產(chǎn)異戊二烯大腸桿 菌宿主中的引入可使用標(biāo)準(zhǔn)的分子和微生物學(xué)技術(shù)來進行（J. Sambrook, E. F. Fritsch和 T.Maniatis Cold Spring Harbor Laboratory Press (冷泉港實驗室出版社），NY. 1989)。
[0110] 在一些方面，與不包含處于木糖誘導(dǎo)型啟動子控制之下的ispA基因的細(xì)胞中的 GPP和/或FPP濃度相比，表達(dá)處于木糖誘導(dǎo)型啟動子控制之下的ispA基因的重組細(xì)胞（如 任何本文所公開的重組細(xì)胞）產(chǎn)生的GPP和/或FPP濃度小于約1%、2%、3%、4%、5%、 6 %,7%,8%,9 %U0%>15%,20 %,25%,30%,35 %,40%,45%,50 %,60%,70%,80 %, 90%或100% (包括這些百分?jǐn)?shù)，且包括這些值之間的任何百分?jǐn)?shù)）。在另一個方面，與包含 一種或多種編碼MVA途徑的一個或多個成員的異源核酸但不包含處于木糖誘導(dǎo)型啟動子 控制之下的ispA基因的重組細(xì)胞中的GPP和/或FPP濃度相比，包含一種或多種編碼MVA 途徑的一個或多個成員的異源核酸和處于木糖誘導(dǎo)型啟動子控制之下的ispA基因、工程 改造為產(chǎn)生異戊二烯的重組細(xì)胞產(chǎn)生的GPP和/或FPP濃度小于約1%、2%、3%、4%、5%、 6%,7%,8 %,9%U0%>15 %,20%,25%,30 %,35%,40%,45 %,50%,60%,70 %,80%, 90%或100% (包括這些百分?jǐn)?shù)，且包括這些值之間的任何百分?jǐn)?shù)）。在一些方面，與不包 含處于木糖誘導(dǎo)型啟動子控制之下的ispA基因的細(xì)胞中的類異戊二烯濃度相比，表達(dá)處 于木糖誘導(dǎo)型啟動子控制之下的ispA基因的重組細(xì)胞（如任何本文所公開的重組細(xì)胞） 產(chǎn)生的類異戊二烯濃度小于約 1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、 25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90%或100%(包括這些百分?jǐn)?shù)，且包 括這些值之間的任何百分?jǐn)?shù)）。在其他方面，與不包含處于木糖誘導(dǎo)型啟動子控制之下的 ispA基因的細(xì)胞的活力相比，表達(dá)處于木糖誘導(dǎo)型啟動子控制之下的ispA基因的重組細(xì) 胞（如任何本文所公開的重組細(xì)胞）表現(xiàn)出5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、 45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%(包括這些百分 數(shù)，且包括這些值之間的任何百分?jǐn)?shù)）的改善的活力中的任一者。在另一個方面，與包含一 種或多種編碼MVA途徑的一個或多個成員的異源核酸但不包含處于木糖誘導(dǎo)型啟動子控 制之下的ispA基因的細(xì)胞的活力相比，包含一種或多種編碼MVA途徑的一個或多個成員 的異源核酸和處于木糖誘導(dǎo)型啟動子控制之下的ispA基因、工程改造為產(chǎn)生異戊二烯的 重組細(xì)胞可表現(xiàn)出約 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、 65 %、70 %、75 %、80 %、85 %、90 %、95 %或100 % (包括這些百分?jǐn)?shù)，且包括這些值之間的 任何百分?jǐn)?shù)）的改善的活力中的任一者。
[0111] 降低的FPP合酶活件
[0112] 在一些方面，通過降低IspA蛋白FPP合酶的活性來降低ispA基因的功能活性。這 可包括抑制IspA mRNA的翻譯或通過用多種本文所述方法降解FPP合酶本身。
[0113] IsdA蛋白與蛋白水解標(biāo)簽的翻譯融合以降低蛋白質(zhì)活件
[0114] 在任何本文所述重組細(xì)胞的一些方面，通過將編碼11個氨基酸的蛋白質(zhì)標(biāo)簽的 DNA序列工程改造進ispA基因中來祀向FPP合酶進行蛋白質(zhì)水解降解（Andersen等人， 1998, Appl Environ Microbiol.(《應(yīng)用和環(huán)境微生物學(xué)》），64(6) :2240-2246)。蛋白水解 tmRNA標(biāo)簽于是在宿主細(xì)胞中靶向FPP合酶進行降解，從而降低FPP合酶活性。在一些方 面，蛋白水解標(biāo)簽融合至FPP合酶蛋白的C末端。在其他方面，蛋白水解標(biāo)簽融合至FPP合 酶蛋白的N末端。
[0115] 在一些方面，與不包含與蛋白水解標(biāo)簽融合的FPP合酶蛋白的細(xì)胞中的GPP和/ 或FPP濃度相比，表達(dá)與蛋白水解標(biāo)簽融合的FPP合酶蛋白的重組細(xì)胞（如任何本文所公 開的重組細(xì)胞）產(chǎn)生的GPP和/或FPP濃度小于約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、 9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90%或 100% (包括這些百分?jǐn)?shù)，且包括這些值之間的任何百分?jǐn)?shù)）。在另一個方面，與包含一種或多種 編碼MVA途徑的一個或多個成員的異源核酸但不包含與蛋白水解標(biāo)簽融合的FPP合酶蛋 白的重組細(xì)胞中的GPP和/或FPP濃度相比，包含一種或多種編碼MVA途徑的一個或多個 成員的異源核酸、已工程改造為產(chǎn)生異戊二烯的表達(dá)與蛋白水解標(biāo)簽融合的FPP合酶蛋 白的重組細(xì)胞（如任何本文所公開的重組細(xì)胞）產(chǎn)生的GPP和/或FPP濃度小于約1 %、 2 %,3%,4%,5 %,6 %,7%,8 %,9 % U0 % >15%,20 %,25 %,30 %,35%,40 %,45 %,50%, 60%、70%、80%、90%或100%(包括這些百分?jǐn)?shù)，且包括這些值之間的任何百分?jǐn)?shù)）。在 一些方面，與不包含與蛋白水解標(biāo)簽融合的FPP合酶蛋白的細(xì)胞中的類異戊二烯濃度相 t匕，表達(dá)與蛋白水解標(biāo)簽融合的FPP合酶蛋白的重組細(xì)胞（如任何本文所公開的重組細(xì)胞） 產(chǎn)生的類異戊二烯濃度小于約 1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、 25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90%或 100% (包括這些百分?jǐn)?shù)，且包 括這些值之間的任何百分?jǐn)?shù)）。在其他方面，與不包含與蛋白水解標(biāo)簽融合的IspA蛋白 的細(xì)胞的活力相比，表達(dá)與蛋白水解標(biāo)簽融合的FPP合酶蛋白的重組細(xì)胞（如任何本文所 公開的重組細(xì)胞）表現(xiàn)出 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%(包括這些百分?jǐn)?shù)，且包括這些值之 間的任何百分?jǐn)?shù)）的改善的活力中的任一者。在另一個方面，與包含一種或多種編碼MVA 途徑的一個或多個成員的異源核酸但不包含與蛋白水解標(biāo)簽融合的FPP合酶蛋白的細(xì)胞 的活力相比，包含一種或多種編碼MVA途徑的一個或多個成員的異源核酸和ispA基因、表 達(dá)與蛋白水解標(biāo)簽融合的FPP合酶蛋白的重組細(xì)胞（如任何本文所公開的重組細(xì)胞）可表 現(xiàn)出約約 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、 75%、80%、85%、90%、95%或100%(包括這些百分?jǐn)?shù)，且包括這些值之間的任何百分?jǐn)?shù)） 的改善的活力中的任一者。
[0116] 通丄寸j申用反.義mRNA矛口核糖體結(jié)合突變講斗〒的IspA蛋白表汰降j氏
[0117] 在一些方面，將針對ispA mRNA的反義mRNA用于防止ispA mRNA翻譯成IspA蛋 白并導(dǎo)致IspA蛋白表達(dá)降低。反義是本領(lǐng)域眾所周知的并且已經(jīng)用于大腸桿菌等生物體 中來降低諸如乙酸之類的分子的產(chǎn)生（Kim J.和Cha H.J.，2003，Biotech Bioeng.(《生 物技術(shù)和生物工程》），83:841-853)或用于工程改造過氧化氫酶敲除表型（Chan E.等人， 2010, J. Exp. Microbiol Immunol.(《實驗微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志》），14:127-134)?？墒?用如下文獻中描述的方法來制備祀向大腸桿菌的ispA基因的反義構(gòu)建體設(shè)計：Shao Y.等 人，2006, Nucleic Acids Res.(核酸研究），34:5660-5669?？墒褂门鋵Φ哪┒耸狗戳xRNA 分子穩(wěn)定化（似1^811；[1]^11等人，2006，池(316；^六(^(18 1^8.(《核酸研究》），34:6138)。在 一些方面，反義寡核苷酸長約150bp?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的任何手段（包括但不限于酶活 性測定法、蛋白質(zhì)印跡法、RNA印跡法或RT-PCR)測量由于反義mRNA處理引起的ispA mRNA 翻譯降低。
[0118] 在其他方面，通過將一個或多個突變引入位于ispA mRNA分子中的一個或多個核 糖體結(jié)合位點來降低IspA蛋白表達(dá)。引入核糖體結(jié)合突變可干擾或廢止IspA mRNA的翻 譯從而導(dǎo)致IspA蛋白表達(dá)降低?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的任何手段（包括但不限于酶活性測 定法或蛋白質(zhì)印跡法）測量由于將一個或多個突變引入位于ispA mRNA分子中的一個或多 個核糖體結(jié)合位點而引起的ispA mRNA翻譯降低。
[0119] 可使用本領(lǐng)域已知的優(yōu)化軟件鑒別具體mRNA中的核糖體結(jié)合位點（RBS)的位置。 例如，可將使用RNA熱力學(xué)參數(shù)的RBS calculator優(yōu)化軟件與Vienna RNA軟件包1. 8. 4 版（可得自 world, wide. web. tbi. univie. ac. at/ ?ivo/RNA/，Gruber 等人，（NAR, 2008)) 和用于RBS calculator的Vienna RNA模塊結(jié)合使用。這種RBS calculator優(yōu)化軟件可 用于鑒別對蛋白質(zhì)表達(dá)具有預(yù)測效果的RBS。例如，可使用RBS calculator優(yōu)化軟件鑒別 應(yīng)該會使祀標(biāo)蛋白質(zhì)（如ispA)的表達(dá)降低的RBS。
[0120] 異戊二烯合酶核酸和多狀
[0121] 在本發(fā)明的一些方面，在任何本文所述的組合物或方法中所述的重組細(xì)胞還包含 編碼異戊二烯合酶多肽或具有異戊二烯合酶活性的多肽的一種或多種核酸。在一些方面， 異戊二烯合酶多肽為內(nèi)源多肽。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的內(nèi)源核酸有效連接 至組成型啟動子。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的內(nèi)源核酸有效連接至誘導(dǎo)型啟動 子。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的內(nèi)源核酸有效連接至強啟動子。在一些方面，使 用不止一種編碼異戊二烯合酶多肽的內(nèi)源核酸（如，2個、3個、4個或更多個拷貝的編碼異 戊二烯合酶多肽的內(nèi)源核酸）。在一個特定方面，對細(xì)胞進行工程改造以相對于野生型細(xì) 胞過表達(dá)內(nèi)源異戊二烯合酶途徑多肽。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的內(nèi)源核酸有 效連接至弱啟動子。在一些方面，該異戊二烯合酶多肽為來自葛屬或楊屬或雜種例如銀白 楊X歐洲山楊的多肽。在一些方面，所述異戊二烯合酶多肽來自桉樹。
[0122] 在一些方面，異戊二烯合酶多肽為異源多肽。在一些方面，細(xì)胞包含不止一個拷貝 的編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸有 效連接至組成型啟動子。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸有效連接至誘導(dǎo) 型啟動子。在一些方面，編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸有效連接至強啟動子。在一些 方面，編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸有效連接至弱啟動子。
[0123] 編碼異戊二烯合酶多肽的核酸可整合進宿主細(xì)胞的基因組中，或者可在細(xì)胞中穩(wěn) 定表達(dá)。編碼異戊二烯合酶多肽的核酸另外可位于載體上。
[0124] 示例性異戊二烯合酶核酸包括編碼具有異戊二烯合酶多肽的至少一種活性的多 肽、多肽片段、肽或融合多肽的核酸。異戊二烯合酶多肽將二甲基烯丙基二磷酸（DMAPP)轉(zhuǎn) 化成異戊二烯。示例性的異戊二烯合酶多肽包括具有異戊二烯合酶多肽的至少一種活性的 多肽、多肽片段、肽和融合多肽。示例性的異戊二烯合酶多肽和核酸包括來自任何本文所述 來源生物體的天然多肽和核酸。此外，異戊二烯合酶的變體可具有改善的活性例如改善的 酶活性。在一些方面，異戊二烯合酶變體具有其他改善的特性，例如改善的穩(wěn)定性（如熱穩(wěn) 定性）和/或改善的可溶性。
[0125] 可使用標(biāo)準(zhǔn)的方法，通過測量多肽在體外、在細(xì)胞提取物中或在體內(nèi)將DMAPP轉(zhuǎn) 化為異戊二烯的能力，來測定該多肽是否具有異戊二烯合酶多肽活性。細(xì)胞提取物中的異 戊二烯合酶多肽活性可例如按如下文獻中所描述的進行測量：Silver等人，1995, J. Biol. Chem.(《生物化學(xué)雜志》）270:13010-13016。在一個示例性的測定法中，可在氮氣流下將 DMAPP(西格瑪公司（Sigma))蒸發(fā)至干燥并在100mM磷酸鉀緩沖液（pH8. 2)中將其再水化 至lOOmM的濃度，并保存于-200C下。為了進行該測定法，可將5mL的1M MgCl2、lmM(250mg/ ml)DMAPP、65mL的植物提取緩沖液（PEB)(50mMTris-HCl，pH8.0,20mMMgCl2,5%甘油和 2mM DTT)的溶液添加至20mL頂空小瓶中的25mL的細(xì)胞提取物中并在振動下于37°C培 養(yǎng)15分鐘，其中該小瓶具有金屬旋蓋和涂有特氟龍的硅隔膜（安捷倫科技公司（Agilent Technologies))。反應(yīng)可通過加入200μ L的250mM EDTA進行淬滅并通過GC/MS進行定量。
[0126] 在一些方面，該異戊二烯合酶多肽為植物異戊二烯合酶多肽或其變體。在一些方 面，該異戊二烯合酶多肽為來自葛屬的異戊二烯合酶或其變體。在一些方面，該異戊二烯合 酶多肽為來自楊屬的異戊二烯合酶或其變體。在一些方面，該異戊二烯合酶多肽為白楊異 戊二烯合酶多肽或其變體。在一些方面，該異戊二烯合酶多肽為葛異戊二烯合酶多肽或其 變體。在一些方面，該異戊二烯合酶多肽為來自葛屬或楊屬或雜種銀白楊X歐洲山楊的多 肽或其變體。
[0127] 在一些方面，異戊二烯合酶多肽或核酸來自豆科（Fabaceae)，例如蝶形花亞科 (Faboideae)。在一些方面，異戊二烯合酶多肽或核酸為來自如下的多肽或核酸：山葛（葛） (Sharkey 等人，2005，Plant Physiology (《植物生理學(xué)》）137:700_712)、野葛、楊（如銀 白楊、黑楊、毛果楊或銀白楊X歐洲山楊（CAC35696) (Miller等人，2001，Planta(《植物 學(xué)》）213:483-487)、山楊（如美洲山楊）（Silver 等人，1995, JBC270 (22) :13010-1316)、英 國橡樹（夏櫟（Quercus robur)) (Zimmer等人，W098/02550)或其變體。在一些方面，該 異戊二烯合酶多肽為來自山葛、野葛、美洲山楊、銀白楊、黑楊或毛果楊的異戊二烯合酶或 其變體。在一些方面，該異戊二烯合酶多肽為來自銀白楊的異戊二烯合酶或其變體。在一 些方面，異戊二烯合酶是香脂楊（Populus balsamifera)(Genbank JN173037)、美洲黑楊 (Populus deltoides)(Genbank JN173039)、弗里芒氏楊（Populus fremontii)(Genbank JNl73〇40)、大齒楊（Populus granididenta)(Genbank JNl73〇38)、柳屬（Genbank JNl73〇 43)、刺槐（Robinia pseudoacacia)(Genbank JNl73〇4l)、紫藤屬（Wisteria) (Genbank JN173042)、藍(lán)按（Eucalyptus globulus) (Genbank AB266390)或 Melaleuca alterniflora(Genbank AY279379)或其變體。在一些方面，編碼異戊二烯合酶（如來自銀 白楊的異戊二烯合酶或其變體）的核酸經(jīng)密碼子優(yōu)化。
[0128] 在一些方面，異戊二烯合酶核酸或多肽是天然存在的多肽或核酸（例如，來自楊 屬的天然存在的多肽或核酸）。在一些方面，異戊二烯合酶核酸或多肽不是野生型或天然存 在的多肽或核酸。在一些方面，異戊二烯合酶核酸或多肽是野生型或天然存在的多肽或核 酸的變體（例如，來自楊屬的野生型或天然存在的多肽或核酸的變體）。
[0129] 在一些方面，異戊二烯合酶多肽為變體。在一些方面，異戊二烯合酶多肽是野生 型或天然存在的異戊二烯合酶的變體。在一些方面，變體與野生型或天然存在的異戊二烯 合酶相比具有改善的活性，例如改善的催化活性。活性（如催化活性）的增加可為至少約 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 或 95% 中的任一者。在一些方面，諸如 催化活性之類的活性的增加為至少約1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、75倍 或100倍中的任一者。在一些方面，諸如催化活性之類的活性的增加為約10%至約100倍 (如，約20%至約100倍、約50%至約50倍、約1倍至約25倍、約2倍至約20倍或約5倍 至約20倍）。在一些方面，變體與野生型或天然存在的異戊二烯合酶相比具有改善的溶解 性。溶解性的增加可為至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95% 中的任一者。溶解性的增加可為至少約1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、75 倍或100倍中的任一者。在一些方面，溶解性的增加為約10%至約100倍（如，約20%至 約100倍、約50 %至約50倍、約1倍至約25倍、約2倍至約20倍或約5倍至約20倍）。在 一些方面，異戊二烯合酶多肽為天然存在的異戊二烯合酶的變體，并與天然存在的異戊二 烯合酶相比具有改善的穩(wěn)定性（如熱穩(wěn)定性）。在一些方面，該異戊二烯合酶多肽來自桉樹 或其變體。在其他方面，該異戊二烯合酶來自洋槐屬（Robinia)、柳屬（Salix)或白千層屬 (Melaleuca)或其變體。
[0130] 在一些方面，變體具有野生型或天然存在的異戊二烯合酶的活性的至少約10%、 至少約20 %、至少約30 %、至少約40 %、至少約50 %、至少約60 %、至少約70 %、至少 約80%、至少約90%、至少約100%、至少約110%、至少約120%、至少約130%、至少約 140 %、至少約150 %、至少約160 %、至少約170 %、至少約180 %、至少約190 %、至少約 200%。變體可與野生型或天然存在的異戊二烯合酶具有序列相似性。在一些方面，野生 型或天然存在的異戊二烯合酶的變體可與野生型或天然存在的異戊二烯合酶具有至少約 40 %,50 %,60 %,70 %,75 %,80 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %,97 %,98 %, 99%、99. 5%或99. 9%中的任一者的氨基酸序列同一性。在一些方面，野生型或天然存在 的異戊二烯合酶的變體與野生型或天然存在的異戊二烯合酶具有約70%至約99. 9%、約 75%至約99%、約80%至約98%、約85%至約97%或約90%至約95%中的任一者的氨基 酸序列同一性。
[0131] 在一些方面，變體在野生型或天然存在的異戊二烯合酶中包含突變。在一些方面， 變體具有至少一個氨基酸置換、至少一個氨基酸插入和/或至少一個氨基酸缺失。在一些 方面，變體具有至少一個氨基酸置換。在一些方面，變體與野生型或天然存在的異戊二烯合 酶之間的不同氨基酸殘基的數(shù)量可為一個或多個，例如1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50或 更多個氨基酸殘基。天然存在的異戊二烯合酶可包括來自植物的任何異戊二烯合酶，例如 葛異戊二烯合酶、楊異戊二烯合酶、英國櫟異戊二烯合酶和柳樹異戊二烯合酶。在一些方 面，變體為來自銀白楊的異戊二烯合酶的變體。在一些方面，來自銀白楊的異戊二烯合酶的 變體具有至少一個氨基酸置換、至少一個氨基酸插入和/或至少一個氨基酸缺失。在一些 方面，變體為截短的銀白楊異戊二烯合酶。在一些方面，編碼變體（如來自銀白楊的異戊二 烯合酶的變體）的核酸為密碼子優(yōu)化的（例如，基于在其中表達(dá)異源異戊二烯合酶的宿主 細(xì)胞而進行密碼子優(yōu)化的）。在一些方面，該異戊二烯合酶多肽來自桉樹或其變體。在其他 方面，該異戊二烯合酶來自洋槐屬、柳屬或白千層屬或其變體。
[0132] 本文提供的異戊二烯合酶多肽可以是W02009/132220、W02010/124146和美國專 利申請公開No. :2010/0086978中所述的任何異戊二烯合酶或異戊二烯合酶變體，將這些 專利關(guān)于異戊二烯合酶和異戊二烯合酶變體的內(nèi)容全文以引用的方式明確地并入本文。
[0133] 本文所述啟動子中的任一者（如本文所述的以及在本公開的實例中所鑒定的啟 動子，包括誘導(dǎo)型啟動子和組成型啟動子）均可用于驅(qū)動任何本文所述異戊二烯合酶的表 達(dá)。
[0134] 合適的異戊二烯合酶包括但不限于Genbank登錄號AY341431、AY316691、 AY279379、AJ457070和AY182241所標(biāo)示的那些?？捎糜诒疚乃鼋M合物或方法（包 括產(chǎn)生編碼本文所述異戊二烯合酶的微生物的方法）中的任一者的異戊二烯合酶類型 也在如下參考文獻中描述：國際專利申請公布No. W02009/076676、No. W02010/003007、 No.W02009/132220, No.W02010/031062, No.W02010/031068, No.W02010/031076, No.W02010/013077, No.W02010/031079, No.W02010/148150, No.W02010/124146, No. TO2010/078457、No. TO2010/148256 以及 Sharkey 等人，"Isoprene Synthase Genes Form A Monophyletic Clade Of Acyclic Terpene Synthases In The Tps_B Terpene Synthase Family"，Evolution (《進化》）（2012)(可在線得自 DOI: 10. 1111/evo. 12013)， 將上述參考文獻每一者以引用的方式全文并入本文。
[0135] 可制備在表A中所示的殘基位置處具有置換的各種異戊二烯合酶變體。任何本文 (包括表A、權(quán)利要求書或?qū)嵗校┧龅淖凅w均可用于本發(fā)明的組合物和方法中。在一些 方面，變體包含一個或多個（即2、3、4、5、6個等）來自表A的對應(yīng)于銀白楊的氨基酸序列 的突變。
[0136]

【權(quán)利要求】
1. 一種能夠產(chǎn)生異戊二烯的重組細(xì)胞，其中所述細(xì)胞包含具有降低的功能活性的 ispA基因和一種或多種編碼如下多肽的核酸： (a) 異戊二烯合酶多肽，其中所述異戊二烯合酶多肽由異源核酸編碼；和 (b) -種或多種甲羥戊酸（MVA)途徑多肽， 其中在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述重組細(xì)胞提供所述多肽的產(chǎn)生以及異戊二烯的合成。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組細(xì)胞，其中所述ispA基因的功能活性通過如下來降低： a. 缺失所述ispA基因； b. 降低ispA基因表達(dá)； c. 降低ispA蛋白活性； d. 降低ispA蛋白表達(dá)；或者 e. 時序調(diào)節(jié)ispA表達(dá)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組細(xì)胞，其中ispA基因表達(dá)通過將所述ispA基因設(shè)置在 弱啟動子的控制下來降低。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組細(xì)胞，其中ispA基因表達(dá)通過將所述ispA基因設(shè)置在 自動調(diào)節(jié)啟動子的控制下來降低。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組細(xì)胞，其中ispA蛋白活性通過所述ispA蛋白與蛋白水 解標(biāo)簽的翻譯融合來降低。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組細(xì)胞，其中ispA蛋白活性通過使用反義RNA來降低。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組細(xì)胞，其中ispA蛋白活性通過將一個或多個突變引入位 于ispA mRNA分子中的核糖體結(jié)合位點中來降低。
8. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組細(xì)胞，其中ispA基因表達(dá)通過HrcA轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白來降 低。
9. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組細(xì)胞，其中ispA蛋白活性通過將內(nèi)源ispA基因替換為 編碼這樣的多肽的基因來降低，所述多肽包含的針對DMAPP的Km與由內(nèi)源ispA基因編碼 的多肽的Km相比是增加的。
10. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組細(xì)胞，其中ispA蛋白活性通過將內(nèi)源ispA基因替換為 包含不同最適溫度的另一基因來降低。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項所述的重組細(xì)胞，其中所述異戊二烯合酶多肽是植物 異戊二烯合酶多肽或其變體。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的重組細(xì)胞，其中所述異戊二烯合酶多肽是來自葛屬 (Pueraria)或楊屬（Populus)或雜種銀白楊（Populus alba) X 歐洲山楊（Populus tremula)的多肽或其變體。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的重組細(xì)胞，其中所述異戊二烯合酶多肽選自山葛 (Pueraria montana)或野葛（Pueraria lobata)、美洲山楊（Populus tremuloides)、銀白 楊、黑楊（Populus nigra)、毛果楊（Populus trichocarpa)或其變體。
14. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的重組細(xì)胞，其中所述植物異戊二烯合酶多肽是葛異戊二烯 合酶多肽或其變體。
15. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的重組細(xì)胞，其中所述植物異戊二烯合酶多肽是桉樹 (Eucalyptus)異戊二烯合酶多肽或其變體。
16. 根據(jù)權(quán)利要求1-15中任一項所述的重組細(xì)胞，其中編碼（b)的一種或多種MVA途 徑多肽的所述一種或多種核酸為異源核酸。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的重組細(xì)胞，其中所述細(xì)胞包含一種或多種編碼來自MVA上 游途徑的MVA途徑多肽的核酸，其中所述MVA上游途徑核酸選自AA-輔酶A硫解酶核酸或 乙酰乙酰輔酶A合酶核酸、HMG-輔酶A合酶核酸和HMG-輔酶A還原酶核酸。
18. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的重組細(xì)胞，其中所述細(xì)胞包含一種或多種編碼來自MVA下 游途徑的MVA途徑多肽的核酸，其中所述MVA下游途徑核酸選自MVK核酸、PMK核酸和MVD 核酸。
19. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的重組細(xì)胞，其中所述細(xì)胞包含一種或多種編碼完整MVA途 徑的MVA途徑多肽的核酸。
20. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞，所述細(xì)胞進一步包含一種或多種編碼異戊烯二磷酸 δ-異構(gòu)酶（IDI)多肽的核酸。
21. 根據(jù)權(quán)利要求1-20中任一項所述的重組細(xì)胞，所述重組細(xì)胞進一步包含1-脫氧木 酮糖-5-磷酸合酶（DXS)多肽。
22. 根據(jù)權(quán)利要求21所述的重組細(xì)胞，其中所述一種或多種編碼DXS多肽的核酸是編 碼DXS多肽的異源核酸。
23. 根據(jù)權(quán)利要求21所述的重組細(xì)胞，其中所述一種或多種編碼DXS多肽的核酸是編 碼DXS多肽的內(nèi)源核酸的拷貝。
24. 根據(jù)權(quán)利要求1-23中任一項所述的重組細(xì)胞，其中所述一種或多種異源核酸被設(shè) 置于誘導(dǎo)型啟動子或組成型啟動子之下。
25. 根據(jù)權(quán)利要求1-24中任一項所述的重組細(xì)胞，其中所述一種或多種異源核酸被克 隆進多拷貝質(zhì)粒中。
26. 根據(jù)權(quán)利要求1-25中任一項所述的重組細(xì)胞，其中所述一種或多種異源核酸被整 合進所述細(xì)胞的染色體中。
27. 根據(jù)權(quán)利要求1-26中任一項所述的重組細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞、藻類細(xì) 胞、真菌細(xì)胞或酵母細(xì)胞。
28. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的重組細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞。
29. 根據(jù)權(quán)利要求28所述的細(xì)菌細(xì)胞，其中所述細(xì)菌細(xì)胞是革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞或革 蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞。
30. 根據(jù)權(quán)利要求29所述的細(xì)菌細(xì)胞，其中所述細(xì)菌細(xì)胞選自大腸桿菌（E.coli) 細(xì)胞、檸檬泛菌（P. citrea)細(xì)胞、枯草芽孢桿菌（B. subtilis)細(xì)胞、地衣芽孢桿菌 (B.licheniformis)細(xì)胞、遲緩芽胞桿菌（B. lentus)細(xì)胞、短芽孢桿菌（B. brevis)細(xì)胞、 嗜熱脂肪芽孢桿菌（B.stearothermophilus)細(xì)胞、嗜堿芽孢桿菌（B.alkalophilus)細(xì) 胞、解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens)細(xì)胞、克勞氏芽孢桿菌（B. clausii)細(xì)胞、 耐鹽芽孢桿菌（B. halodurans)細(xì)胞、巨大芽孢桿菌（B. megaterium)細(xì)胞、凝結(jié)芽孢桿菌 (B. coagulans)細(xì)胞、環(huán)狀芽孢桿菌（B. circulans)細(xì)胞、燦爛類芽孢桿菌（B. lautus)細(xì) 胞、蘇云金芽孢桿菌（B. thuringiensis)細(xì)胞、白色鏈霉菌（S. albus)細(xì)胞、變鉛青鏈霉菌 (S. lividans)細(xì)胞、天藍(lán)色鏈霉菌（S. coelicolor)細(xì)胞、灰色鏈霉菌（S. griseus)細(xì)胞、假 單胞菌屬物種（Pseudomonas sp.)細(xì)胞和產(chǎn)堿假單胞菌（P.alcaligenes)細(xì)胞。
31. 根據(jù)權(quán)利要求30所述的細(xì)菌細(xì)胞，其中所述細(xì)菌細(xì)胞是大腸桿菌。
32. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的重組細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是藻類細(xì)胞。
33. 根據(jù)權(quán)利要求32所述的藻類細(xì)胞，其中藻類細(xì)胞選自綠藻、紅藻、灰藻門、綠蜘藻、 眼蟲、色藻或腰鞭毛蟲。
34. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的重組細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是真菌細(xì)胞。
35. 根據(jù)權(quán)利要求34所述的真菌細(xì)胞，其中所述真菌細(xì)胞是絲狀真菌。
36. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的重組細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是酵母細(xì)胞。
37. 根據(jù)權(quán)利要求36所述的酵母細(xì)胞，其中所述酵母細(xì)胞選自酵母屬物種 (Saccharomyces sp.)、裂殖酵母屬物種（Schizosaccharomyces sp.)、畢赤酵母屬物種 (Pichia sp.)或假絲酵母屬物種（Candida sp.)。
38. 據(jù)權(quán)利要求37所述的酵母細(xì)胞，其中所述酵母細(xì)胞是釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)〇
39. 包含根據(jù)權(quán)利要求1-38中任一項所述的細(xì)胞的一種組合物。
40. -種產(chǎn)生異戊二烯的方法，所述方法包括：(a)在提供異戊二烯的合成的合適條件 下培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求1-38中任一項所述的重組細(xì)胞；以及（b)產(chǎn)生異戊二烯。
41. 根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其還包括回收由所述重組細(xì)胞產(chǎn)生的異戊二烯。
42. 根據(jù)權(quán)利要求40或權(quán)利要求41所述的方法，其中所述ispA基因的功能活性通過 如下來降低： a. 缺失所述ispA基因； b. 降低ispA基因表達(dá)； c. 降低ispA蛋白活性； d. 降低ispA蛋白表達(dá)；或者 e. 時序調(diào)節(jié)ispA表達(dá)。
43. 根據(jù)權(quán)利要求40-42中任一項所述的方法，其中所述異戊二烯合酶多肽是植物異 戊二烯合酶多肽或其變體。
44. 根據(jù)權(quán)利要求40-43中任一項所述的方法，其中所述異戊二烯合酶多肽是來自葛 屬或楊屬或雜種銀白楊X歐洲山楊的多肽或其變體。
45. 根據(jù)權(quán)利要求40-44中任一項所述的方法，其中所述異戊二烯合酶多肽是來自選 自山葛或野葛、美洲山楊、銀白楊、黑楊和毛果楊的多肽或其變體。
46. 根據(jù)權(quán)利要求40-43中任一項所述的方法，其中所述植物異戊二烯合酶多肽是葛 異戊二烯合酶多肽或其變體。
47. 根據(jù)權(quán)利要求40-43中任一項所述的方法，其中所述植物異戊二烯合酶多肽是桉 樹異戊二烯合酶多肽或其變體。
48. 根據(jù)權(quán)利要求40-47中任一項所述的方法，其中編碼（b)的一種或多種MVA途徑多 肽的所述一種或多種核酸為異源核酸。
49. 根據(jù)權(quán)利要求40-48中任一項所述的方法，其中所述細(xì)胞包含一種或多種編碼來 自MVA上游途徑的MVA途徑多肽的核酸，其中所述MVA上游途徑核酸選自AA-輔酶A硫解 酶核酸或乙酰乙酰輔酶A合酶核酸、HMG-輔酶A合酶核酸和HMG-輔酶A還原酶核酸。
50. 根據(jù)權(quán)利要求40-48中任一項所述的方法，其中所述細(xì)胞包含一種或多種編碼來 自MVA下游途徑的MVA途徑多肽的核酸，其中所述MVA下游途徑核酸選自MVK核酸、PMK核 酸和MVD核酸。
51. 根據(jù)權(quán)利要求40-48中任一項所述的方法，其中所述細(xì)胞包含一種或多種編碼完 整MVA途徑的MVA途徑多肽的核酸。
52. 根據(jù)權(quán)利要求40-51中任一項所述的方法，所述方法進一步包含一種或多種編碼 異戊烯二磷酸異構(gòu)酶（IDI)多肽的核酸。
53. 根據(jù)權(quán)利要求40-52中任一項所述的方法，所述方法進一步包含1-脫氧木酮 糖-5-磷酸合酶（DXS)多肽。
54. 根據(jù)權(quán)利要求40-53中任一項所述的方法，其中所述一種或多種編碼DXS多肽的核 酸是編碼DXS多肽的異源核酸。
55. 根據(jù)權(quán)利要求40-54中任一項所述的方法，其中所述一種或多種編碼DXS多肽的核 酸是編碼DXS多肽的內(nèi)源核酸的拷貝。
【文檔編號】C12N9/10GK104245927SQ201280070444
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2012年12月21日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月23日
【發(fā)明者】J·C·麥考利夫, R·E·穆爾, A·T·尼爾森, C·M·派瑞斯, D·V·瓦維林, D·H·韋爾斯 申請人:丹尼斯科美國公司, 固特異輪胎和橡膠公司