專(zhuān)利名稱(chēng)：抗宿主細(xì)胞伴隨皰疹病毒的免疫接種的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗所謂的宿主細(xì)胞伴隨(host cell associated)皰疹病毒的免疫接種領(lǐng)域，所述病毒如家禽的Marek’s病病毒(MDV)和人水痘-帶狀皰疹病毒(Varicella Zoster Virus)(VZV，從潛伏期復(fù)活后導(dǎo)致水痘和帶狀皰疹)，并涉及抗這些病毒所致疾病的免疫接種，尤其涉及家禽疾病特別是抗Marek’s病的免疫接種領(lǐng)域。
特別地，Marek’s病是從大量生產(chǎn)家禽肉開(kāi)始就存在于家禽業(yè)的一個(gè)問(wèn)題。這是一種皰疹病毒所致疾病，引起許多臨床癥狀，從免疫抑制，神經(jīng)功能失調(diào)，貧血和不明淡漠(unspecified apathies)開(kāi)始，并在感染后期以嚴(yán)重淋巴癌終止。原先對(duì)Marek’s病沒(méi)有治療和預(yù)防措施。隨后從火雞中分離了一種非致病性(apathogenic)相關(guān)的(血清型3)病毒(HVT)，并開(kāi)始用于接種。
然而，在用HVT接種后一段時(shí)間，Marek’s病再次出現(xiàn)，而變得明顯了，循環(huán)的野生病毒改變而抵御由HVT毒株引起的保護(hù)作用發(fā)生。在此時(shí)，發(fā)現(xiàn)了一種新的非致病性病毒(Rispens毒株)，其通常具有與導(dǎo)致疾病的病毒相同的血清型。這種疫苗株非常迅速進(jìn)入市場(chǎng)，并產(chǎn)生良好的接種結(jié)果。
然而，在大約10年后，發(fā)生了新的疾病爆發(fā)，循環(huán)野生病毒再一次改變而抵御由所用疫苗株引起的保護(hù)作用發(fā)生。隨后將兩種疫苗(HVT和Rispens)組合使用以對(duì)所述動(dòng)物加以保護(hù)，然而只暫時(shí)見(jiàn)到滿(mǎn)意的結(jié)果。目前，盡管使用所有的這些接種措施，仍發(fā)生了疾病的新爆發(fā)。這種現(xiàn)象的原因還不清楚，但明顯需要新的強(qiáng)力有效的疫苗。
與抗Marek’s病接種相關(guān)的問(wèn)題是盡管生產(chǎn)Marek疫苗已經(jīng)很長(zhǎng)時(shí)間了，但疫苗的制備方法沒(méi)有改良。這歸因于通常宿主細(xì)胞伴隨病毒只能生長(zhǎng)于原代宿主細(xì)胞中，如MDV或HVT生長(zhǎng)于沒(méi)有病原體的原代細(xì)胞如制備自家禽如雞的成纖維細(xì)胞中，水痘帶狀皰疹病毒生長(zhǎng)于(基本上為原代的)人細(xì)胞(同樣，當(dāng)然沒(méi)有病原體)中，而且離開(kāi)了各自宿主的特異細(xì)胞不能或非常難以獲得。這通常使得在實(shí)踐水平生產(chǎn)抗病毒感染或由這些類(lèi)型病毒所致疾病的疫苗非常困難，幾乎是不可能的，而且因此非常昂貴。
例如，抗Marek’s病的Rispens疫苗，是目前認(rèn)為唯一足夠有效的疫苗，與所有血清型-1 Marek病毒相同均是嚴(yán)格宿主細(xì)胞伴隨的。細(xì)胞伴隨病毒(例如血清型1和2)的感染性在正常冷凍或凍干期間完全喪失。因此制備這種疫苗包括非常復(fù)雜和昂貴的步驟，其中全部細(xì)胞必須在液氮中冷凍。所述疫苗必須在液氮中貯存，運(yùn)輸和保持直至使用，因此在運(yùn)輸期間成本巨大且非常困難。
隨后，在使用地點(diǎn)，所述疫苗必須非常小心使用，因?yàn)楦腥镜募?xì)胞對(duì)環(huán)境因素非常敏感。環(huán)境因素如溫度提高，暴露于光照，所用的玻璃器具上殘余的清潔劑通常會(huì)損害所述病毒，由此不能制備出足夠存活的疫苗，導(dǎo)致完全疫苗失敗。只有當(dāng)疾病已經(jīng)開(kāi)始爆發(fā)及感染的家禽顯示出疾病癥狀時(shí)，才可以意識(shí)到這種失敗。
簡(jiǎn)而言之，迄今為止提供滅活疫苗，亞單位疫苗或重組疫苗以抗Marek’s病的所有嘗試均失敗了，因此目前仍沒(méi)有選擇包含Marek’s病病毒的活的細(xì)胞伴隨疫苗的方法。Marek’s病仍然是通過(guò)應(yīng)用感染的細(xì)胞制品作為疫苗加以控制的。這些制品不僅含有懸浮于含有DMSO的培養(yǎng)基中的活細(xì)胞和所有種類(lèi)的細(xì)胞抗原，它們還必須貯存于液氮中。相繼地，冷凍環(huán)節(jié)必須從疫苗生產(chǎn)開(kāi)始至使用者直至施用為止。另外，一旦解凍，所述疫苗必須在短時(shí)間內(nèi)施用，而且每只鳥(niǎo)均要注射。由于出現(xiàn)的這些問(wèn)題，希望制備抗其它細(xì)胞伴隨皰疹病毒如水痘帶狀皰疹病毒的疫苗。
Marek’s病病毒(MDV)是皰疹病毒科(Herpesviridae)的α皰疹病毒亞科(Alphaherpesvirinae)的一個(gè)成員(Lee等，2000，Murphy等，1995)?；趯?duì)雞的毒力及誘導(dǎo)T細(xì)胞淋巴瘤的能力，MDV通常分為3個(gè)血清型(MDV-1，MDV-2和MDV-3)。MDV-3代表火雞的皰疹病毒(HVT)，其廣泛用于抗MDV相關(guān)疾病的免疫接種。然而，在免疫接種失敗及產(chǎn)生所謂的毒性或烈毒性MDV-1后(Witter，1985)，減毒的MDV-2毒株和稍后減毒的MDV-1毒株(例如毒株CVI988 Rispens)用于疫苗配制品中(Witter，1985)。近年來(lái)首先在美國(guó)報(bào)道了毒性更強(qiáng)的MDV-1，所謂的烈毒加(vv+)的MDV-1變體出現(xiàn)，并導(dǎo)致高發(fā)生率的Marek’s病，和由腫瘤發(fā)生所致的死亡率及在感染后早期免疫抑制(Witter，1997)。一種vv+毒株584A已經(jīng)在雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)上傳代100次以上，并示出對(duì)雞喪失致病性(Witter，1997)。然而，vv+MDV-1的致病性提高及喪失毒力的分子學(xué)基礎(chǔ)還不清楚，因?yàn)閷?duì)所有這些變體MDV-1病發(fā)生的分子學(xué)分析不足。原因是難以進(jìn)行分析。一方面，在培養(yǎng)的細(xì)胞中沒(méi)有或只有少量感染病毒子代釋放，另一方面，MDV-1重組的產(chǎn)生是很費(fèi)力的，及歸因于細(xì)胞培養(yǎng)物中所述制劑的高度細(xì)胞伴隨性質(zhì)，需要多次純化病毒重組(Cantello等，1991；Sakaguchi等，1993；Parcells等，1994；Schat等，1998；Anderson等，1998)。
最首要的是，如上所述，免疫接種不能保證保護(hù)動(dòng)物免于Marek’s病病毒感染。所述病毒與所有皰疹病毒一樣，能發(fā)現(xiàn)避免所述疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的方式。因此需要疫苗迅速適應(yīng)野外情況。目前，這是通過(guò)分離局野外分離株(例如HVT或Rispens)和/或在體外進(jìn)一步減毒進(jìn)行的。所述分離本身就引起極大問(wèn)題，因?yàn)殡y以從雞中獲得細(xì)胞伴隨感染性病毒及感染細(xì)胞培養(yǎng)物中的細(xì)胞。隨后的減毒步驟是非常費(fèi)力的，而且費(fèi)時(shí)，因?yàn)槭砂呒兓浅ｋy，這同樣是由于所述病毒的細(xì)胞伴隨性質(zhì)所致。
減毒的結(jié)果一般沒(méi)有確定。這些因素的結(jié)果是長(zhǎng)期以來(lái)沒(méi)有可信賴(lài)的疫苗進(jìn)入市場(chǎng)，目前的HVT和Rispens型疫苗是失敗的。另外，在生產(chǎn)疫苗期間通常發(fā)生過(guò)度減毒，因?yàn)樗霾《疽呀?jīng)傳代過(guò)多次。這進(jìn)一步加重了HVT和Rispens型疫苗的低效力。簡(jiǎn)而言之，以下問(wèn)題構(gòu)成了目前MDV控制僵局的大部分。這些問(wèn)題是傳統(tǒng)疫苗生產(chǎn)的低重復(fù)性，疫苗病毒的過(guò)度減毒，疫苗病毒減毒的不確定性，高生產(chǎn)成本，高貯存和運(yùn)輸成本，所述疫苗對(duì)環(huán)境因素的高敏感性，及新疫苗毒株尤其細(xì)胞伴隨病毒株開(kāi)發(fā)太慢。
以下事實(shí)使得這些問(wèn)題更復(fù)雜化，目前循環(huán)的野外病毒在家禽生產(chǎn)原料中產(chǎn)生高抗體效價(jià)，而這些高抗體效價(jià)通過(guò)卵中的親代抗體傳給子代。這些親代抗體在現(xiàn)有疫苗病毒的初始感染期間的影響，進(jìn)一步降低了抗Marek’s病的免疫接種的現(xiàn)有效力。
本發(fā)明提供了一種抗宿主細(xì)胞伴隨皰疹病毒感染的疫苗，所述疫苗包含衍生自所述皰疹病毒的一種重組病毒基因組，所述基因組使得重組基本沒(méi)有所述宿主細(xì)胞。由此本發(fā)明提供了衍生自據(jù)認(rèn)為是宿主細(xì)胞伴隨皰疹病毒的一種重組病毒基因組，所述基因組優(yōu)選在所述宿主細(xì)胞中至少能復(fù)制，同時(shí)使重組基本沒(méi)有或不依賴(lài)于所述宿主細(xì)胞，不再需要在真核細(xì)胞中同源重組。在詳細(xì)描述中，這樣的基因組用于預(yù)防Marek’s病樣病毒。
在此，例如將Marek’s病病毒血清型1(MDV-1)，毒株584Ap80C的基因組克隆入大腸桿菌中，作為細(xì)菌人工染色體(BAC)。在用病毒DNA和重組質(zhì)粒pDS-pHA1一起轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細(xì)胞后，BAC載體序列通過(guò)同源重組被導(dǎo)入MDV-1基因組的Us2基因座中，所述重組質(zhì)粒pDS-pHA1含有BAC序列及取代MDV-1Us2基因的Eco-gpt基因和側(cè)翼序列。將轉(zhuǎn)染子代在存在霉酚酸和黃嘌呤/次黃嘌呤的情況下，在CEF細(xì)胞上傳代。在4輪選擇后，制備病毒DNA并用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH10B。鑒別一些攜帶完整MDV-1基因組的菌落。將這些MDV-1BAC轉(zhuǎn)染入CEF細(xì)胞中，并從轉(zhuǎn)染后第3天回收感染性MDV-1。回收自各種BAC的MDV-1的生長(zhǎng)通過(guò)噬斑形成及確定生長(zhǎng)曲線分析與親代病毒無(wú)區(qū)別。
本發(fā)明因此提供了一種產(chǎn)生或獲得一種重組的、基本上為宿主細(xì)胞伴隨皰疹病毒基因組的方法，包括衍生自MDV和/或VZV分離株的(如果需要幾乎完整或完整的)感染性皰疹病毒核酸。
當(dāng)然，既然獲得了不含最初被認(rèn)為與其牢固結(jié)合的宿主細(xì)胞的基本上完整的基因組，本發(fā)明還提供了一種基因組，其使得可以全面應(yīng)用分子生物學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員已知的所有重組技術(shù)，因此例如本發(fā)明還提供了一種至少包含(復(fù)制型)小基因組的疫苗。
例如，本發(fā)明提供了一種小基因組，其只表達(dá)僅僅幾個(gè)糖蛋白(如gB，gC，gD或其組合物)，及例如ICP4或已經(jīng)示出在皰疹病毒中誘導(dǎo)細(xì)胞免疫的另一種基因產(chǎn)物?？紤]到所述基因組不再在(真核)宿主細(xì)胞中復(fù)制，這種小基因例如適合鑒別在保護(hù)方面有重要作用的基因。另外，例如在每個(gè)基因或基因構(gòu)建體之前加上HCMV或SV40啟動(dòng)子將使得最小保護(hù)單位得以最終鑒別出。針對(duì)有復(fù)制能力的小基因組，本發(fā)明還提供了缺失全部或主要部分的US區(qū)域，從而所得小病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)也復(fù)制。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了這樣的基因組，其包含衍生自所述皰疹病毒的基本上全長(zhǎng)的拷貝，所述基本上全長(zhǎng)在本文中是指所述病毒基因組的大部分基因均存在，除了一些優(yōu)選(至少功能性)缺失的基因，如病毒在宿主或宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中復(fù)制或傳播所必需的基因，如本發(fā)明的詳細(xì)描述中所提供的那些。在此，例如在根據(jù)本發(fā)明回收的一個(gè)基因組BAC20中，使用一個(gè)線性DNA片段將編碼糖蛋白B(gB)的序列通過(guò)一步recE介導(dǎo)的誘變而缺失。在gB陰性BAC20 DNA(20DgB)轉(zhuǎn)染后重構(gòu)的糖蛋白B陰性MDV-1只能在反式提供gB的細(xì)胞上生長(zhǎng)，表明gB是MDV-1在培養(yǎng)的宿主細(xì)胞中生長(zhǎng)所必需的。生長(zhǎng)所必需的并可以提供給細(xì)胞以產(chǎn)生反式基因產(chǎn)物的其它基因是gH，ICP4，UL15，UL28和UL9，或以下所列的據(jù)認(rèn)為是生長(zhǎng)所必需的另一基因。
另外，本發(fā)明提供了本發(fā)明的基因組制備疫苗的用途，在一個(gè)實(shí)施方案中，這種疫苗抗由基本上是宿主細(xì)胞伴隨皰疹病毒所致疾病，然而，在另一個(gè)實(shí)施方案中，這種疫苗可以用作載體疫苗并可以包含其它或額外的病原體或編碼其的核酸序列。針對(duì)MDV，優(yōu)選的額外病原體核酸包含衍生自例如新城疫病毒，艾美蟲(chóng)屬物種，沙門(mén)氏菌，雞傳染性貧血病毒，流感病毒，傳染性粘液囊病病毒，呼腸孤病毒或在家禽中常見(jiàn)的其它病原體的核酸。
因此，本發(fā)明還提供了一種疫苗，其中所述基因組包含功能性缺失所述皰疹病毒在宿主細(xì)胞中復(fù)制和/或傳播所必需的基因，或者其中所述病毒基因組至少包含一種核酸，所述核酸編碼一種能激發(fā)抗所述皰疹病毒對(duì)個(gè)體的感染的(優(yōu)選保護(hù)性)免疫應(yīng)答的抗原性物質(zhì)。一種典型的有待缺失的必需基因或其片段可以例如是如下基因的MDV同源物，UL1＝糖蛋白L；UL5；UL8；UL9；UL15；UL18；UL19；UL22＝糖蛋白H；UL26；UL26.5；UL27＝糖蛋白B；UL28；UL29；UL30；UL52；UL53；ICP4或選自所述基因組US區(qū)域的基因或其片段(

圖1)。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種疫苗，其包含激發(fā)特異于所述皰疹病毒的標(biāo)記免疫應(yīng)答所必需的基因的功能缺失，這樣用所述疫苗接種的個(gè)體和用所述基本上細(xì)胞伴隨皰疹病毒感染的個(gè)體之間有免疫學(xué)區(qū)別。優(yōu)選的標(biāo)記應(yīng)答例如是針對(duì)gC，gM，gD，或gE的，在詳細(xì)描述段落中進(jìn)一步說(shuō)明了(在gM情況下)在激發(fā)標(biāo)記免疫應(yīng)答的基因中的這種缺失。
另外，本發(fā)明提供了一種疫苗，其中所述病毒基因組至少包含一種編碼一種蛋白質(zhì)物質(zhì)的核酸，所述蛋白質(zhì)物質(zhì)能調(diào)節(jié)一種編碼一種能激發(fā)抗所述皰疹病毒對(duì)個(gè)體的感染的免疫應(yīng)答的抗原性物質(zhì)的核酸的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。
優(yōu)選地，所述疫苗包含一種衍生自所述皰疹病毒的基本上全長(zhǎng)的拷貝，以保持有效調(diào)節(jié)疫苗基因組在接種的宿主中轉(zhuǎn)錄和/或翻譯所需的許多功能，然而，本發(fā)明還提供了小基因組接種。當(dāng)從所述基因組中表達(dá)額外的病原體或衍生自其中的抗原性物質(zhì)時(shí)，當(dāng)然優(yōu)選有效調(diào)節(jié)編碼外源病原體或衍生自其中的抗原性物質(zhì)的核酸轉(zhuǎn)錄和/或翻譯，還應(yīng)理解的是，當(dāng)提供具有編碼額外病原體的核酸的本發(fā)明疫苗時(shí)，為所述基因組也提供了外源(即非皰疹病毒)調(diào)節(jié)元件。
特別地，本發(fā)明提供了一種疫苗，其中所述皰疹病毒包含Marek′s病樣病毒。特別是優(yōu)選提供一種疫苗，其中所述Marek′s病樣病毒包含血清型1。另外，本發(fā)明既然提供了超出基因最初所伴隨的宿主細(xì)胞之外的基因組的操作方法，本發(fā)明還提供一種疫苗，其不是衍生自常規(guī)減毒的或無(wú)毒性Marek′s病樣病毒分離株，而是衍生自毒性，烈毒或烈毒加野生病毒，因?yàn)楝F(xiàn)在從野生分離株中快速分離感染性克隆是可能的，可以制備DNA疫苗以預(yù)防雞和火雞中Marek’s病，其中在所述基因組中可以非常迅速地引入突變。針對(duì)其它基本上細(xì)胞伴隨皰疹病毒如水痘-帶狀皰疹病毒可以使用相同的系統(tǒng)。
使用本發(fā)明提供的含有部分或全部感染性Marek′s病病毒(MDV-1)基因組的復(fù)制型病毒基因組，提供了產(chǎn)生更有效的，生物學(xué)安全的和穩(wěn)定的MDV-1疫苗的各種各樣的新可能性。由于重組MDV-1是回收自克隆的DNA，因此得自DNA轉(zhuǎn)染的病毒子代可以更好定性，并可以避免疫苗病毒的“過(guò)減毒”。例如與減毒相關(guān)的132bp重復(fù)數(shù)目(Maotani et al.，1986)可以精確測(cè)定，而且如果需要，可以根據(jù)疫苗生產(chǎn)或野外情況的需要減少或增加(如下所示)。突變體MDV-1的產(chǎn)生得以大大改善。迄今為止，MDV-1突變體是在真核細(xì)胞中通過(guò)費(fèi)力和耗時(shí)的同源重組和選擇程序產(chǎn)生的。這些選擇程序，如針對(duì)其它皰疹病毒所報(bào)道的，通常導(dǎo)致不希望的基因組突變，尤其在MDV-1的情況下不能獲得無(wú)細(xì)胞病毒，這使選擇程序和回收及增殖突變體更復(fù)雜。與之形成對(duì)照的是本發(fā)明提供了一種操縱病毒基因組的方法，這種方法基于通過(guò)質(zhì)粒pGETrec上存在的recE，recT和recB/C-抑制性λgam基因進(jìn)行誘變(Narayanan等，1999)。這個(gè)系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)是(i)只需要30-50bp同源臂定向于缺失的特異序列，即可以實(shí)現(xiàn)任何開(kāi)放讀框的缺失而不需要克隆重組盒，(ii)所述方法非常快速，及(iii)在沒(méi)有氨芐青霉素的情況下，賦予誘變系統(tǒng)及表達(dá)氨芐青霉素抗性的pGETrec載體迅速自細(xì)菌細(xì)胞中喪失。
通過(guò)使用所謂的E/T克隆方法這種高效技術(shù)，在大腸桿菌中可以進(jìn)行一步突變和選擇(Muyrers等，1999；Narayanan等，1999；Zhang等，1998)。這種技術(shù)還可以缺失MDV-1基因而不需要使用互補(bǔ)細(xì)胞系，因?yàn)楸景l(fā)明提供的突變的MDV-1基因組的復(fù)制不需要反式互補(bǔ)缺失的必需基因。另外，完全不需要克隆程序。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生MDV-1或其它病毒(細(xì)胞伴隨皰疹病毒)BACs的方法，包括用質(zhì)粒pBADαβγ，pGETrec或任何其它可誘導(dǎo)地或穩(wěn)定地表達(dá)recE，recT和λgam基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B細(xì)胞，隨后從取自例如源于體內(nèi)的裂解或潛在感染的細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物中制備環(huán)形病毒DNA。在一組平行的或單獨(dú)的程序中，提供了攜帶BAC載體序列和使BAC載體序列與病毒DNA同源重組的序列的線性DNA。這種線性DNA可以例如是通過(guò)PCR或通過(guò)線性化質(zhì)粒DNA產(chǎn)生的。然后，提供了recE，recT和gam基因在大腸桿菌中的表達(dá)，并提供了電感受態(tài)細(xì)胞(例如Sambrook等，1989)。然后將病毒DNA與攜帶BAC載體序列的線性DNA一起電穿孔入感受態(tài)大腸桿菌中。如詳細(xì)描述部分所述，鋪板于含有適當(dāng)抗生素的瓊脂上以收獲菌落并制備BAC DNA。克隆的BAC DNA的感染性通過(guò)轉(zhuǎn)染易感細(xì)胞而檢測(cè)。本發(fā)明提供了一種方法，用以遺傳重組衍生自宿主細(xì)胞或組織的基本上宿主細(xì)胞伴隨皰疹病毒基因組，而不需要在真核細(xì)胞中進(jìn)行(同源)重組，使得可以獲得衍生自野生分離株或減毒分離株的(如果需要是接近完整或完整的)感染性基因組或皰疹病毒核酸。
本發(fā)明的方法還可以進(jìn)一步減毒候選疫苗MDV-1或產(chǎn)生攜帶其它重要雞病原體基因的MDV-1突變體。另外，不斷出現(xiàn)的具有可能不同的和改變的抗原性質(zhì)的野生MDV-1分離株，可以通過(guò)基于克隆的MDV-1和現(xiàn)有的野生分離株之間各自的突變基因的置換提供一種疫苗而對(duì)抗。這些改變，如上所述，可以用相同的E/T克隆方法進(jìn)行，而且這樣提供了非常迅速對(duì)野外MDV-1的變化作出反應(yīng)的可能性。然而，如本發(fā)明所述，回收感染性MDV-1的另一個(gè)有吸引力的優(yōu)勢(shì)是本發(fā)明提供的基因組作為DNA疫苗的應(yīng)用。迄今為止，Marek′s病是通過(guò)應(yīng)用感染的細(xì)胞制品控制的。
這些制品不僅含有懸浮于含有DMSO的培養(yǎng)基中的活細(xì)胞和所有種類(lèi)的細(xì)胞抗原，而且還必須貯存于液氮中。從而冷凍環(huán)節(jié)必須從疫苗生產(chǎn)保持至疫苗使用者直至施用。另外，一旦解凍，疫苗必須在非常短的時(shí)間內(nèi)施用，而且每只鳥(niǎo)均需注射。用本發(fā)明提供的MDV-1基因組DNA，純化所述“疫苗”(DNA)是易行的及可重復(fù)的。DNA非常穩(wěn)定，不再需要冷凍環(huán)節(jié)，而且感染性DNA可以通過(guò)一些途徑(肌內(nèi)，皮內(nèi)，卵內(nèi)，通過(guò)呼吸道途徑等)和在不同配方中(有或無(wú)載體)施用。另外，存在親代抗體不妨礙免疫原的初次注射。
這樣，本發(fā)明提供的MDV-1基因組首次使得可以生產(chǎn)及工程化高效的及生物學(xué)安全的抗腫瘤和經(jīng)濟(jì)意義重大的疾病的疫苗。本發(fā)明因此提供了限制個(gè)體患有獲得性或顯然由宿主細(xì)胞伴隨皰疹病毒感染所致疾病的風(fēng)險(xiǎn)的方法，包括為所述個(gè)體施用本發(fā)明的疫苗或基因組。
詳細(xì)描述Marek′s病病毒(MDV)是皰疹病毒科α皰疹病毒亞科的一個(gè)成員(Regenmortel等，1999)?；趯?duì)雞的毒力，導(dǎo)致T細(xì)胞淋巴瘤的能力和抗原性質(zhì)，將MDV分成3個(gè)血清型(MDV-1，MDV-2和MDV-3)(Payne，1985)。MDV-3表示火雞皰疹病毒(HVT)，其已經(jīng)廣泛用于抗MDV相關(guān)疾病的接種。根據(jù)最近的命名法，MDV-1分類(lèi)為gallid皰疹病毒2(GHV-2)，MDV-2為GHV-3，HVT為meleagrid皰疹病毒。所有這三種病毒均屬于α皰疹病毒亞科內(nèi)的新Marek′s病樣病毒。
以前控制MDV-1感染主要通過(guò)用HVT接種實(shí)現(xiàn)，然而，在接種失敗和關(guān)于所謂的“烈毒”MDV-1的闡述后(Witter，1989)，MDV-2毒株及后來(lái)減毒的MDV-1毒株(例如毒株CVI 988 Rispens)已經(jīng)用于疫苗配方中(Witter，1985)。
近年來(lái)及首先在美國(guó)報(bào)道出現(xiàn)了更毒性的MDV-1，“烈毒+”(vv+)MDV-變體，而且甚至在接種的家禽中也導(dǎo)致高死亡率(Witter，1997)。將這些vv+毒株之一，584A，在雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)上連續(xù)傳代，其喪失對(duì)雞的致病性(Witter，1997)。vv+MDV-1的致病性提高及類(lèi)似地毒力喪失的分子學(xué)機(jī)制還不清楚，因?yàn)殡y以進(jìn)行MDV-1的分子學(xué)分析。
一方面，在培養(yǎng)的細(xì)胞中沒(méi)有感染性病毒子代釋放，另一方面，MDV-1重組體的產(chǎn)生很費(fèi)力，及由于所述制劑在體外的高細(xì)胞伴隨性質(zhì)，需要多次純化病毒重組體(Cantello等，1991；Sakaguchi等，1993；Parcells等，1994，1995；Schat等，1998；Anderson等，1998)。另外，必須使用原代細(xì)胞培養(yǎng)MDV-1(Payne)，導(dǎo)致分析必需的MDV-1基因幾乎不可能，因?yàn)椴荒墚a(chǎn)生反式互補(bǔ)細(xì)胞系。
使用這種方法，小鼠和人巨細(xì)胞病毒(MCMV和HCMV；Messerle等，1997；Borst等，1999)，1型單純皰疹病毒(HSV-1；Suter等，1998)，假狂犬病病毒(PrV；Smith等，1999，2000)和Epstein-Barr病毒(EBV；Delecluse等，1998)的基因組已經(jīng)克隆為感染性BAC。
本研究的目的是提供快速和有效生產(chǎn)MDV-1重組體的基礎(chǔ)，通過(guò)將完整的180kbp的基因組克隆入大腸桿菌中進(jìn)行。在用克隆的MDV-1 BAC DNA轉(zhuǎn)染CEF細(xì)胞后，易于回收感染性MDV-1，在CEF細(xì)胞中進(jìn)行幾輪細(xì)菌生長(zhǎng)或系列增殖后，MDV-1 BAC仍是穩(wěn)定的。
最后，因?yàn)樵诖竽c桿菌中可以進(jìn)行必需MDV-1基因的一步缺失，所述系統(tǒng)具有非常大的潛力，便于進(jìn)一步分析必需的和非必需的MDV-1基因，及作為生產(chǎn)生物學(xué)安全的經(jīng)修飾的活病毒和/或DNA疫苗的工具。
方法和材料病毒和細(xì)胞 將原代或次級(jí)雞胚成纖維(CEF)細(xì)胞或鵪鶉肌(QM7)細(xì)胞保持在補(bǔ)加5-10％胎牛血清(FCS)的Dulbecco′s改良的基本培養(yǎng)基(DMEM)中。MDV-1毒株584Ap80C是由Dr.RichardWitter惠贈(zèng)，美國(guó)密歇根州東蘭辛ADOL。毒株584Ap80C表示vv+毒株584A細(xì)胞培養(yǎng)物傳代的一種無(wú)毒后代(Witter，1997)，并將其生長(zhǎng)于前述原代或次級(jí)CEF細(xì)胞上(Osterrieder，1999)。針對(duì)基因組的不同區(qū)域，通過(guò)PCR和Southern印跡雜交測(cè)試QM7細(xì)胞沒(méi)有MDV-1序列，之后將它們用于增殖MDV-1(Zelnik和Osterrieder，未公布)。如述作病毒生長(zhǎng)曲線并略修改(Parcells等，1994)。簡(jiǎn)而言之，將100噬斑形成單位(p.f.u.)用于感染2×106個(gè)新鮮種植的CEF細(xì)胞。在感染后的不同時(shí)間(0，12，24，48，72，96，120小時(shí))，將感染的細(xì)胞用胰蛋白酶消化并在新鮮的CEF細(xì)胞上滴定。確定噬斑的數(shù)目，結(jié)果是兩次單獨(dú)試驗(yàn)的平均值。
組成型表達(dá)MDV-1gB的QM7細(xì)胞系是通過(guò)用10μg pcMgB(圖1)轉(zhuǎn)染1×106個(gè)QM7細(xì)胞而獲得的，pcMgB基于pcDNA3(Invitrogen)并含有在人巨細(xì)胞病毒立即早期啟動(dòng)子控制下的來(lái)自毒株Rispens CVI988的MDV-1gB基因。在存在1mg/ml G418的情況下選擇含有pcMgB的QM7細(xì)胞，并使用抗gB單克隆抗體(mab)2K11(由Dr.Jean-Francois Vautherot惠贈(zèng)，INRA，Tours，法國(guó))鑒別表達(dá)gB的克隆。所得表達(dá)MDV-1gB的細(xì)胞系稱(chēng)為MgB1。
構(gòu)建MDV-1BAC如前所述通過(guò)十二烷基硫酸鈉-蛋白酶K提取法，從感染的細(xì)胞中純化MDV-1 DNA(Morgan等，1990)。如下構(gòu)建質(zhì)粒pDS-pHA1。將MDV-1 US2基因任一側(cè)的2.1和3.1kbp片段(圖1)，通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增，使用含有適當(dāng)限制酶位點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)引物(表1)，并將兩個(gè)片段均克隆入pTZ18R(Pharmacia-Amersham)。含有在HCMV立即早期啟動(dòng)子控制下的Eco-gpt基因的BAC是從質(zhì)粒pHA1(由Dr.M.Messerle惠贈(zèng)，德國(guó)慕尼黑LMU；Messerle等，1997)中釋放的，并將其插入質(zhì)粒pDS中存在的2.1和3.1kbp片段中導(dǎo)入的PacI位點(diǎn)中(圖1)。
將原代CEF細(xì)胞用2μg 584Ap80C DNA和10μg pDS-pHA1共同轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染5天后，將細(xì)胞鋪板于具有250μg/ml霉酚酸(MPA)，50μg/ml黃嘌呤和100μg/ml次黃嘌呤的原代CEF細(xì)胞中。重復(fù)MPA/黃嘌呤/次黃嘌呤選擇，共4次。在4次選擇后，在已經(jīng)發(fā)生完全致細(xì)胞病變(cpe)后，從感染的細(xì)胞中制備病毒DNA，并將1μg感染的細(xì)胞DNA電穿孔入DHB10大腸桿菌細(xì)胞中。在含有30μg/ml氯霉素的瓊脂平板上轉(zhuǎn)染16小時(shí)后，開(kāi)始檢測(cè)菌落(Sambrook等，1989)。挑取單個(gè)的菌落，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)堿性裂解方法從大腸桿菌中制備BAC DNA(Sambrook等，1989)。通過(guò)基于二氧化硅的親和層析，使用可商購(gòu)的試劑盒(Qiagen，Macherey & Nagel)，大規(guī)模制備BACDNA。選擇3個(gè)MDV-1584Ap80C BAC克隆(BAC19，BAC20，BAC24)進(jìn)行進(jìn)一步分析。
誘變MDV-1BAC為在大腸桿菌中誘變克隆的MDV-1DNA，進(jìn)行recE-催化的促進(jìn)線性DNA片段之間同源重組的反應(yīng)，稱(chēng)為E/T克隆(Zhang等，1998；Narayanan等，1999)。將攜帶recE，recT和噬菌體1gam基因的質(zhì)粒pGETrec(由Dr.Panos Ioannou提供，澳大利亞墨爾本Murdoch學(xué)院)，轉(zhuǎn)化入含有BAC20的DH10B細(xì)胞中(Narayanan等，1999)。在通過(guò)加入0.2％阿拉伯糖誘導(dǎo)recE，recT和gam后，如述制備電感受態(tài)細(xì)胞(Narayanan)。為缺失BAC20中的gB基因，將質(zhì)粒pEGFP-N1(Clontech)的卡那霉素抗性基因(kanR)通過(guò)PCR擴(kuò)增。所設(shè)計(jì)的引物含有與gB內(nèi)所希望的缺失部位交界的50個(gè)核苷酸同源臂，及20個(gè)核苷酸以擴(kuò)增kanR(表1)。將所得1.6kbp片段從瓊脂糖凝膠(Qiagen)中純化，并電穿孔入含有pGETrec的BAC20中。攜帶gam和kan基因的菌落在含有這兩種抗生素的平板上鑒別(Narayanan等，1999)。
DNA分析 將BAC或病毒584Ap80C DNA用EcoRI，BamHI，BglII或StuI酶切，并在0.8％瓊脂糖凝膠上分離。將DNA片段移至帶正電荷的尼龍膜上(Pharmacia-Amersham)，使用洋地黃毒苷標(biāo)記的BAC19 DNA或MDV-1毒株GA的各個(gè)BamHI片段(Fukuchi等，1991；Osterrieder，1999)進(jìn)行Southern印跡雜交。
另外，制備來(lái)自質(zhì)粒pcgB的gB特異性探針和攜帶kanR基因的探針，以分析gB-陰性MDV-1BAC。根據(jù)廠商指導(dǎo)(RocheBiochemicals)，使用CSPD TM進(jìn)行DNA雜交體的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。
間接免疫熒光 為進(jìn)行間接免疫熒光分析(IIF)，將細(xì)胞生長(zhǎng)于6孔或24孔平板上(Greiner)，或生長(zhǎng)于玻璃蓋片上，隨后在指定處感染。在感染或轉(zhuǎn)染后的不同時(shí)間，將細(xì)胞用90％丙酮固定，并如述精確進(jìn)行IIF(Meindl和Osterrieder，1999)。通過(guò)熒光顯微鏡或聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM)分析樣品。所用的抗體是抗gB mab2K11，抗pp38 mab H19(由Dr.Lucy Lee提供，ADOL，East Lansing，MI)，或是來(lái)自用MDV-1感染雞的恢復(fù)期血清(MDSI)。
結(jié)果構(gòu)建和分析含有BAC的完整MDV-1基因組將1×106個(gè)原代CEF用1×104p.f.u.的MDV-1毒株感染，即將感染的細(xì)胞與未感染的細(xì)胞混合。在發(fā)生完全致細(xì)胞病變作用后，從感染的細(xì)胞中制備DNA，并將2μg病毒DNA與10μg pDS-pHA1質(zhì)粒DNA一起轉(zhuǎn)染入1×106個(gè)原代CEF細(xì)胞中。在轉(zhuǎn)染后5天，將細(xì)胞與新鮮CEF一起種植，并用選擇培養(yǎng)基覆蓋。
將此程序共重復(fù)4次。最后，從能在存在MPA/黃嘌呤/次黃嘌呤情況下生長(zhǎng)的重組MDV-1中分離DNA，并使用標(biāo)記的pHA1作為探針進(jìn)行Southern印跡分析?？梢宰C實(shí)一部分病毒DNA含有插入的F質(zhì)粒序列(數(shù)據(jù)未示出)。將1μg這種病毒DNA用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化的細(xì)菌鋪板于含有30μg/ml氯霉素的瓊脂上，并挑取單個(gè)菌落。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒制備方法提取細(xì)菌菌落的DNA(Sambrook等，1989)并在0.8％瓊脂糖凝膠上電泳。
一些細(xì)菌菌落示出含有高分子量的染色體外DNA，從中選擇3個(gè)克隆(BAC19，BAC20和BAC24)進(jìn)行進(jìn)一步分析(圖2)。為進(jìn)一步定性分離的BAC克隆，將用BamHI或EcoRI酶切后的584Ap80C和BAC DNA，使用標(biāo)記的BAC19 DNA作探針進(jìn)行Southern印跡分析。當(dāng)與親代584Ap80C相比較時(shí)，可以證實(shí)BAC19，BAC20，和BAC24 DNA呈現(xiàn)幾乎相同的限制酶片段模式(圖3A和B)。然而，易于識(shí)別兩個(gè)明顯的例外。在所有分析的BAC克隆中，均沒(méi)有584Ap80C DNA中存在的20kbp BamHI-A片段。取而代之，在BAC19，BAC20和BAC24的DNA中檢測(cè)到大小為16和10kbp的片段(圖3B)。這兩個(gè)條帶代表擴(kuò)大的BamHI-A片段，其中通過(guò)插入F質(zhì)粒和缺失US2序列，產(chǎn)生一個(gè)額外的BamHI位點(diǎn)(圖1)。
在EcoRI-消化的BAC DNA中，觀測(cè)到通過(guò)缺失US2基因產(chǎn)生的一個(gè)額外的5.8kbp條帶(BAC序列)和大小略變化的片段(圖1和圖3B)。使用標(biāo)記的質(zhì)粒pDS或pHA1插入物作為探針，通過(guò)Southern印跡雜交進(jìn)一步分析各種克隆中BAC序列的正確插入，在BamHI消化的或EcoRI-消化的DNA中觀測(cè)到預(yù)期的反應(yīng)模式。在BamHI-消化的BAC DNA中，16和10kbp BamHI片段與pDS探針特異性反應(yīng)，而只有10kbp片段與衍生自質(zhì)粒pHA1的探針?lè)磻?yīng)(圖1；圖3C和D)。
在EcoRI-消化的BAC19，BAC20或BAC24 DNA中，4.3，2.8和1.7kbp的片段與pDS探針特異性反應(yīng)，而5.8和1.7kbp的片段與pHA1探針特異性雜交(圖1，圖3C和D)。這些片段精確相當(dāng)于在插入pHA1序列后推測(cè)的那些片段(圖1)，而且得出結(jié)論F質(zhì)粒序列正確插入所有分析的MDV-1 BAC中代替了US2 ORF。例外，在BamHI或EcoRI消化的DNA中，注意到BAC19，BAC20，和BAC24的條帶模式中的一些變化，例如在BamHI消化的BAC19 DNA中的一個(gè)大約6.2kbp的額外條帶，或在EcoRI消化的BAC20和BAC24的DNA中額外的條帶(圖2，3A和B)。為研究觀測(cè)的各個(gè)限制酶片段的大小變化，與標(biāo)記的BamHI-D片段進(jìn)行雜交，因?yàn)樵讵?dú)特的長(zhǎng)區(qū)域的末端重復(fù)和內(nèi)部重復(fù)(TRL和IRL)中的大小變化是常見(jiàn)的。
通過(guò)Southern印跡示出在BamHI或EcoRI消化的BAC19，BAC20或BAC24的DNA中觀測(cè)的額外的片段，確實(shí)得自TRL和IRL中的變化。在用BamHI消化的病毒584Ap80C DNA中用探針檢測(cè)到兩條不清晰的寬條帶，其范圍是大約9-15kbp和4-8kbp(分別相當(dāng)于毒性MDV-1的BamHI-D和-H片段；圖1)，在分析的所有BAC克隆中均觀測(cè)到獨(dú)特但不同的條帶(圖4)。不同BAC克隆的所有其它限制酶片段表現(xiàn)為與病毒584Ap80C DNA的那些片段是相同的。這可以通過(guò)使用一些其它標(biāo)記的BamHI片段作探針而證實(shí)，包括BamHI-A，-B，-C和-I2片段(圖4中舉例示出的數(shù)據(jù)是針對(duì)BamHI-C探針的)。
從克隆的DNA中重構(gòu)感染性MDV-1將BAC19，BAC20或BAC24的DNA轉(zhuǎn)染入原代CEF中。在轉(zhuǎn)染后3-7天，出現(xiàn)MDV-1特異性病毒噬斑，這通過(guò)使用抗MDV-1gB單克隆抗體通過(guò)IIF證實(shí)。然后將在轉(zhuǎn)染各種BAC后拯救的MDV-1與新鮮CEF一起種植，并將噬斑大小與通過(guò)親代584Ap80C誘導(dǎo)的那些噬斑相比較。如在感染后第2天染色的噬斑所示，檢測(cè)到在重組的和親代的病毒之間噬斑大小沒(méi)有可感知的不同(圖5A)。
為進(jìn)一步定性在BAC感染后回收的MDV-1的生物學(xué)性質(zhì)，將這些病毒的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)與親代584Ap80C相比較。在BAC情況中，將感染后5天回收的病毒用于感染種植于6孔平板上的新鮮CEF細(xì)胞(將50p.f.u.的病毒用于感染含有1×106個(gè)細(xì)胞的一個(gè)孔)。相似地，將50p.f.u.的584Ap80C以相同反式用于感染新鮮CEF。在感染后不同時(shí)間，收獲病毒并通過(guò)將10倍病毒稀釋液與新鮮CEF細(xì)胞一起種植而滴定。這些試驗(yàn)的結(jié)果示于圖5B。
可以證實(shí)所有測(cè)試的MDV-1BAC均呈現(xiàn)與親代584Ap80C幾乎相同的生長(zhǎng)特性(圖5B)。在感染后72小時(shí)達(dá)到最大效價(jià)，并保持恒定直至在感染后120小時(shí)的觀測(cè)期末。從噬斑大小和生長(zhǎng)特性中，我們得出結(jié)論MDV-1BAC在體外的生物學(xué)性質(zhì)與親代毒株實(shí)際上是不能區(qū)別的。
為確定BAC衍生的病毒的穩(wěn)定性，將BAC19和BAC20的BAC轉(zhuǎn)染子代傳代4次并制備病毒DNA。將病毒DNA用BamHI或EcoRI酶切，通過(guò)0.8％瓊脂糖凝膠電泳分離，并移至尼龍膜上。使用pDS或pHA1探針進(jìn)行雜交。用這兩個(gè)探針?lè)治?，觀測(cè)到如上述相似DNA片段，而且隨著轉(zhuǎn)染子代的系列傳代，條帶模式不改變(圖6)。從這些結(jié)果中，我們總結(jié)出即使在CEF細(xì)胞中系列傳代后，F(xiàn)質(zhì)粒衍生的序列保持穩(wěn)定插入在回收自各個(gè)MDV-1BAC克隆的584Ap80C基因組內(nèi)。
然而，通過(guò)與BamHI-D片段雜交和PCR分析所示，132bp重復(fù)序列的可變性恢復(fù)，及在首次病毒傳代后轉(zhuǎn)染子代的BamHI或EcoRI酶切的DNA中觀測(cè)到一條彌散的不清晰的反應(yīng)條帶(數(shù)據(jù)未示出)。
誘變BAC20和缺失gB編碼序列在接下來(lái)的試驗(yàn)中，應(yīng)用一種最近揭示的誘變BAC的方法，以從BAC20中除去2.8kbp gB基因的2.3kbp(圖7)。在將質(zhì)粒pGETrec(Narayanan)轉(zhuǎn)化入含有BAC20的DH10B中后，用可以與MDV-1gB序列同源重組的引物擴(kuò)增kanR基因(表1；圖8)，并電穿孔入BAC20-pGETrec細(xì)胞中。將細(xì)菌鋪板于含有氯霉素和卡那霉素的LB瓊脂上，并提取雙抗性菌落。在分離各個(gè)菌落的DNA后，對(duì)在gB基因內(nèi)攜帶缺失的重組BAC20(20DgB)進(jìn)行Southern印跡分析。在用BamHI，EcoRI，BglII或StuI酶切后，一種kanR和一種gB特異性探針檢測(cè)到20DgB的片段，這與在將kanR抗性基因插入gB編碼序列后的計(jì)算結(jié)果完全一致(圖9)。如前所報(bào)道的，注意到賦予氨芐青霉素抗性的pGETrec易于從在沒(méi)有抗生素情況下生長(zhǎng)的大腸桿菌細(xì)胞中喪失(圖9)。從這些結(jié)果我們得出結(jié)論gB開(kāi)放讀框幾乎完全從20DgB中除去。
分析從20DgB中重構(gòu)的gB陰性MDV-1因?yàn)間B是至今所分析的所有皰疹病毒生長(zhǎng)所必需的(參見(jiàn)Pereira)，因此產(chǎn)生一種QM7細(xì)胞系，其表達(dá)在HCMV立即早期啟動(dòng)子控制下的MDV-1gB。間接免疫熒光分析表明實(shí)際上細(xì)胞系MgB1的每個(gè)細(xì)胞均組成型表達(dá)MDV-1gB，這通過(guò)使用單克隆抗體2K11或恢復(fù)期雞血清(MDSI)表明(圖10)。為分析BAC20和20DgB在各種細(xì)胞系中的生長(zhǎng)，制備DNA并用于轉(zhuǎn)染CEF，QM7或MgB1細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后3-5天，在用BAC20轉(zhuǎn)染的所有細(xì)胞中均觀測(cè)到病毒噬斑(圖10)。
然而，在20DgB DNA轉(zhuǎn)染后，只在表達(dá)gB的MgB1細(xì)胞中觀測(cè)到噬斑(圖11)。在用20DgB轉(zhuǎn)染的CEF和QM7細(xì)胞中，個(gè)別細(xì)胞表達(dá)早期pp38基因，這通過(guò)與單克隆抗體H19的反應(yīng)表明(Lee等，但噬斑形成被抑制(圖11))。gB是MDV-1在體外細(xì)胞之間傳播所必需的這些結(jié)果，是通過(guò)將20DgB感染的MgB1細(xì)胞與CEF，QM7或新鮮的MgB1細(xì)胞一起種植證實(shí)的。在初次轉(zhuǎn)染后示出，噬斑形成只是在與表達(dá)gB的細(xì)胞一起種植后觀測(cè)到(表2)。從這些結(jié)果中總結(jié)出MDV-1gB是MDV-1在培養(yǎng)的細(xì)胞之間傳播所必需的。
盡管Marek′s病病毒是雞的一種重要病原體，在感染的動(dòng)物中導(dǎo)致T細(xì)胞腫瘤和高死亡率，但關(guān)于在感染的裂解，潛伏或腫瘤時(shí)期各個(gè)基因和基因產(chǎn)物的功能了解的還很少。由于兩種主要的原因極大地削弱了對(duì)MDV-1基因和基因產(chǎn)物的分析。首先，用MDV-1感染的培養(yǎng)的細(xì)胞不產(chǎn)生游離的感染性病毒，其次，MDV-1在培養(yǎng)細(xì)胞中的有效生長(zhǎng)受到原代或次級(jí)雞胚成纖維細(xì)胞的限制。
因此，使用常規(guī)同源重組誘變方法用于誘變其它α皰疹病毒亞科病毒是費(fèi)力，費(fèi)時(shí)的，而且還需要持續(xù)供給原代細(xì)胞。通過(guò)使用BAC技術(shù)的確便利了HSV和PrV的誘變，依賴(lài)于在真核細(xì)胞中同源重組的常規(guī)誘變方法是針對(duì)這兩種病毒的一種標(biāo)準(zhǔn)方法，而且已經(jīng)產(chǎn)生了許多突變的病毒。相反，針對(duì)誘變MDV-1，BAC克隆和誘變是一種主要的有益方法。一旦MDV-1基因組克隆為BAC并且可以穩(wěn)定保持在大腸桿菌中，突變體的產(chǎn)生和對(duì)必需基因的分析應(yīng)是相對(duì)容易的。事實(shí)上，可以將毒株584Ap80C的完整基因組克隆為感染性BAC。毒株584Ap80C是烈毒+(vv+)MDV-1毒株584A在CEF細(xì)胞上經(jīng)過(guò)80次系列傳代后的子代(Witter，1997)。對(duì)BAC19，BAC20和BAC24中存在的克隆的MDV-1基因組的分析表明限制酶模式的變化是顯而易見(jiàn)的。
這種多樣性可歸因于BamHI-D和-H片段中的變化。已知在不同的MDV-1毒株中存在不同數(shù)目的132bp串聯(lián)重復(fù)，而且在培養(yǎng)的細(xì)胞中系列傳代后，所述重復(fù)數(shù)目提高(Maotani，Silva，F(xiàn)ukuchi)。例外，串聯(lián)的132bp重復(fù)數(shù)目與喪失致瘤性相關(guān)，因?yàn)榻?jīng)證實(shí)在毒性毒株中這些單位是恒定數(shù)目的(Fukuchi等，1985；Bradley等，1989)，盡管近來(lái)對(duì)廣泛使用的Rispens CVI 988疫苗毒株的研究表明，少量的132bp重復(fù)與毒性不直接相關(guān)。在MDV-1毒株584Ap80C的情況中，限制酶消化的病毒DNA與BamHI-D片段的雜交產(chǎn)生彌散的條帶模式，表明病毒群中存在的重復(fù)數(shù)目是可變的。相反，用相同探針在每個(gè)BAC克隆中只鑒別一個(gè)強(qiáng)反應(yīng)條帶。然而，在用BamHI或EcoRI酶切后，反應(yīng)條帶的大小在BAC19，BAC20和BAC24之間是不同的，表明含有不同數(shù)目132bp重復(fù)的基因組已經(jīng)克隆。這個(gè)結(jié)論通過(guò)定向132bp重復(fù)的PCR分析而證實(shí)。而用584Ap80C的DNA獲得典型的梯形PCR產(chǎn)物(Becker等，1993)，在BAC19，BAC20或BAC24情況中，從克隆的病毒DNA中擴(kuò)增出獨(dú)特的條帶。
因此總結(jié)出不同BAC克隆的可變限制酶模式得自各個(gè)克隆中存在的串聯(lián)的132bp重復(fù)的不同數(shù)目，其不影響克隆的DNA的感染性，因?yàn)楦腥拘圆《臼窃诜蛛x自每個(gè)不同BAC克隆的DNA轉(zhuǎn)染后回收的。
在克隆完整的MDV-1基因組和檢驗(yàn)克隆的MDV-1DNA的感染性之后，可以使用一種新近揭示的誘變系統(tǒng)缺失BAC20的gB編碼序列，所述誘變系統(tǒng)中，一種線性DNA片段可以重組至細(xì)菌DNA中，而且其是通過(guò)recE催化的(Narayanan，muyrers)。所述誘變基于質(zhì)粒pGETrec上存在的recE，recT和recB/C-抑制性λgam基因(Narayanan等，1999)。
首次用于操縱病毒基因組的所述系統(tǒng)的最大優(yōu)勢(shì)是(i)只需要30-50bp的同源臂定向缺失的特異性序列，即可以實(shí)現(xiàn)缺失任何開(kāi)放讀框而不需要克隆重組盒，(ii)所述方法是非?？焖俚?，及(iii)賦予誘變系統(tǒng)和表達(dá)氨芐青霉素抗性的pGETrec載體，在沒(méi)有氨芐青霉素的情況下迅速?gòu)募?xì)菌細(xì)胞中喪失。在將剔除gB的PCR產(chǎn)物電穿孔入含有pGETrec的BAC20細(xì)胞中后，獲得10到30個(gè)camR和kanR雙抗性菌落。將一個(gè)這種菌落稱(chēng)為20DgB-1，并選擇進(jìn)行進(jìn)一步分析，因?yàn)樵阡伆逵诤新让顾睾涂敲顾氐沫傊虾?，其立即喪失pGETrec。
Southern印跡分析表明在20DgB-1中成功缺失gB基因并插入kanR基因。在用20DgB-1轉(zhuǎn)染CEF細(xì)胞后回收的MDV-1不能從感染的細(xì)胞中傳播至鄰近細(xì)胞，表明MDV-1gB與其它皰疹病毒中其相似物一樣，是在細(xì)胞之間傳播感染性所必需的。因?yàn)镸DV-1在培養(yǎng)的細(xì)胞中是高度細(xì)胞伴隨的，而且不在培養(yǎng)基中釋放感染性病毒，因此不能研究MDV-1gB在病毒侵入方面的可能作用。產(chǎn)生的gB突變體是缺失基本基因的MDV-1的第一個(gè)實(shí)例，并表明尤其用于MDV-1情況中的BAC克隆和誘變系統(tǒng)的能力。使用MDV-1BAC和永久細(xì)胞系QM7，是徹底分析必需MDV-1基因的一種極好組合，所述永久細(xì)胞系QM7使MDV-1增殖而且與quail成纖維細(xì)胞QT35細(xì)胞系不同，其不攜帶MDV-1序列(Zelnik等，未公布)。例外，對(duì)各種Alphaherpesvirinae的基因功能的對(duì)比分析，現(xiàn)在可以包括MDV-1，并可以對(duì)一個(gè)病毒科的不太相關(guān)的成員如VZV或BHV-4進(jìn)行研究。
根據(jù)本發(fā)明提供的克隆的基因組，提供了對(duì)其中遺傳操縱非常受限的病毒的裂解的，潛伏的和產(chǎn)生腫瘤的基因的詳細(xì)的進(jìn)一步評(píng)估。
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表1用于產(chǎn)生質(zhì)粒pDS和pcMgB的引物和缺失gB引物序列 產(chǎn)生的片段/質(zhì)粒MUS215′ CGTGTTTGAATACTGG-3′a2.1kbpDSMUS225′ CCGGTAGTCATTAGC-3′ 2.1kbpDSMUS235′ TTTGGCAAAACGGAATAGG-3′ 3.1kbpDSMUS245′ AATATGAATCTCTAAAACTTCTCGGC-3′ 3.1kbpDSgB-up5′ ATGCACTATTTTAGGCGG-3′ pcMgBgB-low 5′ TTACACAGCATCATCTTCTG-3′pcMgBgBkana 5′ 用于gB缺失的kanR基因 AAAGCACTAAATCGGAACCCTAAAGGGAGC-3′bgBkanb 5′ 用于gB缺失的kanR基因 ATTGATTGTCTCCTTCCGTGTTTCAGTTAGCCTC-3′a黑體字表示限制酶位點(diǎn)，斜體序列表示不存在于MDV-1序列中的額外堿基b下劃線序列代表來(lái)自用于擴(kuò)增kanr基因的pEGFP-N1的序列，黑體斜體序列表示用于同源重組和recE/T介導(dǎo)的gB缺失的gB序列附圖簡(jiǎn)述圖1產(chǎn)生攜帶完整MDV-1基因組的BAC的克隆程序示意圖。示出的是根據(jù)Fukuchi等(11)所述，大約180kbp MDV-1基因組(A)和BamHI限制圖(B)組構(gòu)。示出了獨(dú)特的短區(qū)域(Us)和位于Us中的ORFs(C和D)。將鄰近Us2基因(灰色區(qū))的一個(gè)2.1kbp和一個(gè)3.1kbp的片段通過(guò)PCR擴(kuò)增，并克隆入質(zhì)粒pTZ18R中，產(chǎn)生重組質(zhì)粒pDS。將釋放自重組質(zhì)粒pHA1(15)的7.2kbp BAC載體插入pDS中，產(chǎn)生質(zhì)粒pDS-pHA1(E)。根據(jù)(2)的限制酶位點(diǎn)是簡(jiǎn)寫(xiě)的B＝BamHI，E＝EcoRI，P＝PstI，Pa＝PacI，S＝SalI。
圖2溴化乙錠染色的0.8％瓊脂糖凝膠的數(shù)碼掃描圖。將分離自大腸桿菌DH10B克隆BAC19，BAC20和BAC24的DNA用BamHI或EcoRI酶切并分離。限制酶消化是在1kb梯兩側(cè)(Gibco-BRL)。*表示3個(gè)BAC克隆之間各個(gè)片段的額外條帶或大小變化。
圖3584Ap80C(V)，BAC19，BAC20和BAC24的DNA的數(shù)碼掃描圖，所述DNA是用BamHI或EcoRI酶切，通過(guò)0.8％瓊脂糖凝膠電泳分離，并用溴化乙錠染色(左側(cè))。在通過(guò)Southern印跡將DNA片段移至尼龍膜上之后，與釋放自質(zhì)粒pDS或pHA1的洋地黃毒苷標(biāo)記的片段雜交。給出了大小標(biāo)志(1kb梯，Gibco-BRL)和反應(yīng)條帶大小。
圖4分析BAC19，BAC20和BAC24 DNA中大小變化的Southern印跡的數(shù)碼掃描圖。將毒株584Ap80C(V)和各個(gè)BAC的病毒DNA用BamHI或EcoRI酶切，并移至尼龍膜上。將所述膜用洋地黃毒苷標(biāo)記的BAC19 DNA或標(biāo)記的BamHI-C或BamHI-D片段溫育。給出了大小標(biāo)志(1kb梯，Gibco-BRL)。當(dāng)與BamHI-D序列雜交時(shí)，在584Ap80C DNA情況中呈現(xiàn)不清晰的條帶用括號(hào)表示。
圖5(A)在BAC19，BAC20或BAC24 DNA轉(zhuǎn)染后MDV-1噬斑的IIF分析。在轉(zhuǎn)染后5天，將感染的細(xì)胞固定并使用抗gB單克隆抗體2K11進(jìn)行間接免疫熒光測(cè)定。用抗小鼠Alexa TM 488(分子探針)檢測(cè)接合的抗體，并用碘化丙錠將核復(fù)染。放大倍率＝400×。
(B)MDV-1毒株584A和各種BAC的生長(zhǎng)曲線。在用100p.f.u.的584Ap80C感染CEF細(xì)胞，或者轉(zhuǎn)染BAC19，BAC20或BAC24的子代后，通過(guò)與新鮮CEF細(xì)胞一起種植，在感染后指定時(shí)間確定病毒效價(jià)。在用單克隆抗體2K11免疫熒光染色后計(jì)數(shù)噬斑。
圖6分析BAC載體序列在BAC19和BAC20轉(zhuǎn)染后回收的病毒中的穩(wěn)定性的Southern印跡數(shù)碼掃描圖。將轉(zhuǎn)染子代傳代4次，并在每次傳代后分離病毒DNA。將病毒DNA用BamHI或EcoRI酶切，通過(guò)0.8％瓊脂糖凝膠電泳分離并移至尼龍膜上。使用洋地黃毒苷標(biāo)記的質(zhì)粒pDS或pHA的片段進(jìn)行Southern印跡雜交。縮寫(xiě)V＝584Ap80C，19＝BAC19，20＝BAC20。BAC19 DNA轉(zhuǎn)染后第1-4次傳代用數(shù)字1-4表示。BAC20 DNA轉(zhuǎn)染后第4次傳代分別加樣于最后泳道中，并以4a表示。給出了反應(yīng)片段的大小。*表示所述標(biāo)記(1kb梯，Gibco-BRL)的起反應(yīng)的1.6kb條帶。
圖7(A)誘變BAC20以除去gB編碼序列的示意圖。將編碼L-阿拉伯糖可誘導(dǎo)的recE，recT，和gam基因的重組質(zhì)粒pGETrec轉(zhuǎn)化入含有BAC20的DH10B細(xì)胞中。在用引物從質(zhì)粒pEGFP-N1(Clontech)中經(jīng)PCR擴(kuò)增kan基因后，將一個(gè)1.6kbp的PCR擴(kuò)增子電穿孔入攜帶BAC20和pGETrec的DH10B細(xì)胞中。將細(xì)菌懸浮液鋪板于含有30μg/ml卡那霉素和30μg/ml氯霉素的瓊脂上。挑取雙抗性集落并進(jìn)行進(jìn)一步分析。
(B)MDV-1中g(shù)B基因的位置和BAC 20DgB中存在的缺失的示意圖。
圖8溴化乙錠染色的0.8％瓊脂糖凝膠的掃描圖，所述凝膠含有用BamHI，EcoRI，BglI，或StuI酶切的及通過(guò)0.8％瓊脂糖凝膠電泳分離的BAC20和20DgB DNA(左側(cè))。將DNA片段移至尼龍膜并與洋地黃毒苷標(biāo)記的kan或gB特異性探針雜交。標(biāo)示了起反應(yīng)的DNA片段的大小。縮寫(xiě)B(tài)＝BamHI，E＝EcoRI，Bg＝BglI，S＝Stul。
圖9組成型表達(dá)MDV-1gB的MgB1細(xì)胞的聚焦激光掃描分析。將MgB1或QM7細(xì)胞種植于蓋玻片上并用抗gB單克隆抗體2K11或恢復(fù)期雞血清MDSI溫育。二級(jí)抗體是抗小鼠或抗雞IgG AlexaTM488綴合物(分子探針)。用碘化丙錠將核復(fù)染。Bar表示10μm。
圖10在用BAC20(上面)或20DgB(下面)轉(zhuǎn)染MgB1，QM7 or CEF細(xì)胞后的IIF分析。在轉(zhuǎn)染后5天，將細(xì)胞用丙酮固定并用抗pp38單克隆抗體H19溫育。二級(jí)抗體是抗小鼠IgG AlexaTM488(分子探針)。盡管用BAC20 DNA轉(zhuǎn)染后在所有細(xì)胞系上均觀測(cè)到MDV-1噬斑，但在用20DgB轉(zhuǎn)染的MgB1細(xì)胞上只觀測(cè)到病毒噬斑。在QM7和CEF細(xì)胞上只觀測(cè)到單個(gè)感染的細(xì)胞(箭頭所指)。放大倍數(shù)＝400×。
權(quán)利要求
1.一種抗由基本上為宿主細(xì)胞伴隨性皰疹病毒所致感染的疫苗，所述疫苗包含衍生自所述皰疹病毒的重組基因組，所述基因組使得可以進(jìn)行基本上不含所述宿主細(xì)胞的重組。
2.權(quán)利要求1的疫苗，所述基因組在所述皰疹病毒在宿主細(xì)胞中復(fù)制和/或傳播所必需的一個(gè)基因中包含一種功能性缺失。
3.權(quán)利要求1或2的疫苗，所述基因組至少包含一種核酸，所述核酸編碼能激發(fā)抗所述皰疹病毒對(duì)個(gè)體的感染的免疫應(yīng)答的抗原性物質(zhì)。
4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的疫苗，所述基因組在激發(fā)特異于所述皰疹病毒的標(biāo)記免疫應(yīng)答所必需的一個(gè)基因中包含一種功能性缺失，使得可以區(qū)分用所述疫苗接種的個(gè)體和用所述基本上細(xì)胞伴隨皰疹病毒感染的個(gè)體。
5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的疫苗，所述基因組至少包含一種核酸，所述核酸編碼能調(diào)節(jié)一種編碼能激發(fā)抗所述皰疹病毒對(duì)個(gè)體的感染的免疫應(yīng)答的一種抗原性物質(zhì)的核酸的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的蛋白質(zhì)物質(zhì)。
6.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的疫苗，其中所述基因組包含衍生自所述皰疹病毒的基本上全長(zhǎng)的拷貝。
7.上述任一權(quán)利要求的疫苗，還具有至少編碼一種額外病原體的抗原性物質(zhì)的核酸。
8.上述任一權(quán)利要求的疫苗，其中所述皰疹病毒包含Marek′s病病毒。
9.權(quán)利要求8的疫苗，其中所述Marek′s病病毒包含血清型1。
10.權(quán)利要求8或9的疫苗，其中所述Marek′s病病毒衍生自一種毒性、烈毒性或烈毒+野生病毒。
11.一種衍生自基本上為宿主細(xì)胞伴隨性皰疹病毒的重組病毒基因組，所述基因組使得可以進(jìn)行基本上不含所述宿主細(xì)胞的重組。
12.權(quán)利要求11的基因組，其至少包含一種復(fù)制型小基因組。
13.權(quán)利要求11的基因組，其中所述基因組包含衍生自所述皰疹病毒的基本上全長(zhǎng)的拷貝。
14.權(quán)利要求11-13任一項(xiàng)的基因組在制備一種抗基本上為宿主細(xì)胞伴隨性皰疹病毒感染所致疾病的疫苗中的應(yīng)用。
15.一種限制個(gè)體患有基本上為宿主細(xì)胞伴隨性皰疹病毒感染所致疾病風(fēng)險(xiǎn)的方法，包括給予所述個(gè)體權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的疫苗或權(quán)利要求11-13任一項(xiàng)的基因組。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述個(gè)體是鳥(niǎo)。
全文摘要
本發(fā)明涉及所謂的宿主細(xì)胞伴隨皰疹病毒領(lǐng)域，如家禽的Marek′s病病毒(MDV)和人類(lèi)的水痘—帶狀皰疹病毒(VZV)，還涉及抗這些病毒所致疾病的接種。本發(fā)明提供了一種抗宿主細(xì)胞伴隨皰疹病毒感染的疫苗，其包含一種衍生自所述皰疹病毒的重組病毒基因組，所述基因組使得可以進(jìn)行基本上不含所述宿主細(xì)胞的重組。
文檔編號(hào)A61K39/255GK1503843SQ01816795
公開(kāi)日2004年6月9日 申請(qǐng)日期2001年8月1日 優(yōu)先權(quán)日2000年8月3日
發(fā)明者弗蘭克·費(fèi)勒, 克勞斯·奧斯泰里德?tīng)? 奧斯泰里德?tīng)? 弗蘭克 費(fèi)勒 申請(qǐng)人:洛曼動(dòng)物健康兩合公司