專利名稱：包膜病毒的宿主范圍突變及其作為疫苗基質(zhì)的應(yīng)用的制作方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明總地涉及病毒學(xué)和疾病控制領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及突變的以節(jié)肢動物為載體的病毒及其作為疫苗的應(yīng)用。
相關(guān)技術(shù)描述以節(jié)肢動物為載體的病毒(蟲媒病毒)是天然通過吸血昆蟲來傳播的病毒。這些病毒有許多具有膜雙層帶有整合膜蛋白，它構(gòu)成了病毒顆粒的包膜(披膜病毒)(Schlesinger，S.和M.J.Schlesinger，1990)。
總地來說，以節(jié)肢動物為載體的病毒是全世界人類和動物中僅次于瘧疾的昆蟲傳播疾病和致死的根源(Berge A.O.1975)。這些病毒有東部、西部和Venezuelan馬腦炎病毒、登革熱病毒、日本腦炎病毒、San Angelo熱病毒和黃熱病毒。另外由于蚊載體白紋伊蚊(Aedes albopictus)的引入(Sprenger和Wuithiranyagool，1985)，在北美洲再次出現(xiàn)由這些病毒引起的疾病(NIAID的特別工作組關(guān)于微生物學(xué)和傳染病的報告，1992年，NIH出版社No.92-3320)。
它們的特征是，蟲媒病毒必須能在無脊椎昆蟲和哺乳動物宿主二者的組織中復(fù)制(Brown，D.T.，和L.Condreay，1986，Bowers等人，1995)。這兩種宿主細(xì)胞系統(tǒng)的遺傳學(xué)和生物化學(xué)環(huán)境的不同為能在一個宿主中復(fù)制但不能在另一宿主中復(fù)制的病毒(宿主范圍突變體)的產(chǎn)生提供了基礎(chǔ)。
目前，登革熱病毒、東部馬腦炎病毒乙基其它昆蟲攜帶的病毒在美國再次出現(xiàn)。美國軍隊和其它政府機(jī)構(gòu)自1960年起就試圖制備抵抗這些病毒的疫苗，但是進(jìn)展很少。因此，現(xiàn)有技術(shù)缺乏疫苗來抵抗大多數(shù)以節(jié)肢動物為載體的病毒和其它包膜病毒。本發(fā)明實現(xiàn)了本領(lǐng)域中這一長期以來的需要和愿望。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個目的是提供一種經(jīng)基因工程改造的有包膜病毒，其中病毒編碼的跨膜蛋白有一個或多個氨基酸缺失，因而該跨膜蛋白當(dāng)工程改造的病毒在昆蟲細(xì)胞中復(fù)制時能跨越病毒膜，而當(dāng)病毒在哺乳動物細(xì)胞中復(fù)制時，該跨膜蛋白不能跨越病毒膜。本發(fā)明此目的的一個實例提供的以節(jié)肢動物為載體的病毒是經(jīng)基因工程改造的包膜病毒。另外，在更佳的實例中，蟲媒病毒可以選自披膜病毒、黃病毒和布尼亞病毒，和能在哺乳動物和昆蟲細(xì)胞中天然復(fù)制的所有其它有包膜的病毒，以及通過基因工程改造病毒或細(xì)胞而能在哺乳動物和昆蟲細(xì)胞中復(fù)制的有包膜的病毒。
在本發(fā)明的其它實例中，提供了從基因工程改造的膜結(jié)合病毒生產(chǎn)用于哺乳動物疫苗接種的病毒疫苗的方法，該方法包括下列步驟對病毒跨膜蛋白作基因工程改造使得缺失一個氨基酸，以產(chǎn)生工程改造的病毒，其中當(dāng)工程改造的病毒在昆蟲細(xì)胞中復(fù)制時，跨膜蛋白能跨越包膜，而當(dāng)該病毒在哺乳動物細(xì)胞中復(fù)制時，跨膜蛋白不能跨越包膜，其中病毒保留了在昆蟲細(xì)胞中復(fù)制的能力；將該突變病毒導(dǎo)入昆蟲細(xì)胞；并使突變病毒在昆蟲細(xì)胞中復(fù)制，以產(chǎn)生病毒疫苗。
在本發(fā)明的另一個實例中，提供了一種對個體接種疫苗的方法，該方法包括下列步驟將本發(fā)明的病毒疫苗導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞中，導(dǎo)致細(xì)胞和組織非產(chǎn)毒性感染，以引起免疫監(jiān)視。
最后，本發(fā)明還有一個目的是提供一種從基因工程改造的膜結(jié)合病毒來產(chǎn)生病毒疫苗的方法，所述疫苗針對由野生蚊群傳播給哺乳動物的疾病，該方法包括下列步驟對病毒跨膜蛋白作基因改造使得缺失一個氨基酸，以產(chǎn)生工程改造的病毒，其中當(dāng)工程改造的病毒在蚊細(xì)胞中復(fù)制時，該跨膜蛋白能跨越包膜，但當(dāng)病毒在哺乳動物細(xì)胞中復(fù)制時，該跨膜蛋白不能跨越包膜，其中病毒保留了在野生蚊細(xì)胞中復(fù)制的能力；將突變的病毒導(dǎo)入野生蚊群中；和使突變的病毒在野生蚊群的細(xì)胞中復(fù)制，產(chǎn)生一群攜帶該病毒疫苗株且排除野生型(病原性)病毒的蚊子，從而通過蚊子叮咬將疫苗傳輸給受叮咬的哺乳動物。
本發(fā)明的其它和進(jìn)一步的方面、特征和優(yōu)點可以從下文描述的本發(fā)明較佳實例中明顯得出。給予這些實例的目的只是為了公開。
附圖簡述本文包括附圖，以使本發(fā)明的上述特征、優(yōu)點和目的清楚并能被詳細(xì)了解。這些附圖構(gòu)成了說明書的一部分。然而，應(yīng)當(dāng)注意，附圖描述了本發(fā)明的較佳實例，不應(yīng)被認(rèn)為限制了本發(fā)明的范圍。


圖1顯示了從轉(zhuǎn)染的組織培養(yǎng)細(xì)胞回收得到的放射性標(biāo)記的辛德比斯病毒蛋白的結(jié)果。如實施例3所述，用放射活性氨基酸標(biāo)記下列細(xì)胞(1)模擬轉(zhuǎn)染的BHK-21細(xì)胞，(2)突變體A391 RNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，和(3)Δ391 RNA轉(zhuǎn)染的白紋伊蚊細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后24小時，如實施例4所述用病毒特異性抗血清使蛋白沉淀。本圖顯示了經(jīng)缺失突變體RNA轉(zhuǎn)染的BHK-21細(xì)胞和白紋伊蚊細(xì)胞產(chǎn)生了三個病毒結(jié)構(gòu)蛋白E1，E2和C，這些在模擬轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中沒有檢測到。
圖2a和2b是以辛德比斯病毒缺失突變體Δ391的RAN轉(zhuǎn)染的BHK-21細(xì)胞(2a)和白紋伊蚊細(xì)胞(2b)的電子顯微照片。如實施例2所述的那樣轉(zhuǎn)染細(xì)胞。BHK-21細(xì)胞(a)顯示了細(xì)胞質(zhì)中成簇病毒核心結(jié)構(gòu)(A)，即使這些細(xì)胞沒有產(chǎn)生成熟的病毒(表1)。白紋伊蚊細(xì)胞(b)也產(chǎn)生了成簇的病毒核心部分；但是，發(fā)現(xiàn)這些核心部分類似于BHK-21細(xì)胞(A)中的核心那樣游離于細(xì)胞質(zhì)中，并且還發(fā)現(xiàn)和細(xì)胞膜(B)結(jié)合。后一種情況在BHK-21細(xì)胞中沒有看到，這表明糖蛋白E1和E2盡管存在卻沒有起結(jié)合它們的作用。
圖3顯示了辛德比斯病毒糖蛋白在整合入ER中后的構(gòu)型。該蛋白是一種多次通過(multipass)的蛋白，它有6個膜跨越結(jié)構(gòu)域(編號為1-6)。1是原始整合的信號序列。2是第一個E2跨膜結(jié)構(gòu)域(TMD)。3是第二個E2 TMD。4是第一個6k TMD。5是第二個6k TMD。6是E1 TMD。S是信號肽酶斷裂的位點。
圖4顯示E2跨膜結(jié)構(gòu)域中缺失的氨基酸。缺失序列顯示在合適的氨基酸下，范圍從1個缺失到16個缺失。從核苷酸9787開始的組氨酸和脯氨酸序列在該蛋白的管腔側(cè)，但被用來涉及誘變引物。
發(fā)明詳述本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然明白在不脫離本發(fā)明的范圍和精神下可對本文公開的發(fā)明作各種替換和修改。
本文所用的術(shù)語“膜結(jié)合病毒”指含有脂膜雙層作為其保護(hù)性外殼一部分的病毒。
本文所用的術(shù)語“病毒包膜”指含膜病毒的脂膜成分及其伴隨的蛋白。
本文所用的術(shù)語“以節(jié)肢動物為載體的病毒”或“蟲媒病毒”指能在節(jié)肢動物(昆蟲)或哺乳動物細(xì)胞中復(fù)制和產(chǎn)生子代病毒的病毒。它包括披膜病毒、黃病毒和布尼亞病毒。
本文所用的術(shù)語“披膜病毒”指總的一類含有膜的病毒，它包括甲病毒屬。
本文所用的術(shù)語“膜雙層”指由相對的兩性磷脂組成的一種結(jié)構(gòu)。雙層在剖面中排列成從極性頭部基團(tuán)—非極性碳鏈—非極性碳鏈—極性頭部基團(tuán)。
本文所用的術(shù)語“糖蛋白跨膜區(qū)”指膜整合蛋白跨越膜雙層的區(qū)域的氨基酸序列。
本文所用的術(shù)語“病毒疫苗”指具有病毒的抗原性但是不能產(chǎn)生疾病的病毒株或病毒突變體。
本文所用的術(shù)語“免疫監(jiān)視”指血液淋巴細(xì)胞監(jiān)視哺乳動物的細(xì)胞和組織以確定外來(病毒)蛋白的存在，并刺激產(chǎn)生能靶向產(chǎn)生外來蛋白細(xì)胞的淋巴細(xì)胞，對其進(jìn)行破壞的過程。該過程還導(dǎo)致產(chǎn)生抵抗外來蛋白的循環(huán)性抗體。
本文所用的術(shù)語“感染性病毒顆粒”指能進(jìn)入細(xì)胞并產(chǎn)生病毒蛋白的病毒，無論它們是否能產(chǎn)生子代病毒。
本文所用的術(shù)語“非感染性病毒顆?！敝覆荒芨腥净蜻M(jìn)入細(xì)胞的病毒。
本文所用的術(shù)語“脊椎動物細(xì)胞”指任何哺乳動物細(xì)胞。
本文所用的術(shù)語“無脊椎動物細(xì)胞”指任何昆蟲細(xì)胞。
本發(fā)明涉及一種基因工程改造的包膜病毒，其中病毒編碼的跨膜蛋白缺失一個或多個氨基酸，因而該跨膜蛋白在工程改造的病毒在昆蟲細(xì)胞內(nèi)復(fù)制時能跨越病毒膜，而當(dāng)病毒在哺乳動物細(xì)胞中復(fù)制時，該跨膜蛋白不能跨越病毒膜。本發(fā)明此目的的一個實例提供的以節(jié)肢動物為載體的病毒選白披膜病毒、黃病毒和布尼亞病毒，和能在哺乳動物和昆蟲細(xì)胞二者中天然復(fù)制的所有其它有包膜的病毒，以及通過基因工程改造病毒或細(xì)胞能在哺乳動物和昆蟲細(xì)胞中復(fù)制的有包膜的病毒。
本發(fā)明還涉及一種從基因工程改造的膜結(jié)合病毒生產(chǎn)用于哺乳動物疫苗接種的病毒疫苗的方法，該方法包括下列步驟對病毒跨膜蛋白作基因工程，使得缺失一個氨基酸，以產(chǎn)生工程改造的病毒，其中當(dāng)工程改造的病毒在昆蟲細(xì)胞中復(fù)制時，跨膜蛋白能跨越包膜，而當(dāng)該病毒在哺乳動物細(xì)胞中復(fù)制時，跨膜蛋白不能跨越包膜，其中病毒保留了在昆蟲細(xì)胞中復(fù)制的能力；將突變的病毒導(dǎo)入昆蟲細(xì)胞，導(dǎo)致產(chǎn)生能用作疫苗的突變病毒。
另外，本發(fā)明還提供了一種對個體進(jìn)行疫苗接種的方法，該方法包括下列步驟將本發(fā)明的病毒疫苗導(dǎo)入個體的細(xì)胞中；和使疫苗在個體內(nèi)產(chǎn)生能引起免疫監(jiān)視的病毒蛋白。
另外，本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)針對野生蚊群所傳播疾病的病毒疫苗的方法，該方法包括下列步驟在對病毒跨膜蛋白作基因改造使得缺失一個氨基酸，以產(chǎn)生工程改造的病毒，其中當(dāng)所述工程改造的病毒在蚊細(xì)胞中復(fù)制時，該跨膜蛋白能跨越所述包膜，但當(dāng)所述病毒在哺乳動物細(xì)胞中復(fù)制時，所述跨膜蛋白不能跨越所述包膜，其中病毒保留了在蚊細(xì)胞中復(fù)制的能力；將突變的病毒導(dǎo)入野生蚊群中；和使突變的病毒在野生蚊群的細(xì)胞中復(fù)制，產(chǎn)生一群攜帶病毒疫苗株且排除野生型(病原性)病毒的蚊子，從而通過蚊子叮咬將疫苗傳輸給受叮咬的哺乳動物。
根據(jù)本發(fā)明，可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)的分子生物學(xué)、微生物學(xué)和重組DNA技術(shù)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中有充分描述。例如參見，Maniatis，F(xiàn)ritsch &Sambrook，《分子克隆實驗手冊》(1982)；《DNA克隆實踐方法》，第I和II卷(D.N.Glover編輯，1985)；《寡核苷酸合成》(M.J.Gait編輯，1984)；《核酸雜交》(B.D.Hames& S.J.Higgins編輯，(1985))；《轉(zhuǎn)錄和翻譯》(B.D.Hames & S.J.Higgins編輯(1984))；《動物細(xì)胞培養(yǎng)》(R.I.Freshney編輯，(1986))；《固定化細(xì)胞和酶》(IRL Press，(1986))；B.Perbal，《分子克隆實踐指南》(1984)。
因此，如果下列術(shù)語在本文中出現(xiàn)，它們應(yīng)具有下述定義。
“載體”是復(fù)制子，例如質(zhì)粒、噬菌體或粘粒，它可以和另一DNA節(jié)段相連，以使所連接的節(jié)段復(fù)制。如果載體的給藥能被接受的動物耐受，則稱載體是“藥學(xué)上可接受的”。如果給予的量在生理學(xué)上有明顯效果，則稱該制劑是以“治療有效量”給予。如果制劑的存在導(dǎo)致哺乳動物受體生理學(xué)上發(fā)生變化，則該制劑有生理學(xué)意義。例如，在治療病毒感染時，能降低感染程度或減少由感染而引起的生理性傷害程度的化合物將被認(rèn)為是在治療上有效的。
“DNA分子”指單鏈形式或雙鏈螺旋形式的脫氧核糖核苷酸(腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶)的聚合物形式。該術(shù)語僅僅指分子的一級和二級結(jié)構(gòu)，而不限于任何特定的三級形式。因此，該術(shù)語包括，特別是在線性DNA分子(如限制性片段)、病毒、質(zhì)粒和染色體中發(fā)現(xiàn)的雙鏈DNA。在討論本文的結(jié)構(gòu)時，根據(jù)常規(guī)，只給出了沿DNA非轉(zhuǎn)錄鏈(即序列與mRNA同源的鏈)5′至3′方向的序列。
DNA“編碼序列”是當(dāng)置于合適調(diào)控序列控制下能在體內(nèi)轉(zhuǎn)錄并翻譯成多肽的雙鏈DNA序列。編碼序列的邊界由5′(氨基)端起始密碼子和3′(羧基)端翻譯終止密碼子確定。編碼序列可包括(但不局限于)原核序列、真核mRNA的cDNA、來自真核(例如哺乳動物)DNA的基因組DNA序列，甚至是合成的DNA序列。聚腺苷酸化信號和轉(zhuǎn)錄終止序列通常位于編碼序列的3′端。
轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列是DNA調(diào)控序列，例如為編碼序列在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)所提供的啟動子、增強子、聚腺苷酸化信號、終止子等。
“啟動子序列”是能結(jié)合細(xì)胞內(nèi)RNA聚合酶并引發(fā)下游(3′方向)編碼序列轉(zhuǎn)錄的DNA調(diào)控區(qū)域。為了對本發(fā)明作定義，啟動子序列的3′端與轉(zhuǎn)錄起始位點相連，并向上游(5′方向)延伸包括了最少數(shù)量的引發(fā)高于背景可檢測轉(zhuǎn)錄水平所需的堿基或元件。在啟動子序列中會發(fā)現(xiàn)一個轉(zhuǎn)錄起始位點(常用核酸酶S1圖譜來確定)，以及負(fù)責(zé)結(jié)合RNA聚合酶的蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域(共有序列)。真核啟動子通常(但并不總是)含有“TATA”盒和“CAT”盒。可用各種啟動子來驅(qū)動載體。
本文所用的術(shù)語“寡核苷酸”或“探針”指包含核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸的分子。寡核苷酸或探針的確切大小取決于許多因素，而這些因素則取決于寡核苷酸的最終功能和用途。探針的長度并不關(guān)鍵，但通常包含至少大約12個堿基，更通常地包括至少約16個堿基，探針與細(xì)菌基因組的部分基本上互補；然而，探針不需要和基因組完全互補。探針可用合適的合成技術(shù)合成制得，最可能的是包括一個可檢測的標(biāo)記。通常，合成的序列在常見的、公眾能獲得的克隆載體和合適的宿主中擴(kuò)增，以獲得大量的探針。擴(kuò)增的載體本身可被標(biāo)記用作探針，或可以切下含有互補鏈的更短的片段并標(biāo)記。在上述文獻(xiàn)(同上)和授予Falkow等人的美國專利No.4,358,535中描述了制備核苷酸探針的方法以及用核苷酸探針進(jìn)行診斷性測試的方法。
術(shù)語“引物”在這里指一種寡核苷酸，無論其是天然存在于純化的限制性消化物中或是合成的，當(dāng)將其置于誘導(dǎo)引物延伸產(chǎn)物合成(與核酸鏈互補)的條件下，即在核苷酸、誘導(dǎo)劑如DNA聚合酶和合適的溫度、pH下，它能作為合成的起始點。引物可以是單鏈或雙鏈的，且必須有足夠的長度，以便在誘導(dǎo)劑的存在下引發(fā)合成所需的延伸產(chǎn)物。引物的確切長度將取決于許多因素，包括溫度、引物來源及使用方法。例如，對于診斷應(yīng)用，根據(jù)靶序列的復(fù)雜性，寡核苷酸引物通常含有15-25個或更多的核苷酸，但是它也可含有較少的核苷酸。
選擇本文的引物，使其與特定靶DNA序列的不同鏈“基本上”互補。這意味著引物必須足夠互補來與它們各自的鏈雜交。因此，引物序列不需要反映模板的確切序列。例如，非互補性核苷酸片段可與引物的5′端連接，而引物序列的其余部分與鏈互補?；蛘?，非互補的堿基或更長的序列可散布在引物中，只要引物序列與序列有足夠的互補性或與其雜交，從而形成用于合成延伸產(chǎn)物的模板。
本文所用的術(shù)語“限制性內(nèi)切核酸酶”和“限制性酶”指在特異性核苷酸序列處或附近切開雙鏈DNA的細(xì)菌酶。
當(dāng)這種DNA被引入細(xì)胞內(nèi)時，細(xì)胞就被外源或異源DNA“轉(zhuǎn)染”。轉(zhuǎn)染性DNA可以或不必整合(共價連接)入細(xì)胞的基因組?！翱寺　笔且蝗簭膯蝹€細(xì)胞或共同的祖細(xì)胞通過有絲分裂獲得的細(xì)胞?！凹?xì)胞系”是能在體外穩(wěn)定生長許多代的原代細(xì)胞的克隆。
DNA構(gòu)建物的“異源”區(qū)是在較大DNA分子中可鑒別的DNA節(jié)段，其在自然界中沒有發(fā)現(xiàn)與較大分子連接。因此，當(dāng)異源區(qū)編碼哺乳動物基因時，該基因通常被在源生物體基因組中不側(cè)接(flank)哺乳動物基因組DNA的DNA側(cè)接。在另一個例子中，編碼序列是一個構(gòu)建物，其中的編碼序列本身在自然界中沒有發(fā)現(xiàn)(如基因組編碼序列含有內(nèi)含子的cDNA，或含有與天然基因不同的密碼子的合成序列)。
預(yù)計用本發(fā)明的新的突變病毒可以制得藥物組合物。在這種情況下，該藥物組合物包含本發(fā)明的新的病毒以及藥學(xué)上可接受的載體。本領(lǐng)域技術(shù)人員無需過多實驗就能很容易地確定此病毒疫苗化合物的合適劑量和給藥途徑。當(dāng)用于體內(nèi)治療時，本發(fā)明的疫苗以治療有效量給予患者或動物，即，該用量使受治療個體對具體病毒相關(guān)的疾病有了免疫力。通常是腸胃外給藥，較佳的是靜脈內(nèi)給藥，但是也可適當(dāng)?shù)夭捎闷渌慕o藥途徑。給予疫苗的量通常在大約103-106pfu/千克患者體重的范圍內(nèi)。給藥方案可以持續(xù)至使效果達(dá)到最優(yōu)并同時權(quán)衡治療的副作用。見《Remington藥物科學(xué)》，第17版，(1990)Mark Publishing Co.，Easton，Penn.；和《Goodman和Gilman的治療劑的藥學(xué)基礎(chǔ)》第8版(1990)Pergmon Press；這兩篇文章均納入本文作參考。對于腸胃外給藥，疫苗最通常的是和藥學(xué)上可接受的腸胃外載體一起被配制在可注射的單位劑型(溶液、懸液、乳劑)中。這些載體宜無毒性，無治療作用。這些載體的例子是水、鹽水、Ringer′s溶液、葡聚糖溶液和5％人血清白蛋白。
本發(fā)明的疫苗依據(jù)的是包膜病毒的蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域中的缺失突變。產(chǎn)生這些突變的策略所根據(jù)的是下列信息與哺乳動物細(xì)胞膜不同，昆蟲細(xì)胞的膜不含膽固醇(Clayton 1964，Mitsuhashi等人，1983)。膜中膽固醇的存在通常使得膜較厚，厚度隨著膽固醇量的增加而增加(Bretscher，1993)。許多包膜病毒在它們的表面有膜糖蛋白，這些糖蛋白負(fù)責(zé)鑒別和感染靶細(xì)胞(Schlesinger，S.和M.J.Schlesinger，1990)。這些膜糖蛋白有疏水性的跨膜結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域?qū)⒌鞍族^定在膜雙層中(Rice等人，1982)。
這些跨膜蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域必須長得足以從雙層的一側(cè)到達(dá)雙層的另一側(cè)，以將蛋白固定或錨定在膜中。實驗已經(jīng)表明，如果此種結(jié)構(gòu)域由于結(jié)構(gòu)域中缺失氨基酸而縮短，則蛋白質(zhì)就不能和膜恰當(dāng)?shù)剡B接并將掉落(Adams和Rose，1985)。
由于昆蟲的膜中沒有膽固醇，因此昆蟲產(chǎn)生的病毒膜橫截面將比哺乳動物產(chǎn)生的病毒膜薄。由于昆蟲的膜較薄，因此整合入昆蟲膜的蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)域不需要象整合入哺乳動物膜的那些蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域那樣長。因此，就可能在工程改造的病毒中產(chǎn)生缺失，除去病毒糖蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域中的氨基酸。這樣就產(chǎn)生了一種糖蛋白，該糖蛋白能正常地整合入在昆蟲細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的病毒的膜中，但是不能正常地整合入在哺乳動物中復(fù)制的病毒的膜中。這樣，產(chǎn)生了象其親代野生型病毒在昆蟲宿主中一樣在昆蟲細(xì)胞中復(fù)制的突變病毒。另一方面，在哺乳動物中，突變病毒能感染宿主產(chǎn)生病毒蛋白；然而，由于突變的病毒糖蛋白不能跨越和錨定在哺乳動物膜中，因此哺乳動物細(xì)胞中不能產(chǎn)生子代病毒。本發(fā)明方法的另一個優(yōu)點是突變體被改造成缺失突變體，因此絕沒有機(jī)會回復(fù)成野生型表型(這是病毒疫苗的一個常見的問題)。
本發(fā)明預(yù)計的疫苗適用于在脊椎動物和無脊椎動物細(xì)胞中生長的任何包膜的病毒。實際上，本發(fā)明適用于能被改造成在昆蟲細(xì)胞中生長的包膜病毒，或在基因工程修飾的昆蟲細(xì)胞中生長的包膜病毒。
給予下列實施例是為了描述本發(fā)明的不同實施方案，并不是為了以任何方式限制本發(fā)明實施例1用前述的α辛德比斯病毒的全長克隆(Liu等人，1996，Rice等人，1987)，構(gòu)建病毒糖蛋白E2的氨基酸序列，序列中缺失除去1編碼391位賴氨酸的3個堿基。此賴氨酸是此蛋白推定的跨膜結(jié)構(gòu)域的一部分(1982)。
用定點誘變方法在Toto1101中產(chǎn)生一個缺失型突變體(Lys391)，Toto1101是一種含有全長辛德比斯cDNA和SP6啟動子的質(zhì)粒，它能用來體外從該克隆轉(zhuǎn)錄感染性RNA(Rice等人，1987 Liu和Brown，1993a)。采用以前描述的(Liu和Brown，1993a)PCR誘變(Sarkar和Sommer，1990)巨大引物(megaprimer)方法，除去Toto1101的cDNA克隆中的三個核苷酸，核苷酸(nt)9801、9802、9803，導(dǎo)致除去密碼子AAA(K391)。
用30個堿基寡核苷酸序列5′CTCACGG CGCGCAC AGGCACA TAACACTGC3′(SEQ ID NO1)作為誘變引物。該引物和“正向引物”5′CCATCAAGCAGTGCGTCG3′(SEQ ID NO2；18聚體)一起產(chǎn)生了一個518堿基的“巨大引物”(核苷酸9295-9813)。第二個PCR反應(yīng)包括0.5微克巨大引物、100微克Toto1101模板和0.5微克“反向引物”5′GGCAGT GTGCAC CTTAAT CGCCTGC 3′(SEQ ID NO3)。所有PCR反應(yīng)采用30輪95℃1分鐘、64℃1分鐘、72℃1分鐘的循環(huán)，以及最后于72℃培育8分鐘。用BCL I和SPL切割所得PCR產(chǎn)物(1149核苷酸)，并插入Toto 1101中對應(yīng)位點中，產(chǎn)生缺失突變體K391。在用測序酶TM(U.S.Biochemical，Cleveland，OH)以雙脫氧核苷酸測序法通過整個亞克隆區(qū)確認(rèn)缺失后，在體外用SP6聚合酶轉(zhuǎn)錄感染性RNA，并導(dǎo)入(轉(zhuǎn)染入)BHK-21細(xì)胞中。
實施例2體外轉(zhuǎn)錄和RNA轉(zhuǎn)染如以前所述的那樣(Rice等人，1987)，用XhoI使含有辛德比斯病毒K391或野生型RNA的全長cDNA拷貝的質(zhì)粒DNA線性化，并在體外用SP6 RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄。1微克Xho I線性化K391 cDNA或野生型辛德比斯病毒cDNA在以下緩沖液中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體積為20微升的緩沖液中含有80mM Hepes pH7.5，12mM MgCl，10mM DTT和2mM亞精胺和100微克BSA、ATP、UTP、CTP各3mM，1.5mM GTP和4.5mM m7 GpppG，20單位SP6 RNA聚合酶和20單位RNA酶抑制劑。37℃培育2小時后，使2微升RAN產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠上跑電泳來測定RNA的產(chǎn)生。
用突變型或野生型克隆衍生的RNA轉(zhuǎn)染乳倉鼠腎(BHK21)細(xì)胞和白紋伊蚊(蚊)細(xì)胞。蚊細(xì)胞轉(zhuǎn)染的進(jìn)行采用重懸于含20mM Hepes pH7.05，137mM NaCl，0.7mMNa2HPO4和6mM葡聚糖的電泳緩沖液中的5×106細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)對于這些最優(yōu)的電泳參數(shù)為2Kv，25μF，I電阻。37℃培育轉(zhuǎn)染的細(xì)胞直至觀察到細(xì)胞病變效應(yīng)(約24小時)。
培育24小時后，收集感染的細(xì)胞系以及RAN未轉(zhuǎn)染對照的培養(yǎng)基。通過在蚊細(xì)胞和BHK-21細(xì)胞單層上進(jìn)行噬斑試驗(Renz和Brown，1976)，測定各細(xì)胞系培養(yǎng)基中感染性病毒的存在(表1)。
表1辛德比斯病毒野生型或突變型K391轉(zhuǎn)染BHK21細(xì)胞或白紋伊蚊細(xì)胞而產(chǎn)生的感染性病毒
a.模擬表明轉(zhuǎn)染過程的進(jìn)行沒有用RNA如表1所示，突變型K391僅僅在昆蟲細(xì)胞中復(fù)制時才產(chǎn)生感染性病毒顆粒。該病毒進(jìn)而僅僅在蚊細(xì)胞中產(chǎn)生噬斑。當(dāng)試驗結(jié)束時，K391轉(zhuǎn)染的BHK細(xì)胞在BHK或白紋伊蚊細(xì)胞中均沒有產(chǎn)生可檢測的病毒。如果用轉(zhuǎn)染的蚊細(xì)胞產(chǎn)生的病毒感染BHK的培養(yǎng)物，則沒有產(chǎn)生可檢測的病毒。編碼野生型病毒的RNA產(chǎn)生了感染性病毒，該病毒進(jìn)而在兩個細(xì)胞系中均產(chǎn)生了噬斑(表1)。
實施例3病毒蛋白的代謝性放射活性標(biāo)記如上所述，用野生型或K391突變型RNA轉(zhuǎn)染25cm2瓶中的BHK21細(xì)胞亞鋪滿單層。使單層在含有1％FCS、2mM谷氨酰胺和5％TPB的無甲硫氨酸、無半胱氨酸培養(yǎng)基(MEM-E)(饑餓培養(yǎng)基)中饑餓30分鐘。轉(zhuǎn)染后16小時，用含有50μCi/ml[35S]Met/Cys蛋白標(biāo)記混合物的饑餓培養(yǎng)基脈沖標(biāo)記細(xì)胞20分鐘。通過用含有75微克/毫升放線菌酮的PBS洗滌單層來終止標(biāo)記。在含有10倍正常濃度的甲硫氨酸和半胱氨酸以及75微克/毫升放線菌酮的培養(yǎng)基中追蹤(chase)單層(的放射活性)45分鐘。
實施例4免疫沉淀和聚丙烯酰胺凝膠電泳如Knipfer和Brown，1989年所述的那樣，用抗血清免疫沉淀放射性標(biāo)記的病毒蛋白。在冷的PBS中洗滌[35S]Met/Cys標(biāo)記的細(xì)胞兩次，并在裂解緩沖液(0.5％NP-40，0.02M Tris HCl pH7.4，0.05M NaCl，0.2mM PMSF，0.2mM TPCK和0.02mM TLCK)中裂解。離心沉淀胞核棄去。用懸浮在裂解緩沖液中的100微升蛋白A/Sepharose珠(Sigma)預(yù)先吸收上清液1小時，沉淀珠粒。用200微升偶聯(lián)了家兔抗SVHR血清或E2尾單特異性多克隆血清的蛋白A/Sepharose珠粒處理4℃攪拌過夜預(yù)先吸收上清液。用裂解緩沖液洗滌免疫沉淀的珠?！贵w—蛋白復(fù)合物三次，然后溶解在含有12％甘油、4％SDS、50mM Tris pH6.8、5％巰基乙醇和0.02％溴酚藍(lán)的SDS-PAGE樣品緩沖液中。95℃加熱樣品3分鐘，離心除去樣品中的珠粒。如前所述(Liu和Brown，1993 a，b)，在10.8％SDS-PAGE或16％Tricine凝膠上進(jìn)行凝膠電泳。如Bonner和Laskey，1974所述的那樣進(jìn)行熒光照相，并使干燥的凝膠曝光Kodak XAR-5膠片(見圖1)。
實施例5投射電鏡術(shù)在所需時間點通過胰蛋白酶處理從瓶中取出轉(zhuǎn)染蚊細(xì)胞產(chǎn)生的K391感染的或K391 RNA轉(zhuǎn)染的BHK-21細(xì)胞單層，通過低速離心沉淀細(xì)胞。用PBS洗滌細(xì)胞沉淀兩次，并在4％戊二醛中4℃固定過夜。然后用0.2M卡可酸鹽緩沖液(pH7.2)洗滌細(xì)胞三次，后用2％四氧化鋨室溫固定1小時，用卡可酸鹽緩沖液洗滌三次。細(xì)胞用0.5％乙酸雙氧鈾室溫下整體染色1小時。洗滌三次后，將細(xì)胞沉淀包埋在1％瓊脂糖中，并通過分級的乙醇/丙酮系列脫水。最終的包埋是用Mollenhauer′s(1964)Epon-Araldite環(huán)氧混合物#1于70℃進(jìn)行兩天。在Sorvall MT5000顯微切片機(jī)上切下超薄切片，并收集在150目銅網(wǎng)格上。切片用1％乙酸雙氧鈾和/或檸檬酸鉛染色，并在Jeol 100CX投射電鏡中照相(見圖2)。
盡管K391病毒感染的或K391 RNA轉(zhuǎn)染的BHK細(xì)胞沒有產(chǎn)生可被噬斑試驗檢測的病毒，但PAGE顯示，它們確實產(chǎn)生了所有的病毒結(jié)構(gòu)蛋白(圖1)。另外，電子顯微鏡顯示，它們裝配成胞內(nèi)(非感染性)病毒核心(圖2)。
實施例6辛德比斯缺失型突變體K391和其它披膜病毒中產(chǎn)生的類似突變的應(yīng)用當(dāng)允許K391在蚊細(xì)胞中復(fù)制時，它產(chǎn)生了辛德比斯病毒顆粒。蛋白的外露區(qū)域(胞外結(jié)構(gòu)域)為野生型序列。這些野生型蛋白允許病毒進(jìn)入哺乳動物細(xì)胞并產(chǎn)生病毒蛋白(見圖1)，但是如圖2的電子顯微鏡照片所顯示，并沒有裝配成新的病毒。
K391是一種疫苗株。它在培育的昆蟲細(xì)胞中產(chǎn)生的濃度很高。然而，當(dāng)病毒注入哺乳動物宿主中時，該病毒在哺乳動物宿主體內(nèi)循環(huán)并感染細(xì)胞，這些被感染的細(xì)胞產(chǎn)生并呈遞引起免疫監(jiān)視的病毒蛋白，但是，由于其膜結(jié)構(gòu)域截短，感染局限于開始時被接種物感染的那些細(xì)胞。因為該疫苗株是缺失突變產(chǎn)生的，因此不可能回復(fù)成野生型致病性表型。
進(jìn)而，可以將工程改造的缺失突變體導(dǎo)入野生蚊群中。已表明，這些病毒通過卵巢傳遞過程從雌性親代傳播給子代(Leakey 1984)。當(dāng)這些蚊子叮咬脊椎動物時，它們將提供免疫劑量(106感染性顆粒)的疫苗株(例如K391)。Karpf和Brown(1997)已經(jīng)證明，一種甲病毒感染昆蟲細(xì)胞可長時間(在細(xì)胞培養(yǎng)物中超過兩年，而蚊子的壽命為28天)防止該細(xì)胞被另一種甚至是遠(yuǎn)緣關(guān)系的甲病毒感染。因此，疫苗株(例如辛德比斯K391)的存在將通過這些昆蟲來阻斷其它相關(guān)的和致病性病毒的傳播。
實施例7其它缺失突變制備了辛德比斯病毒糖蛋白E2跨膜結(jié)構(gòu)域中的其它缺失突變。產(chǎn)生這些缺失突變的方法如下所述。針對含膜辛德比斯病毒的膜模型描述了這些過程，然而，該程序也易應(yīng)用于其它病毒膜糖蛋白。
將辛德比斯病毒的包膜糖蛋白以具有6個跨膜結(jié)構(gòu)域的多次通過蛋白形式整合入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的膜中。因此，可以有6個潛在的產(chǎn)生缺失突變的靶標(biāo)來防止跨膜結(jié)構(gòu)域的正確整合(見圖3)。這些目標(biāo)中有一些不如其它目標(biāo)那樣適用于此過程。TMD#1(圖2)是信號序列，它被信號識別顆粒識別，并指導(dǎo)ER的膜蛋白質(zhì)合成。截短這一結(jié)構(gòu)域可能擾亂在哺乳動物和昆蟲細(xì)胞中的尋靶作用。TMD#3含有識別并結(jié)合殼蛋白的E2蛋白的序列。已經(jīng)表明，這個相互作用性質(zhì)上非常特異，并需要在跨膜結(jié)構(gòu)域中有該序列(Liu等人，1996；Lopez等人，1994)。因此，象TMD#1一樣，TMD#3具有功能性和結(jié)構(gòu)性成分。該結(jié)構(gòu)域中的明顯缺失可能會消除兩種細(xì)胞系統(tǒng)中的出芽。這樣就留下了四個跨膜結(jié)構(gòu)域可以作為產(chǎn)生影響膜整合的缺失的目標(biāo)(圖3，TMD2、4、5、6)。
6k蛋白不是成熟病毒的成分，它在病毒裝配中的功能還不清楚。在多蛋白中，6k蛋白在ER膜中的適當(dāng)整合和取向?qū)τ贓1的正確整合很關(guān)鍵。6k跨膜結(jié)構(gòu)域(TMD4和5)是進(jìn)行缺失突變的優(yōu)秀的靶標(biāo)，因為這些結(jié)構(gòu)域中的一個不整合就可能會使多蛋白以錯誤的構(gòu)型整合入膜中，或使其不能整合E1。TMD2和6是E2和E1的跨膜結(jié)構(gòu)域，它們均是進(jìn)行缺失突變的明顯目標(biāo)。此多蛋白中的多個跨膜結(jié)構(gòu)域提示，如果單個跨膜結(jié)構(gòu)域中的缺失突變不能完全阻斷哺乳動物細(xì)胞的病毒產(chǎn)生，則其它跨膜結(jié)構(gòu)域中的缺失能進(jìn)一步將成熟化降低到可忽略的水平。
實施例8E2疏水性膜錨著點(TMD#2)的誘變引物的設(shè)計下面給出了測試E2的跨膜結(jié)構(gòu)域上的需求的流程(圖3，TMD2)。該流程容易重復(fù)用于任何其它的辛德比斯跨膜結(jié)構(gòu)域或任何其它病毒糖蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域。疏水性的辛德比斯PE2膜錨著點由26個氨基酸組成。和其它跨膜結(jié)構(gòu)域一樣，甲病毒之間保守的氨基酸同源性很低，但是此疏水性區(qū)域長度卻是高度保守的(Strauss和Strauss，1994)。此結(jié)構(gòu)域缺乏序列保守性提示，該結(jié)構(gòu)域的疏水性質(zhì)才是整合的關(guān)鍵，而不是其序列。
E2的跨膜結(jié)構(gòu)域從PE2序列的氨基酸365開始。此疏水性區(qū)域包括以下序列VYTILA VASATV AMMIGVTVAV LCAC(SEQ ID NO4)。Adams和Rose(1985)證實，為適當(dāng)錨著在哺乳動物細(xì)胞，VSV G蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域中需要最少14個氨基酸。因此，已經(jīng)設(shè)計了在E2跨膜結(jié)構(gòu)域中產(chǎn)生一系列嵌套缺失的誘變性引物。以缺失16個氨基酸開始(在疏水性區(qū)域中留下10個氨基酸)，構(gòu)建了自膜錨著點開始從多達(dá)16個氨基酸缺失到少至1個氨基酸缺失的一組缺失(圖4)。
用PCR巨大引物誘變方法構(gòu)建缺失，產(chǎn)生含有唯一的BclI和SplI位點的缺失片段。將得到的所有構(gòu)建物置入野生型辛德比斯cDNA構(gòu)建物Toto Y420中，產(chǎn)生突變型質(zhì)粒。在用XhoI線性化并用SP6聚合酶轉(zhuǎn)錄后，將轉(zhuǎn)錄本電穿孔轉(zhuǎn)染入BHK或白紋伊蚊細(xì)胞中(如上所述)。在BHK和C710蚊細(xì)胞上測定這些轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的感染性病毒的滴度，以確定這些構(gòu)建物的宿主范圍。表2顯示了用于其構(gòu)建的缺失序列和引物序列。
對于每個構(gòu)建物，采用相同的引物對來產(chǎn)生完整的BclI到SplI區(qū)域。正向引物E1Bcl21包含核苷酸9306-9327的序列，從5′到3′讀為GCGTC GCCTA TAAG AGCGACC(SEQ ID NO5)。反向引物Splext包含核苷酸10420-10444的序列，它是互補的序列，從5′到3′讀為CAGTGT GCACCT TAATCG CCTGC(SEQ ID NO6)。
象對突變體E2 ΔK391那樣，測試轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞產(chǎn)生的病毒在BHK和C7-10蚊細(xì)胞中產(chǎn)生噬斑的能力。用免疫熒光試驗測試感染單層，測試在BHK細(xì)胞中不產(chǎn)生噬斑的那些突變體相對于野生型病毒的感染BHK細(xì)胞的能力。將后一試驗與突變體及野生型病毒的純化制備物中的總蛋白比較，以建立每個突變?nèi)后w的相對感染性。目的是盡可能多地截短跨膜結(jié)構(gòu)域，并仍然在C7-10蚊細(xì)胞單層中獲得合理量的病毒，該病毒能感染但不在BHKH細(xì)胞中產(chǎn)生成熟病毒。如果出現(xiàn)這樣的情況，即單個跨膜結(jié)構(gòu)域的截短減少但不消除BHK細(xì)胞中的病毒生長，則截短第二個結(jié)構(gòu)域，并這樣做直到四個結(jié)構(gòu)域。
表2辛德比斯病毒E2中的缺失和所用引物的名單表設(shè)計的引物缺失的核苷酸 誘變引物的序列E2TM109734-9782 ACATAACACTGCGATGGTGTACAC(SEQ ID No.7)E2 TM12 9740-9782 ACATAACACTGCGGCTAAGATGG(SEQ ID No.8)E2 TM14 9746-9782 ACATAACACTGCTGCGACGGCT(SEQ ID No.9)E2 TM16 9743-9773 GCAACAGTTACGACGGCTAAG(SEQ ID No.10)E2 TM17 9743-9770 ACAGTTACGCCGACGGCTAAG(SEQ ID No.11)E2 TM18 9743-9767 GTTACGCCAATGACGGCTAAG(SEQ ID No.12)E2 TM19 9743-9764 CGCCAATCATGACGGCTAAGA(SEQ ID No.13)E2 TM20 9755-9773 GCAACAGTTACGGTAGCTGA(SEQ ID No.14)E2 TM21 9755-9770 AGTTACGCCGGTAGCTGA(SEQ ID No.15)E2 TM22 9761-9773 TGCAACAGTTACCGCCACGGT(SEQ ID No.16)E2 TM23 9761-9770 ACAGTTACGCCCGCCACGGT(SEQ ID No.17)E2 TM24 9761-9767 GTTACGCCAATCGCCACGGT(SEQ ID No.18)E2 TM25 9761-9764 ACGCCAATCATCGCCACGGT(SEQ ID No.19)本發(fā)明描述的此流程適用于在昆蟲和哺乳動物體內(nèi)復(fù)制、且具有整合膜蛋白作為其結(jié)構(gòu)一部分的任何病毒，即披膜病毒、黃病毒和布尼亞病毒，能在哺乳動物和昆蟲細(xì)胞中天然復(fù)制的所有其它有包膜的病毒，以及能通過基因工程改造病毒或細(xì)胞而在哺乳動物和昆蟲細(xì)胞中復(fù)制的有包膜的病毒。
通過除去病毒包膜的蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域中的氨基酸，制得針對任何含膜病毒的疫苗。這通過除去所述病毒的cDNA克隆中的堿基來實現(xiàn)。將改變的克隆轉(zhuǎn)錄出的RNA轉(zhuǎn)染入昆蟲細(xì)胞內(nèi)。通過在昆蟲細(xì)胞中重復(fù)生長至獲得大量突變型病毒來擴(kuò)增產(chǎn)生的病毒。測試該病毒感染哺乳動物細(xì)胞并在其中產(chǎn)生子代的能力。測試在哺乳動物細(xì)胞中不產(chǎn)生子代的病毒在實驗動物體內(nèi)產(chǎn)生免疫力的能力。確實產(chǎn)生免疫力的那些病毒就是用于生產(chǎn)本領(lǐng)域中已知的人和動物疫苗的候選物。該流程可用于任何蟲媒病毒或其它有包膜的病毒。
本文引用了下列參考文獻(xiàn)Adams G.A.和Rose J.K.(1985)″對蛋白錨著和細(xì)胞表面轉(zhuǎn)運的跨膜結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)需求″Cell 41(3)1007-15Berge T.O.(編著)(1975)《國際蟲媒病毒目錄》第2版，DHEW Publ.No.(CDC)75-8301，(U.S.Government Office，Washington，D.C.)Bonner，W.M.，和R.A.Laskey.1974.″聚丙烯酰胺凝膠中氚標(biāo)記的蛋白和核酸的膜檢測方法″Eur.J.Biochem.4683-88。
Bowers，D.F.，B.A.Abell和D.T.Brown(1995).″白紋伊蚊中辛德比斯甲病毒的復(fù)制和組織嗜性″Virology 2121-12Bretscher MS.(1993)″膽固醇和高爾基體″Science.261(5126)1280-1Brown，D.T.和L.Condreay(1986).《蚊細(xì)胞中的甲病毒復(fù)制，在披膜病毒和黃病毒中》S.Schlesinger編著，473-501頁Clayton，R.B.1964″昆蟲對固醇的利用″J.Lipid res.53-19Karpf，等人(1997)J.Virol.7171 19-7123.
Knipfer，M.E.和D.T.Brown.1989.″辛德比斯病毒糖蛋白的胞內(nèi)運輸和加工″Virology 170！17-122.
Leake，C.J.(1984).″蚊子的卵巢傳播蟲媒病毒″《病毒生物學(xué)中的載體》(Mayo和Harrap編著)63-92頁.Academic Press.
Liu，N.，和D.T.Brown(1993a).″I型膜糖蛋白的胞質(zhì)(內(nèi))結(jié)構(gòu)域瞬時易位入細(xì)胞膜″J.Cell.Biol.120877-833.
Liu，N.，和D.T.Brown(1993b).″磷酸化、去磷酸化行為在辛德比斯病毒成熟中起關(guān)鍵作用″J.Virol.，196703-711.
Liu N.，H.Lee，R.Hernandez和D.T.Brown(！996)″辛德比斯糖蛋白E2的內(nèi)結(jié)構(gòu)域中的突變阻斷內(nèi)結(jié)構(gòu)域的磷酸化、重新取向和核殼體的結(jié)合″Virology 222236-246Mitsuhashi等人1983.″來自昆蟲傳代細(xì)胞系的無固醇真核細(xì)胞″Cell Biol.Int.Rep.71057-1062.
Mollenhauer，H.H.1964.″用于電子顯微鏡法的塑料包埋混合物″Stain Techn.39111-114.
NIAID的特別工作組關(guān)于微生物學(xué)和傳染性疾病的報告，1992年，NIH出版號92-3320Renz.D.，和D.T.Brown.1976.″辛德比斯病毒溫度敏感型突變體在培養(yǎng)的BHK-21和白紋伊蚊(蚊)細(xì)胞中的特征″J.Virol.19775-781.
Rice C.M.等人1982.″辛德比斯病毒糖蛋白的疏水性COOH終端結(jié)構(gòu)域的分離和性質(zhì)分析″J.Mol.Biol.154355-378Rice.，C.M.，R.Levis，J.H.Strauss，和H.V.Huang.1987.″從辛德比斯病毒cDNA克隆產(chǎn)生感染性RNA轉(zhuǎn)錄本致死性突變的圖譜，溫度敏感型標(biāo)記的挽救，和體外誘變以產(chǎn)生定義的突變體″J.Virol.613809-3819.
Sarkar，G.，和S.S.Sommer.1990.″定點誘變的“巨大引物”方法″Biotechniques.8404-407.
Schlesinger，S.和M.J.Schlesinger(1990).″披膜病毒和黃病毒的復(fù)制″(D.M.Kinpe和B.N.Fields編著)《病毒學(xué)》，第I卷，697-711頁.Raven Press，Ltd.New York.
Sprenger，D.和T.Wuithiranyagool(1985).″得克薩斯Harris郡白紋伊蚊的發(fā)現(xiàn)和分布″J.Am.Mosquito Control Assoc.2217-219本說明書中提及的任何專利或出版物表現(xiàn)出本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員的水平。另外，這些專利和出版物在本文以相同程度作引證參考，就如每個單獨的出版物特別單獨納入本發(fā)明作參考一樣。
本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解，本發(fā)明能改變成用來實現(xiàn)本文所提到的和隱含的目的、最終產(chǎn)品和優(yōu)點。本發(fā)明的實施例以及本文描述的方法、步驟、處理過程、分子和特定的化合物是較佳實例的代表，是典型的例子，并不是要限制本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員可在權(quán)利要求范圍確定的本發(fā)明精神范圍內(nèi)作變化和其它應(yīng)用。
序列表<110>Brown，Dennis T.
Hernandez，Raquel<120>用節(jié)肢動物為載體的病毒生產(chǎn)疫苗<130>D6123<140>
<141>1998-09-18<150>US 60/059,668<151>1997-09-18<160>34<210>1<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>和“正向引物”一起用作誘變引物，以產(chǎn)生對應(yīng)于核苷酸9295-9813的518堿基″巨大引物″<400>1ctcacggcgc gcacaggcac ataacactgc30<210>2<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用作“正向引物”和誘變引物一起產(chǎn)生對應(yīng)于核苷酸9295-9813的518堿基″巨大引物″<400>2ccatcaagca gtgcgtcg 18<210>3<211>25<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>用作“反向引物”和巨大引物以及Toto1101質(zhì)粒模板一起產(chǎn)生1149核苷酸產(chǎn)物，用來產(chǎn)生Toto1101中的缺失突變株K391<400>3ggcagtgtgc accttaatcg cctgc25<210>4<211>26<212>PRT<213>辛得比斯病毒<220>
<222>365..390<400>4Val Tyr Thr Ile Leu Ala Val Ala Ser Ala Thr Val Ala Met Met5 10 15Ile Gly Val Thr Val Ala Val Leu Cys Ala Cys20 25<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<222>9306-9327<223>來自巨大引物的正向引物E1Bcl21，和反向引物一起用來產(chǎn)生含有獨特BclI和SplI位點的缺失構(gòu)建物<400>5gcgtcgccta taagagcgac c21<210>6<211>21
<212>DNA<213>人工序列<220>
<222>10420-10444<223>來自巨大引物的反向引物Splext，和正向引物一起用來產(chǎn)生含有獨特BelI和SplI位點的缺失構(gòu)建物<400>6<210>7<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>誘變引物(負(fù)鏈)用來在辛得比斯病毒糖蛋白的E2跨膜結(jié)構(gòu)域中產(chǎn)生缺失<400>7acataacact gcgatggtgt acac24<210>8<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>誘變引物(負(fù)鏈)用來在辛得比斯病毒糖蛋白的E2跨膜結(jié)構(gòu)域中產(chǎn)生缺失<400>8acataacact gcggctaaga tgg 23<210>9<211>22<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>誘變引物(負(fù)鏈)用來在辛得比斯病毒糖蛋白的E2跨膜結(jié)構(gòu)域中產(chǎn)生缺失<400>9acataacact gctgcgacgg ct22<210>10<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>誘變引物(負(fù)鏈)用來在辛得比斯病毒糖蛋白的E2跨膜結(jié)構(gòu)域中產(chǎn)生缺失<400>10gcaacagtta cgacggctaa g 21<210>11<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>誘變引物(負(fù)鏈)用來在辛得比斯病毒糖蛋白的E2跨膜結(jié)構(gòu)域中產(chǎn)生缺失<400>11acagttacgc cgacggctaa g 21<210>12<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>誘變引物(負(fù)鏈)用來在辛得比斯病毒糖蛋白的E2跨膜結(jié)構(gòu)域中產(chǎn)生缺失
<400>12gttacgccaa tgacggctaa g21<210>13<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>誘變引物(負(fù)鏈)用來在辛得比斯病毒糖蛋白的E2跨膜結(jié)構(gòu)域中產(chǎn)生缺失<400>13cgccaatcat gacggctaag a21<210>14<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>誘變引物(負(fù)鏈)用來在辛得比斯病毒糖蛋白的E2跨膜結(jié)構(gòu)域中產(chǎn)生缺失<400>14gcaacagtta cggtagctga 20<210>15<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>誘變引物(負(fù)鏈)用來在辛得比斯病毒糖蛋白的E2跨膜結(jié)構(gòu)域中產(chǎn)生缺失
<400>15agttacgccg gtagctga18<210>16<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>誘變引物(負(fù)鏈)用來在辛得比斯病毒糖蛋白的E2跨膜結(jié)構(gòu)域中產(chǎn)生缺失<400>16tgcaacagtt accgccacgg t21<210>17<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>誘變引物(負(fù)鏈)用來在辛得比斯病毒糖蛋白的E2跨膜結(jié)構(gòu)域中產(chǎn)生缺失<400>17acagttacgc ccgccacggt 20<210>18<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>誘變引物(負(fù)鏈)用來在辛得比斯病毒糖蛋白的E2跨膜結(jié)構(gòu)域中產(chǎn)生缺失<400> 8
gttacgccaa tcgccacggt20<210>19<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>誘變引物(負(fù)鏈)，用來在辛得比斯病毒糖蛋白的E2跨膜結(jié)構(gòu)域中產(chǎn)生缺失<400>19acgccaatca tcgccacggt20<210>20<211>849870<212>DNA<213>辛得比斯病毒<220>
<223>
<400>20catcctgtgt acaccatctt agccgtcgca tcagctaccg tggcgatgat gattggcgta 60actgttgcag tgttatgtgc ctgt84<210>21<211>28<212>PRT<213>辛得比斯病毒<220>
<222>363..390<400>21His Pro Val Tyr Thr Ile Leu Ala Val Ala Ser Ala Thr Val Ala5 10 15
Met Met Ile Gly Val Thr Val Ala Val Leu Cys Ala Cys20 25<210>22<211>27<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>辛得比斯病毒糖蛋白的E2跨膜結(jié)構(gòu)域在缺失氨基酸378后的序列<400>22His Pro Val Tyr Thr Ile Leu Ala Val Ala Ser Ala Thr Val Ala5 10 15Met Ile Gly Val Thr Val Ala Val Leu Cys Ala Cys20 25<210>23<211>26<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>辛得比斯病毒糖蛋白的E2跨膜結(jié)構(gòu)域在缺失氨基酸378和379后的序列<400>23His Pro Val Tyr Thr Ile Leu Ala Val Ala Ser Ala Thr Val Ala5 10 15Ile Gly Val Thr Val Ala Val Leu Cys Ala Cys20 25<210>24
<211>25<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>辛得比斯病毒糖蛋白的E2跨膜結(jié)構(gòu)域在缺失氨基酸378至380后的序列<400>24His Pro Val Tyr Thr Ile Leu Ala Val Ala Ser Ala Thr Val Ala5 10 15Gly Val Thr Val Ala Val Leu Cys Ala Cys20 25<210>25<211>24<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>辛得比斯病毒糖蛋白的E2跨膜結(jié)構(gòu)域在缺失氨基酸378至381后的序列<400>25His Pro Val Tyr Thr Ile Leu Ala Val Ala Ser Ala Thr Val Ala5 10 15Val Thr Val Ala Val Leu Cys Ala Cys20<210>26<211>23<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>辛得比斯病毒糖蛋白的E2跨膜結(jié)構(gòu)域在缺失氨基酸376至380后的序列
<400>26His Pro Val Tyr Thr Ile Leu Ala Val Ala Ser Ala Thr Gly Val5 10 15Thr Val Ala Val Leu Cys Ala Cys20<210>27<211>22<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>辛得比斯病毒糖蛋白的E2跨膜結(jié)構(gòu)域在缺失氨基酸376至381后的序列<400>27His Pro Val Tyr Thr Ile Leu Ala Val Ala Ser Ala Thr Val Thr5 10 15Val Ala Val Leu Cys Ala Cys20<210>28<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>辛得比斯病毒糖蛋白的E2跨膜結(jié)構(gòu)域在缺失氨基酸372至378后的序列<400>28
His Pro Val Tyr Thr Ile Leu Ala Val Met Ile Gly Val Thr Val5 10 15Ala Val Leu Cys Ala Cys20<210>29<211>20<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>辛得比斯病毒糖蛋白的E2跨膜結(jié)構(gòu)域在缺失氨基酸372至379后的序列<400>29His Pro Val Tyr Thr Ile Leu Ala Val Ile Gly Val Thr Val Ala5 10 15Val Leu Cys Ala Cys20<210>30<211>19<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>辛得比斯病毒糖蛋白的E2跨膜結(jié)構(gòu)域在缺失氨基酸372至380后的序列<400>30His Pro Val Tyr Thr Ile Leu Ala Val Gly Val Thr Val Ala Val5 10 15Leu Cys Ala Cys
<210>31<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>辛得比斯病毒糖蛋白的E2跨膜結(jié)構(gòu)域在缺失氨基酸372至381后的序列<400>31His Pro Val Tyr Thr Ile Leu Ala Val Val Thr Val Ala Val Leu5 10 15Cys Ala Cys<210>32<211>16<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>辛得比斯病毒糖蛋白的E2跨膜結(jié)構(gòu)域在缺失氨基酸373至384后的序列<400>32His Pro Val Tyr Thr Ile Leu Ala Val Ala Ala Val Leu Cys Ala5 10 15Cys<210>33<211>14<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>辛得比斯病毒糖蛋白的E2跨膜結(jié)構(gòu)域在缺失氨基酸371至384后的序列
<400>33His Pro Val Tyr Thr Ile Leu Ala Ala Val Leu Cys Ala Cys5 10<210>34<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>辛得比斯病毒糖蛋白的E2跨膜結(jié)構(gòu)域在缺失氨基酸369至384后的序列<400>34His Pro Val Tyr Thr Ile Ala Val Leu Cys Ala Cys5 10
權(quán)利要求
1.一種基因工程改造的有包膜的病毒，其中所述病毒編碼的跨膜蛋白具有一個或多個氨基酸缺失，其中當(dāng)所述工程改造的病毒在昆蟲細(xì)胞中復(fù)制時，所述缺失提供的跨膜蛋白能跨越所述膜而導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生傳染性病毒顆粒，但當(dāng)所述病毒在哺乳動物細(xì)胞中復(fù)制時，該跨膜蛋白不能跨越所述膜，導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生非傳染性病毒顆粒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因工程改造的有包膜的病毒，其中所述病毒能在昆蟲細(xì)胞和哺乳動物細(xì)胞中生長，它是以節(jié)肢動物為載體的病毒。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的病毒，其中所述病毒選自披膜病毒、黃病毒和布尼亞病毒，能在哺乳動物和昆蟲細(xì)胞中天然復(fù)制的有包膜病毒，以及由于病毒或細(xì)胞的基因工程改造而在哺乳動物和昆蟲細(xì)胞中復(fù)制的有包膜病毒。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因工程改造的有包膜的病毒，其中所述昆蟲細(xì)胞是蚊細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的蚊細(xì)胞，其中所述蚊細(xì)胞是白紋伊蚊細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因工程改造的有包膜的病毒，其中所述病毒是辛德比斯病毒，所述跨膜蛋白是病毒糖蛋白E2，所述哺乳動物是人。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因工程改造的有包膜的病毒，其中所述病毒K391病毒。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因工程改造的有包膜的病毒，其中所述跨膜蛋白選自糖蛋白E1、糖蛋白E2、和G蛋白；其中所述病毒選自HSV、HIV、狂犬病毒、肝炎病毒和呼吸道合胞病毒。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因工程改造的有包膜的病毒，其中所述跨膜蛋白是Env，所述病毒是RNA腫瘤病毒。
10.一種從基因工程改造的膜結(jié)合的病毒生產(chǎn)用于哺乳動物接種的病毒疫苗的方法，該方法包括下列步驟對病毒跨膜蛋白作工程改造使得缺失一個氨基酸，以產(chǎn)生工程改造的病毒，其中當(dāng)所述工程改造的病毒在昆蟲細(xì)胞中復(fù)制時，所述跨膜蛋白能跨越所述包膜，但當(dāng)所述病毒在哺乳動物細(xì)胞中復(fù)制時，所述跨膜蛋白不能跨越所述包膜，其中所述病毒保留了在昆蟲細(xì)胞中復(fù)制的能力；將所述突變的病毒導(dǎo)入昆蟲細(xì)胞；和使所述突變的病毒在所述昆蟲細(xì)胞中復(fù)制，以產(chǎn)生病毒疫苗。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述基因工程改造的有包膜的病毒能在昆蟲和哺乳動物細(xì)胞中生長，它是以節(jié)肢動物為載體的病毒或能復(fù)制的任何病毒等。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述病毒選自披膜病毒、黃病毒和布尼亞病毒，能在哺乳動物和昆蟲細(xì)胞中天然復(fù)制的有包膜的病毒，以及通過病毒或細(xì)胞的基因工程改造而能在哺乳動物和昆蟲細(xì)胞中復(fù)制的有包膜的病毒。
13.一種對個體進(jìn)行疫苗接種的方法，該方法包括下列步驟將權(quán)利要求10所述的病毒疫苗導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞中；和使所述病毒疫苗產(chǎn)生病毒蛋白以在所述哺乳動物體內(nèi)引起免疫監(jiān)視，并刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體。
14.一種生產(chǎn)病毒疫苗抵抗蚊群傳播疾病的方法，該方法包括下列步驟對病毒跨膜蛋白作基因改造使得缺失一個氨基酸，以產(chǎn)生工程改造的病毒，其中當(dāng)所述工程改造的病毒在蚊細(xì)胞中復(fù)制時，所述跨膜蛋白能跨越所述包膜，但當(dāng)所述病毒在哺乳動物細(xì)胞中復(fù)制時，所述跨膜蛋白不能跨越所述包膜，且其中所述病毒保留了在蚊細(xì)胞中復(fù)制的能力；將突變的病毒導(dǎo)入野生蚊群中；和使突變病毒在野生蚊群的細(xì)胞中復(fù)制，產(chǎn)生一群攜帶該病毒疫苗株且排除野生型致病性病毒的蚊子，從而通過蚊子叮咬將疫苗輸送給哺乳動物。
全文摘要
本發(fā)明的疫苗和方法根據(jù)的是有包膜病毒的蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域中的缺失突變。產(chǎn)生這些突變的策略根據(jù)的是昆蟲細(xì)胞的膜與哺乳動物細(xì)胞的膜不一樣，它不含膽固醇；因此比哺乳動物的膜更薄。許多膜包覆的病毒其表面具有負(fù)責(zé)鑒定和感染靶細(xì)胞的膜糖蛋白。這些膜糖蛋白有將蛋白錨著在膜雙層中的疏水性跨膜結(jié)構(gòu)域。這些跨膜蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域必須長得足以從雙層的一側(cè)到達(dá)另一側(cè)，以將蛋白固定在膜中。根據(jù)在無脊椎動物中復(fù)制的病毒的膜和在脊椎動物中復(fù)制的病毒的膜之間的差別，本發(fā)明提供了一種疫苗、生產(chǎn)該疫苗的方法以及應(yīng)用該疫苗的方法。
文檔編號C12N15/33GK1553961SQ98809248
公開日2004年12月8日 申請日期1998年9月18日 優(yōu)先權(quán)日1997年9月18日
發(fā)明者D·T·布朗, R·埃爾南德斯, D T 布朗, 系濾 申請人:研究發(fā)展基金會