本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，具體地，涉及純化白喉毒素的方法。
背景技術(shù)：
：白喉是由白喉棒狀桿菌(以下簡稱白喉桿菌)引起的急性呼吸道傳染病。人是白喉桿菌的唯一天然宿主，白喉僅通過飛沫和密切接觸傳播。白喉毒素可以引起產(chǎn)生上呼吸道阻塞性假膜(哮吼)或損傷心肌及其他組織，從而致病和致死。按其菌落形態(tài)的不同及對淀粉發(fā)酵的特點，白喉桿菌可分為4個生物型(重型、belfanti、輕型和中間型)[funkeg,vongraevenitza,clarridgeje,bernardka.clinicalmicrobiologyofcoryneformbacteria.clinmicrobiolrev10:125-159,1997]。除細菌外毒素外，細胞壁成份如o和k抗原，在白喉的致病性中均具有重要作用。所有棒狀菌屬的熱穩(wěn)定性o抗原都相同，而熱不穩(wěn)定k抗原，則因菌株不同而有差異，因而可用于鑒別菌株。同時，k抗原對于粘膜吸附很重要，侵襲性是由索狀因子(毒性糖脂)介導(dǎo)的。白喉桿菌最重要的毒力因子是外毒素，外毒素是由噬菌體介導(dǎo)、細菌染色體編碼的高度保守性多肽。在宿主細胞外，外毒素的活性很低，但通過非毒性片段b粘附并進入細胞后，毒性片段a解離，通過抑制細胞蛋白合成殺死細胞。白喉外毒素可引起局部和全身細胞死亡[diphtheriavaccine:whopositionpaper.geneva,worldhealthorganization,2006,81:24–32]。據(jù)估計在20世紀80年代大量使用白喉類毒素以前，在發(fā)展中國家每年約有100萬病例，5萬～6萬例死亡。即使在近幾年，在地方性流行區(qū)，白喉的報告病死率仍超過10％。對于白喉疾病，最可靠的預(yù)防方法是注射白喉類毒素疫苗。通過疫苗的注射，人體內(nèi)產(chǎn)生了抗體，并在較長時間內(nèi)保持一定的濃度，可以中和進入體內(nèi)的毒素，不致發(fā)病。目前國內(nèi)上市生產(chǎn)企業(yè)均采用硫酸銨二段鹽析法純化白喉毒素。鹽析法是蛋白質(zhì)純化中一種較為粗糙的純化方法，原理是在蛋白質(zhì)溶液中加入中性鹽，改變蛋白質(zhì)的水化膜及表面電荷，導(dǎo)致蛋白溶解度降低，使蛋白質(zhì)分子之間聚集而沉淀。實際上就是利用蛋白質(zhì)溶解度的差異進行分離。其優(yōu)點是成本低，且不會引起蛋白質(zhì)變性；缺點是純度低，注射后易產(chǎn)生不良反應(yīng)，安全性有待提高。白喉類毒素的不良反應(yīng)大多與培養(yǎng)基中的未完全水解蛋白有關(guān)，一般是由白喉毒素純化后殘留的未完全水解蛋白的致敏作用造成的。這些培養(yǎng)基中的非有效成分經(jīng)甲醛脫毒后交聯(lián)在白喉類毒素上，具有反應(yīng)原性，從而引起變態(tài)反應(yīng)。因此，我們需要采用更有效的純化手段，進一步提高白喉毒素的純度。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點，利用離子交換層析和疏水層析分離的雜質(zhì)性質(zhì)互補的特點，即離子交換層析可以分離疏水層析很難或者不能分離的物質(zhì)，采用離子交換層析和疏水層析相結(jié)合純化白喉毒素粗品，獲得高純度的白喉毒素。需要說明的是，本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列工作而完成的：層析技術(shù)是分析領(lǐng)域一種常用的技術(shù)。其中，疏水層析是利用鹽—水體系中樣品組分的疏水基團和固定相的疏水配基之間的疏水力不同，而使樣品組分得以分離的一種層析方法。該方法基于的是蛋白質(zhì)的疏水差異，在高鹽溶液中，蛋白質(zhì)會與疏水配基相結(jié)合，而其他的雜蛋白則沒有此種性質(zhì)進行分離的。利用此種性質(zhì)，因蛋白質(zhì)疏水性不同，可以逐個地先后被洗脫而純化。該方法可用于分離其它方法不易純化的蛋白質(zhì)。而離子交換層析是以離子交換劑作固定相，利用它與流動相中的離子能進行可逆的交換性質(zhì)來分離離子型化合物的層析方法。發(fā)明人將離子交換層析和疏水層析相結(jié)合純化白喉毒素，充分利用了離子交換層析和疏水層析分離的雜質(zhì)性質(zhì)互補的性質(zhì)，即離子交換層析可以分離疏水層析很難或者不能分離的物質(zhì)，獲得高純度的白喉毒素，并有效地避免了白喉毒素引起的變態(tài)反應(yīng)。因而，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了一種純化白喉毒素的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法包括：(1)對含有白喉毒素的溶液進行粗提，以便得到白喉毒素粗品；(2)將所述白喉毒素粗品進行濃縮，以便得到濃縮后的粗品；(3)調(diào)節(jié)所述濃縮后的粗品的ph值至中性或堿性，以便得到調(diào)節(jié)ph后的粗品；(4)將所述調(diào)節(jié)ph后的粗品分別進行疏水層析和離子交換層析，以便獲得純化后的白喉毒素。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，將離子交換層析和疏水層析相結(jié)合純化獲得的高純度白喉毒素，可有效減少過敏原，減輕注射后的不良反應(yīng)。另外，根據(jù)本發(fā)明上述實施例的純化白喉毒素的方法，還可以具有如下附加的技術(shù)特征：根據(jù)本發(fā)明的實施例，步驟(1)中，利用鹽析法對所述含有白喉毒素的溶液進行粗提，優(yōu)選地，利用10％-50％(w/v)硫酸銨溶液進行所述粗提，更優(yōu)選地，為25％(w/v)硫酸銨溶液。由此，利用鹽析法進行粗提，鹽析后樣品含有高濃度的鹽，可以不經(jīng)過或者經(jīng)過很少處理，直接上樣進行疏水層析。根據(jù)本發(fā)明的實施例，步驟(1)中，所述粗提是在ph4.0-7.0的條件下進行的，優(yōu)選地，ph值為ph5.0。由此，將鹽析法和等電點沉淀法相結(jié)合，使粗提的效果更好。根據(jù)本發(fā)明的實施例，步驟(2)中，所述濃縮為超濾濃縮，優(yōu)選地，利用10-50kd膜進行所述超濾濃縮，優(yōu)選地，為30kd膜。由此，超濾效果好。根據(jù)本發(fā)明的實施例，步驟(3)中，調(diào)節(jié)所述濃縮后的粗品的ph值至7.0-9.0，優(yōu)選地，ph值為8.0。根據(jù)本發(fā)明的實施例，步驟(4)中，所述疏水層析的疏水基團選自苯基、辛基和丁基的至少一種，優(yōu)選地，為苯基。由此，疏水層析效果好。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述疏水層析是利用phenylsepharose6ff層析介質(zhì)進行的。由此，疏水層析效果好。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述疏水層析利用含(nh4)2so4的第一緩沖液進行第一步梯度洗脫。由此，洗脫效果好。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述第一緩沖液為選自tris緩沖液、磷酸鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖液和醋酸鹽緩沖液的至少一種。由此，洗脫效果更佳。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述第一緩沖液的濃度為1-5mol/l。由此，洗脫液濃度適宜。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述含(nh4)2so4的第一緩沖液的ph值為7.0-9.0，優(yōu)選地，ph值為8.0，(nh4)2so4的濃度為1-2mol/l。由此，洗脫效果好。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述離子交換層析是陰離子交換層析。由此，適用于分離白喉毒素。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述離子交換層析的層析介質(zhì)為選自deae纖維素、deaesepharoseff、q-ff和captoq的至少一種，優(yōu)選地，層析介質(zhì)為deae纖維素，更優(yōu)選地，層析介質(zhì)為deaesepharoseff層析介質(zhì)。由此，離子交換層析的效果好。根據(jù)本發(fā)明的實施例根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述離子交換層析是利用含nacl的第二緩沖液進行第二步梯度洗脫的。由此，洗脫效果好。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述第二緩沖液為選自tris緩沖液、磷酸鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖液和醋酸鹽緩沖液的至少一種，優(yōu)選地，為磷酸鹽緩沖液。由此，洗脫效果更佳。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述第二緩沖液的濃度為1-100mmol/l。由此，洗脫效果好。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述含nacl的第二緩沖液的ph值為6.0-8.0，優(yōu)選地，ph值為7.0，nacl的濃度為不高于3mol/l。由此，洗脫效果好。本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實踐了解到。附圖說明本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點從結(jié)合下面附圖對實施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中：圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的純化白喉毒素的方法的流程示意圖。具體實施方式下面詳細描述本發(fā)明的實施例，所述實施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。需要說明的是，術(shù)語“第一”、“第二”僅用于描述目的，而不能理解為指示或暗示相對重要性或者隱含指明所指示的技術(shù)特征的數(shù)量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隱含地包括一個或者更多個該特征。進一步地，在本發(fā)明的描述中，除非另有說明，“多個”的含義是兩個或兩個以上。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了一種純化白喉毒素的方法。參考圖1，根據(jù)本發(fā)明的實施例，對該方法進行解釋說明，該方法包括：s100粗提處理根據(jù)本發(fā)明的實施例，對含有白喉毒素的溶液進行粗提，得到白喉毒素粗品。由此，通過粗提初步去除白喉毒素溶液中的雜質(zhì)，便于后續(xù)進一步純化。其中，需要說明的是，本文中的“白喉毒素”應(yīng)做廣義理解，即包含狹義的白喉毒素，也包含白喉毒素突變體。術(shù)語“狹義的白喉毒素”用于指天然發(fā)生的蛋白?！鞍缀矶舅赝蛔凅w”指與白喉毒素具有≥70％、≥80％、≥90％、≥95％、≥98％或≥99％的同一性的序列，并且包括任何已知突變體形式，尤其對于非毒性突變體。“白喉毒素突變體”可以關(guān)于任何本文的白喉毒素使用。根據(jù)本發(fā)明的實施例，利用鹽析法對含有白喉毒素的溶液進行粗提。由此，利用鹽析法進行粗提，鹽析后樣品含有高濃度的鹽，可以不經(jīng)過或者經(jīng)過很少處理，直接上樣進行疏水層析。根據(jù)本發(fā)明的實施例，進行粗提的硫酸銨溶液的濃度不受特別的限制，只要是培養(yǎng)基中的蛋白，充分析出白喉毒素損失小即可，可以根據(jù)溶液的性質(zhì)進行調(diào)節(jié)。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，利用10％-50％(w/v)硫酸銨溶液進行粗提。由于硫酸銨的溫度系數(shù)小，而溶解度大，硫酸溶液的濃度為10％-50％(w/v)，有利于培養(yǎng)基中的蛋白充分鹽析出來。并且硫酸銨的價廉易得，分段效果好，不易引起白喉毒素蛋白質(zhì)變性。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施例，利用25％(w/v)硫酸銨溶液進行粗提。如表1所示，分別采用15％、25％和35％的硫酸銨對相同的含有白喉毒素的溶液進行粗提，雖然這三組硫酸銨的白喉毒素的收和純度都不錯，但相對而言，這三組硫酸銨的白喉毒素的收率逐漸下降，且第3組顯著降低，而白喉毒素的純度逐漸升高，并且第2和3組相對于第1組明顯提高，組合考慮上述粗提結(jié)果，采用濃度為25％(w/v)的硫酸銨溶液進行粗提，培養(yǎng)基中的大部分蛋白雜質(zhì)被析出，白喉毒素收率和純度均較高。表1、不同硫酸銨濃度對收率和純度的對比編號硫酸銨濃度(％)白喉毒素收率(％)白喉毒素純度(lf/mgpn)115832372257655233541683根據(jù)本發(fā)明的實施例，粗提是在ph4.0-7.0條件下進行的。白喉毒素的等電點為ph5.0，在白喉毒素的等電點附近下進行粗提，同時利用鹽析法和等電點沉淀法進行粗提，不同蛋白質(zhì)具有不同等電點，白喉毒素的等電點在ph4.0-7.0范圍內(nèi)，在該ph值范圍內(nèi)，白喉毒素的溶解度低，便于與其它雜質(zhì)蛋白分離。并且，等電點法與鹽析法均屬于沉淀蛋白質(zhì)的方法，當兩種同時使用時，顯著促進蛋白沉淀，使粗提效果更好。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施例，粗提是在ph5.0條件下進行的。由此，粗提是在白喉毒素的等電點下進行的，使等電點沉淀法得到的白喉毒素的純度更高，并且鹽析法和等電點沉淀法相結(jié)合，粗提效果更好。s200濃縮處理根據(jù)本發(fā)明的實施例，將白喉毒素粗品進行濃縮，得到濃縮后的粗品。由此，通過濃縮處理，提高白喉毒素粗品的濃度，減小后續(xù)的層析處理的樣本體積，從而，使層析柱的體積減小，并簡化了層析的步驟，縮短了層析時間。根據(jù)本發(fā)明的實施例，濃縮為超濾濃縮。由此，操作簡便，濃縮效果好。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施例，利用10-50kd膜進行超濾濃縮。由此，超濾膜截留的物質(zhì)的分子量與白喉毒素的分子量相近，保證白喉毒素充分截留，減少白喉毒素在濃縮過程中的損失。進一步地，發(fā)明人分別采用孔徑為10、30和50kd的超濾膜進行超濾濃縮，第1和2組的白喉毒素的收率相同，但第2組的用時僅為第1組的一半左右，而第3組雖然用時較少，但其白喉毒素的收率相對也降低。進而，根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施例，利用30kd膜進行超濾濃縮。由此，截留得到的白喉毒素的不僅收率較高，并且用時較少。表2、不同超濾膜包孔徑的對比編號超濾膜包孔徑(kd)白喉毒素收率(％)15l用時(min)1109413923094733508365s300調(diào)ph值根據(jù)本發(fā)明的實施例，調(diào)節(jié)濃縮后的粗品的ph值至中性或堿性，得到調(diào)節(jié)ph后的粗品。由此，通過調(diào)節(jié)粗品的ph值，使粗品中的白喉毒素和雜質(zhì)分別帶不同的電荷，便于后續(xù)的離子交換層析。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，調(diào)節(jié)濃縮后的粗品的ph值至7.0-9.0。由此，粗品中的白喉毒素和雜質(zhì)分別帶不同的電荷，便于后續(xù)的離子交換層析。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施例，調(diào)節(jié)濃縮后的粗品的ph值至8.0。由此，粗品中的白喉毒素和雜質(zhì)分攜帶的電荷差異大，離子交換層析的效果好。s400層析處理根據(jù)本發(fā)明的實施例，將調(diào)節(jié)ph后的粗品分別進行疏水層析和離子交換層析，獲得純化后的白喉毒素。其中，疏水層析和離子交換層析不受特別的限制，可以先進行疏水層析再進行離子交換層析，也可以先進行離子交換層析，再進行疏水層析。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)將離子交換層析和疏水層析相結(jié)合純化白喉毒素，充分利用了離子交換層析和疏水層析分離的雜質(zhì)性質(zhì)互補的性質(zhì)，即離子交換層析可以分離疏水層析很難或者不能分離的物質(zhì)，獲得高純度的白喉毒素，根據(jù)本發(fā)明的實施例，純化后的白喉毒素的純度達到不低于4000lf/mgpn，減少過敏原，減輕注射后的不良反應(yīng)，提高疫苗的安全性。疏水層析根據(jù)本發(fā)明的實施例，疏水層析的疏水基團不受特別的限制，只要能將白喉毒素與雜質(zhì)蛋白分離即可。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，疏水基團選自苯基、辛基和丁基的至少一種。由此，依據(jù)疏水配基苯基、辛基、丁基、丁基(低密度)，疏水性依次減弱的特點，為了具有較高載量，優(yōu)選疏水性強的苯基配基。依據(jù)對白喉毒素與其它雜蛋白的結(jié)合能力差異大，便于將白喉毒素與其它雜質(zhì)蛋白分離。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施例，層析介質(zhì)為phenylsepharose6fastflow(highsub)(即phenylsepharose6ff)，疏水基團為苯基，疏水層析的效率更高。根據(jù)本發(fā)明的實施例，疏水層析是利用phenylsepharose6ff層析介質(zhì)進行層析純化。phenylsepharose6ff層析介質(zhì)，采用高度交聯(lián)的6％的瓊脂糖作為基架，該基質(zhì)形成球形顆粒(90微米大小)，用疏水配基通過不帶電的化學(xué)穩(wěn)定的氧醚鍵或硫醚鍵取代而成。該基架類型的介質(zhì)，具有高流速、大通量的特點，適合用于疫苗的生產(chǎn)規(guī)模。由此，采用phenylsepharose6ff層析介質(zhì)用于白喉毒素的層析純化。第一步梯度洗脫用于將白喉毒素從層析柱上沖洗下來。根據(jù)本發(fā)明的實施例，疏水層析利用含(nh4)2so4的第一緩沖液進行第一步梯度洗脫。由于(nh4)2so4的分辨率高，利用含(nh4)2so4的第一緩沖液進行洗脫，使白喉毒素與雜蛋白的分離效果更好。根據(jù)本發(fā)明的實施例，第一緩沖液包括但不限于tris緩沖液、磷酸鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖液和醋酸鹽緩沖液，緩沖液可以是其中的一種或幾種。由此，緩沖液的穩(wěn)定性好，洗脫效果更佳。進一步地，根據(jù)本發(fā)明的實施例，第一緩沖液的濃度為1-5mol/l。由于疏水相互作用層析是根據(jù)蛋白表面疏水性的不同，利用蛋白和疏水層析介質(zhì)疏水表面可逆的相互作用來分離蛋白。其中緩沖液里鹽的存在會顯著影響蛋白和疏水層析介質(zhì)的相互作用。高濃度的鹽會增強相互作用，而低濃度的鹽減弱相互作用。具有最低程度疏水性的蛋白最先被洗脫，具有最強相互作用的蛋白最后被洗脫。由此，該濃度的第一緩沖液有利于將白喉毒素和雜蛋白有區(qū)分地洗脫下來，使得到的白喉毒素的純度更高。更進一步地，根據(jù)本發(fā)明的實施例，含(nh4)2so4的第一緩沖液的ph值為7.0-9.0。由此，在該ph值范圍內(nèi)，緩沖液對疏水層析的選擇性和分辨率的影響小。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施例，含(nh4)2so4的第一緩沖液的ph值為8.0，(nh4)2so4的濃度為1-2mol/l。由此，硫酸銨的分辨率更佳，并且緩沖液的鹽濃度對疏水層析的選擇性和分辨率都有重要影響。離子交換層析根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，離子交換層析可以是陰離子交換層析。由此，適用于分離白喉毒素。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，離子交換層析的層析介質(zhì)可以選自deae纖維素、deaesepharoseff、q-ff和captoq的至少一種。由此，層析介質(zhì)的性質(zhì)適于分離白喉毒素。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施例，層析柱為deae纖維素柱。由此，白喉毒素的純化效果好，效率高。根據(jù)本發(fā)明更優(yōu)選的實施例，層析介質(zhì)為deaesepharoseff層析介質(zhì)。由此，白喉毒素的純化效果佳，效率高，純化的白喉毒素純度高。第二步梯度洗脫用于將白喉毒素從離子交換層析柱上沖洗下來，根據(jù)本發(fā)明的實施例，離子交換層析可以是利用含nacl的第二緩沖液進行第二步梯度洗脫的。由此，隨著鹽濃度的增大，鈉離子和氯離子會同結(jié)合的白喉毒素競爭填料表面的電荷，并且對白喉毒素蛋白有一定的穩(wěn)定作用，避免白喉毒素變性。根據(jù)本發(fā)明的實施例，第二緩沖液包括但不限于tris緩沖液、磷酸鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖液和醋酸鹽緩沖液，且可以是其中的一種或多種。由此，緩沖液的緩沖能力好，保持ph值穩(wěn)定。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施例，第二緩沖液為磷酸鹽緩沖液。由此，緩沖液的緩沖能力強，洗脫效果更佳。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，第二緩沖液的濃度為1-100mmol/l。由此，在該濃度范圍內(nèi)，保證緩沖液具有較強的緩沖能力，使溶液的ph保持穩(wěn)定。在離子交換層析中，緩沖液的ph和離子強度必須同白喉毒素的穩(wěn)定性和活性相兼容。最適合的ph應(yīng)該允許白喉毒素結(jié)合，但又盡可能的靠近蛋白洗脫下來的ph值。如果該ph值太高或太低，洗脫將會變得更加困難。根據(jù)本發(fā)明的實施例，含nacl的第二緩沖液的ph值為6.0-8.0。該ph允許白喉毒素結(jié)合，但又靠近白喉毒素洗脫下來的ph值，使白喉毒素易于洗脫，并且白喉毒素在該ph值范圍內(nèi)的穩(wěn)定性和活性不受影響。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施例，含nacl的第二緩沖液的ph值為7.0。由此，白喉毒素的洗脫效果好，并且白喉毒素的穩(wěn)定性好，活性高。相應(yīng)的，根據(jù)本發(fā)明的實施例，nacl的濃度為不高于3mol/l。由此，nacl的離子強度適宜，與前述的ph值范圍相匹配，洗脫效果好，并有效保證了白喉毒素的穩(wěn)定性和活性不受洗脫的影響。下面參考具體實施例，對本發(fā)明進行說明，需要說明的是，這些實施例僅僅是說明性的，而不能理解為對本發(fā)明的限制。下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的方案進行解釋。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下面的實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體技術(shù)或條件的，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品，例如可以采購自sigma公司。實施例1白喉毒素的制備將工作種子批菌種(cmcc38007，來源自中國食品藥品檢定研究院)啟開后，接種于呂氏血清培養(yǎng)基上，于34.5～35.0℃培養(yǎng)24～48小時。第2代至第4代接種于改良林氏培養(yǎng)基，分別于34.5～35.0℃培養(yǎng)24～48小時，然后接種于白喉產(chǎn)毒培養(yǎng)基。白喉產(chǎn)毒培養(yǎng)采用培養(yǎng)罐液體培養(yǎng)。產(chǎn)毒培養(yǎng)的溫度控制在34.5～35.0℃，產(chǎn)毒培養(yǎng)的時間為24～48小時。培養(yǎng)過程中，根據(jù)ph的變化，適當補加碳源、氮源，調(diào)控ph。培養(yǎng)物絮狀單位不再升高后停止培養(yǎng)，加入甲醛溶液使其最終濃度為0.1％(v/v)，攪拌。毒素制造過程中應(yīng)嚴格控制雜菌污染，凡經(jīng)鏡檢或純菌試驗發(fā)現(xiàn)污染者應(yīng)廢棄。將培養(yǎng)物離心取上清液，毒素效價不低于150lf/ml時收獲。實施例2白喉毒素的純化將實施例1獲得的含白喉毒素的上清液進行純化，具體方法如下：1、粗提：采用鹽析法和等電點沉淀法共同進行粗提，具體步驟如下(1)在實施例1獲得的含白喉毒素的上清液中加入25％(w/v)硫酸銨，待硫酸銨完全溶解后，將溶液ph調(diào)至5.0，2℃～8℃，靜置過夜。(2)過夜后，離心，棄去沉淀，收獲上清，過濾。(3)利用30kd膜包超濾濃縮步驟(2)獲得的上清液，濃縮至15倍，獲得濃縮后的白喉毒素。2、疏水層析采用phenylsepharose6ff疏水層析柱進行疏水層析，具體步驟如下：(1)將濃縮后的白喉毒素ph調(diào)節(jié)至8.0，得到調(diào)ph后的白喉毒素。(2)以平衡液(平滑液成份：10mmoltris+2mol/l(nh4)2so4，ph8.0)平衡phenylsepharose6ff疏水層析柱，其中，a泵為平衡液，b泵為緩沖液10mmol/ltris，ph8.0。(3)將調(diào)ph后的白喉毒素上樣，根據(jù)白喉毒素在高鹽環(huán)境下的疏水性質(zhì)，使其與層析介質(zhì)的疏水配基相結(jié)合，掛在柱子上。(4)a泵的平衡液沖洗層析柱，將未與疏水層析介質(zhì)結(jié)合的雜蛋白洗下來；45％b泵洗脫與疏水層析介質(zhì)結(jié)合不緊密的雜蛋白，100％b泵洗脫目標蛋白白喉毒素，得到疏水層析后白喉毒素。3、離子交換層析利用deaesepharoseff離子交換層析柱進行離子交換層析，具體步驟如下：(1)將上一步驟得到的疏水層析后的白喉毒素ph調(diào)至7.0，得到中性白喉毒素。(2)以平衡液(平衡液成份：10mmol/lpb,ph7.0)平衡deaesepharoseff離子交換層析柱，其中，a泵為平衡液，b泵為緩沖液10mmol/lpb+1mol/lnacl,ph7.0。(3)將中性白喉毒素上樣。(4)洗脫：15％b泵洗脫高純度白喉毒素，100％b泵洗脫雜蛋白，得到純化后的白喉毒素。實施例3白喉毒素的脫毒將實施例2得到的純化后的白喉毒素進行脫毒處理，具體方法如下：(1)用pbs緩沖鹽水將實施例得到的純化后白喉毒素稀釋為1000～1500lf/ml。(2)將步驟(1)得到的白喉毒素稀釋液依次加入終濃度為20mmol/l的鹽酸賴氨酸和終濃度為0.25％的甲醛溶液。(3)利用0.45+0.2μm除菌濾器將步驟(2)得到的溶液進行過濾后，置室溫2-3天、37℃環(huán)境中10-15天進行脫毒，制成類毒素。實施例4白喉類毒素的檢定本發(fā)明方法制備的白喉類毒素原液與國內(nèi)普遍采用的二段鹽析方法制備的白喉類毒素原液的比較：表3、白喉類毒素原液的比較結(jié)果顯示，本發(fā)明實施例制備的白喉類毒素原液的純度高度4000lf/mgpn意思，遠高于傳統(tǒng)的鹽析方法的純度，同時也遠高于《中華人民共和國藥典》(2010年版三部)本品種純度不低于1500lf/mgpn的要求。綜上所述，本發(fā)明將離子交換層析和疏水層析相結(jié)合純化白喉毒素，充分利用了離子交換層析和疏水層析分離的雜質(zhì)性質(zhì)互補的性質(zhì)，即離子交換層析可以分離疏水層析很難或者不能分離的物質(zhì)，獲得高純度的白喉毒素，純化后的白喉毒素的純度達到不低于4000lf/mgpn，有效地減少過敏原，減輕注射后的不良反應(yīng)，疫苗的安全性顯著提高。在本說明書的描述中，參考術(shù)語“一個實施例”、“一些實施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點包含于本發(fā)明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術(shù)語的示意性表述不一定指的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點可以在任何的一個或多個實施例或示例中以合適的方式結(jié)合。盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實施例，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解：在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可以對這些實施例進行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求及其等同物限定。當前第1頁12