表達(dá)白喉毒素a片段的慢病毒載體系統(tǒng)及其制備與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種表達(dá)白喉毒素A片段的慢病毒載體系統(tǒng)及其制備與應(yīng)用，本發(fā)明構(gòu)建的慢病毒載體系統(tǒng)能協(xié)同表達(dá)雙順?lè)醋覩FP/RFP和DTA，驅(qū)動(dòng)白喉毒素A片段在腫瘤細(xì)胞中高效表達(dá)，熒光蛋白的表達(dá)可用于驗(yàn)證所表達(dá)的DTA的有效性，同時(shí)，熒光蛋白的表達(dá)還可用于監(jiān)測(cè)慢病毒的包裝效果。本發(fā)明構(gòu)建的慢病毒載體系統(tǒng)能抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞中蛋白質(zhì)的合成，尤其對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW620和乳腺癌細(xì)胞系ZR7530有特異殺傷效果，可用于腫瘤基因治療。
【專利說(shuō)明】表達(dá)白喉毒素A片段的慢病毒載體系統(tǒng)及其制備與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種表達(dá)白喉毒素A片段的慢病毒載體系統(tǒng)及其制備與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]白喉毒素(diphtheriatoxin，DT)只在白喉?xiàng)U菌的溶源性菌體內(nèi)產(chǎn)生，因?yàn)橹挥腥茉淳藕芯幋a該蛋白的結(jié)構(gòu)基因(Tox基因)。白喉毒素致毒機(jī)理主要是能抑制真核生物細(xì)胞的胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成而表現(xiàn)毒性，它能催化真核胞質(zhì)內(nèi)NAD+上的ADP核糖基向翻譯延伸因子-2(EF-2)轉(zhuǎn)移，從而消耗了生物正常代謝過(guò)程所需NAD+并阻斷真核細(xì)胞蛋白質(zhì)合成而對(duì)細(xì)胞致死。同時(shí)，白喉毒素的毒性具有很強(qiáng)特異性，具體表現(xiàn)在兩個(gè)方面:首先，它只催化NAD+上ADP核糖基向EF-2轉(zhuǎn)移，對(duì)NAD+類似物如a -NAD+, NADP+和NADH則不發(fā)生該轉(zhuǎn)移反應(yīng)；其次，僅真核生物的EF-2作為該反應(yīng)的受體。
[0003]白喉毒素的毒性全部集中在白喉毒素A片段(DTA)上，而片段A進(jìn)入細(xì)胞后能獨(dú)立地表達(dá)ADP核糖基轉(zhuǎn)移活性，且編碼片段A的基因長(zhǎng)度大約只有800個(gè)堿基，有利于基因治療方面的操作。
[0004]Ku80蛋白(XRCC5基因編碼)在腫瘤細(xì)胞中高豐度表達(dá)，而在正常組織細(xì)胞中表達(dá)豐度很低，同時(shí)此蛋白還能增強(qiáng)食管癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，這些都表明該基因的異常表達(dá)與腫瘤關(guān)系緊密。在食道癌細(xì)胞中對(duì)KuSO蛋白進(jìn)行RNA干擾，發(fā)現(xiàn)干擾可抑制細(xì)胞的增殖并增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)射線和絲裂霉素C的敏感性。
[0005]為實(shí)現(xiàn)安全的基因治療，慢病毒整合能力應(yīng)盡可能被消除。非整合的慢病毒載體由于病毒組裝、反轉(zhuǎn)錄、前病毒的入核和病毒的整合過(guò)程都分開(kāi)，因此不僅能避免由整合引起的插入突變風(fēng)險(xiǎn)，而且仍具有介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移的優(yōu)勢(shì)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種表達(dá)白喉毒素A片段的慢病毒載體系統(tǒng)及其制備與應(yīng)用，此慢病毒載體系統(tǒng)是一種對(duì)腫瘤細(xì)胞具有顯著治療能力的，可在腫瘤細(xì)胞中高效協(xié)同表達(dá)CMV啟動(dòng)子或XRCC5啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光蛋白和白喉毒素A片段的雙順?lè)醋臃钦下《据d體系統(tǒng)。
[0007]本發(fā)明公開(kāi)了一種表達(dá)白喉毒素A片段的慢病毒載體系統(tǒng)，是將整合酶D64突變?yōu)锳的PMDL (D64A)、REV、VSVG和表達(dá)載體共轉(zhuǎn)入過(guò)量表達(dá)突變EF-2的293T細(xì)胞，即在宿主細(xì)胞中包裝獲得慢病毒載體系統(tǒng)；
所述的表達(dá)載體包括 pPRME-CMV-GFP-2A-DTA-FF3，pPRIME-CMV-RFP-2A-DTA-FF3,pPRIME-XRCC5p-GFP-2A-DTA-FF3, pPRIME-XRCC5p-RFP-2A-DTA-FF3 ；
所述的慢病毒載體系統(tǒng)是一種組成型和腫瘤細(xì)胞特異型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的白喉毒素A片段的非整合慢病毒載體系統(tǒng)。
[0008]所述的慢病毒載體系統(tǒng)是利用CMV啟動(dòng)子或XRCC5啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)白喉毒素A片段和熒光蛋白協(xié)同表達(dá)，其出發(fā)載體為PPRME-CMV-GFP-FF3。
[0009]所述的表達(dá)載體能協(xié)同表達(dá)雙順?lè)醋覩FP/RFP和DTA，其中由CMV驅(qū)動(dòng)的慢病毒表達(dá)載體作為陽(yáng)性對(duì)照，而XRCC5啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的表達(dá)載體為靶向腫瘤基因治療的慢病毒載體。
[0010]一種如上述表達(dá)白喉毒素A片段的慢病毒載體系統(tǒng)的制備方法，包括以下步驟: 步驟I)熒光蛋白基因的克隆:以PPRME-CMV-GFP-FF3或pPRME-CMV-dsRed_FF3質(zhì)粒
為樽板，GFP if 向引物:5’ -GCACCGGTGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGG-3’ (SEQ ID N0:1)，末端為AgeI酶切位點(diǎn)(下 劃線表示的堿基)，GFP反向引物:5’ -ATAGTTTAGCGGCCGCGGGCCCTCTAGACTTGTACAGCTCGTCCATGC-3’(SEQ ID NO: 2)，末端為NotI酶切位點(diǎn)(下劃線表示的堿基)；RFP if 向引物:5’ -GCACCGGTGCCACCATGGCCTCCTCCGAGGAC-3’ (SEQ ID NO:3)，末端為 AgeI酶切位點(diǎn)(下劃線表示的堿基)，RFP反向引物:5’ -ATAGTTTAGCGGCCGCGGGCCCTCTAGACAGGAACAGGTGGTGGCG-3’ (SEQ ID NO:4)，末端為NotI酶切位點(diǎn)(下劃線表示的堿基)，高保真PCR擴(kuò)增GFP和RFP基因，PCR反應(yīng)條件為:95° C變性2min，95° C變性20sec_60。C退火20sec-72° C 30sec延伸重復(fù)35個(gè)循環(huán)，72° C延伸5min，并克隆入T/A克隆載體；
步驟2) DTA克隆:以pBSDTA-1I的質(zhì)粒為模板，正向引物:5’ -GCGGGCCCATGGACCCTGATGATGTTG-3’ (SEQ ID NO: 5)，末端為ApaI酶切位點(diǎn)(下劃線表示的堿基)，反向引物:5’-ATAGTTTAGCGGCCGCTTAGAGCTTTAAATCTCTGTA-3’ (SEQ ID NO:6)，末端為 NotI 酶切位點(diǎn)(下劃線表示的堿基)，高保真克隆DTA片段，PCR反應(yīng)條件為:95° C變性2min，95° C變性20sec-60° C退火20sec-72。C Imin延伸重復(fù)35個(gè)循環(huán)，72° C延伸5min，PCR產(chǎn)物以ApaI和NotI酶按雙酶切連接方法克隆入步驟I)的T/A克隆載體中，獲得GFP/RFP-DTA的T/A克隆載體；
步驟3) 口蹄疫病毒2A序列的設(shè)計(jì)和合成:合成的核苷酸翻譯后對(duì)應(yīng)的氨基酸序列為:SRAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 15)，根據(jù)此2A短肽氨基酸序列，設(shè)計(jì)寡核苷酸片段，通過(guò)退火，連接插入步驟2)中獲得的T/A克隆載體的GFP/RFP和DTA之間，獲得GFP/RFP-2A-DTA的T/A克隆載體；
步驟4)啟動(dòng)子克隆:以提取的293T細(xì)胞基因組DNA為模板，正向引物:5’ -GCGGGCCCCTGCAGAGTAGAATCTCCCTTC-3’ (SEQ ID NO: 7)，末端為ApaI酶切位點(diǎn)(下劃線表示的堿基)，反向引物:5’ -CTAGCTAGCGTTGCCGGTCCTCAGGCGCT-3’ (SEQ ID N0:8)，末端為 NheI 酶切位點(diǎn)(下劃線表示的堿基)，高保真克隆基因啟動(dòng)子，PCR反應(yīng)條件為:95° C變性2min，95° C變性20sec-55° C退火30sec_72° C 45sec延伸重復(fù)35個(gè)循環(huán)，72 ° C延伸5min, PCR產(chǎn)物以ApaI和NheI酶按雙酶切連接方法克隆入用同種內(nèi)切酶酶切形成的線性PPRIME-CMV-GFP-FF3 慢病毒載體，連接形成 pPRME_XRCC5p-GFP_FF3 表達(dá)載體；
步驟5)利用酶切連接方法將GFP/RFP-2A-DTA T/A克隆載體中的GFP/RFP-2A-DTA 片段分別轉(zhuǎn)移入 pPRME-CMV_GFP_FF3 或 pPRME_XRCC5p-GFP_FF3 慢病毒表達(dá)載體，獲得 pPRME-CMV-GFP-2A-DTA-FF3，pPRIME-CMV-RFP-2A-DTA-FF3,pPRIME-XRCC5p-GFP-2A-DTA-FF3 或 pPRME-XRCC5p-RFP-2A-DTA_FF3 ；
步驟6) EF-2基因的克隆:以293T細(xì)胞的RNA反轉(zhuǎn)錄形成的cDNA為模板，正向引物:5’-CGGAATTCGCCACCATGGTGAACTTCACGGTAGAC-3’ (SEQ ID NO: 9)，末端為 EcoRI 酶切位點(diǎn)(下劃線表示的堿某)，反向引物:5’ -CGGGATCCCTACAATTTGTCCAGGAAGTTG-3’ (SEQ ID NO: 10),末端為BamHI酶切位點(diǎn)(下劃線表示的堿基)，高保真擴(kuò)增EF-2基因，PCR反應(yīng)條件為:95° C 變性 2min，95° C 變性 20sec_57° C 退火 20sec_72° C 1.5min 延伸重復(fù) 35 個(gè)循環(huán)，72° C 延伸 5min ;
步驟7)EF-2 717位氨基酸的突變和慢病毒載體的構(gòu)建:利用重疊PCR的方法，將EF-2的717位甘氨酸GGA定點(diǎn)突變?yōu)榫彼酑GA，突變引物為:正向引物:5’ -GACGCCATCCACCGCCGAGGGGGCCAGATCA-3 ’( SEQ ID NO: 11)，反向引物:5 ’ -TGATCTGGCCCCCTCGGCGGTGGATGGCGTC-3’ (SEQ ID NO: 12)，以步驟6)中的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板進(jìn)行高保真擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為:95° C 變性 2min，95° C 變性 20sec_62° C 退火 20sec_72° C 2.5min 延伸重復(fù) 30 個(gè)循環(huán)，72° C延伸5min，再以EcoRI和BamHI酶按雙酶切連接方法將PCR突變產(chǎn)物插入至pCDH-CMV-MCS-EFl-Puro 慢病毒載體，形成 pCDH-CMV-mEF-2-EFl-Puro ； 步驟8)穩(wěn)定表達(dá)突變EF-2的細(xì)胞系的建立:將包裝好的pCDH-CMV-mEF-2-EFl-Puro，與PHR、VSVG載體按比例共轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞系，收集病毒上清液進(jìn)行細(xì)胞感染，再利用
1.5 μ g/ml嘌呤霉素對(duì)感染細(xì)胞進(jìn)行篩選，獲得突變EF-2過(guò)量表達(dá)的293T細(xì)胞系；
步驟9)慢病毒的包裝:在轉(zhuǎn)染前對(duì)293T細(xì)胞進(jìn)行無(wú)血清饑餓2小時(shí)，將位于整合酶D64突變?yōu)锳的PMDL (D64A)、REV、VSVG和步驟5)中的慢病毒表達(dá)載體混勻后，再與自制的PEI轉(zhuǎn)染試劑混勻，共同加入步驟8)中過(guò)量表達(dá)突變EF-2的293T包裝細(xì)胞中，6小時(shí)后將培養(yǎng)基替換為含2%的血清的培養(yǎng)基，連續(xù)收集3天上清，利用超速離心機(jī)濃縮病毒，獲得非整合型的 pPRME-CMV-GFP-2A-DTA-FF3, pPRIME-CMV-RFP-2A-DTA-FF3，pPRIME-XRCC5p-GFP-2A-DTA-FF3 或 pPRME-XRCC5p-RFP-2A-DTA_FF3 慢病毒。
[0011]所述的慢病毒載體系統(tǒng)是一種應(yīng)用于腫瘤基因治療的雙順?lè)醋臃钦下《据d體系統(tǒng)。
[0012]所述的腫瘤基因治療針對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW620和乳腺癌細(xì)胞系ZR7530，其改建方法如下:
步驟I)熒光素酶基因的克隆和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建:以pGL3-Basic質(zhì)粒為模板，if 向引物:5’ -CGGAATTCGCCACCATGGAAGACGCCAAAAACA-3’ (SEQ ID NO: 13)，末端為 EcoRI酶切位點(diǎn)(下劃線表示的堿基),反向引物:5’ -GAAGATCTTTACACGGCGATCTTTCCG-3，(SEQ IDNO: 14)，末端為BglII酶切位點(diǎn)(下劃線表示的堿基)，高保真擴(kuò)增熒光素酶基因，PCR反應(yīng)條件為:95° C 變性 2min，95° C 變性 20sec_60。C 退火 20sec_72。C Imin 延伸重復(fù) 35個(gè)循環(huán)，72° C延伸5min，PCR產(chǎn)物以EcoRI和BglII酶按雙酶切連接方法將熒光素酶基因插入至PLXSN3逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，獲得pLXSN3-Luciferase逆轉(zhuǎn)錄病毒載體；
步驟2)穩(wěn)定表達(dá)突變EF-2的SW620和ZR7530細(xì)胞系的建立方法為:將包裝好的pCDH-CMV-mEF-2-EFl-Puro分別感染SW620和ZR7530細(xì)胞，再分別以濃度為I μ g/ml和1.5 μ g/ml的嘌呤霉素對(duì)感染細(xì)胞進(jìn)行篩選，獲得突變EF-2過(guò)量表達(dá)的SW620 (mEF-2)和ZR7530 (mEF-2)細(xì)胞系；
步驟3)穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶基因的SW620以及ZR7530細(xì)胞系的建立:將pLXSN3-Luc if erase 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體分別轉(zhuǎn)染至 SW620、ZR7530、SW620 (mEF-2), ZR7530(mEF-2)細(xì)胞系中，用2μ g/μ I和1.2μ g/μ I的G418分別對(duì)SW620或ZR7530細(xì)胞系進(jìn)行篩選，獲得相應(yīng)的細(xì)胞系:W620 (Luc)、ZR7530 (Luc)、SW620 (Luc+mEF-2)、ZR7530(Luc+mEF-2)。[0013]本發(fā)明的有益效果在于:
(1)從腫瘤細(xì)胞中有效分離了高效表達(dá)的XRCC5啟動(dòng)子；
(2)通過(guò)載體構(gòu)建的方式，構(gòu)建了由CMV和XRCC5啟動(dòng)子分別驅(qū)動(dòng)的熒光蛋白GFR/RFP和DTA協(xié)同表達(dá)的慢病毒載體，GFR/RFP和DTA之間用口蹄疫病毒的2A片段進(jìn)行藕聯(lián)；
(3)構(gòu)建了蛋白翻譯延伸因子(EF-2)特異氨基酸突變的慢病毒表達(dá)載體，并進(jìn)行了病毒的包裝和293T穩(wěn)定細(xì)胞系的建立，從而形成特定的DTA的慢病毒包裝細(xì)胞系；
(4)利用位于整合酶D64突變?yōu)锳的PMDL(D64A)、REV、VSVG和慢病毒表達(dá)載體，對(duì)DTA和GFP/RFP雙順?lè)醋訁f(xié)同表達(dá)的慢病毒進(jìn)行了包裝，獲得非整合的慢病毒載體系統(tǒng)；
(5)通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)合成能力(熒光蛋白和熒光素酶的表達(dá)能力)以及腫瘤細(xì)胞的存活能力的比較，發(fā)現(xiàn)構(gòu)建的協(xié)同表達(dá)熒光蛋白和白喉毒素的慢病毒載體不僅能有效監(jiān)測(cè)病毒的包裝過(guò)程，同時(shí)，XRCC5驅(qū)動(dòng)的慢病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞具有靶向性；
(6)本發(fā)明構(gòu)建的慢病毒表達(dá)載體系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞具有特異殺傷能力，該系統(tǒng)病毒的產(chǎn)生可用熒光蛋白進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，所構(gòu)建的慢病毒載體系統(tǒng)能抑制蛋白質(zhì)的合成和細(xì)胞的生長(zhǎng)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0014]圖1:CMV或XRCC5啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)熒光蛋白和白喉毒素A片段協(xié)同表達(dá)的慢病毒載體構(gòu)建圖；
圖2:慢病毒的包裝和腫瘤清除模型的流程圖；
圖3:熒光蛋白監(jiān)測(cè)慢病毒的包裝和病毒包裝細(xì)胞系的建立；
圖4:過(guò)量表達(dá)DTA的慢病毒載體感染過(guò)量表達(dá)熒光素酶基因的熒光素酶活性分析。
【具體實(shí)施方式】
[0015]表達(dá)白喉毒素A片段的慢病毒載體系統(tǒng)是將整合酶D64突變?yōu)锳的PMDL-D64A、REV、VSVG和表達(dá)載體共轉(zhuǎn)入過(guò)量表達(dá)突變EF-2的293T細(xì)胞，即在宿主細(xì)胞中包裝獲得慢病毒載體系統(tǒng)；其表達(dá)載體包括PPRME-CMV-GFP-2A-DTA-FF3，PPRIME-CMV-RFP-2A-DTA-FF3, pPRIME_XRCC5p-GFP-2A-DTA_FF3，pPRIME-XRCC5p-RFP-2A-DTA-FF3。
[0016]實(shí)施例1
表達(dá)白喉毒素A片段的慢病毒載體系統(tǒng)的制備方法包括以下步驟:
步驟I)綠色熒光蛋白基因的克隆:以PPRME-CMV-GFP-FF3質(zhì)粒為模板，正向引物:5，-GCACCGGTGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGG-3，(SEQ ID NO:1)，末端為 AgeI 酶切位點(diǎn)(下劃線表示的堿基)，反向引物:5’ -ATAGTTTAGCGGCCGCGGGCCCTCTAGACTTGTACAGCTCGTCCATGC-3’(SEQ ID NO: 2)，末端為NotI酶切位點(diǎn)(下劃線表示的堿基)，高保真PCR擴(kuò)增GFP基因，并克隆入T/A克隆載體；
【權(quán)利要求】
1.表達(dá)白喉毒素A片段的慢病毒載體系統(tǒng)，其特征在于：將整合酶D64突變?yōu)锳的PMDL-D64A、REV、VSVG和表達(dá)載體共轉(zhuǎn)入過(guò)量表達(dá)突變EF-2的293T細(xì)胞，即在宿主細(xì)胞中包裝獲得慢病毒載體系統(tǒng)； 所述的表達(dá)載體包括 pPRME-CMV-GFP-2A-DTA-FF3，pPRIME-CMV-RFP-2A-DTA-FF3,pPRIME-XRCC5p-GFP-2A-DTA-FF3, pPRIME-XRCC5p-RFP-2A-DTA-FF3 ； 所述的慢病毒載體系統(tǒng)是ー種組成型和腫瘤細(xì)胞特異型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的白喉毒素A片段的非整合慢病毒載體系統(tǒng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)白喉毒素A片段的慢病毒載體系統(tǒng)，其特征在于：所述的慢病毒載體系統(tǒng)是利用CMV啟動(dòng)子或XRCC5啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)白喉毒素A片段和熒光蛋白協(xié)同表達(dá),其出發(fā)載體為PPRME-CMV-GFP-FF3。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)白喉毒素A片段的慢病毒載體系統(tǒng)，其特征在于：所述的表達(dá)載體能協(xié)同表達(dá)雙順?lè)醋覩FP/RFP和DTA，其中由CMV驅(qū)動(dòng)的慢病毒表達(dá)載體作為陽(yáng)性對(duì)照，而XRCC5啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的表達(dá)載體為靶向腫瘤基因治療的慢病毒載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)白喉毒素A片段的慢病毒載體系統(tǒng)，其特征在于：其制備方法包括以下步驟： 步驟I)熒光蛋白基因的克?。阂訮PRME-CMV-GFP-FF3或pPRME-CMV-dsRed_FF3質(zhì)粒為模板，高保真PCR擴(kuò)增GFP和RFP基因，并克隆入T/A克隆載體； 步驟2) DTA克?。阂詐BSDTA-II的質(zhì)粒為模板，高保真PCR克隆DTA片段，PCR產(chǎn)物以ApaI和NotI酶按雙酶切連接方法克隆入步驟I)的T/A克隆載體中，獲得GFP/RFP-DTA的T/A克隆載體； 步驟3) ロ蹄疫病毒2A序列的設(shè)計(jì)和合成：根據(jù)合成的核苷酸翻譯后對(duì)應(yīng)的2A短肽氨基酸序列，設(shè)計(jì)寡核苷酸片段，通過(guò)退火，連接插入步驟2)中獲得的T/A克隆載體的GFP/RFP和DTA之間，獲得GFP/RFP-2A-DTA的T/A克隆載體； 步驟4)啟動(dòng)子克隆：以提取的293T細(xì)胞基因組DNA為模板，高保真PCR克隆基因啟動(dòng)子，PCR產(chǎn)物以ApaI和NheI酶按雙酶切連接方法克隆入用同種內(nèi)切酶酶切形成的線性PPRIME-CMV-GFP-FF3 慢病毒載體，連接形成 pPRME_XRCC5p-GFP_FF3 表達(dá)載體； 步驟5)利用酶切連接方法將GFP/RFP-2A-DTA T/A克隆載體中的GFP/RFP-2A-DTA 片段分別轉(zhuǎn)移入 pPRME-CMV_GFP_FF3 或 pPRME_XRCC5p-GFP_FF3 慢病毒表達(dá)載體，獲得 pPRME-CMV-GFP-2A-DTA-FF3，pPRIME-CMV-RFP-2A-DTA-FF3,pPRIME-XRCC5p-GFP-2A-DTA-FF3 或 pPRME-XRCC5p-RFP-2A-DTA_FF3 ； 步驟6) EF-2基因的克?。阂?93T細(xì)胞的RNA反轉(zhuǎn)錄形成的cDNA為模板，高保真PCR擴(kuò)增EF-2基因； 步驟7) EF-2 717位氨基酸的突變和慢病毒載體的構(gòu)建：利用重疊PCR的方法，將EF-2的717位甘氨酸GGA定點(diǎn)突變?yōu)榫彼酑GA，以步驟6)中的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板進(jìn)行高保真PCR擴(kuò)增，再以EcoRI和BamHI酶按雙酶切連接方法將PCR突變產(chǎn)物插入至pCDH-CMV-MCS-EFl-Puro 慢病毒載體，形成 pCDH-CMV-mEF-2-EFl-Puro ； 步驟8)穩(wěn)定表達(dá)突變EF-2的細(xì)胞系的建立：將包裝好的pCDH-CMV-mEF-2-EFl-Puro，與PHR、VSVG載體按比例共轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞系，收集病毒上清液進(jìn)行細(xì)胞感染，再利用I.5 u g/ml嘌呤霉素對(duì)感染細(xì)胞進(jìn)行篩選，獲得突變EF-2過(guò)量表達(dá)的293T細(xì)胞系；步驟9)慢病毒的包裝:在轉(zhuǎn)染前對(duì)293T細(xì)胞進(jìn)行無(wú)血清饑餓2小時(shí)，將位于整合酶D64突變?yōu)锳的PMDL-D64A、REV、VSVG和步驟5)中的慢病毒表達(dá)載體混勻后，再與自制的PEI轉(zhuǎn)染試劑混勻，共同加入步驟8)中過(guò)量表達(dá)突變EF-2的293T包裝細(xì)胞中，6小時(shí)后將培養(yǎng)基替換為含體積分?jǐn)?shù)為2%血清的培養(yǎng)基，連續(xù)收集3天上清，利用超速離心機(jī)濃縮病毒，獲得非整合型的 pPRME-CMV-GFP-2A-DTA-FF3，pPRIME-CMV-RFP-2A-DTA-FF3,pPRIME-XRCC5p-GFP-2A-DTA-FF3 或 pPRME-XRCC5p-RFP-2A-DTA_FF3 慢病毒。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)白喉毒素A片段的慢病毒載體系統(tǒng)，其特征在于:所述的慢病毒載體系統(tǒng)是一種應(yīng)用于腫瘤基因治療的雙順?lè)醋臃钦下《据d體系統(tǒng)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的表達(dá)白喉毒素A片段的慢病毒載體系統(tǒng)，其特征在于:所述的腫瘤基因治療針對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW620和乳腺癌細(xì)胞系ZR7530。
【文檔編號(hào)】C12N15/66GK103540616SQ201310500310
【公開(kāi)日】2014年1月29日 申請(qǐng)日期:2013年10月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月23日
【發(fā)明者】蘭小鵬, 劉寬燦, 林寶順, 趙猛, 陳敏, 閆慧慧, 馬洪玉, 高安定 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍南京軍區(qū)福州總醫(yī)院