專利名稱：白喉毒素－促性腺激素釋放素嵌合蛋白質(zhì)的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于殺傷攜帶促性腺激素釋放素受體之腫瘤細胞的嵌合蛋白質(zhì)。更具體地說，本發(fā)明涉及帶有接頭或間隔臂序列的，由截短的白喉毒素和促性腺激素釋放素分子組成的嵌合毒素分子。本發(fā)明進一步涉及制備所說的白喉毒素—促性腺激素釋放素嵌合毒素蛋白質(zhì)的方法及其作為抗腫瘤劑的應用。
嵌合細胞毒素是一類能夠識別和特異性地破壞過表達特異性受體之靶細胞的導向性分子。在嵌合毒素分子中，兩個或多個以其天然狀態(tài)存在的分子相互連接或融合在一起，形成具有原各基本構成部分的所有功能性的單一分子。其中，導向部分是可與相應的靶分子(例如細胞表面受體或抗原)結合的配體或抗體。例如，當導向部分是抗體時，嵌合分子便可與攜帶相應抗原決定基的細胞結合。嵌合分子的另一個基本組成部分是能夠將嵌合分子運輸?shù)狡渌槍Φ陌心繕说男锓肿?。包括細胞毒素、標記物、放射性核素、配體、抗體、藥物、脂質(zhì)體等在內(nèi)的效應物分子，一般是指可被遞送到靶位點(如靶細胞)并在靶位點發(fā)揮特異作用或活性的分子。
特別適于臨床治療應用的效應物分子是細菌或植物毒素，例如假單胞菌外毒素、白喉毒素、霍亂毒素、葡萄球菌內(nèi)毒素，以及蓖麻毒素和相思豆素等?？墒褂没瘜W偶聯(lián)或DNA重組技術使這些毒素或細胞毒性劑連接到作為導向分子的生長因子(如EGF、TGF-α、bFGF等)、細胞因子(如IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-13等)，或短肽激素(如GnRH、MSH等)上，以產(chǎn)生兼有靶細胞(如腫瘤細胞)導向功能和細胞毒活性的嵌合毒素分子。這些嵌合分子借助其針對靶細胞的導向能力將整個分子帶向靶細胞并利用其毒素部分直接殺傷之。
Pasten等人報導了用于特異性殺傷腫瘤細胞的，包括與假單胞菌外毒素(PEA)融合之白介素4(IL-4)或轉化生長因子α(TGF-α)的，或與白喉毒素(DT)融合之白介素2(IL-2)的嵌合蛋白質(zhì)(Pasten et al.，Ann，Rev，Biochem.61331～354，1992)。Williams等人描述了其中DT的天然受體結合區(qū)被多肽細胞因子白介素2取代的白喉毒素相關融合蛋白質(zhì)DAB486-IL-2。DAB486-IL-2是一種依次由下列部分組成的約68KDa融合蛋白質(zhì)Met、DT殘基1-485，以及可與IL-2受體結合并選擇性殺傷攜帶高親和性IL-2受體之淋巴細胞的成熟人IL-2的氨基酸殘基2-133(Williamset al.，Protein Engineering 1493～498，1987)。另外，Willams等人還描述了由成熟白喉毒素的前386個氨基酸加484-486位三個氨基酸殘基，以及與之融合的成熟人IL-2的殘基2-133組成的DAB389-IL-2(Williams et al.，J.Biol.Chem.26511885～11889，1990)。
另一方面，國際專利WO93/15751公開了將促性腺激素釋放素(GnRH)與假單胞菌外毒素分子偶聯(lián)所得到的嵌合蛋白質(zhì)分子。該專利述及，投用這樣的分子可破壞腦垂體中攜帶GnRH受體的細胞，導致性激素分泌降低，因而可用于動物不育化和抑制類固醇激素相關腫瘤的增殖。美國專利5,488,036和5,707,964描述了借助化學連接劑連接而成的GnRH-DT結合物，以及使用這些結合物使動物不育化和/或治療如前列腺癌或乳腺癌等性相關疾病的方法。美國專利6,303,123和6,132,720也分別公開了通過化學結合劑或肽鍵連接的，包括修飾的GnRH和DT，并能夠在哺乳動物體內(nèi)產(chǎn)生抗黃體生成細胞之免疫反應的免疫組合物，以及使用所說的組合物(或結合物)調(diào)節(jié)哺乳動物黃體類固醇激素相應疾病，或導致動物不育的方法。
再者，隨著導向性嵌合毒素研究的不斷深入，Dominique等人曾首先利用小鼠白介素3(mIL-3)作為導向劑與作為細胞毒性劑的截短的白喉毒素分子連接，并在兩個之間加入一個結構上與用于單鏈抗體(svFc)的多接頭基本上相同的“接頭”序列(Gly4Ser)，成功地制備了融合毒素蛋白質(zhì)DAB389-Gly4Ser-mIL-3。體外實驗和動物模型實驗結果顯示，與不帶接頭序列Gly4Ser的融合蛋白質(zhì)(DAB389-mIL-3)相比，前者對腫瘤細胞的特異性細胞毒性提高了約5～10倍(Dominique，L.et al.，F(xiàn)EBSLetters 406157～161，1997)。最近，也有人報導了一種基于接頭序列的由假單胞菌外毒素(PEA)和GnRH短肽組成的嵌合蛋白質(zhì)(L-GnRH-PE66或L-GnRH-PE40)。細胞學和動物實驗均有力地證明，通過在導向和毒素分子之間加入多接頭而改良的嵌合毒素的體外抑瘤活性提高約1.5～5倍，并且體內(nèi)抑瘤活性提高約5～20倍(AhmiBen-yehudah et al.，Medical Oncology 1638～45，1999)。然而，現(xiàn)有技術中迄今尚未見有關主要用于治療包括腺癌和鱗狀細胞癌等腫瘤的基于接頭序列和白喉毒素的嵌合蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的一個目的是提供一種具有腫瘤細胞特異性結合和殺傷活性的嵌合毒素蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)從N末端到C末端依次包括蛋氨酸(Met)、白喉毒素的氨基酸殘基1-386加上氨基酸殘基484-486、連接毒素和導向兩個部分的接頭序列、促性腺激素釋放素的氨基酸殘基1-10。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的蛋氨酸可以不存在。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的接頭序列是(Gly4Ser)2。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的促性腺激素釋放素的氨基酸殘基可以是在第6和第10位被修飾的。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的修飾包括促性腺激素刺激素的第6位Lys被D-Lys取代，并且第10位Gly被乙酰胺取代。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，所說的嵌合毒素蛋白質(zhì)是以常規(guī)固相肽合成方法生產(chǎn)的。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，所說的嵌合毒素蛋白質(zhì)是以DNA融合和重組技術生產(chǎn)的。
本發(fā)明的另一個目的是提供如上限定的嵌合毒素蛋白質(zhì)在生產(chǎn)抗腫瘤藥物中的應用。


圖1顯示用于表達本發(fā)明的嵌合毒素蛋白質(zhì)的重組質(zhì)粒的構建圖。
圖2顯示本發(fā)明嵌合毒素的SDS-PAGE電泳分析結果。其中泳道1是分子量標記物，泳道2是本發(fā)明的嵌合毒素。
圖3顯示部分純化的DAB389-L-GnRH(●)和對照樣品DAB389-GnRH(○)競爭與人乳腺癌Mcf-7結合之125I-GnRH的能力。圖中橫座標給出的數(shù)值為嵌合毒素蛋白質(zhì)的濃度。縱座標為B/Bo值，其中B是在不同濃度競爭物存在下與Mcf-7細胞膜結合的125I-GnRH的量(cpm)；Bo為在沒有競爭物存在時與Mcf-7細胞膜結合的125I-GnRH的量(cpm)。
圖4顯示部分純化的DAB389-L-GnRH對某些性激素反應性或非反應性組織來源的腫瘤細胞及某些正常組織來源的原代細胞培養(yǎng)物的蛋白質(zhì)合成的影響。圖中●代表卵巢癌OVCAR細胞；▲代表子宮頸癌HeLa細胞；■代表人結腸癌HCT-8細胞；○代表小牛睪丸細胞；△代表小鼠胸腺細胞；□代表人正常乳腺細胞。
本發(fā)明涉及用于殺傷攜帶GnRH受體之腫瘤細胞的嵌合蛋白質(zhì)，特別是涉及帶有中間接頭或間隔臂的，由截短的白喉毒素(DAB389)和促性腺激素釋放素分子組成的嵌合毒素分子。本發(fā)明還涉及制備所說的白喉毒素—促性腺激素釋放素嵌合毒素(DAB389-L-GnRH)蛋白質(zhì)的方法及該嵌合蛋白質(zhì)在生產(chǎn)抗腫瘤藥物中的應用。本發(fā)明人在多年來長期從事用于治療腫瘤的嵌合毒素研究的基礎上，借鑒有關現(xiàn)有技術，成功地制備了以截短的白喉毒素分子(DAB389)作為毒素部分，以哺乳動物(包括人)促性腺激素釋放素(GnRH)作為導向部分，并且在兩者之間插入了一個寡肽接頭序列(Gly4Ser)2的嵌合毒素蛋白質(zhì)。我們的體外細胞學試驗和動物體內(nèi)實驗結果表明，本發(fā)明的嵌合毒素較不帶有接頭序列的相應嵌合毒素大大提高了對腫瘤靶細胞的毒性，顯著地改善了對特異性受體的親和性，從而表現(xiàn)為比不帶接頭序列的相應嵌合毒素有更大程度的靶細胞蛋白質(zhì)合成抑制作用，而且這種抑制作用的發(fā)揮更為迅速(體內(nèi)實驗結果未示出)。推測這些積極效果是由于在毒素分子和導向分子之間加入接頭序列后，有效地改善了嵌合分子的內(nèi)部折迭，更有利于導向部分接近和結合細胞表面受體，進而更有利于毒素部分進入細胞并發(fā)揮其細胞毒效應所致。
白喉毒素(DT)是由535個氨基酸組成的對敏感真核細胞具有強毒性的單鏈多肽。白喉毒素完整分子包括A和B兩個片段。毒素分子首先借助525位上的絲氨酸與細胞表面受體結合，然后經(jīng)受體介導的內(nèi)吞作用通過酸性細胞腔隙，向胞液內(nèi)釋放出具有酶促活性的A片段(Moya M.et al.，J.Cell Biol，101548～559；Sandving，K.etal.，J.Biol Chem.26111639～11645，1986)。A片段催化延伸因子2(EF-2)的NAD+依賴性ADP核糖基化，導致細胞蛋白質(zhì)合成抑制和細胞死亡。所以，可用各種多肽類激素(如GnRH、MSH)、細胞因子(如IL-2、IL-4、IL-13)或生長因子(如EGF、TGF-α)取代天然白喉毒素的受體結合區(qū)，以產(chǎn)生對攜帶相應受體分子的真核細胞具有選擇性結合能力和細胞毒活性的嵌合毒素。本發(fā)明中所使用的即是包括白喉毒素的催化區(qū)和跨膜區(qū)，而去掉了B片段中受體結合區(qū)的前386個氨基酸及第484～486位氨基酸殘基的白喉毒素，即通常所說的DAB389。
促性腺激素釋放素(GnRH)是在調(diào)節(jié)生殖系統(tǒng)中發(fā)揮作用的十肽促激素。GnRH由下丘腦釋放后進入血流并被輸送到腦垂體，在其中誘導促性腺細胞釋放促性腺激素和卵泡刺激素。這兩種性腺激素本身又作用于性腺，誘導類固醇生成和配子形成。從腺體釋放的類固醇進入血循環(huán)進而作用于帶有相應受體的各種靶組織。已知乳腺癌、子宮癌和其他一些婦科腫瘤、子宮內(nèi)膜異位、子宮纖維瘤、前列腺癌和良性前列腺增生等重要疾病均受到促性腺激素和性腺類固醇激素的影響。已有證據(jù)表明，卵巢細胞特別是粒層細胞表面具有GnRH受體。而且已證明睪丸細胞表面的受體表達與體內(nèi)性激素水平有關(Harwood，J.et al.，Endocrinology 107407～413，1980)。另外，還發(fā)現(xiàn)大鼠子宮內(nèi)膜上具有親和力很高的GnRH受體(曹詠清等，中國科學B輯132～37，1984)。我們以前的研究表明，由GnRH與假單胞菌外毒素融合而成的嵌合蛋白質(zhì)(GnRH-PE40和GnRH-PE66)對包括HeLa細胞和黑色素瘤細胞(B16細胞系)在內(nèi)的多種腺癌和上皮細胞癌均表現(xiàn)有明顯的細胞毒活性。
用于本發(fā)明的GnRH可以是具有天然十肽結構的GnRH，但也可以是第6位Gly被D-Gly取代并且去掉第10位Gly而代之以乙酰胺的GnRH肽類似物。可以使用本領域已知的固相肽合成技術分別合成肽鏈相對較短(如少于約50個氨基酸)的導向分子和效應物分子。然后，再使一個分子的氨基酸末端縮合到另一個分子的羧基末端上，從而得到兩部分融合的分子。例如，可以首先以肽合成方法合成一個由GnRH(十肽)+接頭基團[(Gly4Ser)]2+間隔臂(Arg-Pro-Pro-Pro-Pro-Cys)組成的導向分子，然后利用一端含有琥珀酰亞胺酯，并且另一端含有馬來酰亞胺的異雙功能連接劑，通過還原的末端Cys殘基，使該短肽連接到預活化的DT分子上。用于完成連接反應的連接劑可以是N-琥珀酰亞氨基-3-(2-吡啶二硫)丙酸酯(SPDP)、馬來酰亞氨基芐甲?；鵑-羥琥珀酰亞氨酯(MBS)、N-琥珀酰亞氨基(4-碘乙酰)氨基苯甲酸(SIAB)、琥珀酰亞氨基-4-馬來酰亞氨苯基丁酸酯(SMDS)、1-乙基-3-(3-二甲氨基苯基)碳二亞胺(EDC)、雙-二氮雜苯肼和戊二醛。
簡單地說，為了還原半胱氨酸，首先將合成無誤并干燥的肽溶解于含有過量二巰基乙醇(DTT)的0.1M磷酸鈉緩沖液中，并將所得溶液室溫攪拌4小時。然后再次加入10毫摩爾過量的DTT并在水飽和的氮氣環(huán)境下繼續(xù)攪拌2小時。然后在G10 Sephadex柱上層析分離含有還原的半胱氨酸的肽。將DT(10mg)溶解于1ml0.5M PBS(pH6.5)中，并向DT中逐滴加入溶于二甲基甲酰胺的6.15mg N-羥基琥珀酰亞氨馬來酰亞氨乙酯(EMCS)，以活化DT。在暗處室溫保持90分鐘后，在用含有EDTA(0.1mM)的0.1M檸檬酸鈉平衡的G50 Sephadex柱上層析分離混合物。通過PM10超濾膜加壓濃縮含有EMCS的DT的部分。然后將肽溶液加到活化的DT中，并在暗處于氮氣環(huán)境下室溫保溫過夜。使含有足夠量游離-SH的短肽與DT分子(溶于含有0.1mM EDTA的0.1M檸檬酸鈉緩沖液中)上適當比例的EMCS活化的氨基基團反應，以將預先還原的肽偶聯(lián)到活化的DT上?？捎?.2M碳酸氫銨平衡的G50 Sephadex柱低壓層析分離通過EMCS連接到DT上的肽的結合物，并在凍干后-20℃低溫保存。可用氨基酸序列分析方法并根據(jù)其重量的增加鑒定結合物的肽含量。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，本發(fā)明的嵌合蛋白質(zhì)是使用重組DNA技術生產(chǎn)的。總地說來，該方法包括產(chǎn)生編碼融合蛋白質(zhì)的DNA序列、將該DNA連接到處于特定啟動子控制下的表達盒中，然后在適當?shù)乃拗髦斜磉_并分離所需的蛋白質(zhì)。完成所有DNA操作的基本方法是本領域普通技術人員熟知的(如參見Sambrooket al.，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbour Laboratory，2th ed.，1989)。
可以首先用化學合成方法(如磷酸二酯法，參見Narang et al.，Meth.Enzymol.6890～99，1979)定向合成單鏈寡核苷酸，然后以其作為模板在DNA聚合酶存在下與互補序列雜交得到雙鏈DNA。另外，也可以首先克隆亞序列，用適當?shù)南拗泼盖懈詈螅賹⑦@些片段連接成所需的編碼本發(fā)明嵌合蛋白質(zhì)的序列。在本發(fā)明的一個特別優(yōu)選的實施方案中，為了方便起見，可使用DNA擴增法(如PCR方法)，從已知攜帶所需DT或GnRH編碼序列的來源中克隆編碼DT的DNA序列(DAB389編碼序列)和GnRH基因，然后將它們與接頭序列一起連接到一個適當?shù)妮d體中。特別是可根據(jù)DNA操作的需要，在用于PCR反應的正鏈和負鏈引物中引入適當?shù)南拗菩院怂醿?nèi)切酶位點及編碼(Gly4Ser)2接頭和/或Arg-Pro-Pro-Pro-Pro-Cys間隔臂的序列。例如，可以使用這樣的引物從已知攜帶DAB389編碼序列的質(zhì)粒pET-28a-DAB389-L-EGF中直接擴增得到帶有適當?shù)膬?nèi)切酶位點的DAB389-L-GnRH片段?？蓪⑺玫降钠芜B接帶有同樣酶切位點的適當載體中，得到編碼本發(fā)明DAB389-L-GnRH的重組載體。
應特別指出的是，為了進一步改善重組DNA在大腸桿菌宿主內(nèi)的表達效率，本發(fā)明特別將GnRH編碼序列中的個別密碼子改換成大腸桿菌偏性密碼子。
與現(xiàn)有技術不同的是，本發(fā)明的嵌合蛋白質(zhì)中在毒素分子(DAB389)和導向分子(GnRH)之間插入了一個(Gly4Ser)2接頭序列或(Gly4Ser)2-Arg-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Cys接頭/間隔臂序列，從而將兩個部分分隔開。一般說來，雖然該序列只是使兩部分肽序列保持適當?shù)木嚯x和空間關系，但該序列的加入影響了整個嵌合分子的折迭、凈電荷及疏水性質(zhì)，從而改善了分子的空間柔曲性，以有利于嵌合分子導向部分與相應受體的結合及毒素部分的內(nèi)在化。
可在細菌如大腸桿菌、酵母和各種高等真核細胞(如COS、CHO和骨髓瘤細胞系)等各種宿主細胞中表達編碼本發(fā)明嵌合蛋白質(zhì)的核酸序列?？蓪⒅亟M蛋白質(zhì)基因可操作地連接到各宿主的適當表達控制序列中。對于大腸桿菌來說，表達控制序列包括啟動子(如T7、trp和λ啟動子)、核糖體結合位點及轉錄終止信號。對于真核細胞來說，這些控制序列將包括啟動子和衍生于免疫球蛋白基因或SV40等的增強子，以及多聚腺苷酸化序列等。
可使用氯化鈣轉化法(大腸桿菌)和磷酸鈣處理或電穿孔(哺乳動物細胞)等已知方法將本發(fā)明的重組質(zhì)粒轉化到適當?shù)乃拗髦小？筛鶕?jù)質(zhì)粒含有的基因所賦予的抗生素抗性來選擇被轉化的細胞。培養(yǎng)轉化體細胞并表達后，可按照本領域已知的方法純化所需的嵌合蛋白質(zhì)，這些方法包括硫酸銨沉淀法、超濾、凝膠電泳、凝膠過濾以及離子交換層析和高效液相層析等(參見Guide to Protein Purificafion，Academic Press，NY，1990)。純化過程中，可使用多克隆抗DT抗體和Vectastain試劑盒(Vector Labs.Buvlingame，Calif.)以免疫印跡法監(jiān)測純化產(chǎn)物。經(jīng)純化后，嵌合蛋白質(zhì)的純度應在95％以上。眾所周知，按上述方法生產(chǎn)并純化的GnRH受體導向性嵌合蛋白質(zhì)可能具有與天然多肽不同的構象。在這種情況下，可按本領域已知的方法對所得到的純化產(chǎn)物進行變性和還原處理，然后再使這些多肽重新折迭(如參見Dekinski et al.J.Biol.Chem.26814065～14070，1993；Bachuner，et al.，Anal.Biochem.205263～270，1992)。例如，可使用鹽酸胍對包涵體蛋白質(zhì)進行變性并還原處理，然后再用含有氧化態(tài)谷胱苷肽和L-精氨酸的氧化還原緩沖液處理，以使蛋白質(zhì)重折迭。
可使用文獻中已公開的各種檢測方法鑒定本發(fā)明的DAB389-L-GnRH嵌合蛋白質(zhì)的性質(zhì)和生物學活性。這些方法包括(1)ADP核糖基化試驗該方法是根據(jù)DAB389-L-GnRH或DAB389-GnRH催化延伸因子的ADP核糖基化能力檢測嵌合毒素對哺乳動物細胞蛋白質(zhì)合成的抑制作用；(2)MTT細胞存活率試驗該方法是根據(jù)活細胞將MTT轉化成蘭紫色甲瓚結晶體的能力檢測DAB389-L-GnRH或DAB389-GnRH對腫瘤靶細胞存活性的影響；(3)[3H]亮氨酸摻入試驗該方法是根據(jù)活的靶細胞攝入[3H]亮氨酸的能力檢測DAB389-L-GnRH或對照樣品DAB389-GnRH對靶細胞蛋白質(zhì)合成的影響；(4)受體結合試驗該方法是根據(jù)DAB389-L-GnRH或DAB389-GnRH競爭性置換與靶細胞漿膜結合之125I-GnRH的能力檢測其特異性受體結合活性；(5)裸鼠移植瘤生長抑制試驗該方法是根據(jù)DAB389-L-GnRH或DAB389-GnRH對裸鼠移植瘤生長的抑制能力檢測其對腫瘤靶細胞的細胞毒活性。
可用本發(fā)明的DAB389-L-GnRH嵌合蛋白質(zhì)作為基本活性成分，并加入一種或多種醫(yī)藥上可接受的載體或賦形劑，制成適于臨床抗腫瘤治療應用的藥物組合物。所說的載體或賦形劑包括但不只限于磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、生理鹽水、葡萄糖溶液、葡聚糖、右旋糖苷等。根據(jù)待治療的疾病的不同，可在本發(fā)明的藥物組合物中加入一種或多種與本發(fā)明的嵌合蛋白質(zhì)有相似活性，并可發(fā)揮輔助作用的其他來源的活性化合物。另外，可在本發(fā)明的藥物組合物中加入選自人血清白蛋白、低分子量肽、甘氨酸或賴氨酸及金屬陽離子(如Mn2+和Zn2+)的蛋白質(zhì)保護劑，以及選自聚乙二醇、羧甲基纖維素、多聚甘氨酸及谷胱甘肽等的穩(wěn)定劑。
可通過胃腸道外、口服和局部給藥途徑投用本發(fā)明的藥物組合物，但優(yōu)選的是胃腸道外途徑，如靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、體腔內(nèi)及器官腔內(nèi)給藥。本發(fā)明藥物組合物的有效劑量范圍可從幾微克到幾十毫克/天，但針對每個特定病人的具體用藥劑量，應基于個體化原則并根據(jù)待治療疾病或病理狀態(tài)的性質(zhì)和嚴重程度、病人的年齡、體重和其對所用藥物的敏感性，以及所采用的給藥途徑等因素由臨床醫(yī)生確定。
可使用本發(fā)明的嵌合毒素或其藥物組合物作為治療劑，用于治療可依賴該蛋白質(zhì)的毒性作用得以緩解或消除的特定類型人體細胞的各種疾病。本發(fā)明嵌合蛋白質(zhì)的一種特別優(yōu)選的用途是用于治療表面上過度表達GnRH受體之細胞的惡性增生性疾病，特別是各種組織來源的腺癌和鱗狀細胞癌，如卵巢癌、子宮頸癌、前列腺癌、惡性葡萄胎、絨毛膜上皮癌、結腸癌、乳腺癌及黑色素瘤等。我們的體外和體內(nèi)試驗證明，與不帶有接頭和/或間隔臂的親代嵌合分子相比，毒素部分和導向部分之間插入接頭序列和/或間隔臂序列的嵌合毒素分子，顯著地改善了對各種腫瘤靶細胞的細胞毒活性。雖然有關機理目前尚不完全清楚，但推測這可能與加入接頭和/或間隔臂后改善了所得到的嵌合分子的分子構象、帶電性及疏水性，從而更有利于分子導向部分與相應細胞表面受體的結合及毒素部分的細胞內(nèi)在化有關。另外，我們的研究還發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的DAB389-L-GnRH嵌合蛋白質(zhì)不僅對受所謂下丘腦-垂體-性腺軸控制的類固醇激素反應性腫瘤有明顯的體外殺傷活性，而且對某些非性腺器官來源的腺癌細胞如黑色素瘤B16細胞、S-180肉瘤細胞及結腸癌Hct-8細胞系也具有差不多相同的特異性細胞內(nèi)在化及細胞毒活性。
以下借助實施例進一步舉例描述本發(fā)明。本領域技術人員可以理解到，這些實施例并不以任何方式限制本發(fā)明待批權利要求的范圍。
實施例1DAB389-L-GnRH嵌合蛋白質(zhì)的制備本實施例旨在舉例簡要描述以DNA重組技術制備本發(fā)明的DAB389-L-GnRH嵌合蛋白質(zhì)的方法。本實施例中，用于DNA切接、重組質(zhì)粒構建、細胞培養(yǎng)及表達產(chǎn)物分離與純化的所有步驟和操作，均按照Sambrook等人的上述文獻中所述的方法完成。
1.重組表達質(zhì)粒的構建首先，使用按已知方法人工合成的寡核苷酸引物15’-CATGCCATGGCGCTGATGATGTTGTT-3’(SEQ ID NO1)和25’-CGGGATCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCCGCATGCGTTTTATGCCCCGGAGA-3’(SEQ ID NO2)，以攜帶白喉毒素DT全基因的重組質(zhì)粒pGEM-T(可購自Novagen公司)為模板，用PCR方法從中擴增得到編碼DAB389-(Gly4Ser)2的DNA片段。用核酸內(nèi)切酶NcoI和BamHI消化后回收所需的DNA片段，并在T4 DNA連接酶存在下將其連接到已用同樣內(nèi)切酶消化的pET-28a質(zhì)粒(Novagen)中，得到重組質(zhì)粒pET-28a/DAB389-L。用所得到的連接反應混合物轉化感受態(tài)大腸桿菌JM105細胞，以大量制備質(zhì)粒DNA。
然后使用上述合成的寡核苷酸引物1(SEQ ID NO1)和35’-TCAGGCGGAGGTGGATCCCAGCACTGGTCCTACGGTCTGCGTCCGGGTTAAGAATTCCG-3’(SEQ ID NO3)，并以上述重組質(zhì)粒pET-28a/DAB389-L作為模版進行PCR擴增，得到編碼DAB389-(Gly4Ser)2-GnRH的DNA序列。用核酸內(nèi)切酶NcoI和EcoRI消化后分離并回收得到用于本發(fā)明的DAB389-(Gly4Ser)2-GnRH片段。然后，在T4 DNA連接酶存在下將其連接到已用同樣限制酶消化的質(zhì)粒pET-28a上，得到本發(fā)明的攜帶白喉毒素DAB389(SEQ ID NO5)、接頭序列(SEQ ID NO6)和促性腺激素釋放素(SEQ ID NO7)之DNA編碼序列的重組質(zhì)粒pET-28a-DLG。
同時，基本上按照上述方法，并使用合成的寡核苷酸引物1和45’-TACGGTCTGCGTCCGGGTTAAGAATTCCG-3’(SEQ ID NO4)，制備攜帶不帶接頭序列的DAB389-GnRH嵌合蛋白質(zhì)之DNA編碼序列的重組質(zhì)粒pET-28a-DG。
應特別指出的是，為了進一步改善重組DNA在大腸桿菌宿主內(nèi)的表達效率，本發(fā)明特別將GnRH編碼序列中的個別密碼子改換成大腸桿菌偏性密碼子。
2.嵌合蛋白質(zhì)的表達及產(chǎn)物的純化用此重組質(zhì)粒轉化感受態(tài)大腸桿菌BL21(λDE3)菌株，并按常規(guī)方法在含有卡那霉素(30μg/ml)的LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)被轉化的宿主細胞。當OD600值達到0.8～1.2時向培養(yǎng)物中加入1mM異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，37℃繼續(xù)培養(yǎng)3小時，以誘導目的產(chǎn)物的表達。離心收集并于TE(20mM Tris-HCl，pH7.5，1mMEDTA)溶液中破碎細胞后，再次離心(25,000g，20分鐘)收集上清，利用飽合硫酸銨分步沉淀法分離并收集目的蛋白質(zhì)。然后將蛋白質(zhì)溶液用10mM PBS(pH7.4)徹底透析(換液4次)。離心后，上清即為DAB389-L-GnRH粗提物。
將所得的上清液加到已用上述PBS平衡過的DEAE-Sephadex Fast Flow柱(Pharmacia)上，用含有0.05～0.5M NaCl的PB緩沖液(10mM PB pH7.4，1mMEDTA)階段洗脫，并收集蛋白質(zhì)活性峰值部分。使用Amicon超濾裝置(YM-30)濃縮后，使?jié)饪s物通過上述PB緩沖液平衡過的2.6×100cm Sephacryl S-200柱(Pharmacia)，并用含有0.15M NaCl的PB緩沖液洗脫。收集活性峰值部分并再次過Mono Q-Sepharose柱(Pharmacia)。用NaCl梯度洗脫后收集蛋白峰值部分，并用20mM PBS pH7.4徹底透析，如此得到純度96％的本發(fā)明的DAB389-L-GnRH嵌合蛋白質(zhì)。
按照生產(chǎn)商推薦的方法，使用Vectastain ABC試劑盒(Vector Labs Inc.)和多克隆DT抗血清對純化的DAB389-L-GnRH和DAB389-GnRH進行免疫學鑒定。并使用SDS-PAGE方法鑒定本發(fā)明DAB389-L-GnRH的蛋白質(zhì)的純度(參見圖2)。
實施例2DAB389-L-GnRH嵌合蛋白質(zhì)的靶特異性和細胞毒活性試驗本實施例借助蛋白質(zhì)合成抑制試驗檢測本發(fā)明的嵌合毒素蛋白質(zhì)對腫瘤的細胞毒活性，并借助細胞膜受體結合試驗檢測本發(fā)明的嵌合毒素蛋白質(zhì)的特異性細胞受體結合能力。
1.靶細胞膜特異性結合試驗基本上按照Qaycum，A.等人(Br.J.Cancer 6296～99，1990)所述的方法，檢測本發(fā)明的DAB389-L-GnRH競爭并取代與人乳腺癌細胞漿膜結合的125I-GnRH的能力。
將培養(yǎng)的人乳腺癌Mcf-7細胞單層分離到含有10mM Tris-HCl(pH7.5)、1mMDTT和1mg/ml牛血清白蛋白的緩沖液中以制備細胞勻漿。低速離心去掉大的細胞碎片后，再以25,000g將上清部分4℃離心30分鐘，得到細胞漿膜部分。將漿膜懸液按每孔100μl的終體積加于24孔培養(yǎng)板孔中，然后再向各孔中加入5μM125I-GnRH并于37℃溫浴1小時。溫浴后再向每孔內(nèi)加入未標記的GnRH或本發(fā)明的DAB389-L-GnRH或DAB389-GnRH對照樣品(0.1～100μM)，并繼續(xù)保溫24小時。保溫后用上述緩沖液洗樣品并用γ計數(shù)儀檢測結合的配體。結果如圖3所示。
從圖3所示的數(shù)據(jù)可以看出，加入漸增濃度的DAB389-L-GnRH嵌合毒素后，可隨著DAB389-L-GnRH濃度的增加而逐漸取代與Mcf-7細胞膜結合的125I-GnRH。而且，與不帶接頭序列的對照樣品相比，可見本發(fā)明的DAB389-L-GnRH嵌合毒素蛋白質(zhì)具有更強的靶細胞受體結合活性。
2.蛋白質(zhì)合成抑制試驗按照Prior等人(Cell 641017～1023，1991)所述的方法檢測本發(fā)明的DAB389-L-GnRH融合蛋白質(zhì)對選擇的腫瘤細胞或正常細胞系的蛋白質(zhì)合成的抑制作用。實驗中所使用的靶細胞包括卵巢癌OVCAR細胞、子宮頸癌HeLa細胞和結腸癌HCT-8細胞等腫瘤細胞，以及制備的小牛睪丸細胞、小鼠胸腺細胞和人乳腺細胞等原代正常細胞培養(yǎng)物。
按每孔2×104個細胞將各種被試細胞接種在96孔微量培養(yǎng)板中，在5％CO2環(huán)境下37℃保溫24小時后，向各孔中加入不同濃度的DAB389-L-GnRH和作為陽性對照樣品的DAB389-GnRH，以及作為陰性對照樣品的含牛血清白蛋白(BSA)的PBS溶液(BSA-PBS)。所有被試樣品均稀釋到0.2％牛血清白蛋白-磷酸鹽緩沖鹽(BSA-PBS)中。37℃保溫24小時后，加入[3H]-亮氨酸(Amersham，Corp)(2μCi/孔)繼續(xù)保溫12小時。低溫冷凍并快速融解后將細胞收獲到玻璃纖維濾膜上，然后用β計數(shù)器檢測摻入到細胞內(nèi)的放射活性。以占沒有接觸毒素蛋白質(zhì)而只加BSA-PBS的對照細胞的百分摻入量表示的結果如圖4中所示。
從圖4所示的結果可以看出，本發(fā)明的DAB389-L-GnRH嵌合蛋白質(zhì)能夠以劑量依賴方式抑制類固醇反應性器官如卵巢和子宮頸來源的腫瘤細胞的蛋白質(zhì)合成。而且，嵌合毒素對結腸癌細胞也表現(xiàn)有明顯的細胞毒活性。另外，從中還可以看出，本發(fā)明的DAB389-L-GnRH對得自健康供體的正常性腺相關組織(小牛睪丸細胞和人乳腺細胞)、淋巴細胞(小鼠胸腺細胞)來源的原代細胞培養(yǎng)物則未表現(xiàn)有可檢測的細胞毒活性。
序列表(1)一般信息(I)申請人中國人民解放軍軍需大學(II)發(fā)明名稱白喉毒素-促性腺激素釋放素嵌合蛋白質(zhì)(III)序列數(shù)7(IV)通訊地址(A)聯(lián)系人朱平(B)街道西安大路175號(C)城市長春(D)國家中華人民共和國(E)郵編130062(V)計算機可讀形式(A)介體類型3.5英寸軟盤(B)計算機IBMPC(C)操作系統(tǒng)WINDOW98(D)軟件WORD98(VI)電訊信息(A)電話86-0431-7962109(B)傳真86-0431-7965274(2)SEQ ID NO1的信息(I)序列特征(A)長度27bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(II)分子類型DNA(III)序列描述SEQ ID NO1CATGCCATGG GCGCTGATGA TGTTGTT(2)SEQ ID NO2的信息
(I)序列特征(A)長度56bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(II)分子類型DNA(III)序列描述SEQ ID NO2CGGGATCCAC CTCCGCCTGA ACCGCCTCCA CCCGCATGCG TTTTATGCCCCGGAGA(2)SEQ ID NO3的信息(I)序列特征(A)長度59bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(II)分子類型DNA(III)序列描述SEQ ID NO3TCAGGCGGAG GTGGATCCCA GCACTGGTCC TACGGTCTGC GTCCGGGTTAAGAATTCCG(2)SEQ ID NO4的信息(I)序列特征(A)長度29bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(II)分子類型DNA(III)序列描述SEQ ID NO4TACGGTCTGC GTCCGGGTTA AGAATTCCG
(2)SEQ ID NO5的信息(I)序列特征(A)長度1167bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(II)分子類型DNA(III)序列描述SEQ ID NO5ATGGGCGCTGATGATGTTGTTGATTCTTCTAAATCTTTTGTGATGGAAAACTTTTCTTCGTACCACGGGACTAAACCTGGTTATGTAGATTCCATTCAAAAAGGTATACAAAAGCCAAAATCTGGTACACAAGGAAATTATGACGATGATTGGAAAGGGTTTTATAGTACCGACAATAAATACGACGCTGCGGAATACTCTGTAGATAATGAAAACCCGCTCTCTGGAAAAGCTGGAGGCGTGGTCAAAGTGACGTATCCAGGACTGACGAAGGTTCTCGCACTAAAAGTGGATAATGCCGAAACTATTAAGAAAGAGTTAGGTTTAAGTCTCACTGAACCGTTGATGGAGCAAGTCGGAACGGAAGAGTTTATCAAAAGGTTCGGTGATGGTGCTTCGCGTGTAGTGCTCAGCCTTCCCTTCGCTGAGGGGAGTTCTAGCGTTGAATATATTAATAACTGGGAACAGGCGAAAGCGTTAAGCGTAGAACTTGAGATTAATTTTGAAACCCGTGGAAAACGTGGCCAAGATGCGATGTATGATTATATGGCTCAAGCCTGTGCAGGAAATCGTGTCAGGCGATCAGTAGGTAGCTCATTGTCATGCATAAATCTTGATTGGGATGACATAAGGGATAAAACTAAGACAAAGATAGAGTCTTTGAAAGACCATGGCCCTATCAAAAATAAAATCAGCGAAAGTCCCAATAAAACAGTATCTGAGGAAAAAGCTAAACAATACCTAGAAGAATTTCATCAAACGGCATTAGAGCATCCTGAATTGTCAGAACTTAAAACCGTTACTGGGACCAATCCTGTATTCGCTGGGGCTAACTATGCGGCGTGGTCAGTAAACGTTGCGCAAGTTATCGATAGCGAAACAGCTGATAATTTGGAAAAGACAACTGCTGCTGTTTCGATACTTCCTGGTCTAGTTAGCGTAATGGGCATTGCAGACGGTGCCGTTCACCACAATACAGAAGAGATAGTGGCACAATCAATAGCTTTATCGTCTTTAATGGTTGCTCAAGCTATTCCATTGGTAGGAGAGCTAGTTGATATTGGTTTCGCTGCATATAATTTTGTAGAGAGTATTATCAATTTATTTCAAGTAGTTCATAATTCGTATAATCGTCCCGCGTATTCTCCGGGGCATAAAACGCATGCG(2)SEQ ID NO6的信息(I)序列特征(A)長度30bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓撲結構線性(II)分子類型DNA(III)序列描述SEQ ID NO6GGTGGAGGCG GTTCAGGCGG AGGTGGATCC(2)SEQ ID NO7的信息(I)序列特征(A)長度3Obp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(II)分子類型DNA(III)序列描述SEQ ID NO7CAGCACTGGT CCTACGGTCT GCGTCCGGGT
權利要求
1.一種具有腫瘤細胞特異性結合和殺傷活性的嵌合毒素蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)從N末端到C末端依次包括蛋氨酸(Met)、白喉毒素的氨基酸殘基1-386加上氨基酸殘基484-486、連接毒素和導向兩個部分的接頭序列、促性腺激素釋放素的氨基酸殘基1-10。
2.根據(jù)權利要求1的嵌合毒素蛋白質(zhì)，其中所說的蛋氨酸可以不存在。
3.根據(jù)權利要求1的嵌合毒素蛋白質(zhì)，其中所說的接頭序列是(Gly4Ser)2。
4.根據(jù)權利要求1的嵌合毒素蛋白質(zhì)，其中所說的促性腺激素釋放素的氨基酸殘基可以是在第6和第10位被修飾的。
5.根據(jù)權利要求4的嵌合毒素蛋白質(zhì)，其中所說的修飾包括促性腺激素刺激素的第6位Lys被D-Lys取代，并且第10位Gly被乙酰胺取代。
6.根據(jù)權利要求1的嵌合毒素蛋白質(zhì)，其中所說的嵌合毒素蛋白質(zhì)是以常規(guī)固相肽合成方法生產(chǎn)的。
7.根據(jù)權利要求1的嵌合毒素蛋白質(zhì)，其中所說的嵌合毒素蛋白質(zhì)是以DNA融合和重組技術生產(chǎn)的。
8.根據(jù)權利要求1的嵌合毒素蛋白質(zhì)在生產(chǎn)抗腫瘤藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于殺傷攜帶促性腺激素釋放素受體之腫瘤細胞的嵌合蛋白質(zhì)。更具體地說,本發(fā)明涉及帶有接頭或間隔臂序列的,由截短的白喉毒素和促性腺激素釋放素分子組成的嵌合毒素分子。本發(fā)明進一步涉及制備所說的白喉毒素—促性腺激素釋放素嵌合毒素蛋白質(zhì)的方法及其作為抗腫瘤劑的應用。
文檔編號A61P35/00GK1422869SQ0113870
公開日2003年6月11日 申請日期2001年11月23日 優(yōu)先權日2001年11月23日
發(fā)明者朱平, 岳玉環(huán), 張國利 申請人:中國人民解放軍軍需大學