專利名稱：：用于生產(chǎn)白喉毒素的發(fā)酵方法用于生產(chǎn)白喉毒素的發(fā)酵方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及白喉抗原尤其是毒素(包括白喉毒素的突變形式，例如CRM197)領(lǐng)域和制備大批這樣的抗原培養(yǎng)物的發(fā)酵方法。白喉毒素是白喉才奉桿菌(Co^y"e6a"en'MWczj^Aen'a)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)外毒素。其以單一多肽的形式產(chǎn)生，該多肽易于被剪接，在190、192或193殘基處裂解，結(jié)果形成由二硫鍵連接的兩個(gè)亞基A片段和B片段(Moskaug等Biol.Chem.264:15709-15713，1989)。A片段為催化活性部分，是依賴NAD的ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶，其特異性耙向蛋白質(zhì)合成因子EF-2,藉此使EF-2失活，使細(xì)胞中的蛋白質(zhì)合成停止。在感染期間可自然獲得對(duì)細(xì)菌毒素例如白喉毒素的免疫力，或可通過注射去毒形式的毒素(類毒素)人工獲得免疫力(Germanier,er，BacterialVaccines,AcademicPress,Orlando,Fl.，1984)。傳統(tǒng)上一直通過化學(xué)修飾天然毒素來制備類毒素(Lingood等Brit.J.Exp.Path.44;177，1963)，化學(xué)修飾使得天然毒素?zé)o毒，同時(shí)保留抗原性，保護(hù)接種的動(dòng)物可抵抗后來的天然毒素攻擊。作為選擇，業(yè)已闡述了幾種已減毒的突變型白喉毒素(US4709017，US495074t))。CRM197為白喉毒素的無毒形式，但其在免疫上與白喉毒素沒有區(qū)別。CRM197由不產(chǎn)毒噬菌體(3197tox感染的白喉棒桿菌產(chǎn)生，而卩197tox是通過對(duì)產(chǎn)毒棒狀噬菌體進(jìn)行亞硝基胍誘突創(chuàng)造的(Uchida等NatureNewBiology(1971)233;8-11)。CRM197蛋白具有與白喉毒素相同的分子量，但其結(jié)構(gòu)基因不同，其中有單義烕基變化。這導(dǎo)致52位的氨基酸從甘氨酸變?yōu)楣劝孵０罚笰片段不能結(jié)合NAD,因此無毒(Pappenheimer1977,AnnRev,Biochem.46;69-94,RappuoliAppliedandEnvironmentalMicrobiologySept1983p560-564)。白喉類毒素和減毒突變形式CRM197是很多提供抗白喉棒桿菌免疫力的疫苗中的組分。已知幾種聯(lián)合疫苗可預(yù)防百日咳博德特氏菌(Borafefe〃a;eWw^z》、石皮傷風(fēng)4炎菌(C7osW^wwfetom')、白喉棒桿菌和任選的乙型肝炎病毒(HepatitisBvirus)和/或B型流感嗜血桿菌(i7ae淤o//n7wz'"ywe"zae)(例如參見WO93/24148和WO97/00697、WO02/055105)。白喉毒素和包括CRM197在內(nèi)的突變形式作為安全有效的糖類T細(xì)胞依賴性載體也已用于疫苗。目前CRM197用于B型流感嗜血桿菌寡糖CRM197綴合疫苗(HibTitre;LederlePraxisBiologicals、Rochester,N.Y.)。本領(lǐng)域已熟知制備白喉類毒素(DT)的方法。例如，通過從白喉棒桿菌培養(yǎng)物純化毒素，接著通過化學(xué)去毒，可生產(chǎn)DT，或可通過純化重組或遺傳上去毒的毒素類似物來制備DT(例如US4，709，017、US5，843，711、US5,601,827和US5,917,017闡述的CRM197或其它突變體)。白喉棒桿菌在有氧條件下培養(yǎng)。Rappuoli等(BiotechnologyFebruary1985，pl61-163)建議，通過充入空氣和氧氣的混合物，將p02調(diào)節(jié)到25%，空氣和氧氣可自動(dòng)調(diào)節(jié)以維持所需p02。由于蛋白質(zhì)豐度低，妨礙了用于疫苗的大量白喉毒素例如CRM197的生產(chǎn)。這一問題先前通過將更多拷貝的編碼白喉毒素或突變形式的基因引入白喉棒桿菌業(yè)已得到解決(US4，925，792;US5,614,382)。這樣的方法導(dǎo)致產(chǎn)率增加至約3倍。為了可高水平生產(chǎn)這些有價(jià)值的抗原，以可再現(xiàn)的方式進(jìn)一步改進(jìn)白喉毒素產(chǎn)率的方法將是有益的。因此，本申請(qǐng)?zhí)峁└倪M(jìn)的發(fā)酵方法，其包括在發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基里培養(yǎng)白喉棒桿菌菌抹的發(fā)酵步驟，其在足以維持均質(zhì)培養(yǎng)物的攪動(dòng)和限量通氣以便培養(yǎng)物中的p02在發(fā)酵步驟的大部分時(shí)間內(nèi)降低到低于4%的條件下進(jìn)行。在有氧但限量通氣條件下進(jìn)行發(fā)酵，以便在發(fā)酵的大部分時(shí)間內(nèi)(即在其中白喉棒桿菌密度相對(duì)低而p02水平可以較高的初始期之后)氧氣一進(jìn)入培養(yǎng)物就被利用。發(fā)明人業(yè)已發(fā)現(xiàn)，與在較高p02時(shí)實(shí)施的發(fā)酵方法相比，在這樣的條件下培養(yǎng)導(dǎo)致白喉毒素或突變體更有效和/或更一致地表達(dá)。本發(fā)明方法比高水平氧氣下的發(fā)酵更旺盛，使得即使在培養(yǎng)基中含有添加的鐵或在使用質(zhì)量不定的復(fù)合原料時(shí)，也保持白喉毒素高產(chǎn)率。本發(fā)明第二方面提供制備白喉毒素或其突變體制劑的方法，其包括實(shí)施本發(fā)明發(fā)酵方法和從培養(yǎng)物分離白喉毒素或其突變體。盡管本文闡述的是白喉毒素和突變體，但應(yīng)該想象用本發(fā)明方法可分離任何白喉棒桿菌抗原。與保持5%p02或更高例如20%p02比較，〗吏用這樣的方法導(dǎo)致白喉毒素或突變體(例如CRM197)產(chǎn)率更高。本發(fā)明第三方面提供通過本發(fā)明方法分離的白喉毒素或其突變體。本發(fā)明第四方面提供包含本發(fā)明白喉毒素或其突變體和藥學(xué)可接受栽體的藥物組合物。本發(fā)明另一方面提供用于治療的白喉毒素或其突變體，尤其是用于細(xì)菌性疾病例如白喉棒桿菌病的預(yù)防治療。本發(fā)明另一方面提供本發(fā)明白喉毒素或其突變體在制備用于治療或預(yù)防細(xì)菌性疾病尤其是白喉棒桿菌病的藥物中的用途。本發(fā)明另一方面提供治療或預(yù)防細(xì)菌感染尤其是白喉棒桿菌感染的方法，其包括將本發(fā)明藥物組合物給予患者。附圖簡(jiǎn)述圖1-顯示充氧曲線(oxygenationprofile)和其在測(cè)定發(fā)酵KLa中應(yīng)用的圖。A圖表示從氮?dú)廪D(zhuǎn)換到空氣后的充氧時(shí)程。B圖表示ln(100-pO2)對(duì)時(shí)間所作的圖，其使得可通過測(cè)定線,殳的斜率來評(píng)估KLa。圖2-白喉棒桿菌發(fā)酵方法概述。圖3-表示典型的白喉棒桿菌培養(yǎng)物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)的圖。帶圓標(biāo)的線表示在不同培養(yǎng)時(shí)間后的650nrn處的OD值。帶方塊的線表示培養(yǎng)物的pH。圖4-培養(yǎng)物上清液的SDS-PAGE凝膠。第1道為分子量標(biāo)記；第2道為l嗎CRM197標(biāo)準(zhǔn)品；第3道為0.5嗎CRM197標(biāo)準(zhǔn)品；第4道為0.25昭CRM197標(biāo)準(zhǔn)品；第5-11道為白喉棒桿菌發(fā)酵上清液。A凝膠第5道表示CDT082的上清液，第6-8道表示CDT198的上清液(第6道為22.5小時(shí)時(shí)取出的上清液；第7道為24小時(shí)時(shí)取出的上清液；第8道為28小時(shí)時(shí)取出的上清液)，第9、lO和ll道表示CDT199的上清液(第9道為22小時(shí)45分鐘時(shí)取出的上清液；第10道為24小時(shí)45分鐘時(shí)取出的上清液；第11道為隨后微孔過濾和過濾后的上清液)。B凝膠第5道表示CDT082的上清液，第6-9道表示CDT205的上清液(第7道為發(fā)酵21小時(shí)43分鐘后的上清液；第8道為發(fā)酵23小時(shí)后的上清液；第9道為發(fā)酵24小時(shí)后的上清液)，第10-13道表示CDT206的上清液(第10道為發(fā)酵22小時(shí)10分鐘后的上清液；第11道為發(fā)酵23小時(shí)49分后的上清液；第12道為發(fā)酵24小時(shí)30分鐘后的上清液；第13道為微孔過濾和過濾后的上清液)。圖5-表示150升發(fā)酵罐在每分鐘23升的通氣條件下不同攪動(dòng)速度的KLa。發(fā)明詳述在各種情況下，對(duì)于本文術(shù)語"包含"、"包括"，本發(fā)明者意欲可任選分別被術(shù)語"由…組成"來代替。本發(fā)明一方面為發(fā)酵方法，其包括在發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基里培養(yǎng)白喉棒桿菌菌抹的發(fā)酵步驟，其在足以維持均質(zhì)培養(yǎng)的攪動(dòng)(例如足以產(chǎn)生小于30、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1秒的混合時(shí)間)和限量通氣以便培養(yǎng)物中的p02在發(fā)酵步驟的大部分時(shí)間內(nèi)降低到低于5%、4°/。、3%、1%或0.5°/。的條件下進(jìn)行。在優(yōu)選實(shí)施方案中，p02降低到接近零，優(yōu)選在發(fā)酵步驟的大部分時(shí)間內(nèi)接近零。舉例而言，從白喉棒桿菌生長(zhǎng)到密度足以當(dāng)氧氣一進(jìn)入培養(yǎng)物就馬上大部分被消耗(潛伏期，例如在發(fā)酵開始后至少1、2、3、4、5或6小時(shí))，一直到p02濃度再次上升接近發(fā)酵步驟結(jié)束時(shí)的發(fā)酵點(diǎn)(例如在潛伏期后16、18、20、22或24小時(shí))，培養(yǎng)物內(nèi)的p02降到低于5%、4%、3%、1%或0.5%。通常當(dāng)p02上升超過限量通氣條件時(shí)，發(fā)酵結(jié)束，收獲培養(yǎng)物。應(yīng)該注意，在不同的接種條件下，例如當(dāng)用大得多的白喉棒桿菌培養(yǎng)物接種發(fā)酵罐時(shí)，從發(fā)酵開始后不久(例如在發(fā)酵開始后1、5、10、20、30、40或60分鐘)就開始限量通氣條件。當(dāng)在34.5。C和0.5巴壓力時(shí)向培養(yǎng)基通入壓縮空氣后，用氧氣飽和培養(yǎng)基(其中無培養(yǎng)物)時(shí)，存在的氧氣量為100%p02。對(duì)于150升發(fā)酵罐，通氣速率和攪拌速度應(yīng)該設(shè)定為23升/分鐘和240rpm,而對(duì)于20升發(fā)酵罐，通氣速率和攪拌速度應(yīng)設(shè)定為3升/分鐘和300rpm。在接種之前，它可設(shè)定為在完全充氣的發(fā)酵培養(yǎng)基中所存在的氧氣量。均質(zhì)培養(yǎng)物為其中細(xì)菌均勻^:于整個(gè)發(fā)酵罐以便在最上端100/0的培養(yǎng)基中存在至少3%、4%、5%、60/。、7°/。、8%、9%或10%的細(xì)菌的培養(yǎng)物。發(fā)酵步驟定義為其中在發(fā)酵罐中培養(yǎng)白喉棒桿菌的步驟。在將預(yù)培養(yǎng)物引入發(fā)酵罐時(shí)開始發(fā)酵步驟，當(dāng)p02在本文所述限量通氣條件下最終增加到超過10%時(shí)結(jié)束。發(fā)酵步驟通常持續(xù)超過12、14、16、18、20或24小時(shí)，例如16-40小時(shí)，或例如22-28小時(shí)。攪動(dòng)可任選通過攪拌發(fā)酵罐中的培養(yǎng)物來進(jìn)行，但可以任何其它合適方式，例如通過攪動(dòng)、振動(dòng)混合器和/或通氣。攪動(dòng)足以導(dǎo)致培養(yǎng)物的混合時(shí)間不低于20、15、10、8、7、6、5、4、3、2或1秒?？稍诓ＡОl(fā)酵罐中測(cè)量培養(yǎng)物的混合時(shí)間。其為引入彩色水溶液后該彩色水溶液均勻分散到整個(gè)培養(yǎng)基中所花的時(shí)間。發(fā)酵罐是適于工業(yè)生產(chǎn)細(xì)菌培養(yǎng)物的任何設(shè)備。然而，該術(shù)語并不包括通常用于小規(guī)模培養(yǎng)細(xì)菌的培養(yǎng)瓶。發(fā)酵步驟的大部分時(shí)間定義為超過發(fā)酵步驟總長(zhǎng)度的50%、60°/。、70%、80%或90°/。的時(shí)間。發(fā)酵通常在限量通氣條件下持續(xù)12、14、16、18、20、21、22、23、24、25、26或28小時(shí)。限量通氣闡明了這樣的通氣條件，其使得白喉棒桿菌可使用有氧呼吸，然而限制可利用的氧氣量，以便在培養(yǎng)物密度增加后(例如在至少發(fā)酵l、2、3、4、5、6、7、8、9或10小時(shí)后)氧氣進(jìn)入培養(yǎng)物后很快就被消耗，由此p02低于50/0、4%、3%、2%、1%或0.5%。應(yīng)該注意，通過增加用于接種發(fā)酵罐的培養(yǎng)物的量，在接種后很快(例如在發(fā)酵開始l、5、10、20或30分鐘后)就可能達(dá)到限量通氣條件。這樣的限量通氣條件導(dǎo)致毒素例如白喉毒素或其突變體的旺盛表達(dá)。通過通氣速率和攪動(dòng)來將p02降低到接近零，以便引入培養(yǎng)物的氧氣在進(jìn)入培養(yǎng)物后很快就被培養(yǎng)物呼吸耗盡，因此盡管對(duì)培養(yǎng)物通氣，但在氧氣監(jiān)控器上p02讀數(shù)為零或接近零。在發(fā)酵步驟期間，對(duì)于給定設(shè)置的攪動(dòng)和通氣速率而言，p02將以較高水平開始。這是因?yàn)榕囵B(yǎng)物中的細(xì)菌密度在發(fā)酵步驟開始時(shí)低，在發(fā)酵步驟期間增加。通常需要一段時(shí)間(例如長(zhǎng)達(dá)1、2、3、4、5、6、7、8、9或10小時(shí))pO2才降低到小于5。/。。從這一時(shí)間點(diǎn)以后，p02保持低于5%、4%、3%、2%、1%或0.5%,優(yōu)選接近零的水平，直至接近發(fā)酵步驟結(jié)束，例如直到收獲發(fā)酵罐。在整個(gè)發(fā)酵步驟過程中，任選以恒定KLa來實(shí)施發(fā)酵步驟?；蛘?，以一種或多種KLa來實(shí)施發(fā)酵步驟，以便在發(fā)酵步驟的大部分時(shí)間(至少50%、60%、70%、80%、卯％、95%)內(nèi)以存在的KLa值來達(dá)到限量通氣。KLa是對(duì)進(jìn)入培養(yǎng)物的氧氣量的度量。KLa越高，則引入培養(yǎng)物的氧氣速率越高。包括培養(yǎng)基體積和組成、攪動(dòng)、通氣、壓力、溫度和發(fā)酵罐的可移部分的位置和特性在內(nèi)的幾種因素都會(huì)影響具體發(fā)酵步驟的KLa。通常通過將壓縮空氣通入培養(yǎng)物中來將氧氣引入到發(fā)酵培養(yǎng)物中。在引入到培養(yǎng)物中的空氣中存在不同濃度的氧氣時(shí)，應(yīng)該考慮到這點(diǎn)來調(diào)整流量。例如，在100%氧氣供給被引入到培養(yǎng)物中時(shí)，流量將相應(yīng)地低一些。在將含氧量低于空氣的氣體引入到培養(yǎng)物中時(shí)，應(yīng)該采用較高的流量?？捎脤?shí)施1所述方法測(cè)量KLa。該方法涉及i殳定測(cè)量KLa采用的發(fā)酵罐的培養(yǎng)基體積、溫度、壓力、攪動(dòng)和通氣條件，其通過用氮?dú)馊〈諝鈦泶党鰵怏w，通過恢復(fù)通入空氣來吹進(jìn)氣體，測(cè)量p02回到其穩(wěn)態(tài)水平時(shí)的速率。ln(100-pO2)=-KLa.T十C通過ln(100-pO2)對(duì)時(shí)間作圖，直線斜率(或角系數(shù))為KLa。發(fā)酵步驟的KLa受到多種因素影響，所述因素包括培養(yǎng)物的攪動(dòng)量和培養(yǎng)物的通氣速率。當(dāng)例如降低培養(yǎng)物攪動(dòng)并增加通氣速率，或正好相反時(shí)，可維持恒定的KLa。然而，在實(shí)施方案中，在發(fā)酵步驟期間培養(yǎng)物的攪動(dòng)和通氣速率二者都恒定。舉例而言，發(fā)酵步驟以下面的KLa來實(shí)施10-200h-l、10-150h-l、10-100h-l、10-80h-l、10-50h-l、10-40h曙l、10-30h-l、20-150h-l、20-100h-l、20-50h國(guó)l、20-60h-l、20-80h-l、20-30h-l、20-40h-l、30-60h-l、60-80h-l、60-150h-l或60-200h曙l。本發(fā)明發(fā)酵方法的KLa可變化，其視發(fā)酵培養(yǎng)物的多少而定。對(duì)于10-30升培養(yǎng)物而言，可用10-30h-l、15-30、20-30或22-28h-1的KLa。對(duì)于30-250升培養(yǎng)物，可用30-60或40-50h-l的KLa。對(duì)于250-800升培養(yǎng)物，可使用30-50、40-50、40-60、30-60、30-80或60-150h-l的KLa。對(duì)于800-3000升培養(yǎng)物，可使用30-50、40-50、40-60、30-60、30-80、60-150或60-200h-l的KLa。對(duì)于10-30升量的發(fā)酵培養(yǎng)物，例如通過用l-5升/分鐘的空氣流量或通氣速率和200-400rpm的攪拌速度，例如用2-4升/分鐘的通氣速率和250-350rpm的攪拌速度，可達(dá)成10-30h-l的KLa。對(duì)于30-250升的發(fā)酵培養(yǎng)物，例如通過用15-25升/分鐘的空氣流量和150-250rpm的攪拌速度，例如通過用20-25升/分鐘的空氣流量和200-250rpm的攪拌速度，例如通過用15-20升/分鐘的空氣流量和200-250rpm的攪拌速度，可達(dá)成30-60h-l的KLa。在發(fā)酵步驟期間，在CY培養(yǎng)基中的白喉棒桿菌培養(yǎng)物的pH視培養(yǎng)物通氣和攪動(dòng)條件而定(Nikolajewski等J.BiologicalStandardization,1982,10;109-114)。在發(fā)酵步驟開始時(shí)，CY培養(yǎng)基的pH為7.4。在低通氣或低KLa情況下，pH降到大約5。在高通氣情況下，pH上升到大約8.5。在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案中，在CY培養(yǎng)基或SOC培養(yǎng)基(SambrookJ等1989,MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY)或相似培養(yǎng)基中培養(yǎng)白喉棒桿菌。通過通氣程度任選無需加入酸或堿，發(fā)酵罐中的pH可維持在7,0-7.8。本發(fā)明方法可使用任何白喉棒桿菌菌抹。這樣的菌抹可產(chǎn)生野生型白喉毒素、包含白喉毒素或其片段的融合蛋白(例如揭示于US5863891中的融合蛋白)或白喉毒素突變形式或片段，優(yōu)選減毒毒素。這樣的突變毒素的實(shí)例有CRM176、CRM197、CRM228、CRM45(Uchida等J.Biol.Chem.218;3838-3844,1973);CRM9、CRM45、CRM102、CRM103和CRM107和由Nicholls和Youle在GeneticalyEngineeredToxins,Ed:Frankel,MaecelDekkerInc，1992中闡述的其它突變；Glu-148缺失或突變?yōu)锳sp、Gin或Ser和/或Ala158變?yōu)镚ly和揭示于US4709017或US4950740的其它突變；Lys516、Lys526、Phe530和/或Lys534中至少一個(gè)或多個(gè)殘基突變和揭示于US5917017或US6455673的其它突變；或揭示于US5843711的片段。在實(shí)施方案中，白喉棒桿菌菌抹產(chǎn)生CRM197。在實(shí)施方案中，以下白喉棒桿菌菌株用于本發(fā)明方法ATCC39255、ATCC39526、ATCC11049、ATCC11050、ATCC11051、ATCC11951、ATCC11952、ATCC13812、ATCC14779、ATCC19409、ATCC27010、ATCC27011、ATCC27012、ATCC296、ATCC43145、ATCC51280或ATCC51696。用于本發(fā)明的培養(yǎng)基可含有一種或多種以下組分5-20g/L、10-16g/L或10g/L酪蛋白氨基酸或酪蛋白水解物；5-20g/L、7-15g/L或9-12g/L大豆蛋白胨；和/或10-40g/L、14-32g/L或18-22g/L酵母膏。已知生長(zhǎng)培養(yǎng)基的鐵含量可影響白喉棒桿菌的生長(zhǎng)，并影響毒素的生產(chǎn)(參見WO00/50449)。鐵對(duì)于細(xì)菌生長(zhǎng)必不可少，然而，業(yè)已證明高濃度的鐵抑制毒素的產(chǎn)生。在本發(fā)明方法中，培養(yǎng)基的鐵含量下限為10、50、75、100、120或150ppb,上限為200、300、400、500、600、700、細(xì)、900、1000、1500、2000、3000、4000或5000ppb。舉例而言，培養(yǎng)基中的鐵濃度為50-1000ppb、100-1000pb、200-1000ppb、400-1OOOppb、500-1500ppb、700-1300ppb、50-2000ppb、100-2000ppb、200-2000ppb、400-2000ppb、700-2000ppb、50畫3000ppb、100-3000ppb、200-3000ppb、400-3000ppb、700-3OOOppb、1000-3000ppb、1500-3000ppb、1700-3000ppb、50-4000ppb、100畫4000ppb、200畫4000ppb、400-4000ppb、700畫4000ppb、1000-4000ppb、1500-4000ppb、1700-4000ppb或2000-4000ppb。鐵可呈Fe2+和/或Fe3+的形式。在實(shí)施方案中，本發(fā)明方法足以耐受培養(yǎng)基中的鐵鹽存在，以致在使用前無需處理培養(yǎng)基來除去所需要的鐵。發(fā)酵步驟在適于培養(yǎng)白喉棒桿菌的溫度下進(jìn)行，例如25-45°C、25-40。C、30-38。C或34-35。C。發(fā)酵步驟易產(chǎn)生大量泡沫。為了控制泡沫形成，任選將消泡劑加入到發(fā)酵罐。任選在發(fā)酵罐中例如使用泡沫探測(cè)器或機(jī)械消沫器以及消泡劑。本發(fā)明第二方面為用于制備抗原(例如白喉毒素或其突變體或其片段)制劑的方法,其包括實(shí)施上述本發(fā)明發(fā)酵方法和從培養(yǎng)物分離抗原(例如白喉毒素或其突變體或其片段)的步驟。本發(fā)明第三方面為通過本發(fā)明方法分離的白喉毒素或其突變體或其片段(例如CRM197)。白喉毒素的毒性任選通過化學(xué)處理來減毒，包括用交聯(lián)劑處理形成類毒素。提及毒素包括類毒素。本發(fā)明另一方面為藥物組合物，其包含本發(fā)明白喉毒素或其突變體(例如CRM197)或片段和藥學(xué)可接受載體。本發(fā)明藥物組合物任選進(jìn)一步包含聯(lián)合疫苗中的另外的抗原。在實(shí)施方案中，與上述白喉毒素、其突變體或其片段聯(lián)合的抗原包括以下中的一種或多種破傷風(fēng)類毒素、全細(xì)胞百日咳(Pw)、無細(xì)胞百日咳(Pa)(如下所述)、乙型肝炎表面抗原、甲肝病毒、B型流感嗜血桿菌多糖或寡糖、奈瑟氏球菌(例如腦膜炎奈瑟氏球菌(TV.mem力g/^fe))多糖或寡糖、腦膜炎奈瑟氏球菌血清型B蛋白、任選作為外膜嚢泡的部分、肺炎球菌多糖或寡糖、肺炎球菌蛋白質(zhì)或下面所列出的任何抗原?？蓪⒓?xì)菌多糖綴合到載體蛋白。舉例而言，用本發(fā)明方法制備的白喉毒素或類毒素或白喉毒素突變體例如CRM197或片段，可用作載體蛋白。然而，也可使用其它栽體蛋白例如破傷風(fēng)類毒素、破傷風(fēng)類毒素C片段、肺炎球菌溶血素、D蛋白(US6342224)。特定藥物組合物任選含有綴合到不同載體蛋白的多種多糖或寡糖。用本發(fā)明方法制備的白喉毒素或其突變體例如CRM197或其片段，可與來源于以下一種或多種細(xì)菌的莢膜多糖或寡糖調(diào)配腦膜炎奈瑟氏J求菌(iVe&sen'fl附em'"g衍cfc)、B型流感嗜血沐干菌(//0^切0//7^5i'w/we打zaeb)、肺炎鏈球菌(iSfre/fococcMSp"ewmom'ae)、A組鏈球菌、B組鏈球菌、金黃色葡萄球菌CSto//^/ococa^m/rew力或表皮葡萄球菌OStop/^/ococcwse;zVifenm'cfo)。例如，藥物組合物或免疫原性組合物可包含來源于腦膜炎奈瑟氏球菌A、C、W-135和Y血清群中一種或多種的莢膜多糖。例如，血清群A和C;A和W、A和Y;C和W、C和Y、W和Y;A、C和W;AC和Y;A、W和Y;C、W和Y或A、C、W和Y可與CRM197調(diào)配。在另一實(shí)例中，免疫原性組合物包含來源于肺炎鏈球菌的莢膜多糖。肺炎球菌莢膜多糖抗原優(yōu)選來自血清群1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、IOA、IIA、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F(最優(yōu)選來自血清群1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F)。另外的實(shí)例含有B型流感嗜血桿菌的PRP莢膜多糖(或寡糖)。另外的實(shí)例可含有金黃色葡萄球菌的5型、8型、336、PNAG或dPNAG莢膜多糖。另外的實(shí)例可含有表皮葡萄球菌的I型、II型、III型或PIA莢膜多糖。另外的實(shí)例可含有B組鏈球菌的Ia型、Ic型、II型或III型莢膜多糖。另外的實(shí)例可含有A組鏈球菌的莢膜多糖，任選進(jìn)一步包含至少一種M蛋白，更優(yōu)選包含多種類型的M蛋白。用于本發(fā)明的細(xì)菌多糖可為已純化的全長(zhǎng)天然多糖?；蛘?，將多糖篩分(size)2-20次，例如2-5次、5-10次、10-15次或15-20次，以便多糖大小小一些從而更易處理。寡糖通常含有2-20個(gè)重復(fù)單位。這樣的莢膜多糖可不綴合或綴合載體蛋白，例如破傷風(fēng)類毒素、破傷風(fēng)類毒素C片段、白喉類毒素或CRM197(例如二者都由本發(fā)明方法制備)、肺炎球菌溶血素或D蛋白(US6342224)。破傷風(fēng)毒素、白喉毒素和肺炎球菌溶血素通過遺傳突變和/或通過化學(xué)處理去毒?？赏ㄟ^任何已知的偶聯(lián)技術(shù)制備多糖或寡糖綴合物。例如可通過硫醚鍵來偶聯(lián)多糖。這種綴合方法依靠用四氟硼酸l-氰基-4-二曱氨基吡啶鏡(CDAP)活化多糖以形成氰酸酯。由此活化的多糖可直接或通過間隔基團(tuán)偶聯(lián)于載體蛋白上的氨基。任選氰酸酯與己二胺偶聯(lián)，用涉及形成硫醚鍵的異源連接(heteroligation)化學(xué)讓氨基衍生化的多糖綴合于栽體蛋白。這樣的綴合闡述于PCT申請(qǐng)公開說明書WO93/15760UniformedServicesUniversity中。通過如US4365170(Je皿ings)和US4673574(Anderson)所述的直接還原胺化方法也可制備綴合物。其它方法闡述于EP-0-161-188、EP-208375和EP-0-477508中。另外的方法涉及溴化氰活化的用己二酸肼(ADH)衍生化的多糖通過碳二亞胺縮合偶聯(lián)到蛋白載體(ChuC.等Infect.Immunity,(1983)245;256)。在具體實(shí)施例中，讓白喉毒素或其突變體片段(例如CRM197)綴合于藥物組合物中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20種另外的抗原。在一個(gè)實(shí)施方案中，其與多糖組分綴合，例如細(xì)菌多糖，包括上面所列的那些細(xì)菌多糖。本發(fā)明藥物組合物或免疫原性組合物可進(jìn)一步包含另外的蛋白質(zhì)組分。其任選與提供抗破傷風(fēng)和百日咳博德特氏菌感染中一種或多種的保護(hù)作用的抗原一起調(diào)配。百日咳組分可為殺死的全細(xì)胞百曰咳博德特氏菌(Pw)或無細(xì)胞百曰咳(Pa)，后兩者含有來自PT、FHA和69kDa百日咳桿菌粘附素(pertactin)中的至少一種抗原(優(yōu)選2種或所有3種)。某些其它無細(xì)胞百日咳制劑也含有凝集原，例如Fim2和Fim3，這些疫苗也涵蓋用于本發(fā)明中。通常提供抗破傷風(fēng)保護(hù)作用的抗原為破傷風(fēng)類毒素，其為化學(xué)失活毒素(例如用甲醛處理后)或通過引入一個(gè)或多個(gè)點(diǎn)突變而被失活。本發(fā)明藥物組合物或免疫原性組合物任選包含肺炎球菌蛋白抗原，例如那些暴露于肺炎球菌外膜的肺炎球菌蛋白(在至少部分肺炎球菌生活周期中能夠被宿主免疫系統(tǒng)所識(shí)別)，或由肺炎球菌分泌或釋放的蛋白。舉例而言，所述蛋白可為毒素、粘附素、雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)物或肺炎鏈球菌的脂蛋白或它們的片段。這樣的蛋白實(shí)例包括但不限于肺炎球菌溶血素(優(yōu)選通過化學(xué)處理或突變?nèi)ザ?[Mitchell等NucleicAcidsRes.1990Jul11;18(13):4010"Comparisonofpneumolysingenesandproteinsfrom5^re/tococcwsp"ewwow/aetypes1and2."、Mitchell等BiochimBiophysActa1989Jan23;1007(1):67-72"ExpressionofthepneumolysingeneinEsc/zeWc/n'aco//:rapidpurificationandbiologicalproperties."、WO96/05859(A.Cyanamid)、WO卯/06951(Paton等)、WO99/03884(NAVA)];PspA和其橫-爭(zhēng)膜缺失變異體(US5804193-Briles等.)；PspC和其橫跨膜缺失變異體(WO97/09994-Briles等)；PsaA和其橫跨膜缺失變異體(Berry和Paton，InfectImmun1996Dec;64(12):5255-62"SequenceheterogeneityofPsaA,a37-kilodaltonputativeadhesinessentialforvirulenceofSVreptococcwspwewwcra'ae");肺炎^求菌膽石咸結(jié)合蛋白和其4黃跨膜缺失變異體；CbpA和其橫跨膜缺失變異體(WO97/41151;WO99/51266);甘油醛3-磷酸脫氬酶(InfectImmun，199664:3544);HSP70(WO96/40928);PcpA(Sanchez-Beato等FEMSMicrobiolLett1998，164:207-14);M樣蛋白(EP0837130)和粘附素18627(EP0834568)。包含在免疫原性組合物中的其它肺炎球菌蛋白抗原為闡述于WO98/18931、WO98/18930和PCT/US99/30390中的抗原。與本發(fā)明免疫原性組合物一起調(diào)配的奈瑟氏球菌蛋白的實(shí)例包括TbpA(WO93/06861;EP586266;WO92/03467;US5912336)、TbpB(WO93/06861;EP586266)、Hsf(W099/31132)、NspA(W096/29412)、Hap(PCT/EP99/02766)、PorA、PorB、OMP85(也稱為D15)(WO00/23595)、PilQ(PCT/EP99/03603)、PldA(PCT/EP99/06718)、FrpB(W096/31618,參見SEQIDNO:38)、FrpA或FrpC或這兩種共有的至少30、50、100、500、750個(gè)氨基酸的保守部分(W092/01460)、LbpA和/或LbpB(PCT/EP98/05117;Schryvers等Med.Microbiol,199932:1117)、FhaB(WO98/02547SEQIDNO:38)、HasR(PCT/EP99/05989)、lipo02(PCT/EP99/08315)、MltA(W099/5728O)和ctrA(PCT/EP00/00135)。奈瑟氏球菌蛋白任選作為純化蛋白或作為外膜制品的部分加入。本發(fā)明藥物組合物或免疫原性組合物任選包含可保護(hù)宿主4氐抗不可分型流感嗜血桿菌、RSV的一種或多種抗原，和/或可保護(hù)宿主抵抗流感病毒的一種或多種抗原。不可分型流感嗜血桿菌蛋白抗原實(shí)例包括Fimbrin蛋白(US5766608)和包含來自其中的肽的融合蛋白(例如LB1融合蛋白)(US5843464-OhioStateResearchFoundation),OMP26、P6、D蛋白、TbpA、TbpB、Hia、Hmwl、Hmw2、Hap和D15。流感病毒抗原實(shí)例包括全病毒、活病毒或滅活病毒、片段流感病毒(splitinfluenzavirus)(其在雞蛋或MDCK細(xì)胞或Vero細(xì)胞中培養(yǎng))或全流感病毒顆粒(如R.Gluck，Vaccine,1992,10，915-920所述)或其純化蛋白或其重組蛋白，例如HA、NP、NA或M蛋白或其組合。RSV(呼吸道合胞病毒(RespiratorySyncytialVirus))抗原實(shí)例包括F糖蛋白、G糖蛋白、HN蛋白、M蛋白或其衍生物。應(yīng)該了解，本發(fā)明抗原組合物可包含來自一種細(xì)菌的一種或多種莢膜多糖?？乖M合物也可包含來自一種或多種細(xì)菌的莢膜多糖。本發(fā)明另一方面包括免疫原性組合物或疫苗，其包含由本發(fā)明方法制備的白喉毒素、其片段或其突變體(例如CRM197)和藥學(xué)可接受載體。答的量的佐劑。合適的佐劑包括但不限于鋁鹽、角豈烯混合物(SAF-1)、胞壁酰肽、皂苦衍生物、分枝桿菌細(xì)胞壁制備物、單磷脂酰脂質(zhì)A、霉菌酸衍生物、非離子嵌段共聚物表面活性劑、QuilA、霍亂毒素B亞單位、聚磷療(polphosphazene)及衍生物和免疫刺激復(fù)合物(ISCOM),例如由Takahashi等(19卯)Nature344:873-875闡述的免疫刺激復(fù)合物。對(duì)于獸醫(yī)應(yīng)用和在動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生抗體，可使用弗氏佐劑的促細(xì)胞分裂組分。對(duì)于所有免疫原性組合物或疫苗，免疫原的免疫有效量應(yīng)該憑經(jīng)驗(yàn)決定。要考慮的因素包括免疫原性、免疫原是否與佐劑或載體蛋白或其它載體形成復(fù)合物或共價(jià)連接、給藥途徑和待給予的免疫劑的次數(shù)。這樣的因素為疫苗領(lǐng)域所知。不必經(jīng)過過多實(shí)驗(yàn)就可作出這些決定，這完全在免疫學(xué)者的技術(shù)范圍內(nèi)。在本發(fā)明藥物組合物或疫苗中活性劑可以不同濃度存在。通常，該物質(zhì)的最低濃度為達(dá)成其計(jì)劃應(yīng)用所需的量，而最高濃度為保留在溶液或均質(zhì)懸浮在初始混合物中的最大量。例如，治療劑的最小量?jī)?yōu)選將提供單一治療有效劑量的量。對(duì)于生物活性物質(zhì)，最低濃度為重建時(shí)生物活性所需要的量，最高濃度為不能保持均一懸浮液的那一點(diǎn)。在單劑量單位情況下，該量為單一治療應(yīng)用的量。通常預(yù)期每劑將包含l-100嗎蛋白抗原，優(yōu)選5-50|ig,最優(yōu)選5-25jig。優(yōu)選的細(xì)菌多糖劑量為10-20jxg、10-5)ig、5-2.5嗎或2.5-ljxg。該物質(zhì)的優(yōu)選量隨物質(zhì)的不同而變化，但其易于由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定?；蛑委熞赘腥镜牟溉閯?dòng)物(例如人類患者)。這些給予可包括通過肌肉、腹膜內(nèi)、皮內(nèi)或皮下途徑注射；或通過粘膜給予口腔/消化道、呼吸道、泌尿生殖道。盡管本發(fā)明疫苗可作為單一劑量給予，但其組分也可同時(shí)一起給予，或在不同時(shí)間給予(例如若疫苗中存在多糖，則為了彼此之間免疫應(yīng)答最佳協(xié)調(diào)，其可同時(shí)分開給予，或在給予細(xì)菌蛋白組合后1-2周單獨(dú)給予)。除了單一給藥途徑外，可用2種不同給藥途徑。例如，可ID(皮內(nèi))給予病毒抗原，而可IM(肌肉內(nèi))或IN(鼻內(nèi))給予細(xì)菌蛋白。若存在多糖，則其可IM(或ID)給予，而細(xì)菌蛋白可IN(或ID)給予。另外，本發(fā)明疫苗的初次劑量可經(jīng)IM給予，而加強(qiáng)劑量可經(jīng)IN給予。疫苗制劑在VaccineDesign("Thesubimitandadjuvantapproach"(PowellM.F.和NewmanM.J.編輯)(1995)PlenumPressNewYork)中有全面闡述。Fullerton的US4,235,877闡述可在脂質(zhì)體內(nèi)包封。本發(fā)明另一方面為制備藥物組合物的方法，其包括下述步驟用本發(fā)明發(fā)酵方法制備白喉毒素或其片段或其突變體(例如CRM197)，和將其與藥學(xué)可接受載體混合，任選加入任何上述額外抗原。這樣的方法還可包括將白喉毒素或其片段或其突變體(例如CRM197)與藥物組合物中的一種或多種額外組分(優(yōu)選如上所述細(xì)菌多糖或寡糖)綴合的步驟。本發(fā)明另一方面為本發(fā)明白喉毒素或其片段或其突變體(例如CRM197)在制備用于治療或預(yù)防細(xì)菌性疾病尤其是白喉棒桿菌病的藥物中的用途。本發(fā)明另一方面為預(yù)防或治療細(xì)菌感染(尤其是白喉棒桿菌感染)的方法，其包括將本發(fā)明藥物組合物、免疫原性組合物或疫苗給予患者。本專利說明書所引用的所有參考文獻(xiàn)或?qū)＠暾?qǐng)?jiān)诖艘鲄⒖?。本發(fā)明在附隨實(shí)施例中闡明。除非另外詳述，否則用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知和常規(guī)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)實(shí)施以下實(shí)施例。實(shí)施例為說明性的，并非限制本發(fā)明。實(shí)施例實(shí)施例1:測(cè)量KLa為了測(cè)量發(fā)酵步驟的KLa，將所需體積的水裝入發(fā)酵罐，應(yīng)用發(fā)酵參數(shù)(例如溫度、壓力、攪動(dòng)和通氣)使系統(tǒng)達(dá)到穩(wěn)態(tài)。p02探針校準(zhǔn)為100%。將通氣快速轉(zhuǎn)換為氮?dú)?，同時(shí)保持同樣的流量。跟蹤p02直至p02降到小于5%。當(dāng)達(dá)到該點(diǎn)時(shí)，將通氣快速轉(zhuǎn)換為空氣，同時(shí)保持同樣的流量。跟蹤p02水平，在幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)記錄以初始穩(wěn)態(tài)100%水平的百分?jǐn)?shù)記錄p02水平。通過1og(100-pO2。/。)對(duì)時(shí)間作圖計(jì)算KLa。圖形線性部分的角系數(shù)對(duì)應(yīng)于KIa。通常只考慮20%-80%p02的數(shù)據(jù)。結(jié)果在不同時(shí)間點(diǎn)的p02讀數(shù)示于以下表1。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>作圖結(jié)果如圖1所示，從圖IB中線的角系數(shù)測(cè)定KLa。實(shí)施例2:以150升^f莫發(fā)酵白喉棒桿菌菌林ATCC39255制備CRM197(交叉反應(yīng)材料)所用的細(xì)菌為按照A.Pappenheimer方法(NatureNewBiol.233:8-11,1971)用亞硝基胍處理得到的白喉棒桿菌突變菌抹。其表達(dá)去毒白喉毒素(aa52:甘氨酸到谷氨酸突變)。其從ATCC獲得，在ATCC其被稱為39255。發(fā)酵方法概要示于圖2。從冰箱(—70。C)取回含有Uxl0^cfu/ml的工作種子，在室溫解凍。解凍后立即旋渦振蕩管形瓶，用帶針頭的lml注射器取出250pd種子。將該體積注射到100ml無菌鹽溶液(0.9%)中。攪動(dòng)燒瓶。用帶針頭的2ml注射器取出2ml懸浮液，用于接種含有500mLUS4，925，792中所述培養(yǎng)基的3-L錐形瓶。在34.5°C±0.5"于250rpm攪拌速度下溫育該燒瓶，直至光密度(650nm)達(dá)到4.0-6.0(溫育后16-19h)。將150升發(fā)酵罐滅菌，將100L培養(yǎng)基無菌轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐。將500mLH3P0425%(V/V)裝入酸瓶；培養(yǎng)基pH開始大約為7.4,不調(diào)整。在接種的前一天準(zhǔn)備發(fā)酵罐，保持在34.5。C溫度、0.5巴壓力、頂部空間空氣流量23NL/分鐘、攪拌速度50rpm的待用狀態(tài)16-20h直至接種。在接種之前，將發(fā)酵罐設(shè)定到培養(yǎng)條件-34.5。C溫度、0.5巴壓力、噴射入培養(yǎng)基的空氣流量23NL/分鐘和攪拌速度240rpm。240rpm的攪動(dòng)提供1.76m/s的端速(tipspeed),理論混合時(shí)間為3.9秒。不調(diào)節(jié)溶解氧，僅對(duì)其進(jìn)行監(jiān)測(cè)，打開泡沫控制系統(tǒng)，使pH達(dá)到7.8，此后通過加入H3P04來維持pH。在接種之前，將p02探測(cè)器設(shè)定在100%。撹拌速度設(shè)為240rpm,其對(duì)應(yīng)于1.76m/s的外周速度。240rpm的攪拌速度結(jié)合23-L/分鐘的通氣速率，導(dǎo)致KLa(20-80%、水30°C、0.5巴)估計(jì)為42h-l(參見圖6)。通過接種端口將400ml上述種子培養(yǎng)物接種到發(fā)酵罐。繼續(xù)發(fā)酵直到以下兩個(gè)條件都得到滿足。20小時(shí)發(fā)酵時(shí)間，溶解氧水平增加到10%。總發(fā)酵期通常為22-28h。在發(fā)酵結(jié)束時(shí)，改變溫度到設(shè)為20°C,關(guān)閉pH調(diào)節(jié)，為了限制起泡將空氣流轉(zhuǎn)移到頂部空間，關(guān)閉泡沫控制系統(tǒng)，其它參數(shù)不變。將微孔過濾系統(tǒng)連接到發(fā)酵罐上，當(dāng)懸浮液溫度達(dá)到2rc時(shí)，開始微孔過濾。微孔過濾分兩個(gè)階段操作濃縮和滲濾。在濃縮階段，參數(shù)為入口壓力0.6巴；出口壓力約0.1巴；滲透物流量用校準(zhǔn)的蠕動(dòng)泵(滲透壓力約0.3巴)保持在2L/分鐘的恒速。濃縮懸浮液直到首次出現(xiàn)以下事件之一。入口壓力達(dá)到0.9巴或回收了75升滲透物。在滲濾階段，使用以下參數(shù)入口壓力保持在濃縮階段結(jié)束時(shí)達(dá)到的壓力(最大為0.9巴)；以2升/分鐘加入水；加入的總水量為截留物的3倍體積。將截留物在0.22pm膜上過濾，貯存在+4。C。在+4。C或在室溫(+2(TC〈RT〈3。C)儲(chǔ)存長(zhǎng)達(dá)4天后測(cè)定這樣的懸浮液中的CRM197的穩(wěn)定性。通過ELISA定量或在SDS-page上未觀察到降解和差別。于36。C在BAB瓊脂上溫育進(jìn)行試驗(yàn)，以確i正無生長(zhǎng)。結(jié)果用上述發(fā)酵方案進(jìn)行了兩次150-L規(guī);漠的發(fā)酵(CDT199和CDT206)。預(yù)培養(yǎng)條件和培養(yǎng)條件示于表2和3中，CRM197產(chǎn)率示于表4中。圖3所示為典型的預(yù)培養(yǎng)物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)圖。當(dāng)O.D.(650nm)為4.0-6.0時(shí)，很明顯培養(yǎng)物處于指數(shù)生長(zhǎng)期，pH僅稍有變化。表2預(yù)培養(yǎng)條件<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>在發(fā)酵期間，觀察到不同階段。第一階段的特征為溶解氧降低直到達(dá)到0%(持續(xù)時(shí)間大約6-7h)。在該階段pH保持穩(wěn)定或稍微降低(約0.1pH單位)。在第二階段pH升高，達(dá)到約pH7.8的穩(wěn)定水平。在該水平，觸發(fā)pH調(diào)節(jié)，然而，在這些發(fā)酵條件下通常根本不必加入酸。在該pH穩(wěn)定水平期間，觀察到溶解氧水平升高超過0%,接著降到0%。第三階段特征為pH降低到約7.4。最后，在發(fā)酵的22和24h之間，觀察到p02升高。這是收獲信號(hào)。用質(zhì)譜儀分析發(fā)酵罐的排出氣體。觀察到典型的C02產(chǎn)生曲線(profile),為了評(píng)估CRM197產(chǎn)生的動(dòng)力學(xué)，在收獲信號(hào)后延長(zhǎng)了所存在的2次發(fā)酵。我們觀察到，在達(dá)到收獲信號(hào)后CRM197水平?jīng)]有增加，但泡沫產(chǎn)生增加。為了限制消泡劑的消耗，優(yōu)選在收獲信號(hào)時(shí)停止發(fā)酵。然而，CRM197似乎并沒有受到過量起泡的影響，不發(fā)生降解。孩么孔過濾展示了CDT206微孔過濾的數(shù)據(jù)。當(dāng)入口壓力達(dá)到0.9巴時(shí)收獲74.3L滲透物。在整個(gè)濃縮步驟中出口壓力為0.15-0.10巴。在整個(gè)濃縮步驟中滲透壓為0.3-0.4巴，濃縮步驟持續(xù)36分鐘。對(duì)于滲濾階段，逐漸加入(2L/分鐘)75-L水，同時(shí)以同樣的流量提取滲透物。在滲濾開始時(shí)入口壓力為0.9巴，結(jié)束時(shí)降到0.7巴。出口壓力穩(wěn)定在O.l巴。滲濾步驟持續(xù)時(shí)間為39分鐘。CRM197定量低通氣條件下CRM197表達(dá)水平通常是高通氣條件(其中在整個(gè)發(fā)酵期間p02保持在5%或更高)所達(dá)到水平的2-4倍。培養(yǎng)物上清液的染色SDS-page在還原條件下進(jìn)行培養(yǎng)物上清液的SDS-PAGE凝膠電泳(圖4),以便可能檢測(cè)出任何降解條帶(在剪下后可檢測(cè)出分別為35kD和23kD的2個(gè)亞基)。隨后用考馬斯藍(lán)對(duì)其染色。結(jié)果來自2次發(fā)酵的樣品的考馬斯染色凝膠示于圖4A(CDT199)和4B(CDT206)中。CRM197出現(xiàn)在預(yù)期的分子量位置(理論MW:58.4kD)。CRM197未被降解，因?yàn)樵诎l(fā)酵結(jié)束信號(hào)后采集的樣品中未觀察到模式有變化(圖4A第9和10道)。CRM197量不受微孔過濾和在0.22pM上最終過濾的影響，因?yàn)樵趫D4A的第9和11道顯示出等量的CRM197。溫度可能對(duì)CRM穩(wěn)定性有負(fù)面影響(圖4B的第12道)。當(dāng)樣品閥溫?zé)釙r(shí)采集該樣品，該樣品中存在的CRM197量降低了。實(shí)施例3:以20升，發(fā)酵白喉棒桿菌菌林ATCC39255除了使用20升發(fā)酵罐外，用與實(shí)施例2所述相似的方法發(fā)酵白喉棒桿菌。以300rpm攪動(dòng)培養(yǎng)物，空氣流量設(shè)為3升/分鐘。在發(fā)酵期間不需要加入酸或堿，因?yàn)樵谡麄€(gè)發(fā)酵方法中pH保持在大約中性。培養(yǎng)物生長(zhǎng)到最終OD(650nm)-18.3。通過對(duì)染色凝膠的光密度測(cè)定評(píng)估，發(fā)現(xiàn)CRM197產(chǎn)率為103mg/升。實(shí)施例4:以不同規(guī)模發(fā)酵白喉棒桿菌菌林ATCC39255在恒定KLa條件下培養(yǎng)白喉棒桿菌的發(fā)酵方法可用于其它大小和不同設(shè)計(jì)的發(fā)酵罐中。按照表5中所示的發(fā)酵罐大小、空氣流量和攪動(dòng)速度條件，達(dá)到了高產(chǎn)率的CRM197生產(chǎn)。在不同設(shè)計(jì)的發(fā)酵罐中進(jìn)行了三次150L規(guī)模的發(fā)酵。<table>complextableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>如表5所示，重要的是KLa,而不是空氣流量和攪動(dòng)速度條件的具體選擇。因此，為了產(chǎn)生相似的KLa，較低的空氣流量可由較高的攪動(dòng)速度來彌補(bǔ)，仍可達(dá)到很好的CRM197產(chǎn)率。攪動(dòng)速度應(yīng)該足以產(chǎn)生均一懸浮液，限制通氣以保持低p02。N.B.使用不同發(fā)酵罐進(jìn)行20升發(fā)酵。不同幾何形狀的不同發(fā)酵罐導(dǎo)致的kLa值范圍示于表5。然而，對(duì)于不同的發(fā)酵規(guī)模，最佳KLa條件不同。因此，對(duì)于在20升發(fā)酵罐中發(fā)酵，較低的22-28h-l的KLa為最佳。最佳KLa條件為允許限量通氣使培養(yǎng)物內(nèi)的p02落在低水平。對(duì)于特定大小和幾何形狀的發(fā)酵罐而言，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該能夠容易地確定這樣的條件。實(shí)施例5:在不同p02時(shí)鐵濃度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)率的影響按照實(shí)施例3提出的方法，進(jìn)行了一系列20升M^莫的白喉棒桿菌菌抹ATCC39255發(fā)酵，使p02在整個(gè)發(fā)酵的大部分時(shí)間4艮低，或以恒定的5。/op02。所存在的Fe3+量變化為不加Fe3+、加入250ppbFe3+、加入500ppbFe3+和力口入500ppbFe2+。通過SDS-PAGE凝月交光密度測(cè)定法測(cè)定發(fā)酵結(jié)束時(shí)的CRM197產(chǎn)率。該方法給出的結(jié)果往往大約比ELISA得到的結(jié)果低20%。結(jié)果表6<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>如表6所示，當(dāng)白喉棒桿菌在5%p02發(fā)酵時(shí)，加入^t失導(dǎo)致產(chǎn)率降低。然而，當(dāng)降低p02水平時(shí)，在如實(shí)施例3所述的恒定Kla時(shí)在低p02條件下進(jìn)行發(fā)酵，得到較高產(chǎn)率，并且該產(chǎn)率不受加入Fe3十的影響。實(shí)施例6:在低通氣條件下鐵濃度對(duì)DT或CRM197產(chǎn)率的影響在微孔板中測(cè)定不影響CRM197表達(dá)的鐵濃度范圍。微孔板模擬存在于本發(fā)明發(fā)酵方法中的限量通氣條件。在與上述發(fā)酵中所用相同的培養(yǎng)基中(在與CY培養(yǎng)基相似的培養(yǎng)基中)實(shí)施微孔板培養(yǎng)。從含lg/1Fe3+離子的FeCl3.6H20儲(chǔ)液中加入Fe3+。將培養(yǎng)基裝入^f效孔板孔中，以8E5細(xì)菌/mL進(jìn)行培養(yǎng)。在表達(dá)CRM197的白喉棒桿菌和表達(dá)白喉毒素的白喉棒桿菌兩種情況下，微孔板于34.5。C在250rpm攪動(dòng)下培養(yǎng)46h。將樣品通過0.22jnm濾器過濾。在用考馬斯藍(lán)(來自Pierce的Gelcodeblue染色液)著色的SDSpage(XTCriterion4-12%bistris,來自BioRad)上用光密度測(cè)定法測(cè)量表達(dá)。用于定量的參比是ListBiologicalLaboratoriesINC的白喉毒素CRM突變體，其以不同濃度加到凝膠上。結(jié)果表7所示為在微孔板孔中白喉棒桿菌在限量通氣條件下于不同鐵濃度下生長(zhǎng)時(shí)的CRM197表達(dá)。CRM197表i^JtFe3+所致的抑制并不很敏感，沒有明顯受到加入lppm或2ppmFe3+的影響。只有在3ppm時(shí)CRM197表達(dá)出現(xiàn)顯著降低。即使是在該Fe3+水平，CRM197表達(dá)仍然為不加Fe3+時(shí)所達(dá)到水平的79%。表7表達(dá)CRM197的白喉棒桿菌<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>CRM197產(chǎn)率以不加額外Fe3+達(dá)到的產(chǎn)率的百分比表示。在指定條件下于微孔板孔中培養(yǎng)的白喉棒桿菌的DT表達(dá)結(jié)果示于表8中。在限量通氣條件下DT生產(chǎn)對(duì)Fe3+所致的抑制也不很敏感。隨著Fe3+濃度增加，DT表達(dá)增加，在700ppb時(shí)達(dá)到最大DT產(chǎn)量。只有當(dāng)Fe3+濃度增加到3ppm時(shí)，DT表達(dá)才開始下降。表8表達(dá)白喉毒素的白喉棒桿菌力口入的Fe3+光密度DT(ppm)46hpH(%)04,168，66100200ppb4,728,42106300ppb4,68，47107400ppb4,98，51125500ppb4,228，59155600ppb4,488,51148700ppb4,048，63167800ppb4，288,52164900ppb4,588,62168lppm4,488,641662ppm4，78,681763ppm4，28，68141DT產(chǎn)率以不加額外Fe3+達(dá)到的產(chǎn)率的百分比表示。權(quán)利要求1.一種發(fā)酵方法，其包括在發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基里培養(yǎng)白喉棒桿菌(Corynebacteriumdiphtheria)菌株的發(fā)酵步驟，該步驟在足以維持均質(zhì)培養(yǎng)物的攪動(dòng)和限量通氣以便培養(yǎng)物中的pO2在發(fā)酵步驟的大部分時(shí)間內(nèi)降低到低于4％的條件下進(jìn)行。2.權(quán)利要求l的發(fā)酵方法，其中所述p02在發(fā)酵步驟的大部分時(shí)間內(nèi)降低到接近零。3.權(quán)利要求1或2的方法，其中從白喉棒桿菌生長(zhǎng)到因快速消耗氧氣而足以使p02降低到小于4%的密度時(shí)直到發(fā)酵步驟完成，保持所述p02小于4%。4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵步驟在恒定KLa下進(jìn)行。5.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵步驟在恒定攪動(dòng)速度和通氣速率下進(jìn)4亍。6.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵步驟在可變kLa條件下進(jìn)行。7.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵步驟在10-50h-l的KLa下進(jìn)行。8.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵步驟在10-30h-lKLa下于10-30升發(fā)酵罐中進(jìn)行。9.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵步驟在30-60h-l的KLa下于100-250升發(fā)酵罐中進(jìn)行。10.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵步驟在60-150h-l的KLa下于250-800升發(fā)酵罐中進(jìn)行。11.權(quán)利要求8的方法，其中所述發(fā)酵步驟在l-5L/分鐘的壓縮空氣氣流和200-400rpm的攪動(dòng)速度下進(jìn)行。12.權(quán)利要求9的方法，其中所述發(fā)酵步驟在15-25L/分鐘的壓縮空氣氣流和150-250rpm的攪動(dòng)速度下進(jìn)行。13.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述培養(yǎng)基為CY、SOC或相似培養(yǎng)基，發(fā)酵罐中的pH通過通氣程度保持在7.0-7.8,而無需力口入酸或堿。14.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述白喉棒桿菌菌林產(chǎn)生白喉毒素或其突變體，特別是CRM197。15.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述白喉棒桿菌菌林為ATCC39255。16.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法足夠耐受培養(yǎng)基中的鐵鹽存在，以致在使用前無需處理培養(yǎng)基來除去鐵。17.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述培養(yǎng)基含有10-權(quán)0ppb的鐵。18.權(quán)利要求17的方法，其中所述培養(yǎng)基含有100-3000ppb或1700-3000ppb的4失。19.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述培養(yǎng)基含有5-20g/L酪蛋白氨基酸或酪蛋白水解物。20.權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)的方法，其中所述培養(yǎng)基含有5-20g/L大豆蛋白胨或其它植物蛋白胨。21.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述培養(yǎng)基含有10-30g/L酵母膏。22.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵步驟在25-40。C溫度下進(jìn)行。23.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中將消泡劑加入到發(fā)酵罐中。24.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中在發(fā)酵罐中使用泡沫探測(cè)器或機(jī)械消沫器。25.—種制備白喉棒桿菌抗原制劑的方法，其包括實(shí)施權(quán)利要求1-24中任一項(xiàng)的發(fā)酵方法和從培養(yǎng)物分離白喉棒桿菌抗原的步驟。26.權(quán)利要求25的方法，其中所述白喉棒桿菌抗原為白喉毒素或其片段或其突變體。27.權(quán)利要求26的方法，其中所述抗原為CRM197。28.權(quán)利要求25-27中任一項(xiàng)的方法，其包括將一種或多種另外的抗原加到白喉棒桿菌抗原中的步驟。29.權(quán)利要求28的方法，其進(jìn)一步包括讓白喉毒素或其片段或其突變體與一種或多種另外的抗原綴合。30.權(quán)利要求29的方法，其中所述一種或多種另外的抗原包含細(xì)菌多糖或寡糖。31.—種制備藥物組合物的方法，其包括讓通過權(quán)利要求25-30中任一項(xiàng)的方法制備的抗原或白喉毒素或其突變體(綴合的或未經(jīng)綴合的)與藥學(xué)可接受載體混合的步驟。32.通過權(quán)利要求25-31中任一項(xiàng)的方法制備的抗原、白喉毒素或其突變體在制備用于治療或預(yù)防細(xì)菌性疾病的藥物中的用途。33.權(quán)利要求32的用途，其中所述細(xì)菌性疾病為白喉棒桿菌病。34.—種預(yù)防或治療細(xì)菌感染的方法，其包括將用權(quán)利要求31的方法制備的藥物組合物給予患者。35.權(quán)利要求34的方法，其中所述細(xì)菌感染為白喉棒桿菌感染。全文摘要本發(fā)明涉及發(fā)酵方法，其包括在發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基里培養(yǎng)白喉棒桿菌(Corynebacteriumdiphtheria)菌株的發(fā)酵步驟，該步驟在足以維持均質(zhì)培養(yǎng)物的攪動(dòng)和限量通氣以便培養(yǎng)物中的pO2在大部分發(fā)酵步驟中降低到低于4％的條件下進(jìn)行。文檔編號(hào)A61K39/00GK101180313SQ200680017793公開日2008年5月14日申請(qǐng)日期2006年3月21日優(yōu)先權(quán)日2005年3月23日發(fā)明者M(jìn)·R·F·奧爾瓦爾,O·M·S·G·拉盧瓦,P·M·H·德霍泰,S·德蘇伊申請(qǐng)人:葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司