與crm197有關的方法和組合物的制作方法
【專利說明】與CRM197有關的方法和組合物
[0001] 1 引言 本發(fā)明提供了產(chǎn)生白喉毒素的新型方法。特別地，本發(fā)明提供了產(chǎn)生無毒形式的白喉 毒素例如CRM197的新型方法。本發(fā)明還提供了包含白喉毒素或無毒形式的白喉毒素例如 CRM197的新型組合物。
[0002] 2 背景 CRM197蛋白質是安全有效的用于糖類的T細胞依賴性載體，并且目前用于許多不同 的稱為綴合物疫苗的疫苗制劑中。白喉毒素是在由噬菌體β197感染后通過細菌白喉 棒狀桿菌（產(chǎn)生的蛋白質內毒素。白喉毒素("DT"）和 CRM197兩者均為許多疫苗的組分，所述疫苗如例如針對百日咳博德特氏桿菌（你ri/aieWa 破傷風梭菌（白喉棒狀桿菌、乙型肝炎病毒和B型 流感嗜血桿菌(W0 9324148、W0 9700697、W0 02055105)。另 外，由于其與其結合可溶形式HB-EGF的能力有關的潛在抗腫瘤活性，已存在對CRM197日益 增長的興趣（US2006/0270600A1)。
[0003]CRM197通過被不產(chǎn)生毒素的噬菌體i3197tox感染的白喉棒狀桿菌產(chǎn)生。 0 197t〇X通過產(chǎn)生毒素的β棒狀噬菌體的亞硝基胍誘變進行制備（Uchida，T.等人1971， NatureNewBiology233:8-11)。CRM197蛋白質是無毒形式的白喉毒素，但在免疫上與白 喉毒素無法區(qū)別。DT具有58. 350kDa的質量（CRM197 = 58. 415kDa)，并且由N末端A結 構域和C末端B結構域（21和37kDa)組成，所述N末端A結構域和C末端B結構域通過 連接Cysl86和Cys201的二硫橋連接。A片段在從其二硫鍵合的配偶體B片段釋放后是毒 性的。全毒素通過在位置191-3處的連接肽處的輕度蛋白酶解產(chǎn)生切口是A片段活化的 必要條件。B片段沒有明顯的酶促活性，但是毒性所需的，可能是由于將全毒素靶向靶細 胞膜（BrokerM，CostantinoP，DeToraL，McIntoshED，RappuoliR:Biochemicaland biologicalcharacteristicsofcross-reactingmaterial197 (CRM197)，anon-toxic mutantofdiphtheriatoxin:useasaconjugationproteininvaccinesandother potentialclinicalapplications.Biologicals,2011,39 (4) :195-204. )〇
[0004] 受感染的白喉棒狀桿菌培養(yǎng)物跨越胞質膜分泌CRM197蛋白質離開細胞進入培養(yǎng) 基內。CRM197蛋白質具有與白喉毒素大約相同的分子量，但通過結構基因中的單堿基變化 (鳥嘌呤至腺嘌呤）而與其不同。該單堿基變化引起成熟蛋白質中的氨基酸置換(谷氨酸置 換甘氨酸，G52E)，并且消除白喉毒素的毒性特性（GianniniG，RappuoliR，RattiG:The amino-acidsequenceoftwonon-toxicmutantsofdiphtheriatoxin:CRM45and CRM197.Nucleic Acids Res1984,12 (10) :4063-4069)〇
[0005]制備DT和CRM197 的方法在US4709017、US5843711、US5601827 和US5917017 中得到描述。目前存在用于CRM197的工業(yè)制備的三種不同系統(tǒng)。兩種系統(tǒng)基于感染噬菌 體的白喉棒狀桿菌細胞的使用。最近的開發(fā)由焚光假單胞菌 中的重組表達系統(tǒng)組成。該方法采用在遺傳優(yōu)化的熒光假單胞菌菌株中至周質的分泌方 法，使用配備用于分泌到周質內的信號肽的CRM197基因（US20110287443)。
[0006] 例如，從在好氧條件下在基于酪蛋白氨基酸和酵母提取物的培養(yǎng)基中生長的白喉 棒狀桿菌菌株C7 (B197)和/或白喉棒狀桿菌菌株C7 (B197)pPx350培養(yǎng)物中分離白喉毒 素。培養(yǎng)基組分的調整顯示為改善得率（US4925792、W0 2006 100108)。CRM197或DT從 培養(yǎng)上清液中收獲，并且通過超濾濃縮。硫酸銨沉淀是第一個純化步驟，并且陰離子交換層 析是第二個純化步驟。
[0007] 然而，用于疫苗中的大量的CRM197蛋白質的生產(chǎn)已由于低蛋白質豐度而受阻（TO 2006 100108)。
[0008] 使用不產(chǎn)生毒素的棒狀噬菌體β197的雙重溶素原加強CRM蛋白質生產(chǎn)的技 術已得到開發(fā)（IsolationandcharacterizationofC. diphtheriaenontandem doublelysogenshyperproducingCRM197.RRappuoli,Appl. Environ. Microbiol. S印tember1983 46:560-564 ;頒給R.Rappuoli的美國專利號 4, 925, 792 ;以及 Integrationofcorynebacteriophagesbetatox+，omegatox+，andgammatox-into twoattachmentsitesontheC. diphtheriaechromosome.RRappuoli，JLMichel 和JRMurphyJ你cierioZMarch1983 153:1202-1210)。Rappuoli報告了比來自單 重溶素原高直到三倍的來自雙重和三重溶素原的CRM197得率。通過單重溶素原的CRM197 的生產(chǎn)水平是足夠的，但對于利用CRM197蛋白質的疫苗生產(chǎn)在經(jīng)濟上不能令人滿意。必須 指出為了增加白喉棒狀桿菌中的表達效率的雙重和三重溶素原菌株構建是需要費力的篩 選階段的長期過程。
[0009] 開發(fā)了用于在白喉棒狀桿菌中重組表達CRM197的質粒(美國專利5614382、 1995/5614382 _1997)。這使得能夠增加基因的拷貝數(shù)(高達5-10個/細胞)，而無需選擇 生成多溶素原的細菌菌株。
[0010] 如在被菌體β197tox感染的棒狀桿菌屬（菌株的情況下， CRM197在具有低亞鐵含量的專門培養(yǎng)基中表達。盡管細菌菌株遺傳處理所需的時間量中的 降低，但通過與使用雙重溶素原的比較，CRM197的輸出未顯著增加。
[0011]DT的替代表達宿主細胞包括傷寒沙門氏菌（疫苗株cvd 908-htra(OrrN，GalenJE,LevineMM:Expressionandimmunogenicityofamutant diphtheriatoxinmolecule，CRM197,anditsfragmentsinS. typhivaccinestrain CVD908-htrA.In fee t Immun1999，67 (8) :4290-4294 )。沙門氏菌屬是 革蘭氏陰性菌和與大腸桿菌（AcoJi)相似的表達宿主。來自evd908-htra中的多種構 建體(含、不含信號肽)的表達水平很低，并且可溶性和免疫原性很弱。利用溶血素操縱子的 替代的非Sec依賴性易位系統(tǒng)改善可溶性DT的表達，但水平仍很低。
[0012] 關于在大腸桿菌中生產(chǎn)CRM197的報告顯示可溶性CRM197的低得率和在包涵體 中的不溶性產(chǎn)物的形成。截短方法已用于增強表達至更高水平的嘗試中。（BishaiWR， MiyanoharaA,MurphyJR:CloningandexpressioninE. coliofthreefragments ofdiphtheriatoxintruncatedwithinfragmentB.Journal of Bacteriology 1987,169 (4):1554-1563)。
[0013] 使用含有編碼CRM197的突變白喉毒素基因的CRM197單鏈表達質粒用于在 大腸桿菌中表達（BishaiWR，RappuoliR，MurphyJR:High-levelexpressionofa proteolyticallysensitivediphtheriatoxinfragmentinEscherichia coli. Journal〇/ 你cieriWo# 1987,169 (11) :5140-5151;Bishai1987)。在該出版物中，CRM197的轉錄受內源和組成型Ptox啟動子控制。另外，C末端與α黑色素細胞刺激激素 融合的DT("ΑΒΜ508"）通過用于表達的熱誘導型Ρ?3"ω?1啟動子或Pi3e啟動子進行表達。
[0014]Bishai1987推測由于高水平蛋白質誘導的分泌器官干擾引起在誘導周質DT/ CRM197變體表達后的生長停止。這可以是周質蛋白質表達中的一般問題，其已先前得到 觀察且導致蛋白質的低體積得率（BensonSA，HallMN，SilhavyTJ:Geneticanalysis ofproteinexportinE. coliK12.Annual Review of Biochemistry1985， 54:101-134)。分泌器官的干擾和不溶性蛋白質的形成提示大腸桿菌細胞不能提供CRM197 生物發(fā)生的生產(chǎn)性易位和折疊環(huán)境。
[0015] 因此，Bishai1987推理周質表達將避免易位子干擾。因此，Bishai1987去除用 于將表達導向細胞質內的信號肽。僅在低溫下且當細胞質蛋白酶缺失時，細胞質表達構建 體才的確獲得可溶性產(chǎn)物。在高溫下且當存在蛋白酶時，生產(chǎn)是無效的且導致聚集體。
[0016]Bishai1987未能顯示可溶蛋白質CRM197融合蛋白，即具有用于周質靶向的信號 肽的高水平生產(chǎn)。在考馬斯染色的SDS聚丙烯酰胺凝膠中，含有ABM508表達構建體的提取 物顯示對應于ABM508的強烈蛋白質條帶，而表達CRM197 (所述CRM197從天然啟動子表達 具有野生型信號肽）的細胞未顯示在58kDa的預期大小處關于CRM197的明顯條帶。
[0017] 因此，周質表達不視為有效的生產(chǎn)策略，并且迄今為止不存在對于可溶性和正確 折疊的CRM197或DT生產(chǎn)建立的有效的大腸桿菌周質表達系統(tǒng)。
[0018] 通過用于CRM197的第一種基于大腸桿菌的表達系統(tǒng)提供了生產(chǎn)系統(tǒng)，其基于 包涵體中的不溶性CRM197的細胞質表達，隨后為蛋白質的增溶、純化和重折疊（W02010 150230)。當應用另外的蛋白酶解步驟時，不含另外的氨基酸的野生型CRM197可以僅用這 種系統(tǒng)獲得。
[0019] 信號肽誘導對周質的蛋白質分泌，并且對蛋白質生物發(fā)生具有多種效應。（Powers T，WalterP:Co-translationalproteintargetingcatalyzedbytheE. coli signalrecognitionparticleanditsreceptor.The EMBO Journal1997,16 (16) :4880-4886. )(SchierleCF，BerkmenM，HuberD，KumamotoC，BoydD，BeckwithJ: TheDsbAsignalsequencedirectsefficient,cotranslationalexportofpassenger proteinstotheE. coliperiplasmviathesignalrecognitionparticlepathway. Journal of Bacteriology 2QQ?>,lSh(19) :5706-5713)〇
[0020] 3 概述 本文提供的是在大腸桿菌表達菌株中以高得率(例如至少〇. 5mg/1)產(chǎn)生可溶性、折疊 的全長CRM197的方法。特別地，信號肽用于指導蛋白質分泌到周質空間內。
[0021] 本文提供的是用于產(chǎn)生CRM197的方法，其中該方法包括培養(yǎng)包含編碼CRM197的 核酸的大腸桿菌細胞，其中CRM197融合至異源信號肽，所述異源信號肽將CRM197靶向大腸 桿菌細胞的周質。在更特定的實施方案中，CRM197的野生型信號肽已缺失。在甚至更特定 的實施方案中，CRM197的野生型信號肽已替換為異源信號肽。異源信號肽可以選自來自下 述的信號肽：大腸桿菌不耐熱腸毒素、大腸桿菌外膜孔蛋白（OmpA)、大腸