本發(fā)明屬于生物與醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種核酸適配體-多肽復合物探針及其制備方法和應用。

背景技術(shù)：

her2(也被稱為neu、erbb-2、cd340和p185)是一種在her2陽性乳腺癌細胞中呈過表達狀態(tài)的跨膜受體蛋白。her2的過表達可以增強癌細胞的侵襲性、生存能力和再生能力。到目前為止，許多證據(jù)表明早期診斷并及時輔以相應的治療(如赫賽汀(曲妥珠單抗))能夠很好地控制her2陽性乳腺癌的發(fā)展。

現(xiàn)有的一些技術(shù)如蛋白分子印跡(westernblotting)、酶聯(lián)免疫吸附法(elisa)、免疫組織化學(ihc)、熒光原位雜交(fish)等能夠檢測到乳腺癌中her2的表達情況，其中用免疫組織化學(ihc)檢測her2蛋白過表達以及用熒光原位雜交(fish)檢測her2基因擴增已經(jīng)通過了美國食品與藥品監(jiān)督管理局(fda)的審核認證。雖然所有這些方法都能提供關(guān)于her2表達水平的有價值的信息，但是這些大多數(shù)依賴于抗體的技術(shù)，限于抗體的局限性往往缺乏必要的特異性和可重復性，而且在her2基因沒有擴增的情況下，her2蛋白也會存在過表達的情況。在這樣的背景下，一種能在某些領(lǐng)域替代抗體作用的新型分子“核酸適配體”出現(xiàn)了，核酸適配體(aptamer)是通過selex技術(shù)(指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進化技術(shù))篩選出來的單鏈dna分子或rna分子，這類分子獨特的三級結(jié)構(gòu)使其具有易于合成、批次差異小、親和力高、特異性好等特點。

近年來，幾種以her2蛋白為靶標的核酸適配體陸續(xù)被篩選出來，其中，核酸適配體hb5是一種由86個核苷酸堿基構(gòu)成的dna分子，它與her2蛋白胞外結(jié)構(gòu)域上表位多肽結(jié)合的平衡解離常數(shù)(kd)值為18.9nm，與her2蛋白胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合的平衡解離常數(shù)(kd)值為316nm。先前的研究也表明使用hb5比使用抗her2的抗體能觀察到更強的膜染色，尤其是對于一些處理復雜的樣品而言效果更明顯。此外，與抗體相比，hb5對her2陽性乳腺癌細胞有著更好的選擇性。然而，迄今為止發(fā)展出來的檢測技術(shù)大多都依賴于熒光或者電化學傳感平臺。眾所周知，熒光分子往往缺乏耐光性和足夠的發(fā)射強度，而使用熒光的實驗十分依賴于主觀判斷，這常常導致染色強度和程度的統(tǒng)一性判斷仍處于較低水平。近年來，電化學檢測已經(jīng)展露出它的潛能，然而人們對于將核酸適配體固定在電極薄膜表面、微觀環(huán)境對適配體結(jié)構(gòu)的影響以及適配體-配體相互作用的認識研究仍然十分匱乏。更重要的是，大多數(shù)發(fā)展出來的方法提供的定量數(shù)據(jù)十分有限。

近年來，基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學技術(shù)在蛋白質(zhì)分析領(lǐng)域越來越受歡迎，而作為公認的方法之一，基于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(lc-ms/ms)的定向蛋白質(zhì)組學技術(shù)在定量蛋白時具有高靈敏度、高選擇性以及較寬的動態(tài)范圍的特點，這種技術(shù)實現(xiàn)定向分析的關(guān)鍵部分在于在多肽水平特異性檢測和確定目標蛋白。通過目標蛋白的酶解得到能夠代表目標蛋白的特征多肽，然后使用選擇反應檢測(srm)或多反應監(jiān)測(mrm)來檢測特征多肽，從而定量目標蛋白。然而，直接應用常規(guī)的定向蛋白質(zhì)組學方法定量，如her2蛋白這樣的跨膜蛋白，會遇到一些特殊的困難，這主要來源于膜蛋白的疏水性和對蛋白水解的天然抵制，此外較低的溶解度以及較低的酶解效率可能是另一個混雜因素。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

解決的技術(shù)問題：本發(fā)明提供一種可用于檢測乳腺癌細胞表面以及乳腺癌組織中her2蛋白含量的探針及其制備方法和應用。

技術(shù)方案：核酸適配體-多肽復合物探針，結(jié)構(gòu)如下所示：

其中r1為核酸適配體，r2為底物多肽；

上述核酸適配體為hb5：

aaccgcccaaatccctaagagtctgcacttgtcattttgtatatgtatttggtttttggctctcacagacacactacacacgcaca

上述底物多肽為：

gdkavlgvdpfr。

核酸適配體-多肽復合物探針的制備方法，制備步驟為：按比例，以磷酸三氯乙酯為還原劑，100μl濃度為20μm的二硫鍵修飾的核酸適配體hb5與50μl的tcep還原珠混合，在37℃反應振搖2h；然后將樣品1000×g離心5min；取上述制備的含有還原了的hb5的上清液，在上清中加入相同體積的200μm的馬來酰亞胺修飾的底物多肽，37℃振蕩4h進行共軛反應，使用高效液相色譜對反應產(chǎn)物進行純化，去除多余的核酸適配體hb5和底物多肽。

上述核酸適配體-多肽復合物探針在制備檢測乳腺癌細胞表面以及組織中her2蛋白含量產(chǎn)品中的應用。

檢測乳腺癌細胞表面以及組織中her2蛋白含量的試劑盒，含有上述的核酸適配體-多肽復合物探針。

本發(fā)明通過使用一種新的核酸適配體-多肽復合物探針，定向蛋白質(zhì)組學中特征多肽的思想可以被很好的保留下來。核酸適配體-多肽復合物探針是由核酸適配體和多肽兩種分子共價結(jié)合形成的，核酸適配體可以緊密地結(jié)合her2蛋白，底物多肽包含報告多肽以及報告多肽前的胰蛋白酶切割位點。在酶切之后，報告多肽被釋放并且最終使用液相質(zhì)譜串聯(lián)技術(shù)(lc-ms/ms)定量檢測。通過這個方法，her2蛋白信號可以被轉(zhuǎn)換成報告多肽的水平。需要特別指出的是，合適的底物多肽、報告多肽以及核酸適配體首次被應用于核酸適配體-多肽復合物探針的制備。在對新合成探針的結(jié)合效率、穩(wěn)定性、親和力、特異性和酶解效率進行表征之后，我們還對探針結(jié)合條件以及胰蛋白酶酶切條件進行了優(yōu)化。最后，我們對準定向蛋白質(zhì)組學方法進行了方法學驗證，并將其應用于her2陽性乳腺癌細胞(bt474和sk-br-3)、her2陰性乳腺癌細胞(mda-mb-231和mcf-7)以及36對人類乳腺原發(fā)腫瘤組織及其對應癌旁組織中her2蛋白表達水平的檢測。

有益效果：1)本發(fā)明所述的核酸適配體-多肽復合物探針，可化學合成，穩(wěn)定性好；2)本發(fā)明首次將合適的底物多肽、報告多肽以及核酸適配體應用于核酸適配體-多肽復合物探針的制備；3)本發(fā)明所述的核酸適配體-多肽復合物探針制備方法簡單易行，利用的是多肽氨基端修飾的馬來酰亞胺與核酸適配體5’末端修飾的巰基發(fā)生邁克爾加成反應，屬于共價連接，反應速率高，耗時短，產(chǎn)物的純度和產(chǎn)率較高，可直接用于細胞和組織試驗；4)本發(fā)明所述的核酸適配體-多肽復合物探針與her2表位肽有較好的親和力，能夠特異性識別her2表位肽以及乳腺癌細胞和組織上的her2蛋白；5)本發(fā)明首次將核酸適配體技術(shù)與定向蛋白質(zhì)組學技術(shù)結(jié)合，將核酸適配體識別靶標的高特異性、高親和力與定向蛋白質(zhì)組學技術(shù)檢測的高靈敏度、高選擇性以及較寬的動態(tài)范圍結(jié)合起來，發(fā)展了一種全新的準定向蛋白質(zhì)組學定量方法。6)本發(fā)明所述的準定向蛋白質(zhì)組學定量方法能準確檢測her2陽性乳腺癌細胞(bt474和sk-br-3)以及her2陰性乳腺癌細胞(mda-mb-231和mcf-7)表面的her2蛋白含量。7)本發(fā)明所述的準定向蛋白質(zhì)組學定量方法能準確定量乳腺癌組織切片上的her2含量，客觀的定量數(shù)據(jù)很好地彌補了傳統(tǒng)免疫組織化學ihc判定的主觀性，具有發(fā)展成為her2陽性乳腺癌精確診斷依據(jù)的潛力。8)本發(fā)明所述的準定向蛋白質(zhì)組學定量方法理論上可以定量絕大多數(shù)類型的細胞膜蛋白，前提是能篩選出目標膜蛋白對應的核酸適配體以及優(yōu)化對應的反應條件。

附圖說明

圖1為本發(fā)明中核酸適配體-多肽復合物探針的制備及其與準定向蛋白質(zhì)組學結(jié)合檢測her2蛋白新方法的流程示意圖；

圖2為本發(fā)明中報告多肽avlgvdpfr及其對應同位素內(nèi)標多肽av*lgv*dpfr的lc/ms/ms圖譜，其中a：報告多肽avlgvdpfr的子離子圖譜；b：報告多肽avlgvdpfr的液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用色譜圖以及相應同位素內(nèi)標的色譜圖；

圖3-1為本發(fā)明中合成核酸適配體-多肽復合物探針的原理圖；

圖3-2為預測的核酸適配體hb5的二級結(jié)構(gòu)圖；

圖4-1為本發(fā)明中核酸適配體hb5和底物多肽gdkavlgvdpfr在反應前后的高效液相色譜圖，其中a：核酸適配體hb5和底物多肽gdkavlgvdpfr在反應前和反應后在dna的紫外吸收波長260nm處的高效液相色譜圖；b：核酸適配體hb5和底物多肽gdkavlgvdpfr在多肽的紫外吸收波長220nm處的高效液相色譜圖；

圖4-2為本發(fā)明中核酸適配體-多肽復合物以及單獨的核酸適配體用lcqdecaxpplus離子阱質(zhì)譜在電噴霧正離子模式下檢測得到的質(zhì)譜圖，其中a：核酸適配體電噴霧離子源質(zhì)譜圖；b：核酸適配體-多肽復合物探針電噴霧離子源質(zhì)譜圖；

圖4-3為本發(fā)明中核酸適配體-多肽復合物探針在酶切前和酶切后的高效液相色譜圖和液質(zhì)聯(lián)用色譜圖，其中a：核酸適配體-多肽復合物探針在酶切前和酶切后于dna紫外吸收波長260nm處的高效液相色譜圖；b：核酸適配體-多肽復合物探針在酶切前和酶切后于特征mrm通道m(xù)/z487.3→m/z419.3上的液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用色譜圖；

圖5-1為本發(fā)明中核酸適配體-多肽復合物探針在37℃的穩(wěn)定性；

圖5-2為本發(fā)明中核酸適配體-多肽復合物探針以及fitc熒光修飾的核酸適配體hb5對her2表位肽(incthscvdlddkgcpaeqr)的親和力實驗；

圖6為本發(fā)明中闡述的新方法所使用的her2表位肽標準品的標準曲線(從10pm到100nm)；

圖7為本發(fā)明酶切過程中，胰酶的濃度和酶切時間對細胞活性的影響考察實驗，其中a：sk-br-3細胞的顯微鏡下圖；b：bt474細胞的顯微鏡下圖；c：溫度37℃、反應時間30min不變，逐步升高胰蛋白酶濃度時細胞的活性變化；d：溫度37℃和胰酶濃度10μg/ml不變，觀察0-120min經(jīng)歷不同反應時間細胞活性的變化；

圖8-1為使用本發(fā)明中闡述的新方法檢測得到的her2陽性乳腺癌細胞bt474和sk-br-3以及her2陰性乳腺癌細胞mda-mb-231和mcf-7中her2蛋白的表達水平；

圖8-2為her2抗體赫賽汀對本發(fā)明中核酸適配體-多肽復合物探針檢測her2時的競爭性抑制效果；

圖9為使用本發(fā)明中闡述的新方法檢測36對乳腺組織切片樣品中her2蛋白的表達量，其中癌旁正常組織只展示了與her2(3+)乳腺癌組織對應的癌旁組織的數(shù)據(jù)；

圖10為典型的her2陰性、her2(+)、her2(2+)和her2(3+)乳腺腫瘤的免疫組織化學圖，以及對應的用本發(fā)明闡述的新方法檢測得到的多肽質(zhì)譜響應圖。

具體實施方式

以下實施例進一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改和替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。

實施例1核酸適配體-多肽復合物探針的合成及鑒定

(1)核酸適配體-多肽復合物探針的制備和純化

以磷酸三氯乙酯(tcep)為還原劑，100μl濃度為20μm的二硫鍵修飾的核酸適配體hb5

(aaccgcccaaatccctaagagtctgcacttgtcattttgtatatgtatttggtttttggctctcacagacacactacacacgcaca)與50μl的tcep還原珠混合，在37℃反應振搖2h。然后將樣品1000×g離心5min。取含有還原了的hb5的上清液，在上清中加入相同體積的200μm的馬來酰亞胺修飾的底物多肽(gdkavlgvdpfr)，37℃、劇烈振蕩4h進行共軛反應，緊接著利用共軛前后保留時間的不同(核酸適配體以及核酸適配體-多肽復合物的保留時間分別是14.0min和16.9min，如圖4-1a)使用半制備的高效液相色譜對反應產(chǎn)物進行純化，去除多余的未反應hb5和底物多肽，純化后產(chǎn)物的純度通過hplc進行純度鑒定，純度在98％以上。為了排除由于肽段共出峰可能造成的干擾，其余條件不變，用檢測肽段的波長(220nm)對核酸適配體-多肽復合物進行檢測，如圖4-1b所示，肽段沒能從色譜柱中洗脫出來。

(2)核酸適配體-多肽復合物探針的結(jié)構(gòu)鑒定

新合成的核酸適配體-多肽復合物首先經(jīng)過lcqdecaxpplus離子阱質(zhì)譜分析進行驗證(如圖4-2)，核酸適配體增加的分子量與底物多肽的分子量相匹配。新合成的探針還通過用胰蛋白酶酶切來表征，酶切釋放的核苷酸和多肽分別用高效液相色譜(hplc)和液相質(zhì)譜聯(lián)用(lc-ms/ms)進行檢測。正如預期的那樣，在酶切之后出現(xiàn)了新的色譜峰(如圖4-3)。需要指出說明的是新色譜峰的保留時間(如hplc上的8.81min以及l(fā)c-ms/ms上的3.28min)與用于共軛反應的核酸適配體的保留時間(14.0min)以及底物多肽的保留時間(3.07min)不完全一致。保留時間的遷移主要是由于三個氨基酸殘基從底物多肽上脫落，并裝載到了核酸適配體上。所以，實際上酶切后我們檢測到的是hb5-gdk和avlgvdpfr(報告多肽)。最后測得核酸適配體-多肽復合物探針的酶切效率為94.38±1.49％，與底物多肽單獨酶切的效率(95.8±2.6％)相比，差別無統(tǒng)計學意義，表明探針的核酸部分不會對胰蛋白酶的酶切產(chǎn)生影響。

(3)核酸適配體-多肽復合物探針的性質(zhì)鑒定

a)穩(wěn)定性

將約200μl制備好的核酸適配體-多肽復合物探針(約2μm)加入到200μl的結(jié)合緩沖液中，結(jié)合緩沖液的成分是磷酸鹽緩沖液(pbs)外加5mmmgcl2、4.5g/l葡萄糖、0.1mg/ml鮭魚精dna和1mg/ml牛血清蛋白?；旌衔镌?7℃反應12個小時，并用高效液相色譜在0h、0.5h、1h、2h、4h、8h和12h七個時間點監(jiān)測探針濃度。如圖5-1所示，在37℃條件下孵育12h對探針穩(wěn)定性的影響微乎其微。

b)親和力

200μl的珠子加入到200μl包含100μm的生物素化her2表位肽的pbs中，在37℃孵育振搖2小時。用pbs沖洗三次后，將珠子與各種不同濃度的核酸適配體-多肽復合物探針(200μl的結(jié)合緩沖液中含有5nm、10nm、20nm、40nm、80nm、160nm的探針)在37℃中孵育2.5h。然后，用500μl的pbs沖洗三遍去除未結(jié)合的探針，通過胰蛋白酶酶切結(jié)合了探針的珠子，使報告多肽釋放出來，用質(zhì)譜檢測響應。使用以下方程計算kd值：y＝bmaxx/(kd+x)，其中x是加入探針的濃度，y是計算出來多肽的含量，bmax是最大結(jié)合容量。如圖5-2所示，測得核酸適配體-多肽復合物探針對靶標her2表位肽的平衡解離常數(shù)(kd)值為64.1nm，與單獨核酸適配體對her2表位肽的kd值29.5nm相比，親和力下降了2.2倍，但這個親和力水平還是能夠滿足分析要求的。

實施例2用核酸適配體-多肽復合物探針檢測乳腺癌細胞表面的her2蛋白含量

為了防止對細胞表面的蛋白質(zhì)造成損傷，我們使用無酶細胞消化液分別收集狀態(tài)良好的her2陽性乳腺癌細胞(bt474和sk-br-3)以及her2陰性乳腺癌細胞(mda-mb-231和mcf-7)。細胞在pbs沖洗三次后，用200μl的結(jié)合緩沖液進行封閉，封閉溫度37℃，時間30min。然后在細胞數(shù)約為1×10⁶的細胞中加入200μl的濃度為1μm的探針，混合物在37℃中振搖反應2.5小時。反應結(jié)束后用500μl冷的pbs沖洗細胞三次洗去未結(jié)合的探針，再用100μl濃度為50mm的碳酸氫銨溶液沖洗細胞兩次。然后用表層酶切(或限制性酶解)技術(shù)主要用于從生物樣品中釋放報告多肽，對于已經(jīng)結(jié)合了探針的細胞樣品，將測序級的胰蛋白酶與細胞懸液(約10⁶個細胞)在最佳條件下孵育，然后樣品被轉(zhuǎn)移到冰上，用離心機2,000×g，4℃離心10min。取上清放入新的管中，用20,000×g，4℃離心10min。取上清，在上清中再加入2μg胰蛋白酶，然后讓樣品在37℃反應24h。通過加入10μl的濃度0.1％的三氟乙酸溶液終止酶切反應，然后加入20μl濃度為5nm的內(nèi)標溶液。接著將混合物轉(zhuǎn)移到一個微型c18除鹽柱中，除鹽柱預先使用100μl的乙腈和100μl的水進行活化，裝載了樣品中的多肽之后，用100μl含有0.1％三氟乙酸的5％乙腈溶液沖洗，再用100μl的含有0.1％甲酸的80％乙腈溶液洗脫裝載的多肽，最后進行質(zhì)譜檢測。

胰蛋白酶的濃度和酶切的時間都經(jīng)過了調(diào)整優(yōu)化，具體來說，我們評估了10min到120min里5個時間點以及5μg/ml到100μg/ml之間6個濃度點，結(jié)果表明，在20μg/ml胰蛋白酶濃度條件下孵育30min，活細胞數(shù)目仍能保持在一個穩(wěn)定的水平(見圖7)。

用本發(fā)明中的準定向蛋白質(zhì)組學方法測得her2蛋白在bt474細胞中的準確含量為(8.37±2.19)×10⁵/cell，在sk-br-3細胞中含量為(7.86±1.57)×10⁵/cell，在mcf-7細胞中含量為(0.47±0.14)×10⁵/cell，在mda-mb-231細胞中含量為(0.45±0.08)×10⁵/cell(見圖8-1)。為了進一步證明這種準定向蛋白質(zhì)組學方法的定量能力，我們用赫賽汀(曲妥珠單抗)進行了her2蛋白競爭性結(jié)合實驗。赫賽汀是一種人源的單克隆抗體，與核酸適配體hb5一樣，能夠結(jié)合在her2蛋白胞外結(jié)構(gòu)域的第四區(qū)域，所以它可以在一定程度上競爭性地抑制核酸適配體hb5與her2蛋白的結(jié)合。如圖8-2所示，用赫賽汀進行預處理之后，有效封閉了結(jié)合位點，抑制了核酸適配體-多肽復合物探針與her2的結(jié)合。意料之中的是少量的her2仍然能夠被檢測到，這是由于結(jié)合位點空間位阻作用導致的，這種作用限制了抗體結(jié)合抗原的數(shù)量，造成了不完全封閉。相比之下，預先用過量胰蛋白酶處理可以完全去除her2表位肽，也就檢測不到信號了。

實施例3用核酸適配體-多肽復合物探針檢測乳腺癌組織切片上的her2蛋白含量

將36對人類乳腺原發(fā)腫瘤組織及其對應癌旁組織放在事先用100％的酒精和100％的甲醇處理過的凍結(jié)切片機上切成6μm的組織切片，將200μl的結(jié)合緩沖液滴在組織切片上，于37℃輕微搖晃1h，之后用結(jié)合緩沖液沖洗組織切片三遍。然后，加入200μl含有200pmol探針的結(jié)合緩沖液，在37℃孵育2.5h。最后，組織切片用pbs沖洗三遍，用濃度為50mm的碳酸氫銨溶液沖洗兩遍。用胰蛋白酶與裝載了探針的切片進行孵育，用離心管收集反應后溶液。在20,000×g，4℃離心10min之后，在離心管中加入2μg的胰蛋白酶，然后在37℃環(huán)境下反應24小時，加入10μl的0.1％三氟乙酸溶液終止酶切反應。最后，在樣品中加入20μl的內(nèi)標溶液進質(zhì)譜檢測。

圖9展示了用本發(fā)明所述的準定向蛋白質(zhì)組學方法檢測的結(jié)果，我們也用免疫組織化學檢測對每個組織樣本進行0～3+的評分(如圖10)，雙向的曼-惠特尼(mann-whitney)檢驗顯示除了her2(2+)組和her2(3+)組之間沒有統(tǒng)計學差異之外，其他各組之間均有統(tǒng)計學差異(p<0.005)。檢測可知正常癌旁組織中her2的參考值范圍是5.30(90％ci，3.61-6.99)nmol/m²到12.0(90％ci，10.3-13.7)nmol/m²，而癌組織her2-、her2+、her2++、her2+++四組中分別有9個、2個、1個、0個樣本的檢測結(jié)果在正常值范圍內(nèi)，表明免疫組織化學這種檢測方法存在假陽性結(jié)果的問題。而用本研究的準定向蛋白質(zhì)組學定量方法則能使測得的數(shù)據(jù)更加精確，更能滿足精確診斷的要求，更容易應用于her2評分參考范圍的建立以及進一步的分層。

以上實例只為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點，其目的在于讓熟悉此項技術(shù)的人是能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實施，并不能以此限制本發(fā)明的保護范圍。凡根據(jù)本發(fā)明精神實質(zhì)所做的等效變換或修飾，都應涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>南京醫(yī)科大學

<120>核酸適配體-多肽復合物探針及其制備方法和應用

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