本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于識(shí)別Gremlin-1的核酸適配子及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

Gremlin-1是一種高度保守的，含184個(gè)氨基酸，可糖基化和磷酸化的分泌型蛋白質(zhì)。Gremlin-1可與骨形態(tài)形成蛋白(Bone morphogenetie protein，BMP)2、BMP4、BMP7，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2(VEGFR-2)，YWHAH和Slit蛋白結(jié)合，影響其生物學(xué)作用。Gremlin-1在胚胎發(fā)育、肢體形成、腎臟、肺臟等器官的發(fā)育過(guò)程中起著非常重要的作用。在個(gè)體發(fā)育完善后其表達(dá)逐漸減少，但是在有些病理過(guò)程如糖尿病腎病、特發(fā)性肺纖維化、青光眼等疾病中都能發(fā)現(xiàn)Gremlin-1表達(dá)的增高，且被證實(shí)Gremlin-1在這些疾病中有明顯的促纖維化作用。同時(shí)，Gremlin-1與很多惡性腫瘤的發(fā)生都有關(guān)系，如宮頸癌，肺癌等。

SELEX技術(shù)即指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(SystematicEv olution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX)。利用該技術(shù)可以從隨機(jī)單鏈核酸序列庫(kù)中篩選出特異性與靶物質(zhì)高度親和的核酸適配體(Aptamer)。它的基本思想是：體外化學(xué)合成一個(gè)單鏈寡核苷酸庫(kù)，由于每個(gè)不同序列的單鏈核酸可以自身折疊形成特異的二級(jí)結(jié)構(gòu)，不同二級(jí)結(jié)構(gòu)的單鏈核酸就有可能與不同靶分子或一個(gè)靶分子中的不同位點(diǎn)依照熱力學(xué)原理結(jié)合，從而篩選出與靶分子結(jié)合的短鏈核酸即特異的適配子。核酸適配子能與多種目標(biāo)物質(zhì)高特異性、高選擇性地結(jié)合，因此在生物傳感器研究、疾病診斷、治療等方向有廣闊的應(yīng)用前景。核酸適配子在親和力和特異性方面可與抗體媲美，并且具有抗體所不具備的其他一些優(yōu)點(diǎn)，如篩選周期短，能應(yīng)用于大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)；生產(chǎn)成本低，穩(wěn)定性好，重復(fù)性強(qiáng)，生產(chǎn)中很少存在批次間的差異；沒(méi)有免疫原性，沒(méi)有毒性和明顯的副作用；易于化學(xué)修飾，可以在合成時(shí)精確、定點(diǎn)連接其他功能基團(tuán)和分子，如巰基、氨基和熒光素、生物素、酶或金屬微粒等。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種用于識(shí)別Gremlin-1的核酸適配子及其應(yīng)用。

本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：

本發(fā)明公開(kāi)了一種用于識(shí)別Gremlin-1的核酸適配子，該核酸適配子命名為G-ap49，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

在所述核酸適配子G-ap49的核苷酸的5′端帶有生物素標(biāo)簽。

所述核酸適配子G-ap49不帶固定序列的結(jié)構(gòu)為：

所述核酸適配子G-ap49能特異性識(shí)別Gremlin-1全長(zhǎng)。

本發(fā)明還公開(kāi)了上述核酸適配子在制備識(shí)別Gremlin-1的檢測(cè)試劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明還公開(kāi)了上述核酸適配子在制備識(shí)別Gremlin-1的檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。

本發(fā)明還公開(kāi)了含有上述核酸適配子的檢測(cè)試劑。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果：

本發(fā)明公開(kāi)了一種識(shí)別蛋白質(zhì)Gremlin-1的核酸適配子序列，通過(guò)SELEX方法成功篩選了特異性識(shí)別蛋白質(zhì)Gremlin-1全長(zhǎng)的核酸適配子。經(jīng)過(guò)生物素標(biāo)記后的核酸適配子可以應(yīng)用于核酸蛋白質(zhì)印跡(South-Western blotting)、基于適配子的酶聯(lián)吸附試驗(yàn)(ELAA)、細(xì)胞及組織化學(xué)染色(Aptamer-based histochemistry and cytochemistry)。結(jié)果表明，大量制備的核酸適配子G-ap49可以特異性識(shí)別Gremlin-1。因此，G-ap49有望被開(kāi)發(fā)為Gremlin-1的體外檢測(cè)試劑盒，且可能具有較高的特異性及靈敏性。

附圖說(shuō)明

圖1為篩選的核酸適配子G-ap49與重組人Gremlin-1親和力結(jié)果；

圖2為不帶固定序列的G-ap49預(yù)測(cè)的二級(jí)結(jié)構(gòu)圖；

圖3為G-ap49與重組人Gremlin-1特異性結(jié)合的Dot-blot印跡圖；

圖4為G-ap49結(jié)合重組人Gremlin-1的解離常數(shù)分析圖；

圖5為G-ap49分別與重組人Gremlin-1和小鼠纖維化肺組織所做的South-Westren blot圖；其中，(a)為G-ap49與重組人Gremlin-1；(b)為G-ap49與小鼠纖維化肺組織；

圖6為G-ap49穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果；

圖7-1，圖7-2分別為改變G-ap49濃度，改變重組人Gremlin-1濃度所做的基于適配子的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)；

圖8為G-ap49用小鼠纖維化肝組織切片所做的組織化學(xué)染色；其中，A為normal rabbit IgG；B為anti-Gremlin-1Ab；C為ssDNA library；D為G-ap49；

圖9為G-ap49用轉(zhuǎn)染了重組質(zhì)粒PEGFP-C2-hGremlin-1或PEGFP-C2的HEK293細(xì)胞爬片所做的細(xì)胞化學(xué)染色。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明通過(guò)SELEX技術(shù)，成功篩選了識(shí)別重組人Gremlin-1的核酸適配子。人工合成的隨機(jī)單鏈DNA文庫(kù)通過(guò)SELEX方法篩選出與重組人Gremlin-1特異性結(jié)合的單鏈DNA，經(jīng)測(cè)序獲得該單鏈DNA序列后，通過(guò)人工合成大量制備，并進(jìn)行生物素標(biāo)記。結(jié)果表明帶有生物素標(biāo)簽的核酸適配子可以特異性的識(shí)別重組人Gremlin-1，可以應(yīng)用于核酸蛋白質(zhì)印跡(South-Western blotting)、基于適配子的酶聯(lián)吸附試驗(yàn)(ELAA)、細(xì)胞及組織化學(xué)染色(Aptamer-based histochemistry and cytochemistry)。下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定。

一、SELEX技術(shù)篩選核酸適配子

1、隨機(jī)單鏈DNA(ssDNA)文庫(kù)的構(gòu)建和引物合成

1)構(gòu)建并人工合成長(zhǎng)度為76個(gè)堿基(nt)的隨機(jī)ssDNA文庫(kù)，兩端為18個(gè)堿基的固定序列，中間為40個(gè)堿基的隨機(jī)序列，文庫(kù)容量大約為10¹⁵～10¹⁶(Takara公司，大連，中國(guó))。

5′–GGACAAGAATCACCGCTC–N40–CGTACAGGAGGCATACAG–3′

2)合成引物：

上游引物：5′–GGACAAGAATCACCGCTC–3′

下游引物：5′–CTGTATGCCTCCTGTACG–3′

2、微孔板為介質(zhì)的SELEX篩選

1)微孔板包被方法：將重組人Gremlin-1(R&D生物科技有限公司,明尼阿波里斯市,美國(guó))按50ng/孔溶于50mM碳酸鹽緩沖液(pH 9.6)，100μl/孔包被于Nunc 96孔酶聯(lián)板上，4℃過(guò)夜，3％牛血清白蛋白(BSA)(SHMCK緩沖液配制：20mM Hepes，120mM NaCl，5mM KCl，1mM MgCl2，1mM CaCl2，pH 7.4)封閉，37℃2小時(shí)，備用，同時(shí)包被不加重組人Gremlin-1，只用3％BSA封閉的微孔，備用。

2)SELEX篩選方法：

a)取200ng文庫(kù)ssDNA溶于100μl SHMCK緩沖液。將ssDNA 95℃熱變性10分鐘，立即冰浴10分鐘，室溫下放置10分鐘。復(fù)性的ssDNA溶液中加入酵母tRNA(終濃度100μg/ml)及BSA(1mg/ml)。酵母tRNA及BSA用于去除文庫(kù)中與其結(jié)合的ssDNA。

b)將以上混合溶液先加入BSA包被的微孔內(nèi)，37℃孵育1小時(shí)，反篩去除與BSA結(jié)合的ssDNA。然后，將孔內(nèi)液體轉(zhuǎn)移至重組人Gremlin-1包被孔，37℃孵育1小時(shí)。棄去微孔中液體，用含有0.05％Tween-20的SHMCK緩沖液(SHMCKT)洗滌微孔，洗3遍，每次5分鐘，洗去未結(jié)合的ssDNA。

c)微孔內(nèi)加入洗脫緩沖液(7M尿素，0.5M NH4Ac，1mM EDTA，0.2％SDS)，95℃孵育10分鐘。洗脫下來(lái)的與Gremlin-1結(jié)合的ssDNA，經(jīng)酚-氯仿抽提，乙醇沉淀，溶解于20μl TE緩沖液中(10mM Trise-HCl,1mM EDTA,pH8.0)。

d)對(duì)稱(chēng)PCR方法擴(kuò)增篩選獲得的ssDNA，PCR產(chǎn)物為雙鏈DNA(dsDNA)，對(duì)稱(chēng)PCR體系為：

對(duì)稱(chēng)PCR反應(yīng)條件為：

94℃預(yù)變性5分鐘，95℃變性30秒，59℃退火30秒，72℃延伸30秒，反應(yīng)15個(gè)循環(huán)，72℃10分鐘。

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit將dsDNA回收，溶解于20μl TE緩沖液中。

e)不對(duì)稱(chēng)PCR方法獲得ssDNA，不對(duì)稱(chēng)PCR體系為：

不對(duì)稱(chēng)PCR反應(yīng)條件為：

94℃預(yù)變性5分鐘，95℃變性30秒，51℃退火30秒，72℃延伸30秒，反應(yīng)15個(gè)循環(huán)，72℃10分鐘。

不對(duì)稱(chēng)PCR產(chǎn)物經(jīng)10％變性丙烯酰胺膠(SDS-PAGE)電泳，銀染分析ssDNA條帶。切下含有ssDNA條帶的丙烯酰胺膠，經(jīng)Column PAGE Oligo Gel DNA Extraction Kit回收ssDNA?；厥盏膕sDNA以吸光度OD260/280定量，用于下一輪篩選。

f)按照上述篩選方法，篩選15輪后獲得的ssDNA經(jīng)對(duì)稱(chēng)PCR方法獲得dsDNA。dsDNA與pGEM-T easy載體連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α細(xì)胞。轉(zhuǎn)化后挑取50個(gè)克隆，提質(zhì)粒。

3)以含有所篩核酸適配子候選序列的T載體質(zhì)粒為模板，不對(duì)稱(chēng)PCR方法獲得帶有生物素標(biāo)簽的ssDNA(biotin-ssDNA)，不對(duì)稱(chēng)PCR體系為：

不對(duì)稱(chēng)PCR反應(yīng)條件為：

94℃預(yù)變性5分鐘，95℃變性30秒，51℃退火30秒，72℃延伸30秒，反應(yīng)15個(gè)循環(huán)，72℃10分鐘。

4)核酸適配子與重組人Gremlin-1的親和力檢測(cè)

a)biotin-ssDNA按上述方法回收?；厥盏腷iotin-ssDNA(100nM)溶于100μl SHMCK緩沖液。將ssDNA95℃熱變性10分鐘，立即冰浴10分鐘，室溫下放置10分鐘。

b)復(fù)性后的biotin-ssDNA分別加入BSA包被的微孔及重組人Gremlin-1包被的微孔內(nèi)，37℃孵育1小時(shí)。棄去微孔中液體，用SHMCKT洗滌微孔，洗3遍，洗去未結(jié)合的ssDNA。

c)在上述每孔中加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素(HRP-streptavidin，1：2000，SHMCK稀釋)100μl，37℃孵育1小時(shí)。棄去微孔中液體，用SHMCKT洗滌微孔，洗3遍，顯色。

d)利用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)為450nm條件下進(jìn)行分析。

e)親和力檢測(cè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，從50個(gè)克隆中最終選出親和力排前10的候選適配子進(jìn)行測(cè)序，RNA Structure v3.5軟件進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析。

測(cè)序結(jié)果顯示，4個(gè)候選適配子(G-ap32,G-ap39,G-ap48,G-ap49)序列類(lèi)似，僅個(gè)別核苷酸不同，其余6個(gè)序列各不相同，而這4個(gè)候選適配子中，G-ap49在預(yù)測(cè)的二級(jí)結(jié)構(gòu)中自由能最低，穩(wěn)定性最好，故選擇G-ap49進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)(如圖1)。同時(shí)二級(jí)結(jié)構(gòu)顯示，G-ap49可以折疊成由胸腺嘧啶(T)連接的具有兩個(gè)頸-環(huán)的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)(如圖2)，這與文獻(xiàn)報(bào)道的其他適配子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)一致。

2、以斑點(diǎn)印跡實(shí)驗(yàn)(Dot-blot)驗(yàn)證G-ap49與Gremlin-1結(jié)合的特異性

1)重組人Gremlin-1及BSA分別點(diǎn)在PVDF膜上，每個(gè)斑點(diǎn)為200ng重組人Gremlin-1或BSA。10％脫脂奶粉(PBST稀釋)封閉。

2)人工合成5′端帶有生物素標(biāo)簽(Takara，大連，中國(guó))的不帶固定序列的G-ap49。將G-ap49 95℃熱變性10分鐘，立即冰浴10分鐘，室溫下放置10分鐘。復(fù)性后的G-ap49與帶有重組人Gremlin-1或BSA的PVDF膜孵育(80nM)，37℃孵育1小時(shí)。

3)PBST洗膜，每5分鐘一次，洗3遍。然后用PBST稀釋后的HRP-streptavidin(1:2000)與膜孵育，37℃孵育1小時(shí)。PBST洗膜，每5分鐘一次，洗3遍。

4)ECL(enhanced chemiluminescence)顯影。

如圖3，不帶固定序列的G-ap49與重組人Gremlin-1結(jié)合顯示出斑點(diǎn)，且與BSA不顯示斑點(diǎn)。證明不帶固定序列的G-ap49與Gremlin-1也有很高的親和力。

3、G-ap49的解離常數(shù)(Kd)分析

1)微孔板包被方法：同篩選過(guò)程

2)解離常數(shù)分析方法：

a)將帶有生物素標(biāo)記的G-ap49以SHMCK緩沖液稀釋成不同濃度(7.9nM,15.8nM,31.6nM,62.5nM,125nM,250nM,500nM)。經(jīng)變性復(fù)性后，加入重組人Gremlin-1包被的微孔。37℃孵育1小時(shí)。棄去微孔中液體，用SHMCKT洗滌微孔，洗3遍，洗去未結(jié)合的ssDNA。

b)每孔加入SHMCK稀釋后的HRP-streptavidin(1:2000)100μl，37℃孵育1小時(shí)。棄去微孔中液體，用SHMCKT洗滌微孔，洗3遍，顯色。

c)酶標(biāo)儀波長(zhǎng)450nm條件下進(jìn)行分析。

d)分析數(shù)據(jù)經(jīng)GraphPad Prism 6.0軟件分析，獲得Kd值。

結(jié)果顯示如圖4。G-ap49Kd為2.43nM，較低的解離常數(shù)提示G-ap49與Gremlin-1有較高的親和力。

二、G-ap49的應(yīng)用性研究

1、驗(yàn)證G-ap49在核酸-蛋白質(zhì)印跡法(South-Western Blot)中的應(yīng)用

1)、以重組人Gremlin-1做South-Western Blot

a)取重組人Gremlin-1 200ng,溶于10μl PBS中，加入2×SDS-PAGE loading buffer(體積比1：1)和適量的1M DTT(終濃度為0.1M)混勻后，于100℃的沸水浴10min，冰浴10min，12,000rpm離心后即可用于上樣。

b)電泳與轉(zhuǎn)膜：使用12％的聚丙烯酰胺膠進(jìn)行電泳，電泳完后，常規(guī)半干轉(zhuǎn)移儀轉(zhuǎn)膜。用10％脫脂奶粉封閉膜。

c)一抗孵育：抗Gremlin-1抗體(生工生物工程,上海,中國(guó),1:500，PBST稀釋)，適配子G-ap49以相同方法孵育(80nM用PBS稀釋)，室溫1h后移至4℃過(guò)夜。

d)二抗孵育：次日，用PBST洗膜4次，每次5-10min，一抗為抗Gremlin-1抗體的PVDF膜加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1:10000，PBST稀釋)，以適配子G-ap49孵育的PVDF膜加入HRP-streptavidin(1:2000)，室溫孵育1h。

e)用PBST液洗膜4次，每次5-10min，在暗室內(nèi)加入ECL發(fā)光液，l min后壓膠片曝光，觀察結(jié)果并掃描圖像。

2)、以組織標(biāo)本做South-Western Blot

a)博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠肺組織蛋白的提?。喝〕鰞龃娴姆谓M織，向其中加入200μl的RIPA裂解液及2ul PMSF(10mg/ml)。在冰上碾磨、超聲、離心后，收集上清。經(jīng)考馬斯亮藍(lán)G250結(jié)合法進(jìn)行蛋白定量

b)制樣：取處理好的肺組織，蛋白量約100μg，加入2×SDS-PAGE loading buffer和適量的1M DTT，混勻后，于100℃的沸水浴10min，冰浴10min，12,000rpm離心后即可用于上樣。

c)余做法同以重組人Gremlin-1做South-Western Blot的過(guò)程。

結(jié)果如圖5所示，其中，(a)為G-ap49與重組人Gremlin-1；(b)為G-ap49與小鼠纖維化肺組織；以重組人Gremlin-1做South-Western Blot，適配子G-ap49與抗Gremlin-1抗體在約25kDa的位置均有條帶，與重組人Gremlin-1說(shuō)明書(shū)提供的Gremlin-1蛋白分子量一致。表明G-ap49可以識(shí)別固定在PVDF膜上的變性Gremlin-1。以組織標(biāo)本做South-Western Blot，G-ap49與抗體在大約25Kda，31Kda處出現(xiàn)相似的條帶，提示G-ap49能特異性的識(shí)別組織中的Gremlin-1，其作用與抗體類(lèi)似。

2、核酸適配子生物穩(wěn)定性的初步研究結(jié)果

1)高糖細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM中加入10％胎牛血清，100U/ml青霉素及100U/ml鏈霉素配制成完全培養(yǎng)基。將1μg G-ap49溶于100μl SHMCK緩沖液中，經(jīng)變性復(fù)性后加入200μl培養(yǎng)的HEK293細(xì)胞中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱，37℃孵育。分別于0,6,12,18,24,30,36,42及48小時(shí)，從混合物中取樣5μl，并以樣品作為模板擴(kuò)增雙鏈DNA。

PCR體系為：

對(duì)稱(chēng)PCR反應(yīng)條件為：

95℃預(yù)變性5分鐘，95℃變性30秒，59℃退火30秒，72℃延伸30秒，反應(yīng)20個(gè)循環(huán)，72℃10分鐘。

2)PCR產(chǎn)物經(jīng)10％變性丙烯酰胺膠(SDS-PAGE)電泳，銀染分析雙鏈DNA條帶，如圖6。

結(jié)果顯示G-ap49與培養(yǎng)著HEK293細(xì)胞的完全培養(yǎng)基孵育36小時(shí)內(nèi)，均可以從混合物中擴(kuò)增出雙鏈DNA。表明G-ap49在體外類(lèi)似體液的條件中可以穩(wěn)定存在36小時(shí)，這也為研發(fā)基于適配子的Gremlin-1血清學(xué)檢測(cè)提供了依據(jù)。

3、驗(yàn)證G-ap49在基于適配子的酶聯(lián)吸附試驗(yàn)即ELAA中的應(yīng)用

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)模擬酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)中的雙抗體夾心法(具體系統(tǒng)：包被在微孔板上的抗Gremlin-1抗體作為捕捉抗體—重組人Gremlin-1—G-ap49作為示蹤抗體—HRP-streptavidin作為顯色系統(tǒng))，用于驗(yàn)證G-ap49是否可用于酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)。

1)抗體包被：將抗Gremlin-1抗體(1:500用PBS稀釋)溶于50mM碳酸鹽緩沖液(pH 9.6),包被于Nunc 96孔酶聯(lián)板上，4℃過(guò)夜，3％BSA(PBST緩沖液配制)封閉，37℃2小時(shí)，備用。

2)固定包被抗體和重組人Gremlin-1的濃度，確定合適的G-ap49的用量：

a)將重組人Gremlin-1加入到抗Gremlin-1抗體包被的微孔中(50ng/ml，PBS稀釋)，37℃孵育1小時(shí)。棄去孔中液體，用PBST洗3次。

b)帶有生物素標(biāo)記的G-ap49經(jīng)變性后復(fù)性，以SHMCK緩沖液稀釋成100nM,50nM,25nM，加入到洗滌后的微孔中。37℃再孵育1小時(shí)。棄去微孔中液體，PBST洗3遍。

c)每孔加入HRP-streptavidin(1:2000，SHMCK稀釋)100μl，37℃孵育1小時(shí)。棄去微孔中液體，PBST洗3遍，顯色。

d)酶標(biāo)儀波長(zhǎng)450nm條件下進(jìn)行分析。

如圖7-1，固定抗體包被濃度及Gremlin-1濃度后，可見(jiàn)G-ap49濃度在0-100nM之間時(shí)，OD值隨G-ap49濃度增加而顯著增大；G-ap49濃度在100nM以后，OD值基本上不再有明顯變化。因此，選擇100nM的G-ap49濃度作為工作濃度，用于后續(xù)確定可檢測(cè)的Gremlin-1的濃度范圍。

3)固定包被抗體濃度及G-ap49的濃度(100nM)，確定可檢測(cè)的重組人Gremlin-1的濃度范圍。

a)將重組人Gremlin-1(100ng,50ng,25ng,12.5ng/ml，3％BSA/PBST稀釋)加入到抗Gremlin-1抗體包被的微孔中，37℃孵育1小時(shí)。棄去孔中液體，用PBST洗3次。

b)帶有生物素標(biāo)記的G-ap49變性復(fù)性后加入到洗滌后的微孔中(100nM)。37℃再孵育1小時(shí)。棄去微孔中液體，PBST洗3遍。

c)每孔加入SHMCK稀釋后的HRP-streptavidin(1:2000)100μL，37℃孵育1小時(shí)。棄去微孔中液體，PBST洗3遍后顯色。

d)酶標(biāo)儀波長(zhǎng)450nm條件下進(jìn)行分析。

如圖7-2，當(dāng)固定包被濃度及G-ap49濃度后，OD值隨Gremlin-1的濃度增大而明顯增加。

以上表明G-ap49可以用于基于適配子的酶聯(lián)吸附試驗(yàn)即ELAA。

4、驗(yàn)證G-ap49在組織化學(xué)染色中的應(yīng)用。

1)選擇四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化的肝臟標(biāo)本。60℃烤片1小時(shí)，梯度二甲苯及酒精脫蠟、脫水。蒸餾水沖洗切片。

2)消除過(guò)氧化物酶：將3％H2O2(PBS稀釋)滴加在切片上，室溫孵育約30min，PBS沖洗3遍。

3)抗原修復(fù)：將切片放入0.01M檸檬酸鹽緩沖液(PH6.0)中，于微波爐內(nèi)微波輻射95℃10分鐘，待修復(fù)液降至室溫后，PBS洗3次。

4)封閉：將山羊血清滴加在切片上，室溫靜置2小時(shí)后，棄去。

5)一抗孵育：

抗Gremlin-1抗體(1：200，PBS稀釋)，同時(shí)設(shè)正常兔IgG做陰性對(duì)照；

G-ap49(400nM，PBS稀釋)，同時(shí)設(shè)文庫(kù)對(duì)照；

滴加在切片上，室溫孵育1小時(shí)后移至4℃過(guò)夜。

6)將濕盒取出，在室溫下孵育45min，用PBS洗3次，各5min。

7)二抗孵育：在滴加抗Gremlin-1抗體及正常兔IgG的切片上滴加一滴生物素標(biāo)記的山羊抗兔二抗工作液，置于37℃溫箱中孵育1小時(shí)。

8)用PBS洗3次，各5min。

9)在所有切片上加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈酶卵白素工作液(1:500，PBST稀釋)，于37℃溫箱中孵育1小時(shí)。

10)DAB染色：染色5-20min，在顯微鏡下觀察控制染色程度。

11)用自來(lái)水充分沖洗切片，蘇木精染液復(fù)染，最后脫水、透明、中性樹(shù)膠固定，常規(guī)封片。

12)光學(xué)顯微鏡下觀察切片。

如圖8所示，以G-ap49及抗Gremlin-1抗體做的組織化學(xué)染色，在其纖維間隔及匯管區(qū)可見(jiàn)明顯的陽(yáng)性染色，甚至G-ap49組存在陽(yáng)性染色的細(xì)胞核。而各自的對(duì)照組，文庫(kù)對(duì)照及正常兔IgG對(duì)照，沒(méi)有明確的陽(yáng)性染色。

5、驗(yàn)證G-ap49在細(xì)胞化學(xué)染色中的應(yīng)用

1)高糖細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM中加入10％胎牛血清，100U/ml青霉素及100U/ml鏈霉素配制成完全培養(yǎng)基。蓋玻片經(jīng)泡酸，高溫滅菌處理后置于6孔板中，加HEK293細(xì)胞培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁，匯合率達(dá)80％之后，脂質(zhì)體2000用于轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒PEGFP-C2-hGremlin-1(包含EGFP-hGremlin-1的融合基因)及PEGFP-C2。轉(zhuǎn)染的重組質(zhì)粒分別于轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，取出細(xì)胞爬片，用4％多聚甲醛固定后進(jìn)行免疫組化染色。

2)PBS洗3遍后，用0.5％曲拉通X-100(TritonX-100)孵育30min，增加細(xì)胞膜的通透性，PBS洗3遍。

3)余做法同組織化學(xué)染色。

如圖9所示，經(jīng)G-ap49染色后，轉(zhuǎn)染PEGFP-C2-hGremlin-1重組質(zhì)粒的細(xì)胞有陽(yáng)性染色，轉(zhuǎn)染PEGFP-C2的細(xì)胞爬片無(wú)明顯陽(yáng)性染色細(xì)胞，這個(gè)結(jié)果與抗Gremlin-1抗體染色結(jié)果相似。綜合以上結(jié)果可知，G-ap49可以特異性的結(jié)合Gremlin-1，作用與抗體相當(dāng)，可用于免疫組化染色中檢測(cè)Gremlin-1的存在。

目前蛋白質(zhì)的識(shí)別及檢測(cè)主要以抗體為主，核酸適配子在親和力和特異性方面可與抗體媲美，甚至優(yōu)于抗體，并且具有抗體所不具備的其他一些優(yōu)點(diǎn)：篩選周期短，能應(yīng)用于大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)；生產(chǎn)成本低，穩(wěn)定性好，重復(fù)性強(qiáng)，生產(chǎn)中很少存在批次間的差異；沒(méi)有免疫原性，沒(méi)有毒性和明顯的副作用；易于化學(xué)修飾，可以在合成時(shí)精確、定點(diǎn)連接其他功能基團(tuán)和分子，如巰基、氨基和熒光素、生物素、酶或金屬微粒等，解離常數(shù)(K_d)多在pmol/l-nmol/l之間。因此，核酸適配子具有更為廣闊的應(yīng)用前景。

綜合本發(fā)明的以上結(jié)果表明，帶有生物素標(biāo)簽的核酸適配子G-ap49可以特異性的識(shí)別重組人Gremlin-1，且具有較高的特異性及靈敏性。經(jīng)過(guò)生物素標(biāo)記后的核酸適配子可以應(yīng)用于核酸蛋白質(zhì)印跡(South-Western blotting)、基于適配子的酶聯(lián)吸附試驗(yàn)(ELAA)、細(xì)胞及組織化學(xué)染色(Aptamer-based histochemistry and cytochemistry)。因此，G-ap49在親和力和特異性方面可與抗體媲美，甚至優(yōu)于抗體，有望被開(kāi)發(fā)成為體內(nèi)外檢測(cè)蛋白質(zhì)Gremlin-1的有力工具。