專利名稱：高啟動(dòng)強(qiáng)度寬宿主組成型表達(dá)質(zhì)粒pMMPc及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是基因工程領(lǐng)域表達(dá)質(zhì)粒及應(yīng)用，尤其是關(guān)于高啟動(dòng)強(qiáng)度寬宿主范 圍組成型表達(dá)質(zhì)粒PMMPc及其在生物降解和生物修復(fù)領(lǐng)域的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
基因表達(dá)系統(tǒng)在生物降解和生物修復(fù)領(lǐng)域具有重要作用，是進(jìn)行外源基因表達(dá)的 重要工具?，F(xiàn)在常用的基因表達(dá)系統(tǒng)，比如tac啟動(dòng)子表達(dá)系統(tǒng)、Tn7啟動(dòng)子表達(dá)系統(tǒng)以及 一些光照誘導(dǎo)型或者溫度誘導(dǎo)型啟動(dòng)子表達(dá)系統(tǒng)等，都有一個(gè)共同的缺陷，即啟動(dòng)子誘導(dǎo) 表達(dá)需要額外添加誘導(dǎo)因子，如IPTG、溫度變化、光照變化等。這為生物降解和生物修復(fù)帶 來了額外的操作，增加了成本，而且，在環(huán)境領(lǐng)域應(yīng)用時(shí)增加了表達(dá)系統(tǒng)實(shí)施的難度，并可 能會(huì)給環(huán)境帶來負(fù)面的影響(Di Gennaro et al. ,2008 ；Choi et al.，2005)。因而，有必 要開發(fā)新的不受上述限制的組成型表達(dá)質(zhì)粒。芳烴類化合物是一類重要的致癌物質(zhì)，在環(huán)境中廣泛存在，不但對(duì)環(huán)境造成了嚴(yán) 重污染，而且嚴(yán)重威脅人類健康。利用微生物，通過生物降解和生物修復(fù)來消除環(huán)境污染已 經(jīng)成為現(xiàn)在重要的研究課題。兒茶酚又稱鄰苯二酚，是許多芳烴類化合物代謝的中間產(chǎn)物。 兒茶酚雙加氧酶能夠作用于芳烴類化合物代謝的中間產(chǎn)物鄰苯二酚，它催化苯環(huán)的鄰位裂 解。這一特性使該酶在芳烴類化合物代謝中處于重要的地位，對(duì)消除芳烴類化合物的環(huán)境 污染具有重要的意義。參考文獻(xiàn)Di Gennaro P,Ferrara S,Bestetti G,et al. Novel auto-inducing expression systems for the development of whole—cell biocatalysts. Appl Microbiol Biotechnol，2008，79 :617_625.Choi K H, Gaynor J B, White K G, et al. (2005)A Tn7_based broad-range bacterial cloning and expression system. Nat Methods, 2005, 2 :443-448.

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有質(zhì)粒的缺陷以及現(xiàn)階段環(huán)境污染的現(xiàn)狀，本發(fā)明的目的是提供一種高啟 動(dòng)強(qiáng)度寬宿主范圍的組成型表達(dá)質(zhì)粒，并使其應(yīng)用于在革蘭氏陰性菌中表達(dá)兒茶酚雙加氧 酶。本發(fā)明所述高啟動(dòng)強(qiáng)度寬宿主范圍組成型表達(dá)質(zhì)粒，命名為pMMPc，由復(fù)制子 ReflOlO、篩選標(biāo)記基因bla(氨芐抗性基因)、多克隆位點(diǎn)、基因間序列和高啟動(dòng)強(qiáng)度組成 型啟動(dòng)子Pc組成；其特征在于，所述質(zhì)粒pMMPc的核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示；其中， 所述高啟動(dòng)強(qiáng)度組成型啟動(dòng)子Pc的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。本發(fā)明所述的質(zhì)粒pMMPc的構(gòu)建方法是合成啟動(dòng)子Pc，共225bp。以上述合成的Pc片段為模板，設(shè)計(jì)引物如下
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Pc. f (劃線部分為 MluI 酶切位點(diǎn))CATGACGCGTTGCCGATACAAGAACAAPc. r (劃線部分為 EcoRI 酶切位點(diǎn))GTCAGAATTCACGGGTTCGCTACCTGC然后配制反應(yīng)體系ddH2034 μ l，dNTP Mixture (2. 5mM each)4 μ 1, IOXEasy Taq Buffer5 μ 1，Sense Primer (20 μ Μ) 0. 5 μ 1, Anti Primer (20 μ Μ) 0. 5 μ 1, life. DNA ( ^^ 啟動(dòng)子 Pc 片段)0. 5 μ 1，EasyTaq Ιμ 。體系配好以后進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，循環(huán)如下940C 4min ；之后 94°C 30s，55°C 30s, 72°C 30s，共 29 個(gè)循環(huán)；最后 72°C IOmin0分別用相應(yīng)的核酸內(nèi)切酶對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物和寬宿主范圍表達(dá)質(zhì)粒pMMB66EH(核苷酸 序列如SEQ ID No.3所示)進(jìn)行酶切，DNA連接酶連接，進(jìn)行鑒定，獲得陽(yáng)性重組質(zhì)粒，命名 為pMMPc ；所述質(zhì)粒pMMPc的核苷酸序列，如SEQ ID No. 4所示。本發(fā)明所述質(zhì)粒pMMPc在革蘭氏陰性菌中表達(dá)兒茶酚雙加氧酶的應(yīng)用。其中， 所述兒茶酚雙加氧酶的表達(dá)是以在質(zhì)粒PMMPc啟動(dòng)子Pc后插入兒茶酚雙加氧酶的基因 bphC(核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示)實(shí)現(xiàn)。兒茶酚雙加氧酶基因bphC表達(dá)的酶為兒茶酚雙加氧酶BphC，該酶的特性在于，它 可以迅速的催化化合物兒茶酚生成2-羥基粘糠酸半醛，2-羥基粘糠酸半醛是一種有黃顏 色的化合物，而兒茶酚是無色的。實(shí)驗(yàn)中通過核酸內(nèi)切酶酶切、DNA連接、轉(zhuǎn)化等分子操作， 將兒茶酚雙加氧酶基因bphC插入到啟動(dòng)子Pc后邊，然后將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化不同的菌株。通過向 轉(zhuǎn)化子平板噴涂?jī)翰璺铀芤海^察轉(zhuǎn)化子的顏色變化來方便的檢測(cè)轉(zhuǎn)化子是否具有催化 化合物兒茶酚生成2-羥基粘糠酸半醛的能力，從而檢測(cè)本發(fā)明質(zhì)粒是否可以組成型表達(dá) 以及質(zhì)粒的宿主適用范圍，并通過兒茶酚雙加氧酶活性的測(cè)定檢測(cè)質(zhì)粒的其它特性。上述質(zhì)粒pMMPc的應(yīng)用步驟為從假單胞菌B6-2 (CGMCC No. 3758)中提取基因組， 以此為模板，PCR擴(kuò)增得到基因bphC。然后設(shè)計(jì)帶有核酸內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的引物，以bphC基 因?yàn)槟０?，再次擴(kuò)增。之后用核酸內(nèi)切酶對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物和質(zhì)粒PMMPc進(jìn)行酶切，DNA連接酶連 接。經(jīng)過鑒定，得到陽(yáng)性重組質(zhì)粒pMMPcbphC。以此為基礎(chǔ)，將重組質(zhì)粒以自然轉(zhuǎn)化法和電 穿孔轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化不同的宿主，如革蘭氏陰性菌。通過噴涂」L茶酚水溶液以及菌落PCR檢測(cè)。 研究結(jié)果表明pMMPc優(yōu)選適用于大腸桿菌Mach Tl ((Escherichia coli MachTl)購(gòu)買自北 京全式金生物技術(shù)有限公司(TransGen Biotech, Co.))、施氏假單胞菌SDM(Pseudomonas stutzeri SDM，CCTCC No. M206010)和惡臭假單胞菌 CICC 23651 ((Pseudomonas putida CICC 23651)購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心)等。本發(fā)明進(jìn)一步對(duì)Pc啟動(dòng)子啟動(dòng)強(qiáng)度進(jìn)行了研究，比較了 Pc啟動(dòng)子和IPTG誘 導(dǎo)的tac啟動(dòng)子的啟動(dòng)強(qiáng)度。首先，將經(jīng)過驗(yàn)證正確的含有構(gòu)建質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子P. putida CICC23651/pMMbphC 和本發(fā)明構(gòu)建的轉(zhuǎn)化子 P. putida CICC 23651/pMMPcbphC 過夜培養(yǎng)。 然后，按接種量轉(zhuǎn)接50ml/500ml LB三角瓶，搖床震蕩培養(yǎng)。每?jī)蓚€(gè)小時(shí)取樣，測(cè)定菌體 濃度(OD6J以及兒茶酚雙加氧酶BphC的酶活。上述酶活測(cè)定方法為超聲波破碎細(xì)菌，離心去除細(xì)胞碎片，取一定量粗酶液用 APbuffer (含10%丙酮的pH 7.5的PB緩沖液)稀釋至3ml，加入50 μ 1的0. 2Μ的兒茶酚 溶液，振蕩混勻。然后用UV-2500紫外分光光度計(jì)測(cè)定酶活的具體數(shù)據(jù)。將兩個(gè)轉(zhuǎn)化子不同時(shí)間的酶活除以對(duì)應(yīng)時(shí)間的菌體濃度(OD6J得到單位濃度菌 體的酶活，進(jìn)行數(shù)據(jù)比較，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的P. putida CICC 23651/pMMPcbphC轉(zhuǎn)化子單位濃度
4菌體酶活的最大值比P. putida CICC 23651/pMMbphC轉(zhuǎn)化子單位濃度菌體酶活的最大值高 大約6倍，而且誘導(dǎo)的速度快，在12小時(shí)達(dá)到誘導(dǎo)強(qiáng)度的最大值，而IPTG誘導(dǎo)的tac啟動(dòng) 子表達(dá)系統(tǒng)在14小時(shí)左右達(dá)到誘導(dǎo)強(qiáng)度的最大值(具體數(shù)據(jù)見圖4)。該結(jié)果表明，本發(fā)明 構(gòu)建的質(zhì)粒pMMPc(Pc啟動(dòng)子)在不需要外加任何誘導(dǎo)物或進(jìn)行任何額外誘導(dǎo)操作時(shí)即可 啟動(dòng)外源基因的表達(dá)，而且較寬宿主范圍表達(dá)質(zhì)粒pMMB66EH(IPTG誘導(dǎo)的tac啟動(dòng)子)具 有更高的啟動(dòng)效率，啟動(dòng)速度也快。本發(fā)明利用細(xì)菌III型整合子中的啟動(dòng)子Pc與寬宿主范圍表達(dá)質(zhì)粒pMMB66EH構(gòu) 建了新的表達(dá)質(zhì)粒pMMPc，由于啟動(dòng)子Pc具有不需要誘導(dǎo)(即組成型表達(dá))、啟動(dòng)強(qiáng)度高、 啟動(dòng)速度快和適用范圍廣的特點(diǎn)(Xu et al.，2007)，將該啟動(dòng)子插入到質(zhì)粒上，使得構(gòu)建 的質(zhì)粒具有該啟動(dòng)子的優(yōu)點(diǎn)，即不需要誘導(dǎo)、啟動(dòng)強(qiáng)度高、啟動(dòng)速度快和適用范圍廣，正是 目前基因表達(dá)系統(tǒng)的很好的替代系統(tǒng)。為了檢測(cè)本發(fā)明的質(zhì)粒在生物降解和生物修復(fù)領(lǐng)域 的應(yīng)用潛力，本發(fā)明以假單胞菌(P. putida)B6-2基因組為模板，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)克 隆兒茶酚雙加氧酶的基因bphC，通過核酸內(nèi)切酶酶切、DNA連接、轉(zhuǎn)化等系列分子操作將其 插入到表達(dá)質(zhì)粒PMMPc中啟動(dòng)子Pc的后面。通過檢測(cè)bphC基因的酶活，并與IPTG誘導(dǎo)的 tac啟動(dòng)子bphC基因的酶活進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)在實(shí)際應(yīng)用中質(zhì)粒pMMPc在啟動(dòng)外源基因表達(dá) 時(shí)無需加入誘導(dǎo)物或進(jìn)行任何額外的誘導(dǎo)操作即可快速高效的啟動(dòng)外源基因的表達(dá)，而且 其在假單胞菌中的表達(dá)強(qiáng)度比IPTG誘導(dǎo)的表達(dá)系統(tǒng)高大約6倍，且達(dá)到表達(dá)強(qiáng)度的最大值 所用的時(shí)間也縮短2個(gè)小時(shí)，即誘導(dǎo)的速度快(見圖4)。通過自然轉(zhuǎn)化法和電穿孔轉(zhuǎn)化法 將構(gòu)建質(zhì)粒轉(zhuǎn)化不同的革蘭氏陰性細(xì)菌，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的質(zhì)粒可以優(yōu)選應(yīng)用于大腸桿菌、施 氏假單胞菌和惡臭假單胞菌。以上特點(diǎn)表明本發(fā)明的質(zhì)粒PMMPc具有組成型表達(dá)、啟動(dòng)效 率高、啟動(dòng)速度快、宿主范圍廣的特點(diǎn)，不需要外加任何誘導(dǎo)物或者進(jìn)行任何額外的誘導(dǎo)操 作。本發(fā)明所提供的質(zhì)粒的特點(diǎn)使其成為目前使用的基因誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的很好的替代系 統(tǒng)，在生物降解和生物修復(fù)領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用前景。所述的宿主，是指質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細(xì)菌細(xì)胞。所述的轉(zhuǎn)化子，是指質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到細(xì)菌中，接受質(zhì)粒的細(xì)菌細(xì)胞叫做轉(zhuǎn)化子。所述的活性檢測(cè)，是指在啟動(dòng)子Pc后面連接外源基因，然后轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，通過 檢測(cè)外源基因表達(dá)的酶的活性，來表征獲得的啟動(dòng)子Pc片段是否具有功能活性。所述的組成型表達(dá)，是與誘導(dǎo)型表達(dá)相對(duì)應(yīng)的一個(gè)概念，是指基因無需誘導(dǎo)即可 實(shí)現(xiàn)表達(dá)的一種基因表達(dá)方式。所述的誘導(dǎo)型表達(dá)，是指基因在通常情況下不表達(dá)或表達(dá)程度很低，但在誘導(dǎo)物 的作用下，該基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)被啟動(dòng)或增強(qiáng)的一種基因表達(dá)方式。參考文獻(xiàn)Xu H, Davies J, Miao V. (2007)Molecular characterization of class 3integrons from Delftia spp. J Bacteriol, 2007,189 :6276_6283.


圖1為質(zhì)粒pMMbphC圖譜；該質(zhì)粒的構(gòu)建是為了與質(zhì)粒pMMPcbphC進(jìn)行比對(duì)，檢測(cè) 質(zhì)粒pMMbphC(IPTG誘導(dǎo)的Iac啟動(dòng)子)與質(zhì)粒pMMPcbphC (Pc啟動(dòng)子)質(zhì)粒特性的差別；圖 中ReflOlO為復(fù)制子，bla為氨芐青霉素抗性基因，IacI為基因表達(dá)調(diào)控的抑制基因，bphC為兒茶酚雙加氧酶的基因。圖2為質(zhì)粒pMMPc圖譜，圖中ReflOlO為復(fù)制子，bla為氨芐青霉素抗性基因，IacI 為基因表達(dá)調(diào)控的抑制基因，Pc為高啟動(dòng)強(qiáng)度組成型表達(dá)的啟動(dòng)子基因。圖3為質(zhì)粒pMMPcbphC圖譜，圖中ReflOlO為復(fù)制子，bla為氨芐青霉素抗性基因， IacI為基因表達(dá)調(diào)控的抑制基因，Pc為高啟動(dòng)強(qiáng)度組成型表達(dá)的啟動(dòng)子基因，bphC為兒茶 酚雙加氧酶的基因。質(zhì)粒pMMPcbphC的構(gòu)建是為了通過基因bphC來檢測(cè)質(zhì)粒pMMPc的特性。圖 4 為轉(zhuǎn)化子 P. putida CICC 23651/pMMbphC 和 P. putida CICC 23651/ pMMPcbphC單位菌體濃度酶活數(shù)據(jù)曲線。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體的實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而 不用于限制本發(fā)明的范圍。下面實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法，如 Sambrook 等分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press， 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1pMMB66EH(來自于 GenBank，編號(hào)X15234)質(zhì)粒提取質(zhì)粒的少量提取使用TIANGEN TIANperp Mini Plasmid Kit質(zhì)粒小體試劑盒(離 心柱型)完成。①柱平衡步驟向吸附柱CB3 (吸附柱放入收集管中)，加入500 μ 1的平衡液BL， 12, OOOrpm(-13400*g)離心lmin，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放入收集管中。②取l-5ml過夜培養(yǎng)的細(xì)菌，加入離心管中，12，OOOrpm(_13400*g)離心lmin，盡 量吸除上清(菌液較多時(shí)可以通過多次離心將菌體沉淀收集到一個(gè)離心管中)。③向留有菌體沉淀的離心管中加入250 μ 1溶液Pl (請(qǐng)先檢查是否已加入 RNaseA)，使用移液器或渦旋振蕩器徹底懸浮細(xì)菌沉淀。注意如果有未徹底混勻的菌塊，會(huì)影響裂解，導(dǎo)致提取量和純度偏低。④向離心管中加入250 μ 1溶液Ρ2，溫和地上下翻轉(zhuǎn)4-6次使菌體充分裂解。注意溫和的混合，不要?jiǎng)×艺鹗?，以免打斷基因組DNA，造成提取的質(zhì)粒中混有 基因組DNA片段。此時(shí)菌液變得清亮粘稠，所用時(shí)間不超過5min，以免質(zhì)粒受到損壞。⑤向離心管中加入350 μ 1溶液P3，立即溫和的上下翻轉(zhuǎn)6-8次，充分混勻，此時(shí)將 出現(xiàn)白色絮狀沉淀。12，OOOrpm(_13400*g)離心lOmin，此時(shí)在離心管底部形成沉淀。注意P3加入后應(yīng)立即混合，避免產(chǎn)生局部沉淀。如果上清中還有微小白色沉淀， 可再次離心后取上清。⑥小心將上清倒入或移入吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，注意盡量不要吸 出沉淀。室溫放置l-2min，12，OOOrpm(_13400*g)離心30-60秒，倒掉收集管中的廢液，將 吸附柱重新放回收集管中。⑦向吸附柱CB3中加入700μ 1漂洗液PW(請(qǐng)先檢查是否已加入無水乙醇)， 12，OOOrpm(-13400*g)離心30-60秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。⑧向吸附柱CB3中加入500 μ 1漂洗液Pff, 12，OOOrpm(_13400*g)離心30—60秒，倒掉收集管中的廢液。⑨將吸附柱CB3重新放回收集管中，12，OOOrpm(_13400*g)離心2min，目的是將吸
附柱上殘存的漂洗液除去。注意漂洗液中乙醇的殘留會(huì)影響后續(xù)的酶反應(yīng)(酶切、PCR等)實(shí)驗(yàn)。為確保下 游實(shí)驗(yàn)不受殘留乙醇的影響，建議將吸附柱CB3開蓋，置于室溫或50°C溫箱放置數(shù)分鐘，以 徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。⑩將吸附柱CB3置于一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜中間部位滴加50-100 μ 1洗 脫緩沖液ΕΒ，室溫放置lmin，12，OOOrpm(_13400*g)離心2min將質(zhì)粒溶液收集到離心管中。DNA凝膠電泳檢測(cè)，通過試劑盒提取到了質(zhì)粒pMMB66EH。實(shí)施例2假單胞菌(Pseudomonas putida) B6_2 (發(fā)明人保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委 員會(huì)普通微生物中心CGMCC No. 3758)基因組提取。基因組的少量提取使用Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega Corporation, Madison, WI, USA)完成。①取1. 5ml過夜培養(yǎng)的細(xì)菌，加入離心管中，12，OOOrpm(_13400*g)離心lmin，盡 量吸除上清(菌液較多時(shí)可以通過多次離心將菌體沉淀收集到一個(gè)離心管中)。②加入600 μ 1核酸裂解液，輕輕混勻。③80°C，溫育5min，然后冷卻至室溫。④加入3μ 1 RNA酶，混勻，37°C，溫育15-60min，然后冷卻至室溫。⑤加入200 μ 1蛋白抽提液，旋渦混勻。冰浴5min。然后13，OOOrpm，離心3min。⑥將上清轉(zhuǎn)移至新的印pendorf管中，加入600 μ 1異丙醇，混勻。13，OOOrpm，離 心3min，棄掉上清液。⑦向印pendorf管中加入600μ1室溫的70%乙醇，輕輕震蕩混勻。然后 13，OOOrpm，離心 3min。⑧棄上清，室溫放置10-15min，使印pendorf管晾干。⑨加入100 μ 1溶解液65°C放置lh，或者4°C過夜溶解基因組DNA。DNA凝膠電泳檢測(cè)，通過試劑盒提取到了假單胞菌B6-2的基因組。實(shí)施例31.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)克隆基因bphC引物設(shè)計(jì)如下bphC. f (劃線部分為SmaI酶切位點(diǎn))CGTACCCGGGTCGACGAAGGAGACAGTAATGAGCATCAbphC. r (劃線部分為HindIII酶切位點(diǎn))GATCAAGCTTCTAGATCATGCTTTGTTGCGCGCAG①反應(yīng)體系的配制ddH2034 μ 1, dNTP Mixture (2. 5mM each)4 μ 1, IOXEasy Taq Buffer5 μ 1， Sense Primer (20 μ Μ) 0. 5 μ 1, Anti Primer (20 μ Μ) 0. 5 μ 1, life. DNA (P. putida Β6-2 SS^l )0. 5 μ 1，EasyTaq 1 μ 1。②聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)循環(huán)具體步驟為94°C4min ；之后 94°C 30s,55°C 30s,72°C lmin，共 29 個(gè)循環(huán)；最后720C IOmin。DNA凝膠電泳檢測(cè)，擴(kuò)增出了基因bphC。2.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)克隆基因Pc(Pc基因片段由北京六合華大基因科技股份 有限公司合成)。引物設(shè)計(jì)如下Pc. f (劃線部分為 MluI 酶切位點(diǎn))CATGACGCGTTGCCGATACAAGAACAAPc. r (劃線部分為 EcoRI 酶切位點(diǎn))GTCAGAATTCACGGGTTCGCTACCTGC①反應(yīng)體系的配制ddH20 34 μ l，dNTP Mixture (2. 5mM each)4 μ 1，IOXEasy Taq Buffer5 μ 1，Sense Primer (20 μ Μ) 0. 5 μ 1, Anti Primer (20 μ Μ) 0. 5 μ 1, life. DNA ( ^^ 啟動(dòng)子 Pc 片段)0. 5 μ 1，EasyTaq Ιμ 。②聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)循環(huán)具體步驟為94°C4min ；之后 94°C 30s，55°C 30s，72°C 30s，共 29 個(gè)循環(huán)；最后 72°C IOmin。DNA凝膠電泳檢測(cè)，擴(kuò)增出了基因Pc。實(shí)施例4pMMbphC, pMMPc, pMMPcbphC 質(zhì)粒的構(gòu)建1. pMMbphC質(zhì)粒的構(gòu)建①提取pMMB66EH質(zhì)粒，SmaI和HindII I雙酶切(核酸內(nèi)切酶SmaI 0.5μ1，核酸內(nèi) 切酶 HindIII 0. 5 μ 1,10 XBuffer 1μ 1, DNA 8 μ 1，37°C，2 小時(shí))，然后切膠回收大片段。②擴(kuò)增基因bphC (bphC. f (SmaI) bphC. r (HindiII))，SmaI 和 HindiII 酶切 PCR 產(chǎn)物(酶切反應(yīng)與①相同)，然后與上述酶切好的質(zhì)粒連接(10XT4DNA Ligase Buffer 1μ 1，T4DNALigase 1 μ 1，質(zhì)粒片段 1. 5 μ 1，基因 bphC 片段 6. 5 μ 1，16°C，過夜連接)。轉(zhuǎn) 化大腸桿菌，通過常規(guī)方法篩選具有基因活性的轉(zhuǎn)化子，得到了質(zhì)粒PMMbphC，其核苷酸序 列如SEQ IDNo. 6所示。2. pMMPc質(zhì)粒的構(gòu)建①提取pMMB66EH質(zhì)粒，MluI和EcoRI雙酶切(核酸內(nèi)切酶MluI 0. 5 μ 1，核酸內(nèi) 切酶 EcoRI 0. 5 μ 1,10 XBuffer 1 μ 1，DNA8 μ 1，37°C，2 小時(shí))，然后切膠回收大片段。②PCR 擴(kuò)增 Pc 啟動(dòng)子，Pc. f (MluI) Pc. r (EcoRI)用MluI和EcoRI酶切處理pMMB66EH質(zhì)粒和PCR擴(kuò)增的Pc啟動(dòng)子(核酸內(nèi)切 酶 MluI 0. 5 μ 1，核酸內(nèi)切酶 EcoRI 0. 5μ 1, IOXBuffer 1 μ 1, DNA 8 μ 1，37°C，2 小時(shí))， 連接(10XT4DNALigase Buffer 1 μ 1, T4DNALigase 1 μ 1，質(zhì)粒片段 1· 5 μ 1，基因 Pc 片段 6. 5 μ 1，16°C，過夜連接)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，用菌落PCR方法篩選轉(zhuǎn)化子。通過常規(guī)方法篩選 具有基因活性的轉(zhuǎn)化子，得到了質(zhì)粒pMMPc，其核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示。3. pMMPcbphC 質(zhì)粒的構(gòu)建①提取pMMPc質(zhì)粒，Sma I和HindIII雙酶切(核酸內(nèi)切酶SmaI 0.5μ1，核酸內(nèi)切 酶 HindIIIO. 5 μ 1，IOXBuffer 1 μ 1,DNA 8 μ 1，37°C，2 小時(shí))。切膠回收純化質(zhì)粒 pMMPc。②擴(kuò)增基因bphC (bphC. for (SmaI) bphC. rev (HindiII))，SmaI 和 HindiII 酶切 PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pMMPc (核酸內(nèi)切酶SmaI 0. 5 μ 1，核酸內(nèi)切酶HindIII 0. 5 μ 1，IOXBuffer 1 μ 1,DNA 8μ 1，37°C，2 小時(shí))，T4DNA 連接酶連接(10XT4DNA Ligase Buffer 1 μ 1,T4DNALigase lμl，質(zhì)粒片段1.5μl，基因bphC片段6.5μl，16°C，過夜連接)。轉(zhuǎn)化大腸桿 菌，篩選具有基因活性的轉(zhuǎn)化子。通過常規(guī)方法篩選具有基因活性的轉(zhuǎn)化子，得到了質(zhì)粒 pMMPcbphC，其核苷酸序列如SEQ ID No. 5所示。實(shí)施例5構(gòu)建質(zhì)粒宿主適用范圍檢測(cè)1.質(zhì)粒pMMbphC，pMMPc, pMMPcbphC通過自然轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化大腸桿菌(大腸桿菌 Mach Tl ((Escherichia coli Mach Tl)購(gòu)買自北京全式金生物技術(shù)有限公司(TransGen Biotech, Co.)))。①制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。②將10 μ 1質(zhì)粒加入100 μ 1感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞，混合均勻，冰浴30min。③37 °C水浴保溫5min。④冰浴2min，加入400 μ 1 LB液體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)lh。⑤取100 μ 1培養(yǎng)物，涂布抗性平板，培養(yǎng)過夜。經(jīng)過常規(guī)方法驗(yàn)證，得到了Ε. coli Mach T1/pMMbphC，E. coli Mach Tl/pMMPc, E. coliMach TlpMMPcbphC 轉(zhuǎn)化子。2.質(zhì)粒pMMbphC，pMMPcbphC通過電穿孔轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化假單胞菌。(施氏假單胞 菌SDM(Pseudomonas stutzeri SDM，發(fā)明人保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCCNo. M206010)；惡臭假單胞菌 CICC 23651 ((Pseudomonas putida CICC23651)購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微 生物菌種保藏管理中心))①制備假單胞菌感受態(tài)。②向150μ 1感受態(tài)細(xì)胞中加入10μ l(50ng/y 1)DNA，轉(zhuǎn)移到冰浴預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯 中，冰上放置1 1. 5min。③電擊25 μ F，200 Ω，時(shí)間常數(shù)為4. 5 5. 0ms，低于4. 2ms，則效率明顯下降。④電擊完畢后取出杯子并立即加入Iml恢復(fù)培養(yǎng)基，30°C孵育lh。⑤涂布抗性平板，30°C過夜培養(yǎng)。經(jīng)過常規(guī)方法驗(yàn)證，得到了P. stutzeri SDM/pMMPcbphC, P. putidaCICC23651/ pMMbphC, P. putida CICC23651/pMMPc, P. putida CICC23651/pMMPcbphC 轉(zhuǎn)化子。3.向轉(zhuǎn)化子平板噴涂?jī)翰璺铀芤?，通過轉(zhuǎn)化子菌落顏色變化檢測(cè)質(zhì)粒是否可以 組成型表達(dá)以及它的適用范圍。結(jié)果發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒pMMPc可以優(yōu)選適用于菌株大腸桿菌、施氏假單胞菌、惡臭假單胞 菌。4.菌落PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)化子挑取轉(zhuǎn)化子菌落至LB搖管，過夜震蕩培養(yǎng)，取Iml菌液，離心，棄上清，菌泥用 100 μ 1無菌水懸浮，沸水浴lOmin，然后離心，以上清作為模板，進(jìn)行實(shí)施例3所述的聚合酶 鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，擴(kuò)增出了 SOObp左右的條帶，證明轉(zhuǎn)化子中含有正確的構(gòu)建質(zhì)粒。實(shí)施例6構(gòu)建質(zhì)粒誘導(dǎo)強(qiáng)度檢測(cè)將經(jīng)過驗(yàn)證正確的含有構(gòu)建質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子P. putida CICC 23651/pMMbphC和 P. putidaCICC 23651/pMMPcbphC 過夜培養(yǎng)。
按接種量轉(zhuǎn)接50ml/500ml LB三角瓶，30°C搖床震蕩培養(yǎng)。轉(zhuǎn)化子P. putida CICC23651/pMMbphC 接種后 1. 5h 加入 IPTG 誘導(dǎo)，轉(zhuǎn)化子 P. putida CICC 23651/pMMPcbphC 不加任何誘導(dǎo)物也不進(jìn)行任何其他的誘導(dǎo)操作。每?jī)蓚€(gè)小時(shí)取樣，測(cè)定菌體濃度(OD6tltl)以 及兒茶酚雙加氧酶(BphC)的酶活。上述酶活測(cè)定方法超聲波破碎細(xì)菌，離心去除細(xì)胞碎片，取一定量粗酶液用AP buffer (含10%丙酮的pH 7. 5PB緩沖液)稀釋至3ml，加入50 μ 1的0. 2Μ的兒茶酚溶液， 振蕩混勻。然后用UV-2500紫外分光光度計(jì)測(cè)定酶活的具體數(shù)據(jù)。將得到的數(shù)據(jù)除以對(duì)應(yīng)時(shí)間的菌體濃度(OD6J，然后作圖比較轉(zhuǎn)化子P. putida CICC23651/pMMbphC 和 P. putida CICC 23651/pMMPcbphC 的數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，本發(fā)明的 質(zhì)粒不但可以組成型啟動(dòng)外源基因的表達(dá)，不需要添加任何誘導(dǎo)物也不需要進(jìn)行任何額外 的誘導(dǎo)操作，而且誘導(dǎo)強(qiáng)度也比IPTG誘導(dǎo)的tac啟動(dòng)子表達(dá)系統(tǒng)高大約6倍，且誘導(dǎo)的速 度快，在12小時(shí)達(dá)到誘導(dǎo)強(qiáng)度的最大值，而IPTG誘導(dǎo)的tac啟動(dòng)子表達(dá)系統(tǒng)在14小時(shí)左 右達(dá)到誘導(dǎo)強(qiáng)度的最大值(具體數(shù)據(jù)見圖4)。
權(quán)利要求
一種高啟動(dòng)強(qiáng)度寬宿主組成型表達(dá)質(zhì)粒，命名為pMMPc，由復(fù)制子Ref1010、篩選標(biāo)記基因bla(氨芐抗性基因)、多克隆位點(diǎn)、基因間序列和高啟動(dòng)強(qiáng)度組成型啟動(dòng)子Pc組成；其特征在于，所述質(zhì)粒pMMPc的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；其中，所述高啟動(dòng)強(qiáng)度組成型啟動(dòng)子Pc的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.權(quán)利要求1中所述質(zhì)粒pMMPc在革蘭氏陰性菌中表達(dá)兒茶酚雙加氧酶的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述兒茶酚雙加氧酶的表達(dá)是以在質(zhì)粒 pMMPc啟動(dòng)子Pc后插入兒茶酚雙加氧酶的基因bphC實(shí)現(xiàn)。
4.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述革蘭氏陰性菌是大腸桿菌、施氏假單胞 菌或惡臭假單胞菌。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種啟動(dòng)強(qiáng)度高啟動(dòng)速度快宿主范圍寬的組成型表達(dá)質(zhì)粒pMMPc及其在革蘭氏陰性菌中表達(dá)兒茶酚雙加氧酶的應(yīng)用。本發(fā)明的質(zhì)粒不但可以組成型啟動(dòng)外源基因的表達(dá)，不需要添加任何誘導(dǎo)物也不需要進(jìn)行任何額外的誘導(dǎo)操作，而且誘導(dǎo)強(qiáng)度也比IPTG誘導(dǎo)的tac啟動(dòng)子表達(dá)系統(tǒng)高大約6倍，且誘導(dǎo)的速度快，表明該質(zhì)粒在生物降解和生物修復(fù)領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力。
文檔編號(hào)C12N9/02GK101955967SQ20101027756
公開日2011年1月26日 申請(qǐng)日期2010年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月9日
發(fā)明者徐友強(qiáng), 許平, 陶飛, 馬翠卿 申請(qǐng)人:山東大學(xué)